MX2007004031A

MX2007004031A - Vacunas de cebado/refuerzo contra el paludismo.

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Publication number: MX2007004031A
Application number: MX2007004031A
Authority: MX
Inventors: Jaap Goudsmit; Maria Grazia Pau; Joseph D Cohen; Patrice M Dubois; V Ann Stewart; Donald G Heppner
Original assignee: Crucell Holland Bv
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2005-10-13
Publication date: 2007-11-08
Also published as: US20090285879A1; EA016648B1; CN101068568B; CN101068568A; PT1802336E; AU2005293572B2; ATE523205T1; WO2006040334A1; BRPI0518146A; EA200700849A1; KR20070104881A; CA2582455A1; JP5108521B2; IL214460A0; HK1100121A1; PL1802336T3; NO20072470L; RS52187B; NZ583291A; SI1802336T1

Abstract

La invencion se refiere a nuevos regimenes de vacunacion en los cuales se aplican regimenes especificos de cebado/refuerzo usando vectores adenovirales recombinantes de baja neutralizacion que portan acidos nucleicos que codifican para antigenos de Plasmodium falciparum y vacunas de proteinas recombinantes tales como RTS,S, en el contexto de adyuvantes adecuados.

Description

VACUNAS DE CEBADO/REFUERZO CONTRA EL PALUDISMO Campo de la invención La invención se refiere al campo de la medicina. Específicamente, la invención se refiere a nuevas estrategias de vacunas de cebado/refuerzo usando vectores adenovirales producidos de manera recombinante y proteínas purificadas en el contexto de un adyuvante para la prevención del paludismo causado por P. falciparum . .Antecedentes de la invención El paludismo representa actualmente una de las infecciones más frecuentes en áreas tropicales y subtropicales a lo largo del mundo. Al año, las infecciones por paludismo matan hasta 2.7 millones de personas en países en desarrollo y emergentes. La ocurrencia ampliamente difundida e incidencia elevada del paludismo son una consecuencia de los números cada vez más altos de parásitos resistentes a fármacos y vectores parásitos resistentes a insecticidas. Otros factores incluyen cambios ambientales y climáticos, revueltas civiles y movilidad incrementada de poblaciones. El paludismo es causado por parásitos hematoprotozoarios originados en mosquitos que pertenecen al género Plasmodium . Cuatro especies de protozoarios de Plasmodium ( P. falciparum, P. ivax, P. ovale y P. malariae) son responsables de la enfermedad en el hombre; muchos otros REF.: 180895 causan enfermedad en animales, tales como P. yoelii y P. berghei . P. falciparum tiene que ver con la mayoría de las infecciones en humanos y es el tipo más letal. Los parásitos del paludismo tienen un ciclo de vida que consiste en cuatro etapas separadas. Cada una de estas etapas es capaz de inducir respuestas inmunes específicas dirigidas contra el parásito y los antígenos específicos de etapa que ocurren de manera correspondiente, pero el paludismo inducido naturalmente no protege contra reinfección. Los parásitos del paludismo son transmitidos al hombre por varias especies de mosquitos Anopheles hembra. Los mosquitos infectados inyectan la forma esporozoita del parásito del paludismo en el torrente sanguíneo de los mamíferos. Los esporozoitos permanecen durante pocos minutos en la circulación antes de invadir hepatocitos. En esta etapa el parásito se localiza en el ambiente extracelular y está expuesto al ataque de anticuerpos, dirigidos principalmente a la proteína circumsporozoito (CS) , un gran componente de la superficie de los esporozoitos. Una vez en el hígado, el parásito se replica y se desarrolla para crear un schizonte. Durante esta etapa, el parásito invasor sufrirá multiplicación asexual, produciendo hasta 20,000 merozoitos hijos por célula infectada. Durante esta etapa intracelular del parásito, los principales actores de la respuesta inmunológica del huésped son los linfocitos T, especialmente linfocitos T CD8+ (Romero et al. 1989). Después de aproximadamente una semana de infección en el hígado, miles de merozoitos son liberados en el torrente sanguíneo y entran en los glóbulos rojos (RBC's), volviéndose objetivos de la respuesta inmunológica mediada por anticuerpos y citocinas secretadas por células T. Luego de invadir los eritrocitos, los merozoitos sufren varias etapas de replicación, transformándose en trofozoitos, y schizontes, los cuales se rompen para producir una nueva generación de merozoitos que posteriormente infectan nuevos glóbulos rojos. La etapa eritrocítica está asociada con enfermedad clínica declarada. Un número más pequeño de trofozoitos pueden desarrollarse en gametocitos macho o hembra, las cuales son la etapa sexual del parásito. Cuando los mosquitos susceptibles ingieren gametocitos, la fertilización de estos gametos lleva a la formación de zigotos y a su posterior transformación en oocinetes, después en oocistos y finalmente en esporozoitos, los cuales migran a las glándulas salivares para completar el ciclo. Los dos principales brazos de la respuesta inmunológica específica de patógenos que ocurren luego de la entrada del parásito en el cuerpo son celulares y humorales. Un brazo, la respuesta celular, se refiere a células T CD8+ y CD4+ que participan en la respuesta inmune. Los linfocitos T citotóxicos (CTL's, por sus siglas en inglés) expresan CD8 y son capaces de matar específicamente células infectadas que expresan antígenos patógenos sobre su superficie. Las células T CD4+ o células T auxiliares soportan el desarrollo de CTL's, producen varias citocinas y también ayudan a inducir células B al dividirse y producir anticuerpos específicos para los antígenos. Durante la respuesta humoral, las células B específicas para un antígeno particular son activadas, se replican, diferencian y producen anticuerpos específicos de antígenos. Ambos brazos de la respuesta inmunológica son relevantes para la protección contra una infección palúdica. Cuando los esporozoitos infecciosos viajan al hígado y entran en los hepatocitos, los esporozoitos se vuelven patógenos intracelulares, pasando muy poco tempo fuera de las células infectadas. En esta etapa, las células T CD8+ y células T CD4+ son especialmente importantes toda vez que estas células T y sus productos citocinas, tales como interferón-? (IFN-?) , contribuyen a la eliminación de hepatocitos huésped infectados. Se ha encontrado que la eliminación de los parásitos hepáticos intracelulares en el modelo de paludismo en murino depende de respuestas de células T CD8+ dirigidas contra péptidos expresados por parásitos en etapa hepática (Hoffman y Doolan, 2000) . El agotamiento de células T CD8+ abroga la protección contra el ataque por esporozoitos, y la transferencia adoptiva de células T CD8+ animales naives confiere protección. Cuando una infección palúdica alcanza la etapa eritrocítica en la cual los merozoitos se replican en glóbulos rojos, los merozoitos se encuentran también circulando libremente en el torrente sanguíneo. Debido a que el eritrocito no expresa moléculas MHC clase I o II requeridas para la interacción cognada con células T, se cree que las respuestas a anticuerpo son más relevantes en esta etapa. En conclusión, un posible enfoque de vacuna contra el paludismo sería muy benéfico si pudiera inducir una fuerte respuesta inmune celular así como una fuerte respuesta inmune humoral para atacar las diferentes etapas en las cuales el parásito ocurre en el cuerpo humano. Los enfoques actuales en el desarrollo de vacunas contra el paludismo pueden clasificarse de acuerdo con diferentes etapas de desarrollo del parásito, como las descritas arriba. Tres tipos de vacunas posibles pueden distinguirse : Vacunas pre-eritrocíticas, las cuales están dirigidas contra esporozoitos y/o hepatocitos infectados por schizontes. Históricamente, este enfoque ha sido dominado por estrategias a base de (CS) . Ya que la fase de infección pre-eritrocítica es asintomática, una vacuna pre-eritrocítica idealmente debería conferir inmunidad estéril, mediada por una respuesta inmune humoral y celular, y prevenir completamente una infección de paludismo latente. - Vacunas de etapa sanguínea asexual, las cuales están dirigidas contra ya sea el glóbulo rojo infectado o el propio merozoito, son diseñadas para minimizar la severidad clínica. Estas vacunas pueden reducir la morbidez y mortalidad e intentan prevenir que el parásito ingrese y/o se desarrolle en los eritrocitos. - Vacunas de bloqueo de transmisión, las cuales están diseñadas para dificultar el desarrollo del parásito en el huésped mosquito. Este tipo de vacuna debería favorecer la reducción de los índices de infección de paludismo de amplias poblaciones. Finalmente, la viabilidad de desarrollar vacunas contra el paludismo en combinación que se enfoquen en varias etapas del ciclo de vida del parásito se está buscando en las llamadas vacunas de varios componentes y/o varias etapas. Actualmente ninguna vacuna disponible comercialmente contra el paludismo está disponible, aunque el desarrollo de las vacunas contra el paludismo fue iniciado hace más de 30 años. La inmunización de roedores, primates no humanos y humanos con esporozoitos atenuados por radiación confirió protección contra un ataque subsecuente con esporozoitos viables (Nussenzweig et al. 1967; Clyde et al. 1973) . Sin embargo, hasta el momento el costo y la falta de un sistema de cultivo a gran escala viable para la producción de esporozoitos irradiados ha evitado la aplicación ampliamente difundida de estas vacunas (Lu e et al. 2003). Hasta la fecha los candidatos a vacunas más promisorios probados en humanos se han basado en un número pequeño de antígenos de superficie de esporozoitos. La proteína CS es el único antígeno de P. falciparum que demostró prevenir de manera consistente el paludismo cuando se usó como la base de inmunización activa en humanos contra infección causada por mosquitos, aunque a niveles que comúnmente son insuficientes. Análisis teórico ha indicado que la cobertura de la vacuna así como la eficiencia de la misma debe ser de más del 85%, o de otra manera mutantes que sean más virulentos pueden escapar en áreas endémicas (Gandon et al. 2001) . Una forma de inducir una respuesta inmune en un mamífero es mediante la administración en un vector infeccioso, el cual porta un ácido nucleico que codifica para el antígeno en su genoma. Uno de estos vehículos es un adenovirus recombinante, el cual se ha hecho de replicación defectuosa mediante la remoción de regiones dentro del genoma que normalmente son esenciales para la replicación, tales como la región El. Ejemplos de adenovirus recombinantes que comprenden genes que codifican para antígenos se conocen en la técnica (WO 96/39178). Por ejemplo, los componentes antigénicos derivados de VIH han demostrado producir una respuesta inmune si son suministrados mediante adenovirus recombinantes (WO 10/02607; WO 02/22080; US 6,733,993). En el paludismo, se han desarrollado vacunas a base de adenovirus recombinantes. Estos vectores expresan la proteína CS completa de P. yoelii , uno de los modelos de paludismo en ratón, y estos vectores han demostrado ser capaces de inducir inmunidad estéril en ratones en respuesta a una sola dosis de inmunización (Bruña-Romero et al. 2001). Se ha demostrado que las células T CD8+ median principalmente esta protección inducida por adenovirus. Ya que un alto porcentaje de individuos tienen inmunidad preexistente contra los vectores adenovirales generalmente usados tales como el adenovirus serotipo 5 (Ad5), se desarrollaron nuevas tecnologías en la técnica, en las que adenovirus recombinantes defectuosos en replicación se basaron en serotipos que encontraron inmunidad preexistente en forma de anticuerpos neutralizantes sólo en un pequeño porcentaje de individuos saludables. Estos serotipos son generalmente conocidos como serotipos de baja neutralización, o serotipos raros. Se encontró que Adll, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 y Ad50 eran particularmente útiles (WO 00/70071; WO 02/40665; WO 2004/037294; WO 2004/083418; Vogels et al. 2003). Una vacuna a base de ADN que contiene un plásmido que expresa la proteína CS de P. falciparum fue desarrollada por Vical, Inc. San Diego, CA, E.U.A. y el Centro Naval de Investigación Médica (Horn et al. 1995). Estudios en un modelo de ratón demostraron inducción de CTL específica de antígeno y respuestas de anticuerpo luego de la inmunización con ADN plasmídico (Doolan et al. 1998). Sin embargo, hasta la fecha el único uso de vacunas de ADN ha probado ser menos que óptimo para la inducción de respuestas inmunes protectoras en humanos. Usando la vacuna de .ADN se encontró que voluntarios vacunados no desarrollaron anticuerpos contra la proteína CS como se evalúa mediante una prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes (IFAT) contra esporozoitos secados al aire y ELISA contra péptidos recombinantes y sintéticos (Wang et al. 2001), aunque sus respuestas a CTL fueron significativas. En contraste, el enfoque de vacuna contra el paludismo RTS,S (proteína purificada) (Gordon et al. 1995; US 6,306,625; WO 93/10152) es capaz de inducir una robusta respuesta de anticuerpos a la proteína CS (Kester et al. 2001; Stoute et al. 1997 y 1998), mientras que también es un potente inductor de la inmunidad celular y humoral tipo Thl.

