CN110857318B - 一种抗血栓多肽cystatin-T及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗血栓多肽cystatin‑T，所述抗血栓多肽cystatin‑T由101个氨基酸残基组成，分子量11063.48Da，等电点6.72，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明同时公开了上述抗血栓多肽cystatin‑T的制备方法和应用。本发明中的抗血栓多肽cystatin‑T具有稳定性好、人工表达简单、抗血栓和心脑血管保护作用显著、溶血活性低的优点，具有广泛的应用前景。

Description

一种抗血栓多肽cystatin-T及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种抗血栓多肽cystatin-T及其制备方法和应用。

背景技术

血栓是导致心血管疾病发病和致死的主要原因，与年龄增长成正相关。我国正在步入老龄化的国家，心血管疾病成为一个沉重的社会负担。长期以来，针对血液凝固、血小板激活与聚集和血栓溶解等生理机制开发出了大量的抗血栓药物。但许多抗血栓药物因具有出血活性、导致低血压等全身性副作用而受到限制。

目前应对心脑血管疾病的药物有多种，但来自于食物源的生物分子，尤其是通过生物技术手段得到的，纯度高、疗效好，毒副作用及依赖性小的多肽药物仍属于研究热点。

多肽类抗血栓药物具有结构简单，易代谢，毒副作用较小靶向性特异等特点。本发明提供一种抗血栓多肽cystatin-T，该多肽具有显著的大小鼠体内抗凝、抗血栓的作用，且通过原核表达极易获得，溶解性好，低溶血活性和毒性，可开发为新型的抗血栓药物。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有高效的抗血栓活性和极低溶血活性、性质稳定的新型抗血栓多肽cystatin-T及其应用。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出一种抗血栓多肽cystatin-T，所述抗血栓多肽cystatin-T由101个氨基酸残基组成，分子量11063.48Da，等电点6.72，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：Met¹Ala²Lys³Val⁴Gly⁵Gly⁶Ile⁷Thr⁸Glu⁹Ser¹⁰Ala¹¹Gly¹²Ser¹³Ala¹⁴Asn¹⁵Ser¹⁶Ser¹⁷Glu¹⁸Ile¹⁹Asp²⁰Ser21Leu²²Ala²³Arg²⁴Phe²⁵Ala²⁶Val²⁷Asp²⁸Glu²⁹His³⁰Asn³¹Lys³²Lys³³Glu³⁴Asn³⁵Ala³⁶Cys³⁷Leu³⁸Glu³⁹Phe⁴⁰Ser⁴¹Lys⁴²Val⁴³Val⁴⁴Asn⁴⁵Val⁴⁶Lys⁴⁷Gln⁴⁸Gln⁴⁹Val⁵⁰Val⁵¹Ser⁵²Gly⁵³Thr⁵⁴Val⁵⁵Tyr⁵⁶Tyr⁵⁷Ile⁵⁸Thr⁵⁹Leu⁶⁰Glu⁶¹Ala⁶²Thr⁶³Asn⁶⁴Gly^{6 5}Gly⁶⁶Gln⁶⁷Lys⁶⁸Lys⁶⁹Ala⁷⁰Tyr⁷¹Glu⁷²Ala⁷³Lys⁷⁴Val⁷⁵Trp⁷⁶Val⁷⁷Lys⁷⁸Pro⁷⁹Trp⁸⁰Met⁸¹Asn⁸²Phe⁸³Lys⁸⁴Glu⁸⁵Leu⁸⁶Gln⁸⁷Glu⁸⁸Phe⁸⁹Lys⁹⁰Pro⁹¹Ile⁹²Gly⁹³Asp⁹⁴Thr⁹⁵Pro⁹⁶Ser⁹⁷His⁹⁸Pro⁹⁹Ser^{10 0}Ala¹⁰¹。

编码其的核酸序列如SEQ ID NO.2为：atggccaaagtcggaggaattacggaatcggcaggcagtgcgaatagctcagagatcgacagcctcgctcgatttgccgttgacgaacacaacaagaaagagaatgcttgtcttgagttcagcaaagtcgtgaatgtgaagcaacaggttgtttctggaactgtgtactatataacactggaagcaaccaacggtggtcaaaagaaagcttatgaagcgaaggtctgggtgaagccatggatgaatttcaaggagttgcaggaattcaagcccatcggtgacactccttcacaccctagtgcttag。

