JPH04505162A - 白血球エラスターゼとカテプシンｇとを阻害するペプチド、ｄｎａ、ベクター、宿主生物と取得の方法、並びにペプチドを含有する薬剤学的製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 白血球エラスターゼとカテプシンＧとを阻害するペプチド、ＤＮＡ、ベクター、 宿主生物と取得の方法、並びにペプチドを含有する薬剤学的製剤 白血球エラスターゼ及びカテプシンＧを阻害するペプチド、ＤＮＡ、ベクター、 宿主生物とその取得方法並びに薬剤学的製剤。 細胞外空間に達したリゾソームブロテアーゼは、普通エンドブロチイナーゼイン ヒビター、例えばα１−プロテイナーゼインヒビターにより急速に失活する。　 Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　５２　（１９８３）＋　６５５　参 照、しかしリゾソームブロテアーゼが激しく遊離するような状況の場合、例えば 急性又は慢性の炎症、複数の外傷又はショックの場合には、この防ｊｎ機能が局 部的又は全身に於いて過負荷を受けることになり、そのため、結合組織及び血漿 タンパク質が凝固因子、繊維素溶解因子及び補体因子を含めて、エラスターゼ及 びその他のリゾソームブロテアーゼにより著しく分解され、その結果重大な臨床 症状、例えば肺気腫、ショック肺、急性呼吸不全症候（ＡＲＤＳ）　、凝血異常 、腎不全、肝不全等を招く恐れがある。その治療方法としてはこの圧倒的なタン パク譬分解活性を、リソソームプロテアーゼである白血球エラスターゼ及びカテ プシンＧに対して特異的に作用するようなインヒビターにより阻害することが考 えられる。 実験的なモデルでは、敗血症及び肺気腫の場合に合成及び動物由来のエラスター ゼインヒビターの治療効果が既に実証された０例えばＡｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１２７　（１９８３）　５５４−５５８　及びＥｕｒ、 　Ｊ。 Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　６６５ｕｐｐ１．１３９　（１９８５）　６６− ７０．　Ｌかし、人体用医薬として使用するには、毒性及びアレルギー性副作用 を防ぐ為に、ヒト由来のプロテアーゼインヒビターが望ましい。これはα１−プ ロテイナーゼインヒビター欠乏症の治療のような長期の治療の場合に特に望まれ る。 α１プロテイナーゼインヒビターは、好中性のエラスターゼに対する天然の阻害 物質で、分子の質量が５３０００ドルトンの垢タンパク質であるが、それ自体は 治療用にはあまり通していない、即ち分子の質量が大きいので大量のインヒビタ ーの使用が必要になる。確かにタンパク質の必要量は遺伝子工学的方法で入手可 能であるかもしれないが、それは正しくタンパク質を分解した形ではない、正し く修飾されていない組換えタンパク質の生物学的半値時間は循環の際に著しく短 くなる　（例えばＪ、Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２５１　（１９８６）　 １０４０４参照）ので、更に多量のインヒビターを使用しなければならず、その 上アレルギー反応の恐れも生じてくる。 粘液プロテアーゼインヒビター（ＭＰＩ）はヒトの器官の一連の粘液様漿液から 得られる。例えば５ｃｈｉｅＢ］ｅｒ等のＨａｖｅｍａｎｎ　＆　Ｊａｎｏｆｆ 著Ｎｅｕｔｒａｌ　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐ ｈｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ（ヒトの多形核白血球の中性プロテ アーゼ）１９７−２０７．出版社Ｕｒｂａｎ＆　Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ、 Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９７８；　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、１９９　（１９８６ ）　４３−４８；　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｓ、　）Ｉｏｐｐｅｒ−Ｓｅｙｌｅｒ 、　３６９５ｕｐｐ１．　（１９８８）　７９−８２参照。 ？