Lo que es más importante, esta vacuna protege repetidamente a alrededor de la mitad de los receptores. Sin embargo, la protección desarrollada por RTS,S es de corta duración (Stoute et al. 1998). La inmunización con RTS,S induce anticuerpos anti-CS y respuestas IFN-? dependientes de células T CD4+, pero deficientes respuestas CTL o IFN-? dependientes de células T CD8+ (Lalvani et al. 1999). Sin embargo, estas respuestas CD8+ mínimas que se producen han demostrado correlacionarse con la protección en pruebas en humanos (Sun et al. 2003). Así, una mejora racional se enfocaría en el incremento de la inducción de respuestas de células T CD8+ a CS inducida por RTS,S. El reto de desarrollar una vacuna contra paludismo por P. falciparum que tenga una eficacia protectora de al menos 85% aún no ha sido satisfecho. La tarea es particularmente difícil toda vez que, a diferencia de otras enfermedades comúnmente fatales tales como sarampión o viruela, una exposición a paludismo anterior y el desarrollo de inmunidad natural no protege contra una infección de paludismo subsecuente. De todos los candidatos a vacuna y las estrategias de suministro de vacunas probadas hasta la fecha, sólo RTS,S ha proporcionado de manera consistente cierto nivel de protección. Otros candidatos probados han sido ya sea inadecuadamente inmunogénicos, o inmunogénicos pero inadecuadamente protectores. Esta solicitud describe una combinación estratégica de formulaciones de vacuna diseñadas para sacar ventaja de la inmunogenicidad serológica óptima del enfoque proteína/adyuvante junto con una excelente inducción de respuestas celulares proporcionadas por vectores adenovirales recombinantes defectuosos en replicación.

Breve descripción de las figuras Figura 1. Regímenes heterólogos de vacunación de cebado/refuerzo, seguidos al medir la respuesta de células T en análisis ELISPOT IFN-? relacionados con el término C de CS. La respuesta se midió dos semanas después del refuerzo final. Las barras horizontales representan medias geométricas . Figura 2. Respuesta de células T medida en análisis IFN-? ELISPOT relacionadas con el término C de CS . La respuesta se midió tres meses después del refuerzo final. Las barras horizontales representan medias geométricas. Figura 3. Respuesta de anticuerpo medida en un ELISA, relacionada con la región de repetición de CS, dos semanas después del refuerzo. Las barras horizontales representan medias geométricas . Figura 4. Respuesta de anticuerpo medida en ELISA, relacionada con la región de repetición de CS, tres meses después del refuerzo. Las barras horizontales representan medias geométricas. Figura 5. Respuesta de células T, en experimentos de cebado con un vector Ad35-CS recombinante y refuerzo con RTS,S o Ad35-CS, medida mediante IFN-? ELISPOT después de dos semanas (izquierda) o después de tres meses (derecha) . El régimen homólogo cebado/refuerzo/refuerzo RTS, S/RTS, S/RTS, S se usó como una referencia. Figura 6. Respuesta de anticuerpo, en experimentos de cebado con un vector Ad35-CS recombinante y reforzando con RTS,S o Ad35-CS, medida por ELISA después de dos semanas (izquierda) o después de tres meses (derecha) . El régimen homólogo cebado/refuerzo/refuerzo RTS, S/RTS, S/RTS, S se usó como una referencia. Figura 7. Respuesta de células T, en experimentos de refuerzo con un vector Ad35-CS recombinante y cebando con RTS,S o Ad5-CS, medida después de dos semanas (izquierda) o después de tres meses (derecha) . El régimen homólogo cebado/refuerzo/refuerzo RTS, S/RTS, S/RTS, S se usó como una referencia . Figura 8. Respuesta de anticuerpo, en experimentos de refuerzo con un vector Ad35-CS recombinante y cebando con RTS,S o Ad5-CS, medida después de dos semanas (izquierda) o después de tres meses (derecha) . Se usó como una referencia el régimen homólogo cebado/refuerzo/refuerzo RTS, S/RTS, S/RTS, S. Figura 9. Respuesta de células T medida en análisis IFN-? ELISPOT relacionada con el término N de CS, dos semanas después del refuerzo. Las barras horizontales representan medias geométricas. Figura 10. Respuesta de células T medida en análisis IFN-? ELISPOT relacionada con el término N de CS, tres veces después de refuerzo. Las barras horizontales representan medias geométricas . Figura 11. Respuesta de células T al término N, en experimentos cebando con un vector Ad35-CS recombinante y reforzando con RTS,S o Ad35-CS, medida después de dos semanas (izquierda) o después de tres meses (derecha) . Se usó el régimen homólogo cebado/refuerzo/refuerzo (RTS, S/RTS, S/RTS, S como una referencia. Figura 12. Respuesta de células T al término N, en experimentos de refuerzo con un vector Ad35-CS recombinante y cebando con RTS,S o Ad5-CS, medida después de dos semanas (izquierda) o después de tres meses (derecha) . Se usó el régimen homólogo cebado/refuerzo/refuerzo RTS, S (RTS, S/RTS, S como una referencia. Breve descripción de la invención La invención se refiere a un kit de partes que comprende un adenovirus recombinante de replicación defectuosa en un excipiente adecuado, el adenovirus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno de circumsporozoito (CS) de un parásito causante de paludismo; y un antígeno proteináceo adyuvado, de preferencia también de un parásito causante de paludismo; en donde el adenovirus recombinante se selecciona del grupo que consiste en adenovirus humano serotipo 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 y 50. Un antígeno proteináceo que se prefiere comprende RTS,S. El parásito causante de paludismo que se prefiere es Plasmodium falciparum. En otra modalidad la invención se refiere también al uso de un adenovirus recombinante de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno CS de un parásito causante de paludismo, y un antígeno proteináceo adyuvado, de preferencia de un parásito causante de paludismo tal como Plasmodium falciparum, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de paludismo, en donde el adenovirus recombinante es un adenovirus simiano o un adenovirus humano serotipo 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 ó 50. La invención describe ciertos regímenes cebado-refuerzo preferidos, en donde se prefiere que el adenovirus recombinante de replicación defectuosa se use como una composición cebadora y el antígeno proteináceo adyuvado se use como una composición de refuerzo. La invención se refiere también a un método para vacunar un mamífero contra una infección de paludismo, que comprende las etapas de cebar al mamífero con un adenovirus recombinante de replicación defectuosa en un excipiente adecuado, el adenovirus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno CS de un parásito causante del paludismo; y reforzar al mamífero con un antígeno proteináceo adyuvado, de preferencia RTS,S.

Descripción detallada de la invención La presente invención se refiere a un kit de partes que comprende un adenovirus recombinante de replicación defectuosa en un excipiente farmacéuticamente aceptable, el adenovirus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno de circumsporozoito (CS) de un parásito causante de paludismo; y un antígeno proteináceo adyuvado; en donde el adenovirus recombinante se selecciona del grupo que consiste en adenovirus humano serotipo 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 y 50. De preferencia, el adenovirus recombinante es adenovirus humano serotipo 35. Se prefiere también un kit de acuerdo con la invención en el que el antígeno proteináceo comprende una proteína CS, o un fragmento inmunogénico de la misma, de un parásito causante de paludismo. El antígeno proteináceo comprende de preferencia una proteína híbrida de proteína CS o un fragmento inmunogénico de la misma fusionado al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) , en forma de partículas de lipoproteína con HBsAg. En una modalidad preferida más, el antígeno proteináceo comprende RTS,S. Se prefiere también que el antígeno proteináceo sea adyuvado con QS21 y 3D-MPL, de preferencia en una formulación con liposomas que contengan colesterol. Aunque se sabe en la técnica que diferentes parásitos causan paludismo en humanos, una modalidad de la presente invención es un kit de partes de acuerdo con la invención, en el que el parásito causante de paludismo es Plasmodium falciparum . Para respuestas inmunes adecuadas se prefiere que el ácido nucleico heterólogo sea optimizado en codones para una producción incrementada de la proteína codificada en un mamífero, de preferencia un humano. El adenovirus recombinante puede estar presente en una mezcla con un adyuvante . La aplicabilidad de adenovirus simianos para usarse en terapia génica humana o vacunas es bien apreciada por aquellos de capacidad ordinaria en la técnica. Aparte de esto, se encontró que otros adenovirus no humanos tales como adenovirus caninos y bovinos infectaban células humanas in vitro y son por lo tanto también aplicables para uso humano ya que su seroprevalencia es baja en muestras humanas. Así, la invención se refiere también a un kit de partes que comprende un adenovirus simiano, canino o bovino recombinante y de replicación defectuosa en un excipiente farmacéuticamente aceptable, el adenovirus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno de circumsporozoito (CS) de Plasmodium falciparum optimizado en codones ; y un antígeno proteináceo adyuvado que comprende RTS,S, en donde se prefiere que el antígeno proteináceo sea adyuvado con QS21 y 3D-MPL, de preferencia en una formulación con liposomas que contengan colesterol. La presente invención describe que ciertos regímenes de cebado-refuerzo proporcionan un resultado inesperado y sorprendente con respecto a respuestas inmunes si los diferentes componentes del kit de partes descrito se administran en cierto orden. Así, la invención se refiere también a un kit de partes de acuerdo con la invención, en el que el adenovirus recombinante de replicación defectuosa es una composición cebadora y el antígeno proteináceo adyuvado es una composición de refuerzo. La respuesta inmune desencadenada por una sola administración (cebado) de una vacuna comúnmente no es lo suficientemente potente y/o persistente como para proporcionar una protección efectiva. La administración repetida (refuerzo) puede incrementar de manera significativa respuestas humorales y celulares a antígenos de vacuna (por ejemplo, véase Estcourt et al. 2002) . La invención se refiere también al uso de un adenovirus recombinante de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno CS de un parásito causante de paludismo, y un antígeno proteináceo adyuvado, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de paludismo, en donde el adenovirus recombinante es un adenovirus simiano, canino o bovino, o un adenovirus humano serotipo 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 ó 50, en donde se prefiere que el adenovirus recombinante de replicación defectuosa se use como una composición cebadora y el antígeno proteináceo adyuvado se use como una composición de refuerzo. De acuerdo con una modalidad de la invención, se refiere a un uso de acuerdo con la invención, en el que el antígeno proteináceo comprende una proteína CS, o un fragmento inmunogénico de la misma, de un parásito causante de paludismo, de preferencia Plasmodium falciparum. El antígeno proteináceo comprende de preferencia una proteína híbrida de proteína CS o un fragmento inmunogénico de la misma fusionado al antígeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg) , en forma de partículas de lipoproteína con HBsAg. RTS,S es un antígeno proteináceo adyuvado que se prefiere, aunque un adyuvante que se prefiere es QS21 y 3D-MPL, de preferencia en una formulación con liposomas que contengan colesterol. Para una expresión óptima seguida por respuesta inmune óptima en mamíferos, de preferencia humanos, el ácido nucleico heterólogo usado en la presente invención es optimizado en codones para una producción incrementada de la proteína codificada en un mamífero, de preferencia un humano. En otra modalidad más, la presente invención se refiere a un método para vacunar un mamífero contra una infección de paludismo, que comprende las etapas de cebar al animal con un adenovirus recombinante de replicación defectuosa en un excipiente farmacéuticamente aceptable, el adenovirus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno CS de un parásito causante de paludismo, y reforzar al mamífero con un antígeno proteináceo adyuvado que comprenda una proteína híbrida de proteína CS o un fragmento inmunogénico de la misma fusionado a HBsAg, en forma de partículas de lipoproteína con HBsAg. El antígeno proteináceo comprende de preferencia RTS,S, en donde el adyuvante que se prefiere es QS21 y 3D-MPL, de preferencia en una formulación con liposomas que contengan colesterol, mientras que el parásito causante del paludismo que se prefiere es Plasmodium falciparum. Los adenovirus preferidos que se usan para producir adenovirus recombinantes y usados en los métodos de la presente invención pueden ser adenovirus humanos o no humanos tales como adenovirus simianos, caninos y bovinos, toda vez que se prefiere altamente usar adenovirus que no encuentren inmunidad preexistente en el huésped (humano) al cual se vaya a administrar el virus recombinante. Los adenovirus simianos y ciertos serotipos de adenovirus humanos son altamente adecuados para esto, como se describe en la presente. Los adenovirus humanos que se prefieren que se usan para los métodos, usos y kit de partes de acuerdo con la invención son los adenovirus humanos serotipos 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 y 50.