本发明进一步提出了制备上述抗血栓多肽cystatin-T的制备方法，根据SEQ IDNO.2所示的核酸序列，用原核或真核表达系统表达其全序列，通过FPLC层析纯化；或根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，采用化学合成的方法，并使用HPLC进行分离纯化，并检测纯度。具体地，根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。但限于目前大量生产合成100个氨基酸的技术成本，推荐根据SEQ ID NO.2进行原核表达产生重组多肽，再利用各标签纯化，FPLC等纯化等步骤获得纯品。

本发明提出了上述抗血栓多肽cystatin-T在制备抗血栓或心脑血管保护药物或保健品及其免疫相关功能产品领域的应用。

本发明更进一步地提出一种组合物，所述组合物包含所述的抗血栓多肽cystatin-T和药学上可接受的载体或稀释剂。

更进一步地，本发明提出来该组合物在制备抗血栓或心脑血管保护药物或保健品及其免疫相关功能产品领域的应用。

本发明研究发现，上述抗血栓多肽cystatin-T和含有抗血栓多肽cystatin-T的组合物可以广泛应用于抗血栓或心脑血管保护药物或保健品及其免疫相关功能产品领域的应用等领域。

有益效果：本发明中的抗血栓多肽cystatin-T，其基因序列来源于茶树，属于食源级多肽。茶在人们生活中已经使用几千年。该多肽具有分子量小、多种真核原核大量表达均可，即使带有融合标签依然效果显著、各种抗血栓作用显著、溶血活性低的优点，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为双酶切验证重组质粒的结果图；

图2中A为经FPLC高效液相色谱纯化，获得较单一纯蛋白组分，B为FPLC纯化前后蛋白纯度检测；

图3中A为不同浓度的多肽cystatin-T的血小板聚集抑制效果；B为不同浓度的多肽cystatin-T对内源性凝血途径活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响；C为不同浓度的多肽cystatin-T显著影响大鼠血浆复钙时间(PRT),其中，Control为生理盐水，也是溶解多肽的溶剂组分；*表示与control相比p<0.05,**代表p<0.01；

图4为激光散班仪检测10mg/kg cystatin-T对FeCl₃诱导的小鼠颈动脉血栓的影响；sham组为正常小鼠对照组，control组为手术小鼠注射生理盐水溶剂组，*表示与control相比p<0.05,**代表p<0.01；

图5中A为不同浓度的cystatin-T对脑梗死的保护作用，B为Bederson神经行为学评分；*表示与control相比p<0.05,**代表p<0.01；

图6为多肽cystatin-T的溶血活性示意图；**代表p<0.01；

图7为cystatin-T的稳定性检测，其中，A为pH稳定性，B为温度稳定性；

图8为插入PET-32α(+)的目标序列的示意图。

具体实施方式

根据下述实施例可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所详细描述的本发明。

实施例1.cystatin-T基因的克隆。

茶树总mRNA的提取：从茶树嫩芽中提取mRNA，采用简易CTAB-LiCl法并加以修改，提取到了较高质量的mRNA。

采用北京百泰克生物技术有限公司的BioTeKe supermoⅢRT Kit进行cDNA第一链的合成

在RNAase-free的PCR管里，于冰上加入下列试剂:

在PCR仪上按照以下条件进行反转录:

50℃，45min；70℃，10min；

克隆进载体目的片段的构建：引入KPn1和BamH1的双酶切位点,并在两端加入了保护碱基。在成熟多肽表达前，加入了化学切割位点：甲酸切割位点GACCCG(编码氨基酸为DP)，以确保从载体上表达后，用化学方法切除标签蛋白。插入PET-32α(+)的目标序列如图8所示。

根据载体特点和甲酸识别位点序列，分别设计级联上下游引物：

级联引物分别为：

5‘-1ATGATGACCCGATGGCCAAAGT，其中，GACCCG为甲酸切割位点；

5‘-2CGGGGTACCGATGATGATGAC，GGTACC为KPn1酶切位点；

下游引物为:3’CGGGATCCCTAAGCACTAGGGT，GGATCC为BamH1的酶切位点。

PCR模板为上面构建的单链cDNA，进行两轮PCR，将第二轮的PCR产物切胶回收，目的条带。Kpn1和BamH1共酶切过夜回收的目的片段条带与双酶切的pet-32a连接，能够成功连接转化到克隆载体DH5α中，双酶切验证(如图1)并测序验证。