ＩＰＩはその分子の質量が１４０００ドルトンで、２個の活性領域から成り、 その一方の領域はエラスターゼ、もう一方の領域はトリプシン及びトリプシン類 似の酵素に対して活性を示す。従ってこれはエラスターゼに特異なインヒビター ではない。 分子の質量がα、−ブロティナーゼインヒビターに比べて遥かに小さく、且つ白 血球エラスターゼ及びカテプシンＧに対してヒトの生体内での防御機能が実証さ れた、特異性のあるブロティナーゼインヒビターはこれまで知られていないので 、そのようなインヒビターを既に公知のヒト由来のインヒビターの修飾により特 に作成しなければならない。即ち個々のアミノ酸を、白血球エラスターゼ及びカ テプシンＧに対して特異的阻害物質である、他の好ましくは天然のアミノ酸で置 換して作成する必要がある。このように修飾したインヒビターを臨床的に使用す る際の抗原反応を避けるため、一方では交換するアミノ酸の数をできるだけ少な くしなければならない。 本発明によれば、ヒトの精漿に含まれていて、分子の質量が６９００ドルトンで アクロシンとトリプシンとを特異的に阻害するプロテアーゼインヒビターＨＵＳ Ｉ−■を原料とした。 本発明の一つの実施態様によれば、 （ａ）次のアミノ酸配列Ｈ）のペプチド、又は（ｂ）次のアミノ酸配列（＋）を 含むペプチド、又は（ｃ）次のアミノ酸配列（１）のペプチド、又は次のアミノ 酸配列（１）を含むペプチドに於いて、−個又は二個以上のアミノ酸が欠失して いるペプチド、又は （ｄ）次のアミノ酸配列（１）のペプチド、又は次のアミノ酸配列（１）を含む ペプチドに於いて、−個又は二個以上のアミノ酸がそれぞれ一個の他のアミノ酸 と置換しているペプチドであって、Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　 Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ｖａ１Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇ ｉｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＴｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｈ ｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒ。 Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　ＡｌａＡｓｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｔ ｂｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ１１ｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌ ｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙ５　（１）白血球エラスターゼ及びカテプシンＧを阻害するペ プチドである。 前記ペプチド（ａ）は後述する本発明の方法により、従来の技術に比べて特に純 粋な方法で取得することができる。 前記ペプチド（ｂ）、　（ｃ）又は（ｄ）に於いて、アミノ酸配列（１）に−個 のリーダーペプチド、例えば−個のシグナル配列又はリンカ−配列を備えた一個 のシグナル配列が先導していてもよい。 前記ペプチド（ｃ）又は（ｄ）に於いてその修飾は、約４３個迄のアミノ酸、好 ましくは３８個迄のアミノ酸に関するものでもよい。 前記ペプチド（ｃ）に於いては、前記アミノ酸配列（１）の１，２゜３、４．５ ．６．７．８．９．１０．１１．１２．１３．１４．１５．１６．１７．１Ｂ、 　１９゜２０、２１．２２．２３．２４．２５．２６．２７．２Ｂ、　２９．３ ０．３１及び／又は３２の位１のアミノ酸が欠失していてもよく、前記ペプチド （ｄ）に於いては、４５．４６．４７．４８．４９．５６．５７．６０．６４及 び／又は６７の位置のアミノ酸が、−個の他のアミノ酸、好ましくは天然に存在 する一個の他のアミノ酸によって置換されていてもよい。 