La invención se refiere también a un método para vacunar un mamífero contra una infección de paludismo usando un kit de partes de acuerdo con la invención. Si se usa un kit de partes de acuerdo con la invención para vacunar un mamífero contra una infección de paludismo usando un régimen de cebado-refuerzo preferido como el descrito en la presente, el refuerzo es seguido preferiblemente por uno o más refuerzos subsecuentes . La presente invención se refiere al uso de adenovirus recombinantes como un vehículo de al menos un antígeno de paludismo y usados en combinación heteróloga con una proteína adyuvada en un régimen de cebado/refuerzo. Se ha encontrado sorprendentemente que la combinación de un vector viral y una proteína adyuvada en un régimen heterólogo de cebado/refuerzo proporciona una respuesta inmune superior en primates en términos de respuestas de células T iniciales y longevidad de las respuestas inmunes. En particular, se ha encontrado que cebar un mamífero con un vector viral que porte un ácido nucleico que codifique para un antígeno seguido por un refuerzo subsecuente, ya sea mediante una inyección individual o múltiple de antígeno proteináceo adyuvado, proporciona resultados superiores en términos de respuestas inmunes cualitativas y/o cuantitativas. Los vectores virales que se prefieren son vectores adenovirales, muy preferiblemente vectores adenovirales humanos, y todavía más preferiblemente vectores adenovirales humanos que encuentran bajos niveles de actividad neutralizante en el huésped mamífero al cual son administrados. Los serotipos altamente preferidos son los adenovirus 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 y 50. De acuerdo con una modalidad preferida, el antígeno proteináceo y el antígeno codificado por el vector viral son antígenos de paludismo, muy preferiblemente la proteína circumsporozoito (CS) de Plasmodium falciparum, o derivados inmunogénicos y/o fragmentos de la misma. Como un ejemplo de este concepto, el polipéptido codificado por el vector viral comprende el ácido nucleico que codifica para la proteína CS de P. falciparum, incluyendo la parte N-terminal, la región de repetición de la parte central y la parte C-terminal (con una supresión de los 14 aminoácidos más C-terminales: la secuencia de ancla GPI) , mientras que el antígeno proteináceo comprende la construcción RTS,S, la cual carece de la región N-terminal . El antígeno proteináceo adyuvado para usarse en cualquiera o todos los aspectos de la invención puede comprender la proteína CS de P. falciparum, o un fragmento inmunogénico de la misma, la cual puede estar en forma de una proteína de fusión. Por ejemplo, el antígeno puede comprender una proteína híbrida de la proteína CS o un fragmento inmunogénico fusionado al antígeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg) , proteína híbrida que puede ser expresada en células huésped procarióticas o eucarióticas y puede tener la forma de partículas de lipoproteína. La proteína de fusión puede comprender por ejemplo sustancialmente toda la porción C-terminal de la proteína CS, cuatro o más repeticiones tándem de la región inmunodominante, y el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) . Por ejemplo, la proteína híbrida que comprende una secuencia que contiene al menos 160 aminoácidos que es sustancialmente homologa a la porción C-terminal de la proteína CS y puede estar libre de los aminoácidos finales del término C de la proteína CS, por ejemplo los últimos 10 a 12 aminoácidos. La proteína híbrida puede estar en forma de partículas de lipoproteína mezcladas, por ejemplo con HBsAg. En particular, se proporciona una proteína híbrida como la descrita en WO 93/10152, designada ahí "RTS*" pero referida en la presente como "RTS", la cual puede estar en forma de partículas de lipoproteína mezcladas con HBsAg, designada en la presente RTS,S. La relación de proteína híbrida : antígeno S en estas partículas mixtas es por ejemplo de 1:4. La proteína híbrida designada "RTS" en la presente se generó usando la secuencia génica de la proteína CS de P. falciparum NF54 (Clone 3D7 ; Caspers et al. 1989) y que comprende sustancialmente la región completa 207 a 395 de la proteína CS de P. falciparum NF54. La porción de la secuencia de proteínas CS NF54 (3D7) que está incluida en RTS es la siguiente secuencia de 189 aminoácidos: DPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNKNNQG NGQGHNMPND PNRNVDENAN ANSAVKNNNN EEPSDKHIKE YLNKIQNSLS TEWSPCSVTC GNGIQVRIKP GSA KPKDEL DYANKIEKKI CKMEKCSSVF NW?SSIGL (SEQ ID ?O : 1). En particular, RTS es: • Un residuo de metionina codificado por los nucleótidos 1059-1061 derivado de la secuencia génica TDH3 de Sacchromyces cerevisiae (los nucleótidos 1-1058 en este marco de lectura constituyen el propio promotor TDH3 ) . (Musti et al. 1983) . • Tres aminoácidos: Met, Ala, Pro, derivados de una secuencia de nucleótidos (1062-1070) creada por el procedimiento de clonación usado para construir el gen híbrido) . • Un tramo de 189 aminoácidos (dado arriba, SEQ ID ?O:l) codificado por 1071-1637 aminoácidos representantes 207 a 395 de la proteína CS de la cepa ?F54 de P. falciparum (clon 3D7; Caspers et al. 1989) . • Un aminoácido (Gly) codificado por nucleótidos 1638 a 1640, creado por el procedimiento de clonación usado para construir el gen híbrido. • Cuatro aminoácidos, Pro, Val, Thr, Asn, codificados por los nucleótidos 1641 a 1652, y que representan los cuatro residuos carboxi terminales de la proteína preS2 del virus de la hepatitis B (serotipo adw) (Valenzuela et al. 1979). • Un tramo de 226 aminoácidos, codificado por los nucleótidos 1653 a 2330, y que especifica la proteína S del virus de la hepatitis B (serotipo adw) (Valenzuela et al. 1979) . RTS puede estar en forma de partículas mixtas, RTS,S, en donde la relación de RTS : S es por ejemplo de 1:4. Aunque la invención por ningún motivo está limitada a antígenos palúdicos, la invención se explicará en gran detalle usando vectores virales que codifican para un antígeno palúdico en combinación con antígeno palúdico proteináceo adyuvado. Los expertos en la técnica serán capaces de modificar la enseñanza general provista en la presente usando diferentes insertos antigénicos y antígenos proteináceos correspondientes de otros agentes patógenos, incluyendo parásitos, bacterias, virus, levaduras o incluso auto-antígenos, incluyendo pero no limitados a, antígenos tumorales (por ejemplo, PSA, gplOO, CEA, MUC1, Her2/neu) y similares . La presente invención se refiere a un vector adenoviral recombinante de replicación defectuosa que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica para un antígeno de Plasmodium falciparum . En una modalidad preferida el vector viral es un adenovirus derivado de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en: Adll, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 y Ad50. La razón para esta selección de adenovirus humanos es debido a que el uso de adenovirus en general como vectores de vacuna es típicamente dificultado por el hecho de que los humanos son infectados regularmente con adenovirus tipo silvestre, los cuales causan enfermedades leves o no aparentes como el resfriado común. Las respuestas inmunes desarrolladas durante esta infección con un serotipo tipo silvestre progenitor pueden impactar negativamente la eficacia del serotipo de adenovirus recombinante cuando se usen con un vector de vacunas recombinante subsecuente, tal como una vacuna contra el paludismo en la cual se apliquen adenovirus. La dispersión de los diferentes serotipos de adenovirus en la población mundial humana difiere de un área geográfica a otra. Generalmente, los serotipos preferidos encuentran una baja actividad neutralizante en huéspedes en la mayoría de las partes del mundo, como se detalla en varios reportes en la técnica. Los inventores de la presente invención han hecho ahora una nueva combinación entre un adenovirus recombinante y una proteína purificada en un esquema de vacunación secuencial, conocido como cebado/refuerzo heterólogo, esquema que hace uso de las diferentes respuestas inmunes inducidas por los diferentes componentes de vacuna de cebado/refuerzo. La elección del factor recombinante es influenciada por aquellos que encuentran actividad neutralizante en un bajo porcentaje de la población humana en necesidad de la vacunación. Sorprendentemente, la combinación de antígeno vectorizado por adenovirus y antígeno de proteína adyuvado proporciona una mejora significativa en respuestas inmunes sobre aquellas observadas usando cada vacuna sola. El incremento inmune se ilustra por la detección in vitro de respuestas inmunes dadas in vivo a macacos rhesus como las descritas en la presente. En otra modalidad, el adenovirus recombinante de replicación defectuosa es un adenovirus simiano, tal como aquellos aislados de chimpancés. Ejemplos que son adecuados incluyen C68 (también conocido como Pan 9; US 6,083,716) y Pan 5, 6 y 7 (WO 03/046124) . En un aspecto particular de la invención el vector viral recombinante de replicación defectuosa comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína CS, o una parte inmunogénica o fragmento de la misma. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico heteróloga es optimizada en codones para una expresión elevada en un mamífero, de preferencia un humano. La optimización en codones se basa en el contenido de aminoácidos requerido, el uso de codones óptimos general en el mamífero de interés y un número de aspectos que deben evitarse para asegurar una expresión adecuada. Estos aspectos pueden ser sitios de empalme de donador receptor, codones de detención, sitios Chi, tramos poly(A), secuencias ricas en GC y AT, cajas TATA internas, etc. Los métodos de optimización en codones para huéspedes mamíferos se conocen bien por la persona capacitada y pueden encontrarse en varios lugares en la literatura de biología molecular. En una modalidad preferida, la invención se refiere a un vector adenoviral recombinante de replicación defectuosa de acuerdo con la invención, en el que el contenido de adenina más timina en el ácido nucleico heterólogo, en comparación con el contenido de citocina más guanina, es menos del 87%, de preferencia menos de 80%, muy preferiblemente menos de 59% y más preferiblemente igual a alrededor de 45%. La invención proporciona, en una modalidad, un vector adenoviral recombinante de replicación defectuosa, en el que la proteína CS es cualquiera de las proteínas CS como las descritas en WO 2004/055187, muy preferiblemente la proteína CS de P. falciparum o un fragmento inmunogénico de la misma. La producción de vectores adenovirales recombinantes que portan genes heterólogos se conoce bien en la técnica e implica típicamente el uso de una línea de células de empaque, construcciones adaptadoras y cósmidos y la supresión de al menos una parte funcional de la región El del genoma adenoviral (véase también abajo para sistemas de empaque y líneas de células preferidas) . La invención se refiere también a kits que comprenden como componentes por un lado un vector adenorival recombinante que encuentra baja actividad neutralizante en el huésped y por otro lado una proteína purificada, en donde se prefiere que la proteína purificada se proporcione en mezcla con un adyuvante. Un adyuvante que se prefiere es QS21 y 3D-MPL, de preferencia en una formulación con liposomas que contienen colesterol. Los componentes se usan en una estrategia de suministro de vacuna heteróloga cebado/refuerzo en la cual se prefiere administrar primero el vector adenovirual recombinante como un agente de cebado y después la proteína purificada como un agente de refuerzo, refuerzo que puede ser repetido más de una vez . Los componentes se mantienen típicamente en vehículos farmacéuticamente aceptables . Los vehículos farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica y se usan extensamente en una amplia gama de productos terapéuticos. De preferencia, se aplican vehículos que funcionan bien en vacunas. Se prefieren más las vacunas que comprenden además un adyuvante. Se sabe en la técnica que los adyuvantes incrementan más la respuesta inmune a un antígeno aplicado. La invención se refiere también al uso de un kit de acuerdo con la invención en el tratamiento terapéutico, profiláctico o diagnóstico del paludismo. La presente invención se refiere a un método para tratar un mamífero para una infección de paludismo o para prevenir una infección de paludismo en un mamífero, el método comprende (en cada orden, o simultáneamente) las etapas de administrar un adenovirus recombinante que porta un antígeno de P. falciparum; y administrar al menos una proteína de P. falciparum purificada, la proteína está mezclada con un adyuvante. De preferencia el adenovirus recombinante se selecciona del grupo que consiste en Adll, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 y Ad50, aunque se prefiere también que el adenovirus recombinante porte el gen que codifica para la proteína CS, o un fragmento inmunogénico del mismo. La proteína purificada que se prefiere y se usa en combinación con el adenovirus recombinante es RTS,S, aunque un adyuvante que se prefiere es QS21 y 3D-MPL, de preferencia en una formulación con liposomas que contengan colesterol. La fuerza impulsora detrás del desarrollo de la respuesta inmune es las citocinas, un número de mensajeros proteínicos identificados que sirven para ayudar a las células del sistema inmunológico y dirigir la respuesta inmune eventual a una respuesta ya sea Thl o Th2. Así, altos niveles de citocinas tipo thl tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células al antígeno dado, mientras que altos niveles de citocinas tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales a antígeno. Es importante recordar que la distinción de las respuestas inmunes tipo Thl y Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmune que se describa como siendo predominantemente Thl o predominantemente Th2. Sin embargo, comúnmente es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de aquellas descritas en clones de células T CD4+ de murino por Mosmann y Coffman (1989). Tradicionalmente, las respuestas tipo Thl están asociadas con la producción de las citocinas INF-y e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas comúnmente directamente asociadas con la inducción de respuestas inmunes tipo Thl no son producidas por células T, tales como IL-12. En contraste, las respuestas tipo Th2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y factor de necrosis tumoral (TNF-ss) . Los adyuvantes adecuados para usarse en la invención incluyen una sal aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también pueden ser una sal de calcio, hierro o zinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos derivados catiónica o aniónicamente, polifosfacenos o liposomas de montanuro .