实施例2抗血栓多肽cystatin-T的制备。

抗血栓多肽cystatin-T的原核表达方法：根据编码基因序列，在基因两端加上不同的限制性内切酶序列，与表达载体PET-32a经双酶切酶连后，转入表达宿主细胞BL21 DE3大肠杆菌中表达。经超声破碎，离心取上清，经Ni亲和层析，FPLC，等纯化手段鉴定其纯度，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

实施例3：抗血栓多肽cystatin-T全血抗凝活性检测。

血小板是抗凝系统的关键因子，本方法采用北京普利生血小板聚集仪进行此次血小板聚集实验并采用全自动凝血仪法检测各组大鼠全血的部分凝血活酶时间APTT及血浆复钙时间PRT的凝血时间。

具体操作如下：取wistar雄性大鼠40只(200g-250g)，随机分4组，每组10只，分别为生理盐水(对照组)，给药组(1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)。给药前禁食12h，鼠尾静脉给药1h后正常禁食，给药4h后，用戊巴比妥钠60mg/kg麻醉大鼠，进行心脏取血。全血用3.8％枸橼酸钠(体积比1:9抗凝)。室温3000rpm/min离心5分钟，得到上清为富血小板血浆(PRP)，沉淀继续离心，3000rpm/min，10分钟制备上清为贫血小板血浆(PPP)。通过使用PPP血浆来稀释PRP中血小板至血小板浓度为3×10⁸/ml。将待测样品(同体积、不同母液浓度)用移液枪加入37℃保温的血小板中，孵育1min，然后分别加入血小板聚集激动剂ADP(10μmol/L)诱导血小板聚集反应，测定5min内最大聚集率。从图3可知，随着多肽的浓度增加，血小板的聚集率显着降低。证实多肽cystatin-T可以通过抑制血小板聚集从而达到抗凝的效果，并且随着浓度的增加，显著影响血液的复钙时间，和内源性凝血系统中部分凝血活酶APTT时间，具有显著的抗凝效果。

实施例4：激光散斑仪检测多肽cystatin-T对FeCl₃诱导的血栓模型血流状况的影响

3％戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔麻醉小鼠，仰卧固定，颈部75％酒精消毒，取颈正中切口，逐层切开小鼠皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露小鼠左侧颈总动脉(CCA)。用直径为5mm的打孔器打孔滤纸片，在颈总动脉下侧垫上一片生理盐水浸泡的滤纸片，用于去除背景干扰。之后尾静脉注射注入10mg/kg多肽样品，10min后，将10％FeCl₃浸泡过的滤纸片覆盖于动脉上侧。作用2min后移去滤纸片并用生理盐水洗去残留FeCl₃，然后置于激光散斑仪下观察血流变化。结果如图4所示。

根据上述实验可证实，多肽cystatin-T对FeCl₃诱导的小鼠颈动脉血栓有显著的治疗作用，对照组在十分钟时加入FeCl₃可迅速形成血栓，进而完全检测不到血流。10mg/kg的cystatin-T治疗组在相同时间内仍能保持血管的血流状态不变，证实cystatin-T具有显著的抗血栓功能。

实施例5：cystatin-T能显著降低脑梗死模型中的脑梗死体积。

雌雄性各30只C57BL/6五周龄小鼠(昆明医学院实验动物中心)随机分为5组，每组6只，使用线栓法鼠建立了60min小鼠脑缺血再灌注模型，在再灌注前10min打药，给药剂量为1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg，设立正常小鼠及实验模型组(注射生理盐水)。观察cystatin-T对小鼠脑的缺血再灌注损伤的治疗保护作用，用来模拟cystatin-T对临床病人的脑缺血损伤及血栓再通造成损伤的治疗作用。建模24h后，我们对小鼠进行了Bederson神经行为学评分后处死，取脑切片，进行2％TTC染色，计算脑切片梗死面积。