もう一つの実施態様によれば、本発明は１個のＤＮＡに関し、それは （ａ’）　（ａ）記載のペプチドを指定し、次の塩基配列（ｎ）又は機能的に同 等の一個の塩基配列を有するか、又は（ｂ’）　（ｂ）、　（ｃ）又は（ｄ）記 載のペプチドを指定し、次の塩基配列（ＩＩ）又は機能的に同等の一個の塩基配 列を有するか、又は（ｃ’）　（ｃ）記載のペプチドを指定し、−個又は二個以 上のコドンが欠失している次の塩基配列（ＩＩ）又は機能的に同等の一個の塩基 配列を有するか又は含んでいるか、又は （ｄ’）　（ｄ）記載のペプチドを指定し、−個又は二個以上のコドンがそれぞ れ一個の他のコドンによって置換されている次の塩基配列（Ｉｆ）又は機能的に 同等の一個の塩基配列を存するか又は含んでいるＤＮＡである。 ＩｆＲＮＧＰＣ 機能的に同等の配列とは、配列が異なっているにもかかわらず同一のタンパク質 を指定するようなりＮＡ配列を意味する。これは周知のようにいくつかのコドン では、指定されたタンパク質の中で該当するアミノ酸が変わることなく、１個、 ２個又は３個の塩基を交換することができるからである。 前記塩基配列（ＩＩ）又はこれと機能的に同等の配列を、その５′末端に於いて 一個のリーダーペプチド、例えば−個のシグナル配列又はリンカ−配列を備えた 一個のシグナル配列に対応するコドンだけ延長してもよい。 前記塩基配列（Ｉ［）又はこれと機能的に同等の配列に於いて、前記アミノ酸配 列（１）の１．２．３．４．５．６．７．８．９．１０．１１゜１２、１３．１ ４．１５．１６．１７．１Ｂ、　１９．２０．２１．２２．２３．２４．２５． ２６゜２７、２８．２９．３０．３１及び／又は３２の位置のアミノ酸に対応す るコドンが欠失していてもよい。 前記塩基配列（Ｉ［）又はこれと機能的に同等の配列に於いて、４５、４６．４ ７．４８．４９．５６．５７．６０．６４及び／又は６７の位置のアミノ酸に対 応するコドンが、−個の他のアミノ酸、好ましくは天然に存在する一個の他のア ミノ酸に対応する一個のコドンによって置換されていてもよい。 もう一つの実施態様によれば、本発明は前述のペプチドの何れか１個を発現する ためのベクターに関し、その場合この発現ベクターは前述のＤＮＡベクターの何 れか１個を含んでいる。このようなベクターはρＭＡＭＰＦ２又はｐＭＡＭＰＦ ３を用いて作成することができる。 もう一つの実施態様によれば、本発明は本発明による一個の発現ベクターにより 形質転換された一個の宿主生物、例えば大ｌ！菌に間する。 もう一つの実施態様によれば、本発明は本発明による宿主生物を使用して、それ 自体は公知の方法でペプチドを取得する、本発明によるペプチドを取得する方法 に関する。 本発明によるペプチドの特徴は、これが特異的に白血球エラスターゼを阻害し、 又このペプチドと白血球エラスターゼとの反応で形成される複合体は、その分子 の質量が比較的小さくて腎臓を通過することができるので、遊離したエラスター ゼの有効な除去が保証される点にある。本発明のペプチドはヒト由来のＨＵＳＩ −ＩＩに相当しているので、Ｒ床的に使用した場合免疫システムの防御反応によ っ生ずる合併症のおそれがないと見なすことができる。 本発明のもう一つの実施態様によれば、本発明によるペプチドから成るか、或い はこの種のペプチドと場合によっては一種又は多種のその他の作用物質及び／又 は−個の通常の担体及び／又は希釈剤とを含む薬剤学的製剤を提供することがで きる。 次に実施例により本発明の詳細な説明する。 災血■上 式（ＩＩ）のＤＮＡ配列をプラスミドｐＴＺ１９Ｒ−ＨＬＩＳＴ　Ｉｔから一個 の入手可能の発現ベクター、例えばｐＭＡＭＰＦ３　（Ｍ、　Ｓｚａｒｄｅｎｉ ｎｇｓ、　ＴｈｅｓｉｓＴＵ　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ　１９８９　及びＳｚ ａｒｄｅｎｊｇｎｓ　＆　Ｃｏ１１ｉｎｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅ＋　９４（１９９０ ）　１−７）に移し、このベクターにより市販の大腸菌株、例えばに１２ＪＭ１ ０３　（Ｐｈａｒ＋＋ａｃｉａ　ＩＪＢ　Ｎｏ、２７−１５１１−ｏｌ；　Ｍｅ ｓｓｉｎｇ等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　９　（１９８１ ）　３０９）を形質転換した。前記プラスミドｐＴＺ１９Ｒ−ＨＬＩＳＴ　ＩＩ はドイツ微生物収集機関にＤＳ？Ｉ　５６２７として寄託しである。宿主生物の 培養によりアミノ酸配列（１）のペプチドが得られた。 