En la formulación de vacunas para usarse en la invención, en el contexto del vector de adenovirus, un adyuvante puede o no ser administrado. En el caso del componente proteínico de la combinación, la composición adyuvante puede seleccionarse para inducir una respuesta a Thl preferencial. Más aún, también se pueden inducir otras respuestas, incluyendo otras respuestas humorales. Ciertos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citocinas ya sea tipo Thl o Th2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio Thl:Th2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluye una medición directa de la producción de citocinas Thl o Th2 por linfocitos T in vi tro después de la re-estimulación con antígeno, y/o la medición de la relación IgGl:IgG2a de respuestas de anticuerpo específicas para antígenos. Así, un adyuvante tipo Thl es uno que estimula poblaciones de células T aisladas a producir altos niveles de citocinas tipo Thl cuando son re-estimuladas con antígeno in vi tro e inducen respuestas de inmunoglobulina específicas de antígeno asociadas con el isotipo Thl. Por ejemplo, los inmunoestimulantes tipo Thl que pueden formularse para producir adyuvantes adecuados para usarse en la presente invención pueden incluir lípido A de monofosforilo, en particular lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado (3D- MPL) . 3D-MPL es un adyuvante bien conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Químicamente es comúnmente suministrado como una mezcla del lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado con ya sea 4,5 ó 6 cadenas aciladas. Puede ser purificado y preparado mediante los métodos enseñados en GB 2122204B, referencia que también describe la preparación del lípido A de difosforilo, y variantes 3-0-desacetiladas de los mismos. Otros lipopoliscáridos purificados y sintéticos han sido descritos (patente de E.U.A. N6, 005, 099, EP 0729473 Bl , EP 0549074 Bl) . En una modalidad, 3D-MPL está en forma de una formulación en partículas que tiene un pequeño tamaño de partícula de menos de 0.2 µm de diámetro, y su método de fabricación se describe en EP 0689454. Las saponinas son otro ejemplo de los inmunoestimulantes Thl que pueden usarse con la invención. Las saponinas son adyuvantes bien conocidos. Por ejemplo, Quil A (derivado de la corteza del árbol Sudamericano Quillaja Saponria Molina) , y sus fracciones del mismo, se describen en la patente de E.U.A. 5,057,540 y EP 0362279 Bl . Las saponinas hemolíticas QS21 y QS17 (fracciones purificadas por HPLC de Quil A) han sido descritas como potentes adyuvantes sistémicos, y el método de su preparación se describe en la patente de E.U.A. 5,057,540 y EP 0362279 Bl . También se describe en estas referencias el uso de QS7 (una fracción no hemolítica de Quil-A) , la cual actúa como un potente adyuvante para vacunas sistémicas. Combinaciones de QS21 y polisorbato o ciclodextrina también se conocen (WO 99/10008) . Sistemas adyuvantes en partículas que comprenden fracciones de QilA, tales como QS21 y QS7 se describen en WO 96/33739 y WO 96/11711. Otro ejemplo más de un inmunoestimulante es un oligonucleótido inmunoestimulador que contiene dinucleótidos CpG no metilados ("CpG") . CpG es una abreviatura para motivos de dinucleótido de citocina/guanisina presentes en ADN. CpG se conoce en la técnica como siendo un adyuvante cuando se administra tanto por rutas sistémicas como mucosas (WO 96/02555, EP 0468520) . Históricamente, se observó que la fracción de ADN del bacilo de Calmette-Guerin (BCG) podría ejercer efecto anti-tumoral. En estudios adicionales, oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias de genes de CG mostraron ser capaces de inducir efectos inmunoestimuladores (tanto in vi tro como in vivo) . Los autores de estos estudios concluyeron que ciertas secuencias palindrómicas, incluyendo un motivo CG central, portaban esta actividad. Un análisis detallado ha demostrado que el motivo CG tienen que estar en cierto contexto de secuencia, y que estas secuencias son comunes en ADN bacteriano pero son raras en ADN de vertebrado. La secuencia inmunoestimuladores como: purifina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en donde el motivo CG no está metilado, pero otra secuencia CPG se sabe que son inmunoestimuladoras y pueden usarse en la presente invención. En ciertas combinaciones de los seis nucleótidos, una secuencia palindrómica puede estar presente. Varios de estos motivos, ya sea como repeticiones de un motivo o una combinación de motivos diferentes, pueden estar presentes en el mismo oligonucleótido. La presencia de una o más de estas secuencias estimuladoras que contienen oligonucleótidos puede activar varios subconjuntos inmunes, incluyendo células asesinas naturales (las cuales producen interferón ? y tienen actividad citolítica) y macrófagos. Otras secuencias que contienen CPG no metilado que no tienen esta secuencia de consenso también han demostrado ser inmunomoduladoras . Cuando se formulan en vacunas, CpG se administra generalmente en solución libre junto con antígeno libre (WO 96/02555, 68) o conjugado covalentemente a un antígeno (WO 98/16247), o formulado con un vehículo tal como hidróxido de aluminio (antígeno de superficie de hepatitis) . Estos inmunoestimulantes como los descritos arriba pueden formularse junto con vehículos, tales como, por ejemplo, liposomas, emulsiones de aceite en agua y/o sales metálicas, incluyendo sales de aluminio (tales como hidróxido de aluminio) . Por ejemplo, 3D-MPL puede formularse con hidróxido de aluminio (EP 689454) o emulsiones de aceite en agua (WO 95/17210) ; QS21 puede formularse adecuadamente con liposomas que contengan colesterol (WO 96/33739), emulsiones de aceite en agua (WO 95/17210) o alumbre (WO 98/15287); CpG puede formularse con alumbre o con otros vehículos catiónicos . También pueden usarse combinaciones de inmunoestimulantes, tales como una combinación de un lípido A de monofosforilo y un derivado de saponina (WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 98/05355; WO 99/12565; WO 99/11241) o una combinación de QS21 y 3D-MPL como la descrita en WO 94/00153. Como alternativa, también se puede usar en la presente invención una combinación de CpG más una saponina tal como QS21. Así, los sistemas adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, una combinación de lípido A de monofosforilo, tal como 3D-MPL, junto con una sal aluminio. Otra modalidad combina un lípido A de monofosforilo y un derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL como la descrita en WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en donde QS21 es extinguido en liposomas que contienen colesterol (DQ como la descrita en WO 96/33739. Otra formulación adyuvante más que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210. En otra modalidad, se usan oligonucleótidos CpG solos o junto con una sal aluminio. Un adyuvante adecuado para usarse en la presente invención es un adyuvante estimulador Thl preferente, por ejemplo un adyuvante que comprende una saponina tal como QS21 o un derivado de lípido A de monofosforilo tal como 3D-MPL, o un adyuvante que comprende ambos de estos opcionalmente junto con liposomas que contienen colesterol. Una combinación de QS21 y 3D-MPL en una formulación de liposomas que contiene colesterol se describe por ejemplo en WO 96/33739. Las ventajas de la presente invención son múltiples. Virus recombinantes, tales como adenovirus recombinantes, pueden producirse a muy altos títulos usando células que se consideren seguras, y que pueden crecer en suspensión a niveles muy altos, usando medio que no contenga ningún componente derivado de animales o humanos. Asimismo, se sabe que los adenovirus recombinantes desarrollan una dramática respuesta inmune contra la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico heteróloga en el genoma adenoviral . La presente invención combina estas características en un vector que porta el gen de circumsporozoito de P. falciparum con el uso de proteína adyuvada para reforzar respuestas. Más aún, el gen ha sido optimizado en codones para dar un nivel de expresión que sea adecuado para dar una adecuada respuesta inmune en humanos. La presente invención proporciona vacuna contra infecciones de paludismo, haciendo uso de adenovirus que no encuentran altos títulos de anticuerpos neutralizantes. Los adenovirus altamente preferidos para este propósito son serotipo 11 y 35 (Adll y Ad35, véase WO 00/70071 yWO /40665) . El contenido de ácido nucleico entre el patógeno causante de paludismo, tal como P. falciparum y el huésped de interés, tal como Homo sapiens es muy diferente. La invención proporciona ácidos nucleicos optimizados en codones que proporcionan niveles de expresión más altos en mamíferos, tales como humanos . El uso de diferentes entidades para regímenes de cebado/refuerzo como los descritos en la presente proporciona un método de vacunación que ofrece respuestas inmunes adecuadas de brazos tanto celulares como molares del sistema inmunológico. Implica células T CD8+, células T CD4+ y anticuerpos. Ninguna de estas vacunas sola establece una respuesta inmune sostenible que invoque niveles óptimos de células T CD8+, células T CD4+ y anticuerpos específicos de antígenos. Más aún, el orden en el cual los diferentes componentes se administran puede alterar estas respuestas inmunes y puede dar origen a diferentes periodos de protección posible contra infecciones futuras. Los métodos y kits de la presente invención hacen posible desarrollar una respuesta inmune que maneje todas las etapas diferentes del ciclo de vida del parásito en humanos, a partir de esporozoitos y merozoitos de circulación libre a hepatocitos infectados y glóbulos rojos. Más aún, proporciona una protección sostenida contra infección de paludismo durante un periodo de tiempo prolongado. En una modalidad preferida, la invención se refiere al uso de adenovirus recombinantes que son defectuosos en replicación a través de la remoción de al menos parte de la región El del genoma adenoviral, ya que la región El se requiere para los procesos de replicación, transcripción, traducción yempaque de adenovirus recién hechos. Los vectores suprimidos en El generalmente se producen en líneas de células que complementan las funciones El suprimidas. Estas líneas de células y el uso de las mismas en la producción de virus recombinantes han sido descritas extensamente y se les conoce bien en la técnica. De preferencia, células PER.C6®, como las representadas por las células depositadas en ECACC No. 96022940 en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC) en el Centro para Microbiología e investigación Aplicada (CAMR, Reino Unido) , o derivados de las mismas están siendo usadas para prevenir la producción de adenovirus competentes en replicación (rea) . En otra modalidad, se están aplicando células que soportan el crecimiento de adenovirus recombinantes que no son aquellos derivados para el adenovirus serotipo 5 (Ad5). Hágase referencia a publicaciones WO 97/00326, WO 01/05945, WO 01/07571, WO 00/70071, WO 02/40665 y 29 99/55132, para métodos y medios para obtener fondos adenovirales libres de rea para Ad5 así como para otros serotipos de adenovirus, tales como el Ad35 recombinante de replicación defectuosa el cual puede ser producido sobre células HER inmortalizadas con El a partir de Ad35, o células PER.C6® que comprenden además genes El de Ad35 para proporcionar una complementación adecuada de los adenovirus tipo B . Se debe notar aquí que en los documentos publicados WO 00/03029, WO 02/24730, WO 00/70071 y WO 02/40665, Ad50 se llamó erróneamente Ad51. El serotipo Ad51 que fue mencionado en las publicaciones anteriores es el mismo que el serotipo Ad50 en una publicación por De Jong et al. (1999), en donde fue indicado como un adenovirus del grupo B. Por motivos de claridad, Ad50 como se usa en la presente, es el serotipo Ad50 del grupo B como el mencionado por De Jong et al. (1999) . Las vacunas de la presente invención se usan típicamente en escenario de cebado/refuerzo, por ejemplo Ad/proteína; proteína/Ad; proteína/Ad/Ad; Ad/proteína/Ad; Ad/Ad/proteína, Ad/proteína/proteína/proteína, Ad/proteína/vector viral/proteína, etc., etc. Se puede vislumbrar que una combinación con otro kit más de vacuna (tal como ADN desnudo o un vector viral recombinante diferente de adenovirus (pudieron aplicarse en combinación con los agentes de cebado/refuerzo de la presente invención. También se pueden usar antígenos palúdicos adicionales o polipéptidos . Una secuencia es 'derivada' según se usa en la presente, si un ácido nucleico puede obtenerse a través de clonación directa a partir de secuencias tipo silvestre obtenidas de virus tipo silvestre, mientras que pueden por ejemplo también obtenerse a partir de PCR usando diferentes piezas de .ADN como una plantilla. Esto significa también que estas secuencias pueden estar en la forma tipo silvestre así como en forma alterada. Otra opción para alcanzar el mismo resultado es a través de combinar .ADN sintético. Se debe entender que 'derivado' no significa exclusivamente una clonación directa del ADN tipo silvestre. Una persona capacitada en la técnica también estará consiente de las posibilidades de biología molecular para obtener formas mutantes de cierta pieza de ácido nucleico. Los términos 'parte funcional, derivado y/o análogo de la misma' se deben entender como equivalentes de la secuencia de ácido nucleico con la que están emparentados. Una persona capacitada en la técnica apreciará el hecho de que ciertas eliminaciones, cambios, mutaciones (por punto), adiciones, etc., pueden aún dar como resultado una secuencia de ácido nucleico que tenga una función similar a la secuencia de ácido nucleico original, y deben producir un polipéptido similar o incluso idéntico una vez traducidas. Por lo tanto se debe entender que estas alteraciones que no alteran significativamente la funcionalidad de las secuencias de ácido nucleico están dentro del alcance de la presente invención. Si cierto vector adenoviral se deriva de cierto serotipo adenoviral de elección, también se debe entender que el producto final puede obtenerse a través de vías indirectas, tal como la clonación directa y la sintetización de ciertas piezas de ADN genómico, usando metodología bien conocida en la técnica. Ciertas eliminaciones, mutaciones y otras alteraciones del contenido genómico que no alteren los aspectos específicos de la invención se consideran aún parte de la misma. Ejemplos de estas alteraciones son por ejemplo eliminaciones en la estructura de base viral para hacer posible la clonación de piezas más grandes de ácidos nucleicos heterólogos. Ejemplos de estas mutaciones son por ejemplo eliminaciones o supresiones E3 y/o alteraciones en las regiones que codifican para las proteínas E2 y/o E4 del adenovirus. Estos cambios aplicados a la estructura de base adenorival se conocen en la técnica y se aplican comúnmente, ya que espacio es un factor indicativo para que el adenovirus sea empacado; ésta es una razón principal para eliminar ciertas partes del genoma adenoviral. Otras razones para alterar las regiones E2 , E2 y/o E4 del genoma pueden estar relacionadas con la estabilidad e integridad del vector adenoviral, como por ejemplo se describe en WO 03/104467 y WO 2004/001032) . Estas solicitudes se refieren entre otras cosas al uso de un gen E4orf6 de un serotipo de un subgrupo de estructura de base de un adenovirus de otro subgrupo, para asegurar compatibilidad entre la actividad de E4orf6 y la actividad E1B-55K durante la replicación y empaque en una línea de células de empaque. Se refieren además al uso de un promotor pIX de funcionamiento adecuado para obtener niveles de expresión de PIX más altos y un vector adenoviral recombinante más estable. 'De replicación defectuosa' según se usa en la presente significa que los vectores virales no se replican en células no complementarias. En células complementarias, las función es requerida para la aplicación, y de esta manera la producción del vector viral, se proporcionan por la célula complementaria. Los vectores virales defectuosos en replicación de la presente invención no portan todos los elementos que hacen posible la replicación en cualquier célula huésped que no se una a célula de complementación. 'Heterólogo' según se usa en la presente en conjunto con ácidos nucleicos significa que la secuencia de ácido nucleico se deriva de una fuente original diferente a las versiones tipo silvestre de los vectores virales en los cuales se clona el ácido nucleico heterólogo. Por ejemplo en el caso de adenovirus, el ácido nucleico heterólogo que es clonado en el vector adenoviral de replicación defectuosa no es una secuencia de ácido nucleico adenoviral, sino que proviene de cierto otro agente patógeno de interés. 'Heterólogo' según se usa en la presente en conjunto con las estrategias de vacunación de cebado-refuerzo significa que dos o más componentes separados, ejemplificados por un vector de adenovirus no replicante recombinante y una proteína adyuvada se usan en una combinación deliberada, en lugar de que un componente se administre varias veces, como es usual en la industria hasta la fecha. '.Antígeno', según se usa en la presente, significa cualquier antígeno derivado de una fuente que desarrolle una respuesta inmune en un huésped al cual se le suministre (administre) el determinante. El antígeno puede provenir de una fuente externa, por ejemplo, un patógeno, un parásito o incluso ser un auto-antígeno . Ejemplos de antígenos de Plasmodium que pueden suministrarse usando los virus recombinantes defectuosos en replicación de la presente invención son la proteína circumsporozoito (CS) , el polipéptido SE36, polipéptido C-terminal de 19 kDa de la proteína 1 de superficie de merezoito (MSP-lpl9), MSP-1, MPS-lp42, Antígeno 1 de Merozoito Apical (AMA-1) , Antígeno 1 de Etapa Hepática (LSA-19) o antígeno 3 de Etapa Hepática (LSA-3), o un fragmento de cualquier de los mencionados arriba. En un aspecto preferido la invención se refiere a la proteína circumsporozoito (CS) de P. falciparum . 'Optimizado en codones' según se usa en la presente significa que el contenido de ácido nucleico de una secuencia ha sido alterado para soportar niveles de expresión suficientemente altos de la proteína de interés en un huésped de interés al cual se le suministre el gen que codifique para la proteína. Niveles de expresión suficientemente altos en este contexto significa que los niveles de proteínas deben ser lo suficientemente altos como para desarrollar una respuesta inmune en el huésped para de esta manera protegerlo contra infección o contra enfermedades. Se sabe en la técnica que ciertas vacunas dan una respuesta inmune en humanos, a través de la cual aproximadamente 60% de los individuos vacunados son protegidos contra enfermedades inducidas por ataques subsecuentes con el patógeno (por ejemplo, esporozoitos) . Por lo tanto, los niveles de expresión se considera que son suficientes si 60% o más de los individuos tratados son protegidos contra infecciones subsecuentes. Se cree que con las combinaciones de aspectos adenovirales que pueden aplicarse y la elección de antígeno como se describe en la presente, estos porcentajes pueden ser alcanzados. De preferencia, el 85% de los individuos son protegidos, aunque se prefiere más tener una protección a un ataque subsecuente en más del 90% de huéspedes vacunados. Los ácidos nucleicos descritos en la presente invención son optimizados en codones para su expresión en humanos. De acuerdo con Narum et al. (2001), el contenido de adenina más timina (A+T) en ADN de Homo sapiens es de alrededor de 59%, en comparación con el porcentaje de citocina más guanina (C+G) . El contenido de adenina más timina en P. falciparum total es de aproximadamente 80%. El contenido de adenina más timina en el gen CS de P. falciparum es de alrededor de 87%. Para obtener una protección suficiente se cree que es necesario mejorar los niveles de producción en el huésped. Una forma de lograr esto es el uso de codones para mantener la misma secuencia de aminoácidos final, pero usar secuencias más típicas de la expresión en mamíferos. Para esto, los vectores virales recombinantes defectuosos en replicación de acuerdo con la invención tienen un contenido de adenina más timina en los ácidos nucleicos heterólogos de la presente invención de menos 87%, de preferencia menos de 80% y muy preferiblemente menos de o igual a aproximadamente 59%. Con base en el uso de codones en humano y el contenido de aminoácidos de los genes CS de P. falciparum y yoelii , los porcentajes de los genes optimizados en codones fueron todavía más bajos, alcanzando alrededor de 45% para el contenido de aminoácidos como el descrito por la presente invención. Por lo tanto, en cuanto a los genes CS involucra se prefiere tener un contenido de adenina más timina de aproximadamente 45%. Se debe entender que si otras especies no humanos van a ser tratadas, las cuales pueden tener una concentración diferente de adenina más timina (menos o más de 59%) , y/o un uso de codones diferentes, que los genes que codifican para la proteína CS de la presente invención pueden ser ajustados para adaptarse al contenido requerido y dar origen a niveles de expresión adecuados para un huésped particular. Por ejemplo, no se puede excluir tampoco que ligeros ataques en contenido pudieran resultar en cambios a nivel de expresión ligeros en diferentes áreas geográficas alrededor del mundo. Se debe entender también que los ligeros cambios en el número de repeticiones incluidas en la secuencia de aminoácidos de las proteínas, qué porcentajes pueden diferir en consecuencia. Otros antígenos de interés pueden modificarse similarmente. Todos estos contenidos ajustados forman parte de la presente invención. La proteína designada RTS,S es una proteína de fusión que consiste en la mitad C-terminal de la proteína CS de P . falciparum (17 de las repeticiones NANP centrales más la mayoría de la porción C-terminal) expresada como una proteína de fusión con el antígeno de superficie de la hepatitis B. Una de las diferentes ventajas ofrecidas por vectores adenovirales incompetentes a replicación es la menor patogenicidad de los virus progenitores y la falta documentada de enfermedad significativa causada por estos vectores en cualquier individuo, incluyendo aquellos que no sean inmunosuprimidos . El trabajo en el modelo de paludismo en ratón, P. yoelii , indicó que construcciones de adenovirus recombinante que expresaban la proteína CS no sólo engendran sorprendentes respuestas inmunes celulares, sino que también proporcionan una excelente protección contra infecciones. Por lo tanto, en un esfuerzo por mejorar la intensidad de la respuesta a células T y la longevidad de la respuesta inmune total a CS, los inventores de la presente invención decidieron combinar un enfoque adenoviral con el enfoque de proteína recombinante en una nueva estrategia heteróloga de cebado-refuerzo. Desafortunadamente, el ratón no es el modelo ideal para predecir respuestas en humanos. Esto es particularmente cierto para el adenovirus 35 (Ad35). El vector incompetente en replicación estándares del adenovirus 5 (Ad5) , el cual ha demostrado ciertos problemas con optimizar sus capacidades vectoras debido al carácter endémico ampliamente difundido de este virus y al hecho de que una proporción sustancial de la mayoría de las poblaciones humanas virales tienen inmunidad preexistente al virus progenitor. Ad35 obtiene el potencial de demostrar utilidad incrementada con un vector de vacuna. La disponibilidad de construcciones que porten tanto Ad5 como Ad35 CS permitió la evaluación de inmunizaciones adenovirales heterólogas secuenciales con diferentes construcciones específicamente para la cuestión de inmunidad de CS . Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígenos más potentes en el cuerpo, y el hecho de que tanto AD5 como Ad35 se dirijan a DC humano, es uno de los aspectos de su biología que los hace tan excelentes vectores de vacuna. Sin embargo, sólo Ad5 infecte eficientemente DC de murino; Ad35 sólo infecta confiablemente DC de primate. Así, aunque las preguntas de potencia básica acerca de las construcciones de Ad35 pueden contestarse en modelos de animales pequeños, las preguntas de inmunogenicidad reales que implican Ad35 sólo pueden preguntarse en primates no humanos. Los inventores decidieron examinar las combinaciones cebado-refuerzo de RTS,S con vectores adenovirales que contenían el gen CS para determinar si las respuestas celulares y/o humorales contra el paludismo serían una mejora sobre las respuestas observadas en RTS,S solo. Además, se optimizó un régimen para dos dosis de vacuna de adenovirus sola. Ejemplo Vacunación heterológa de cebado/refuerzo usando vectores adenovirales recombinantes y proteína adyuvada purificada en monos rhesus Los objetivos del experimento fueron evaluar RTS,S, seguido por Ad35, y Ad35 seguido por RTS,S, en una comparación directa con un régimen de inmunización estándar de RTS,S de tres dosis y un régimen de Ad35 de dos dosis estándar. Un objetivo secundario fue optimizar el régimen de adenovirus de dos dosis. Las respuestas inmunes serológicas y celulares durante y después de varios regímenes diferentes de estas construcciones en combinación fueron estudiadas. El mono rhesus (Marca mulata) es un excelente modelo para la respuesta inmune humana debido a su relación filogenética mucho más cercana. Alelos MHC clase II son particularmente bien conservados; la generación de algunos alelos compartidos se calcula de hace 25 millones de años, antes de la fecha de determinación de especie de humano y rhesus. Así, existe un uso de epítopes similares en presentación de antígeno a células Th, lo cual incrementa ampliamente el valor predictivo del modelo. Más importantemente, en el modelo de mono Rhesus en el pasado ha probado ser altamente productivo de las respuestas inmunogenicidad humanas tanto para antígenos de paludismo como para VIH, otra enfermedad humana para la cual el desarrollo de una vacuna ha sido obstaculizado por la complejidad de la respuesta inmune. Experimentos preliminares ya han sido llevados a cabo con construcciones adenovirales-CS de P. yoelii de paludismo en ratón que demostraron excelente inmunogenicidad y eficacia protectora. Sin embargo, el largo historial de intentos no exitosos por extrapolar directamente a partir del modelo de paludismo en ratón a humanos en la búsqueda del desarrollo de vacunas contra paludismo por P. falciparum obliga a una etapa intermedia en un modelo de primate no humano. El macaco rhesus representa la mejor elección de especie toda vez que tiene una extensa base de datos de información anterior sobre estas vacunas en esta especie, gracias a la proximidad filogenética a los humanos, debido a que su tamaño permite muestras de sangre de suficiente volumen para asegurar una evaluación adecuada de respuestas inmunes y debido a que los reactivos y ensayos existen que están ya optimizados para esta especie y de esa forma no requieren protocolos auxiliares y muchos años de desarrollo. Además, las construcciones 35 de adenovirus sólo pueden probarse adecuadamente en primates no humanos, debido la incapacidad de este virus para invadir eficientemente en las células dendríticas de otros mamíferos. Las construcciones y la producción de los adenovirus recombinantes de replicación defectuosa que portan el gen que codifica para CS de P. falciparum (Ad5Cs y Ad35CS) usadas en este estudio han sido descritas en gran detalle en los ejemplos de WO 2004/055187 (clon 02-659; véase figura 2 en el mismo) . Brevemente, estos adenovectores comprenden un gen heterólogo que codifica para la proteína CS con una secuencia de aminoácidos que es similar a la proteína CS de la cepa NF54, clon 3D7, que tiene entre otros, una secuencia de señal N-terminal, 27 repeticiones NANP, un racimo de 3 repeticiones NVDP y una repetición ?VDP separada, el epítope universal (Lockyer et al. 1989; Zevering et al. 1994; ?ardin et al. 2001) y una eliminación de los últimos 14 aminoácidos (en el término C) . La diferencia con la proteína de RTS,S es que RTS,S carece de la secuencia de señal ?-terminal, y una gran población de la región de repetición, así como la mayoría de la secuencia de señal de ancla GPI localizada C-terminalmente la cual también está ausente en las construcciones adenovirales. El experimento fue un estudio de seguridad e inmunogenicidad ciego y clasificado aleatoriamente de varias combinaciones y estrategias de regulación de tiempo para la optimización de estrategias de cebado-refuerzo de RTS,S con construcciones que portaban CS de Ad5 y Ad35 (Ad5CS y Ad35CS) y para la optimización de Ad5CS y AD35CS solo. El mejor régimen anterior contra el cual las nuevas estrategias se compararon fueron las tres dosis intramusculares de 50 µg de RTS,S con adyuvante dado a 0, 1 y 3 meses. Esto fue el grupo 1, el grupo de control positivo. Todos los grupos se detallan en la tabla ÍA. En todos los casos el adyuvante estuvo formado de 50 µg de 3D-MPL, 50 µg de QS21, en una formulación con liposomas que contenían colesterol como la descrita en WO 96/33739. El grupo 2 recibió dos dosis de RTS, S/adyuvante en el mes 0 y 1 seguida por una dosis de Ad35CS luego de 3 meses. El grupo 3 recibió una dosis de Ad35CS el mes 0 seguida por dos dosis de RTS, S/adyuvante luego de 1 y 3 meses. Los grupos 4, 5 y 6 sólo recibieron construcciones adenovirales. Experiencia anterior con dos dosis de construcciones de adenovirus 5 en diferentes enfermedades indicaron que las respuestas inmunes serológicas y celulares óptimas se obtienen cuando el intervalo entre las inmunizaciones es de al menos 6 meses. Debido a la necesidad de evaluar construcciones Ad35 en humanos o primates no humanos, el tiempo óptimo entre dosis para este vector aún no fue establecido. Así, el grupo 4 recibió dos dosis de Ad35CS en un programa de 0, 3 meses (para un control directo a los grupos de proteínas) y el grupo 5 recibió dos dosis en un programa de 0 , 6 meses. Para poder evaluar la pregunta de si dos dosis de la misma construcción de adenovirus eran inferiores a la alternancia de construcciones para la proteína CS, el grupo 5 se comparó con el grupo 6, el cual recibió Ad5CS seguido por Ad35CS en el programa de meses 0, 6. Finalmente, el grupo de control 7 obtuvo dos dosis de Ad35 simple (sin inserto de gen de paludismo) en los meses 0 y 3 para servir como un grupo de control de inmunización para evaluaciones de inmunogenicidad. Los sitios de inyección fueron sujetados y claramente marcados para facilitar la observación de la reactogenicidad de la vacuna. Además, los animales fueron sedados y el sitio de inyección se examinó directamente para señales de induración, hinchazón, calor, enrojecimiento u otra anormalidad 24, 48 y 72 horas y 7 y 14 días luego de la inyección. Aunque las señales de toxicidad sistémica no fueron esperadas, los animales también fueron sedados y examinados en estos puntos de tiempo para linfadenopatía, celulitis, abscesación, artritis, anorexia y pérdida de peso, y sus valores de química hematológica y clínica fueron monitoreados para alteraciones. Se tomó sangre en el momento de la inyección y 24, 48, 72 horas y 7 y 14 días después de cada inyección para un conteo hemático completo (CBC) y para un panel de ensayos de química clínica que incluía (pero no necesariamente limitado a) determinación de BUN, creatinina, AST, ALT, GT y CK. Muestras fecales para confirmar la ausencia de un derrame de vectores no replicativos se tomaron y guardaron a -70 aC cada uno de los días 0-10 para cada inyección de adenovirus, para pruebas de adenovirus subsecuentes . Uno a tres mililitros de suero se recogieron en el momento de y 1, 2 y 4 semanas después de cada inyección, y al menos una vez al mes posteriormente para determinar la naturaleza y magnitud de la respuesta de anticuerpo de CS R32 (la región de repetición de la proteína CS usada para desarrollar el ensayo ELISA estandarizado a la proteína CS, véase abajo) mediante ELISA. Las muestras de suero se almacenaron a -70 SC hasta usarse, y las muestras se procesaron por lotes cerca del final del experimento para minimizar la variabilidad entre ensayos. Volúmenes de suero tomados fueron adecuados por lo que por cada inyección de adenovirus, 0.5-1.0 ml de suero a partir del día 0, 1, 7 y 14, y al menos cada 4 semanas posteriormente pueden usarse para la determinación del título de anticuerpos anti-adenovirus. Grandes volúmenes (20-40 ml) de sangre anti-coagulada con EDTA o heparina se tomaron para cosechas de células antes de la primera inmunización, 4 semanas después de la segunda inmunización (si las demandas de volumen lo permiten) , 4 semanas después de la tercera inmunización y 6 meses después de la tercera inmunización. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron concentradas a partir de estas muestras usando métodos estándares por separación de centrifugación de densidad. Aunque los rendimientos de células pueden ser altamente variables de un animal a otro, en general entre más grande el volumen de la muestra, mayor el número de células recuperadas. Debido a que es imposible predecir la exacta recuperación de células, se prefiere tomar una muestra más grande cuando sea posible de tal forma que suficientes células se obtengan para repetir ensayos con motivos de validez estadística. Las células fueron congeladas para permitir el procesamiento intermitente en un punto de tiempo posterior y de esta manera mejorar el control de calidad. Las células fueron congeladas en suero autólogo con 10% de DMSO a una velocidad de reducción de temperatura controlada y se almacenaron en nitrógeno líquido en fase de vapor durante al menos una semana antes de usar. De los animales más grandes cuyos datos CBC indicaron que hubieran tolerado bien, una muestra adicional para cosecha de células se tomó después del cebado, pero antes del refuerzo. Ya que hubieron 14 monos (dos grupos) que recibieron dos dosis de RTS, S/adyuvante y 14 monos que recibieron una sola dosis de Ad35CS antes de la 8a semana, se esperó muestrear al menos la mitad y de esta manera mantener significatividad estadística. Las cosechas de células ocurrirían no antes de 4 semanas después de una inyección. Ya que los grupos que sólo obtenían construcciones de adenovirus recibieron sólo dos inyecciones, y de esta manera tienen un programa de sangrado menos demandante que los monos que recibieron tres inyecciones, se esperó que una cosecha de células intermedia entre dos inyecciones no presentara problemas . Los análisis de respuestas inmunes celulares incluyeron ensayos ELISPOT de corto plazo para la cuantificación de células productoras de IFN-? específico de antígeno. El análisis citométrico de flujo de células estimuladas por antígeno no sólo confirma los datos acumulados en los análisis ELISPOT, sino proporciona también información adicional acerca del fenotipo de las células específicas de antígeno que están respondiendo. Así, la determinación del subconjunto de secreción de IFN-? de CD8+ específico de antígeno por tinción intracelular y citometría de flujo también se investiga. Ensayos adicionales que se llevan a cabo incluyen análisis ELISPOT globales para citocinas adicionales, tinción intracelular para la enumeración de subconjunto de células T de citocinas adicionales, otros ensayos a base de citometría de flujo para cuantificación de la producción de citocinas de subconjunto de células T específicas de antígenos y RT-PCR para la correlación cuantitativa con los demás métodos. Los monos fueron divididos en grupos que coincidían uniformemente para edad, sexo, peso y origen geográfico, y los grupos fueron después clasificados aleatoriamente. Todas las evaluaciones clínicas y determinaciones de puntos finales de seguridad se determinaron sin el conocimiento de la asignación de grupo de los monos. Similarmente, todos los ensayos inmunológicos se llevaron a cabo sin conocimiento anterior de los grupos a los cuales pertenecían las muestras individuales. La excepción a esta política de ceguera fueron los animales que recibieron inmunizaciones en un programa de mes 0 y 6 a diferencia de 0 , 1 y 3; sin embargo, la ceguera se mantuvo en cuanto a la inyección específica que se estaba dando .