2％TTC染色：使用3％戊巴比妥钠腹腔内注射，麻醉小鼠后断头剥离大脑，去除脑嗅球和脑干，放入冷的生理盐水中浸泡5min，取出，置于小鼠脑切片模具((HarvardApparatus,Holliston,MA,USA).)中，横向切4-5片，每片2mm，浸入37℃2％TTC(Sigma)中避光染色10-30min，4％多聚甲醛固定，拍照，使用软件Image pro plus计算脑梗死体积，计算公式为V＝Sd/T2，S为梗死灶面积，d为厚度，T为线性放大倍数，该实验结果如图5所示。

如上述结果显示，随着cystatin-T浓度的升高，小鼠的脑梗死体积显著下降。对应的Bederson神经行为学评分也显著下降，由此说明，多肽cystatin-T对脑梗死具有良好的作用及预后。

实施例6：多肽cystatin-T的溶血活性

为评估多肽cystatin-T的毒性，我们检测了多肽cystatin-T的溶血活性，具体操作如下：将采集的新鲜C57小鼠血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷～10⁸cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的多肽cystatin-T样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝(A样品-A阴性对照)/A阳性对照×100％。

溶血活性可直接表明多肽使用的安全性，实验结果表明多肽cystatin-T浓度为160μg/ml时，并没有检测到任何的溶血活性。

实施例7：多肽cystatin-T的稳定性

为检测多肽cystatin-T的稳定性,我们检测了在pH 1-9的范围及37℃-100℃的范围内保育半小时，检测其作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的活性。结果如图7所示。

上述结果表明，多肽cystatin-T具有广泛的pH和温度的稳定性，即使在极酸(pH1-2)的条件下，其活性丝毫不受影响，同时在100℃，其活性仍能达到最适温度的50％，证明多肽cystatin-T具有极好的稳定性和应用价值。

综上所述，本发明抗血栓多肽cystatin-T，具有显著的大小鼠体内抗凝、抗血栓的作用，且通过原核表达极易获得，溶解性好、低溶血活性和毒性，稳定性极佳，可开发为新型的抗血栓药物，可以广泛应用于药品或保健品中，应用前景广阔。

序列表

<110> 广州医科大学附属肿瘤医院

<120> 一种抗血栓多肽cystatin-T及其制备方法和应用

<130> 20180807

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Lys Val Gly Gly Ile Thr Glu Ser Ala Gly Ser Ala Asn Ser

1 5 10 15

Ser Glu Ile Asp Ser Leu Ala Arg Phe Ala Val Asp Glu His Asn Lys

20 25 30

Lys Glu Asn Ala Cys Leu Glu Phe Ser Lys Val Val Asn Val Lys Gln

35 40 45

Gln Val Val Ser Gly Thr Val Tyr Tyr Ile Thr Leu Glu Ala Thr Asn

50 55 60

Gly Gly Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Val Trp Val Lys Pro Trp

65 70 75 80

Met Asn Phe Lys Glu Leu Gln Glu Phe Lys Pro Ile Gly Asp Thr Pro

85 90 95

Ser His Pro Ser Ala

100

<210> 2

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccaaag tcggaggaat tacggaatcg gcaggcagtg cgaatagctc agagatcgac 60

agcctcgctc gatttgccgt tgacgaacac aacaagaaag agaatgcttg tcttgagttc 120

agcaaagtcg tgaatgtgaa gcaacaggtt gtttctggaa ctgtgtacta tataacactg 180

gaagcaacca acggtggtca aaagaaagct tatgaagcga aggtctgggt gaagccatgg 240

atgaatttca aggagttgca ggaattcaag cccatcggtg acactccttc acaccctagt 300

gcttag 306

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatgaccc gatggccaaa gt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggggtaccg atgatgatga c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatccct aagcactagg gt 22

Claims (4)

1.抗血栓多肽cystatin-T在制备抗血栓或心脑血管保护药物中的应用，其中，所述抗血栓多肽cystatin-T由101个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗血栓多肽cystatin-T的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种组合物，所述组合物包含抗血栓多肽cystatin-T和药学上可接受的载体或稀释剂，其中，所述抗血栓多肽cystatin-T由101个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

4.权利要求3所述的组合物在制备抗血栓或心脑血管保护药物中的应用。

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