国際調査報告 国際ｐ４１１報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）次のアミノ酸配列（Ｉ）のペプチド、又は（ｂ）次のアミノ酸配列（ Ｉ）を含むペプチド、又は（ｃ）次のアミノ酸配列（Ｉ）のペプチド、又は次の アミノ酸配列（Ｉ）を含むペプチドに於いて、一個又は二個以上のアミノ酸が欠 失しているペプチド、又は （ｄ）次のアミノ酸前列（Ｉ）のペプチド、又は次のアミノ酸配列（Ｉ）を含む ペプチドに於いて、一個又は二個以上のアミノ酸がそれぞれ一個の他のアミノ酸 と置換しているペプチドであって、【配列があります】（Ｉ） 白血球エラスターゼ及びカテプシンＧを阻害するペプチド。 ２．前記アミノ酸配列（Ｉ）に一個のリーダーペプチド、例えば一個のシグナル 配列又はリンカー配列を備えた一個のシグナル配列が先導していることを特徴と する、請求項１（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）記載のペプチド。 ３．前記アミノ酸配列（Ｉ）の１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１ １，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２ ３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１及び／又は３２の位置の アミノ酸が欠失していることを特徴とする、請求項１（ｃ）記載のペプチド。 ４．４５，４６，４７，４８，４９，５６，５７，６０，６４及び／又は６７の 位置のアミノ酸が、一個の他のアミノ酸、好ましくは天然に存在する一個の他の アミノ酸によって置換されていることを特徴とする、請求項１（ｄ）記載のペプ チド。 ５．ＤＮＡが （ａ′）請求項１（ａ）記載のペプチドを指定し、次の塩基配列（ＩＩ）又は機 能的に同等の一個の塩基配列を有するか、又は（ｂ′）請求項１（ｂ），（ｃ） 又は（ｄ）記載のペプチドを指定し、次の塩基配列（ＩＩ）又は機能的に同等の 一個の塩基配列を有するか、又は（ｃ′）請求項１（ｃ）記載のペプチドを指定 し、一個又は二個以上のコドンが欠失している次の塩基配列（ＩＩ）又は機能的 に同等の一個の塩基配列を有するか又は含んでいるか、又は（ｄ′）請求項１（ ｄ）記載のペプチドを指定し、一個又は二個以上のコドンがそれぞれ一個の他の コドンによって置換されている次の塩基配列（ＩＩ）又は機能的に同等の一個の 塩基配列を有するか又は含んでいることを特徴とする、ＤＮＡ。 【配列があります】（ＩＩ）６．前記塩基配列（ＩＩ）がその５′末端に於いて 、一個のリーダーペプチド、例えば一個のシグナル配列又はリンカー配列を備え た一個のシグナル配列に対応するコドンだけ延長されていることを特徴とする、 請求項５（ｂ′），（ｃ′）又は（ｄ′）記載のＤＮＡ。 ７．前記塩基配列（ＩＩ）に於いて、前記アミノ酸配列（Ｉ）の１，２，３，４ ，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１ ８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３ ０，３１及び／又は３２の位置のアミノ酸に対応するコドンが欠失していること を特徴とする、請求項５（ｃ′）記載のＤＮＡ。 ８．前記塩基配列（ＩＩ）に於いて、４５，４６，４７，４８，４９，５６，５ ７，６０，６４及び／又は６７の位置のアミノ酸に対応するコドンが、一個の他 のアミノ酸、好ましくは天然に存在する一個の他のアミノ酸に対応する一個のコ ドンによって置換されていることを特徴とする、請求項５（ｄ′）記載のＤＮＡ 。 ９．ベクターが請求項５乃至８の何れか一項記載のＤＮＡを含むことを特徴とす る、請求項１乃至４の何れか一項記載のペプチドを発現するためのベクター。 １０．ベクターが請求項５乃至８の何れか一項記載のＤＮＡを傭えたｐＭＡＭＰ Ｆ２又はＭＡＭＰＦ３に関するものであることを特徴とする、請求項９記載のベ クター。 １１．宿主生物が請求項９又は１０記載の一個のベクターにより形質転換されて いることを特徴とする、宿主生物。 １２．宿主生物が大腸菌、特にＤＳＭ５６２７に関するものであることを特徴と する、請求項１１記載の宿主生物。 １３．請求項１１又は１２記載の一個の宿主生物を使用して、それ自体は公知の 方法でペプチドを得ることを特徴とする、請求項１乃至４の何れか一項記載のペ プチドを取得する方法。 １４．請求項１乃至４の何れか一項記載のペプチドから成るか、或いはこの種の ペプチドと場合によっては一種又は多種のその他の作用物質及び／又は一個の通 常の担体及び／又は希釈剤とを含むことを特徴とする、薬剤学的製剤。