Un tamaño de grupo de siete animales por grupo de prueba (y cuatro en el grupo de control) es ideal para minimizar el tamaño del grupo pero para detectar aún precisamente las diferencias entre grupos, con base en datos anteriores de experimentos similares pero sólo distintamente relacionados . La media geométrica de resultados de los ensayos ELISA se comparó paramétricamente usando análisis estándares tales como la prueba T del estudiante, asumiendo una variación igual y dos colas, y ANOVA. Los resultados de los ensayos ELISPOT, expresados en puntos por 200,000 células, fueron tratados similarmente y también se les examinó usando análisis no paramétricos tales como la prueba de Kruskal-Wallis. Cuando las comparaciones entre grupos se requieren, la prueba T del estudiante, en bruto o los datos transformados por logaritmo, se usan para determinar diferencias entre cualquier par de grupos. Antes de la inyección, el cabello fue sujetado y la piel limpiada con alcohol de frotación al 70%, y un círculo de 2.5-3 cm se dibujó sobre la piel con tinta indeleble para facilitar la ubicación del sitio de inyección para la palpación y evaluación de reactogenicidad subsecuentes. Inyecciones de RTS,S fueron mezcladas con el adyuvante inmediatamente antes de ingresar en el corredor del mono. El volumen de inyección final fue de 0.5 ml y se suministró a través de una aguja calibre 25-29 al interior de la musculatura del muslo. Las construcciones de adenovirus fueron preparadas como se describe en (WO 2004/055187) en solución salina de pH regulado y también se administraron en la misma ubicación intramuscular en un volumen final de 0.5 ml. La biomuestra primaria fue sangre, ya sea para suero o células. Un programa de sangrado se delinea en la tabla IB. El estado patológico de los animales se monitoreó; indicando la capacidad de un individuo para mantener un biomuestreo repetido o significando que el programa de biomuestreo planeado es reducido. Cada vez que se tomó sangre, un conteo hemático completo (CBC) se llevó a cabo con un contador de células hemáticas automatizado Coulter (requiriendo <50 µl de sangre no coagulada) . Los lineamientos tipo GLP recomendados por el fabricante para el mantenimiento y actualización se llevaron a cabo. Hematocrito, hemoglobina, volumen corpuscular medio (MCV) , conteo de glóbulos rojos (RBC) y porcentaje de reticulocitos fueron seguidos estrechamente para evaluar que los animales no se volvieran anémicos . Sangre venosa se tomó de las venas femoral, safena o cefálica usando agujas calibre 20-24 y ya sea jeringas o tubos de vacío. En general, las venas safena o cefálica se prefirieron para las extracciones de sangre de menos de 10 ml, y las venas femorales se prefirieron para evitar hemolisis y acortar el tiempo de venipuntura total cuando volúmenes de más de 10 ml fueron removidos. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC's, por sus siglas en inglés) se cosecharon a los animales antes de la inmunización, dos semanas después de la inmunización final y tres meses después de la inmunización final. En este protocolo, las PBMC's se separaron mediante métodos estándares de centrifugación de densidad, y se criopreservaron en suero autólogo al 45% (45% de solucipn salina y 10% de DMSO) . Brevemente, sangre entera fue estratificada sobre medio de separación de células Ficoll-hypaque Ly phoprep® (Axis-Shield, Oslo, Noruega) y se centrifugó a 650 g durante 20 minutos. La capa de células se removió y se lavó en dos lavados de dPBS (BioWhittaker, Walkersville, MD) a 400 g durante 15 minutos. Las células viables se contaron usando un hemocitómetro Coulter ACT*10. Los granulos se resuspendieron a lxl07/ml en 50% de dPBS, 50% de solución salina. También se añadió por goteo DMSO hasta un volumen final de 10%. Las células fueron congeladas en alícuotas de 0.55 ml de exactamente 5 millones de células cada una al colocarlas en un baño de isopropanol de reducción de temperatura controlado en el congelador a -702C durante la noche, y se almacenaron en fase de vapor de nitrógeno líquido hasta usarse.

Luego de la última vacunación, células T secretoras de interferón gama (IFN-?) en muestras de sangre de los diferentes monos se identificaron con el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISpot) después de la estimulación con antígenos enteros y fondos de péptidos específicos C- y N-terminales (como los descritos en detalle abajo) . Los resultados se grafican en la figura 1 (2 semanas después de la última vacunación) y figura 2 (3 meses después de la última vacunación) , y se expresan en la tabla 2 y 4, respectivamente, como unidades formadoras de punto medias por millón de células (SFU) ; una comparación estadística se llevó a cabo usando análisis de variación (ANOVA) en daos transformados por logaritmo. Todos los grupos fueron comparados. En caso de que una significación estadística se determinara un análisis post-hoc puede llevarse a cabo para una comparación de grupo por grupo (resultados no mostrados) . Para comparar los resultados de ELISpot entre diferentes estrategias de tratamiento, relaciones de títulos geo medios fueron calculadas para estrategias con Ad35 como tratamiento de cebado. En estas relaciones el título geo medio obtenido con tratamiento con RTS,S solo (a 0, 2, 3 meses) se tomó como tratamiento de referencia (figura 5 y 6, y tabla 10) . Similarmente, las relaciones se calcularon también para estrategias con Ad35 como tratamiento de refuerzo (figura 7 y 8, y tabla 11) .

Análisis similares se llevaron a cabo para los resultados de los ELISpots de células T de estimulación específicas del término N. Los resultados se grafican en las figuras 9 y 10, y en las tablas 12 y 14, respectivamente. Finalmente, se calcularon las relaciones que se presentan en la figura 11 (estrategias de cebado con Ad35) y figura 12 (estrategias de refuerzo con Ad35) , y tablas 16 y 17, respectivamente . Se llevaron a cabo ELISpots en PBMC's criopreservadas descongeladas en placas para ELISpot MultiScreen-IP con fondo de PVDF (Millipore, Bedford, MA) usando metodología estándar. La técnica estéril se siguió estrictamente hasta que las células fueran removidas el día 2 para un desarrollo de puntos final. Medios usados: Medio completo (cRPMI) se preparó frescamente de RPMI-1640 (BioWhittaker, Walkersvile, MD) con la adición de 1:100 de penicilina/estreptomicina, 1:100 de L-glutamina, 1:200 de NaHC03 (Sigma, St . Louis, MO) , 1:100 de aminoácidos no esenciales, 1:10 de piruvato y 1:300 de 2-ME (Gibco) . Suero de becerro fetal (FCS, HyClone, Logan, UT) , de un lote caracterizado previamente mediante ensayo de proliferación específico para soportar un adecuado crecimiento de células de mono aún proporciona muy poco fondo estimulador, se añadió a un volumen final de 10% para Crpmi-10, 20% para Crpmi-20, ETC. Media-plus (M+) fue complementado adicionalmente con anticuerpos CD28 anti-mono y CD49D anti-mono a 1:500 (BD Pharmingen, San José, CA) . Los siguientes estimulantes se prepararon frescos dos veces a la concentración final deseada en M+ sin suero añadido : Con A: Concanavalina A (Sigma) a 2.5 µg/ml (final 1.25 µg/ml) como un control positivo para todos los frascos. CS-C: un fondo de polipéptidos de 15 meros, que se traslapa por 11 aminoácidos, que cubre la porción C-terminal de la molécula de PfCS (suministrado por GSK, Rixensart, Bélgica) a 2.5 µg/ml de cada péptido (1.35 µg/ml final). CS-N: un grupo similar de péptidos de 15 meros, que se traslapa por 11, que cubre el término N de la molécula PfCS. RTS , S : antígeno de complejo de proteína entera purificado RTS,S adecuado para cultivo de células (GSK) a 2 µg/ml (1 µg/ml final). HEF : proteína entera de antígeno superficial de hepatitis B purificado (hbS) (el componente "S" de RTS,S), también adecuada para el cultivo de células (GSK) a 23.2 µg/ml (11.6 µg/ml final). HbS-P: un fondo de péptidos HbS de 15 meros (GSK) a 2.5 µg/ml cada péptido (1.25 µg/ml final). El control negativo fue M+ sin suplementación adicional.

Las placas se prepararon como sigue. Las placas se recubrieron con 50 µl/pocillo de una dilución 1:100 en dPBS estéril del anticuerpo IFN-? anti-mono monoclonal primario (UcyTech #21-43-09, Utrecht, los Países Bajos), y se incubaron en una bolsa de plástico a 4SC durante 5-6 horas. 1 Hora antes de usar, el anticuerpo de recubrimiento se removió y la placa se bloqueó con cRPMI-10 en una incubadora de cultivo de células de humedad controlada por 5% de C02 y 379C. Inmediatamente antes de usar, se removió el medio de bloqueo. Descongelación de PBMC crioconservadas : Frascos congelados fueron revueltos en agua de la llave caliente (37-402C justo antes de ser casi descongelados, y los contenidos de 0.55 ml se transfirieron inmediatamente a 8 ml RPMI-20. Las células fueron lavadas a 350 g durante 13 minutos, y el granulo se resuspendió cuidadosamente en 2.0 ml de cRPMI-20. Una alícuota estéril de 40 µl se removió después para confirmar números de células viables, y el volumen se ajustó como fura necesario para producir una sola suspensión de células de 2xl06 células/ml. Pre-estimulación: Volúmenes iguales de suspensión de células en cRPMI-20 y estimulantes en M+ fueron mezclados en tubos de cultivos de células con polipropileno para dar la concentración deseada final de todos los reactivos . Las células se almacenaron después en incubadora durante al menos horas, con tapas flojas y en posición inclinada para facilitar el intercambio de gas. Estimulación final: Después de 5-6 horas de incubación, las células fueron centrifugadas a 400 g durante 10 minutos y los sobrenadantes se descartaron. Las células fueron después inmediatamente resuspendidas de nuevo en medio cRPMI-20 y medio estimulante. Después fueron regresadas a la incubadora durante 10-20 minutos para permitir la estabilización del pH. Luego, las células se mezclaron brevemente y 200 µl (200,000 células) se pipetearon cuidadosamente en los pocilios adecuados sobre las placas bloqueadas y vacías. Se tuvo cuidado en todas las etapas de estimulantes que los pocilios no se secaran. Las placas se incubaron después sin alteración durante la noche (>16 h) . Desarrollo de puntos: Una dilución 1:100 de anticuerpo anti-ratón-IFN-? policlonal secundario (UcyTech) se hizo en dPBS con 2% de FCS. Las células y medios fueron retirados de la placa; los pocilios se lavaron 8 veces con dPBS-0.5% de Tween 20 (Sigma) y se cargaron con 50 µl mediante cuerpo secundario diluido. Las placas se incubaron sobre un panel oscilatorio durante tres horas a temperatura ambiente en una bolsa de plástico. Las placas se lavaron nuevamente 8 veces con dPBS-0.5% de Tween 20 y se cargaron con 50 µl/pocillo de una dilución 1:1,000 de conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Southern Biotech #7100-04, Birmingham, AL) . Las placas se incubaron después durante 2 horas más a temperatura ambiente en un bolsa de plástico sobre un panel oscilante. Finalmente, las placas se lavaron 8 veces como arriba, seguidas por un solo lavado con agua destilada y adición de 100 µl/pocillo de substrato NBT-BCIP cromogénico (Pierce Biotech, Rockford, IL) . Se dejó que se desarrollara un color durante 10-20 minutos, hasta que el fondo fuera negro. Las placas se enjuagaron después con al menos dos lavados de 300 µl de agua destilada, y se secaron al aire durante la noche antes de la lectura. Lectura de las placas : Las placas fueron leídas en un lector AID ELHR01 Elispot usando AID ELISpot Reader v3.1.1. Todos los pocilios se examinaron visualmente, y los conteos de puntos inadecuados (pelusa u otros restos) se excluyeron manualmente. Los datos se guardaron en una hoja de cálculo Excel. Pocilios duplicados o triplicados fueron promediados, y este número se multiplicó por 5 para producir los datos brutos finales en puntos/millones de células. Control de calidad: la recuperación de células viable promedio después de congelación/descongelación excedió 95%. Se repitieron las corridas si los pocilios de control de medio promediaron más de 20 puntos/millón, o si las colonias ConA eran menos de 500 puntos/millón. Asimismo, en general, la viabilidad de CD4+ y CD8+, evaluada usando citometría de flujo con la exclusión de tinte 7-AAD y tinción de superficie, tuvieron todas que exceder 90% o se repetía la corrida (datos no incluidos) . La tabla ÍA muestra los resultados del régimen experimental para el régimen de cebado/refuerzo en monos rhesus usando vectores adenovirales recombinantes a base de serotipos 5 y 35 que comprenden el gen que codifica para la proteína CS de P. falciparum, y los RTS,S adyuvados como el componente de antígeno proteináceo. Tabla ÍA La tabla IB muestra un programa de toma de sangre.

Cosechas de CBC y células requieren de sangre entera; química y ELISA' s requieren suero. Se asume que 1 ml de suero representa 2 ml de sangre entera. Sólo volúmenes de sangre entera son indicados. Las escalas indican cuando muestras más grandes pueden ser tomadas de monos más grandes . En la columna CBC/Quim, "0.5" indica sólo CBC llevado a cabo en esos días . * Indica que no todos los monos sangraron en este punto de tiempo.

Tabla IB En las siguientes tablas, RTS,S es referido simplemente como "RTS". La tabla 2 muestra los resultados de inmunidad de células T específicas de PfCS C-terminal dos semanas después del refuerzo: media y media geométrica IFN-? ELISpot (en SFU/millones de células) y comparación ANOVA. Se dan diferentes regímenes cebado/refuerzo (izquierda) .

Tabla 2 La tabla 3 es una prueba T del estudiante. Valores p para comparación ELISpot de IFN-? específico de PfCS C- terminal, como se muestra en la tabla 2, dos semanas después del refuerzo (última vacunación) .

Tabla 3 La tabla 4 muestra la inmunidad de células T de IFN-? específicas de la terminal C tres meses después del refuerzo: ELISpot media y media geométrica (en SFU/millones de células) y comparación ANOVA. Se dan diferentes regímenes de cebado/refuerzo (izquierda) .

Tabla 4 La tabla 5 es una prueba T del estudiante. Valores p para comparación ELISpot, como se muestra en la tabla 4, tres meses después del refuerzo (última vacunación) .

Tabla 5 La tabla 6 muestra la inmunidad de células B (título de anticuerpos anti-repetición) dos semanas después del refuerzo final: título de ELISA media y media geométrica y comparación ANOVA. Se dan diferentes regímenes cebado/refuerzo (izquierda) . Tabla 6 La tabla 7 es una prueba T del estudiante. Valores p para comparación de anticuerpos, como se muestra en la tabla 6, dos semanas después del refuerzo (última vacunación) .

Tabla 7 La tabla 8 muestra la inmunidad de células B (título de anticuerpos) tres meses después del refuerzo relacionado con CS de P. falciparum-. ELISA media y media geométrica (en SFU) y comparación ANOVA. Se dan diferentes regímenes cebado/refuerzo (izquierda) . Tabla 8 La tabla 9 es una prueba T del estudiante. Valores p para comparación de anticuerpos, como se muestra en la tabla 8, tres meses después del refuerzo (última vacunación). Tabla 9 La tabla 10 muestra la relación* de medias geométricas. Respuestas de células T y B. Se usa Ad35 como una vacuna cebadora . Tabla 10 * RTS, RTS, RTS como referencia La tabla 11 muestra la relación* de medias geométricas. Respuestas de células T y B. Se usa Ad35 como una vacuna de refuerzo. Tabla 11 RTS, RTS, RTS como referencia La tabla 12 muestra los datos de inmunidad de células T de IFN-? específicas de PfCS terminal N dos semanas después de vacunación final : ELISpot media y media geométrica (en SFU/millones de células) y comparación ANOVA . Se dan diferentes regímenes cebado/refuerzo (izquierda) . Tabla 12 La tabla 13 es una prueba T del estudiante. Valores p para comparación ELISpot, como se muestra en la tabla 12, dos semanas después del refuerzo (última vacunación) . Tabla 13 La tabla 14 muestra los datos de inmunidad de células T de IFN-? específicas de PfCS terminal N tres meses después de vacunación final: ELISpot media y media geométrica (en SFU/millones de células) y comparación ANOVA. Se dan diferentes regímenes cebado/refuerzo (izquierda) .

Tabla 14 La tabla 15 es una prueba T del estudiante. Valores p para comparación ELISpot, como se muestra en la tabla 14, dos semanas después del refuerzo (última vacunación) . Tabla 15 La tabla 16 muestra la relación* de respuesta de células T media geométrica contra el término N de PfCS. Se usa Ad35CS como una vacuna de refuerzo. Tabla 16 * RTS, RTS, RTS como referencia La tabla 17 muestra la relación* de respuesta de células T media geométrica contra el término N de CS. Se usa Ad35CS como una vacuna de refuerzo. Tabla 17 * RTS, RTS, RTS como referencia REFERENCIAS Bruna-Romero 0 et al. (2001) Complete, long-lasting protection against malaria of mice primed and boosted with two distinct viral vectors expressing the same plasmodial antigen. Proc Nati Acad Sci USA 98:11491-11496. Caspers P et al. (1989) The circumsporozoite protein gene from NF54, a Plasmodium falciparum isolate used in malaria vaccine triáis. Mol Biochem Parasitol 35:185-189. Clyde DF et al. 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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un kit de partes caracterizado porque comprende: un adenovirus recombinante de replicación defectuosa en un excipiente farmacéuticamente aceptable, el adenovirus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno de circumsporozoito (CS) de un parásito causante de paludismo y - un antígeno proteináceo adyuvado, en donde el adenovirus recombinante se selecciona del grupo que consiste en adenovirus humano serotipo 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 y 50.
2. El kit de partes de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el adenovirus recombinante es adenovirus humano serotipo 35.
3. El kit de partes de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el antígeno proteináceo comprende una proteína CS, o un fragmento inmunogénico de la misma, de un parásito causante de paludismo .
4. El kit de partes de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antígeno proteináceo comprende una proteína híbrida de proteína CS o un fragmento inmunogénico de la misma fusionado al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) , en forma de partículas de lipoproteína con HBsAg.
5. El kit de partes de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el antígeno proteináceo comprende RTS,S.
6. El kit de partes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el antígeno proteináceo es adyuvado con un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL.
7. El kit de partes de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el adyuvante comprende además liposomas que contienen colesterol.
8. El kit de partes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el parásito causante de paludismo es Plasmodium falciparum.
9. El kit de partes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el ácido nucleico heterólogo es optimizado en codones para una producción incrementada de la proteína codificada en un mamífero, de preferencia un humano.
10. El kit de partes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el adenovirus recombinante está presente en una mezcla con un adyuvante.
11. Un kit de partes caracterizado porque comprende: un adenovirus simiano, canino o bovino recombinante y de replicación defectuosa en un excipiente farmacéuticamente aceptable, el adenovirus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno de circumsporozoito (CS) de Plasmodium falciparum optimizado en codones y un antígeno proteináceo adyuvado que comprende RTS , S .
12. El kit de partes de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el antígeno proteináceo es adyuvado con un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL.
13. El kit de partes de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el adyuvante comprende además liposomas que contienen colesterol.
14. El kit de partes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el adenovirus recombinante de replicación defectuosa es una composición cebadora y el antígeno proteináceo adyuvado es una composición de refuerzo.
15. Uso de un adenovirus recombinante de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno CS de un parásito causante de paludismo, y un antígeno proteináceo adyuvado, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de paludismo, en donde el adenovirus recombinante es un adenovirus simiano, canino o bovino, o un adenovirus humano serotipo 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 ó 50.
16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el adenovirus recombinante de replicación defectuosa se usa como una composición cebadora y el antígeno proteináceo adyuvado se usa como una composición de refuerzo.
17. El uso de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, en donde el antígeno proteináceo comprende una proteína CS, o un fragmento inmunogénico de la misma, de un parásito causante de paludismo.
18. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde el parásito causante de paludismo es Plasmodium falciparum .
19. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde el antígeno proteináceo comprende una proteína híbrida de proteína CS o un fragmento inmunogénico de la misma fusionado al antígeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg) , en forma de partículas de lipoproteína con HBsAg.
20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde el antígeno proteináceo adyuvado comprende RTS,S.
21. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde el antígeno proteináceo es adyuvado con QS21 y 3D-MPL.
22. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en donde el ácido nucleico heterólogo es optimizado en codones para una producción incrementada de la proteína codificada en un mamífero, de preferencia un humano.
23. Un método para vacunar un mamífero contra una infección de paludismo, caracterizado porque comprende las etapas de: - cebar al animal con un adenovirus recombinante de replicación defectuosa en un excipiente farmacéuticamente aceptable, el adenovirus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno CS de un parásito causante de paludismo y - reforzar al mamífero con un antígeno proteináceo adyuvado que comprenda una proteína híbrida de proteína CS o un fragmento inmunogénico de la misma fusionado al antígeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg) , en forma de partículas de lipoproteína con HBsAg.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el antígeno proteináceo comprende RTS , S .
25. El método de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque el adenovirus recombinante es un adenovirus humano, simiano, canino o bovino.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el adenovirus recombinante es un adenovius humano seleccionado del grupo que consiste en adenovirus humanos serotipos 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 y 50.
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizado porque el antígeno proteináceo es adyuvado con QS21 y 3D-MPL.
28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado porque el parásito causante de paludismo es Plasmodium falciparum.
29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, caracterizado porque el ácido nucleico heterólogo es optimizado en codones para una producción incrementada de la proteína codificada en un mamífero, de preferencia un humano.
30. Un método para vacunar un mamífero contra una infección de paludismo caracterizado porque se usa el kit de partes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
31. Un método para vacunar un mamífero contra una infección de paludismo usando el kit de partes de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el refuerzo es seguido por uno o más refuerzos subsecuentes .