CN111265552A

CN111265552A - 一种沙蚕抗血栓活性物质的制备方法

Info

Publication number: CN111265552A
Application number: CN201811473470.4A
Authority: CN
Inventors: 陈西广; 李阳; 程晓杰
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2020-06-12

Abstract

本发明公开了一种沙蚕抗血栓活性物质的制备技术。通过沸水煮提法提取出抗血栓活性物质，并通过等电点沉聚法、分级醇沉法和凝胶柱层析法对活性物质进行纯化。本发明制备得到的抗血栓活性物质，不仅具有高效的抗血栓活性，而且制备过程精简，同时由于制备过程中经历了沸水煎煮和强酸碱环境下的等电点沉聚步骤，还具有优良的热稳定性和pH稳定性，便于储存和后续的抗血栓药物和保健品生产工艺的设计。本发明为源于沙蚕的抗血栓物质的制备开拓了新方法和新道路，具有良好的研究和开发利用前景。

Description

一种沙蚕抗血栓活性物质的制备方法

技术领域

本发明属于海洋生物制品领域的一种沙蚕抗血栓活性物质的制备方法。

背景技术

沙蚕在分类学上属于环节动物门、多毛纲、游走目、沙蚕科，俗称海虫、海蛆、海蜈蚣、海蚂蝗，长10厘米左右，栖息泥沙中，生殖季节或夜出觅食时，能游水；沙蚕体似蠕虫，呈长椭圆柱形而稍扁，两侧对称，后端尖，整体由头部、躯干部和尾部3部分组成，头部发达，躯干部具有许多刚节，各节两侧有1对外伸的肉质扁平凸起，称为疣足，足上有刚毛，刚毛有毒腺，刺到皮肤有红肿疼痛感觉，尾部为体的末节，沙蚕在潮间带极为习见，亦见于深海，在岩岸石块下、石缝中、海藻丛间，以及珊瑚礁或软底质中均为占优势的无脊椎动物，沙蚕主要食其他蠕虫及海产小动物，沙蚕科的多数种在生殖前发生明显的形态变化，雄性的背须具齿状乳突、肛节长出特化的感觉乳突，内部变化包括肌肉的分解和重组、消化道的自融、体腔充满生殖产物，结果使虫体变化，雄性乳白色、雌性蓝绿色，沙蚕由底栖转入生殖浮游，起浮于海面排精放卵生殖后，雌雄个体大多下沉于海底死去；沙蚕是构成海洋生物食物链的主要成分之一，是鱼、虾、蟹类的上好食物，是钓取海鱼的主要饵料，更也是水产养殖界重要饵料，现中国发现沙蚕有35种，多产于我国的黄海和渤海沿岸，海南、福建、浙江、广东、山东沿海有养殖。

目前沙蚕已被人们当作美食和营养保健品利用，鲜品沙蚕放入油锅中爆炒，肉脆味丰；沙蚕晒干后，又称“龙肠干”，色金黄而透明，比鲜品更为醇美清甜，为高级宴席的珍贵名菜，沙蚕营养甚丰，有开胃明目、养肝补脾、健胃润肠之功用，成束成捆的沙蚕干作为馈赠至亲好友的贵重礼品；沿海居民还视生殖腺成熟的沙蚕为营养珍品；干制后煮汤味极鲜美，有“天然味精”之称，油炸后酥松香脆，为下酒佳肴，沙蚕无论在国内或出口都十分畅销。

沙蚕具有药用价值，在我国古代就作为药材用于身体调养和疾病治疗；根据我国医学巨著《本草纲目》记载，沙蚕具有祛风补血，延年益寿的作用；另外现代医学研究发现，沙蚕作为药材均具有溶栓的活性，并已经实现了溶栓活性成分的分离纯化；包括沙蚕溶栓蛋白酶、沙蚕金属蛋白酶、沙蚕纤溶酶和沙蚕激酶。

陈颢1999年公开从沙蚕体内提取溶血栓纤溶酶—沙蚕激酶，提供一种原料丰富、价格低廉、安全无毒、口服有效的溶栓药物。沙蚕激酶的分子量在25000-55000之间，等电点在3-7之间。

王斌 2006年公开了一种具有溶栓活性的沙蚕激酶的编码基因序列及其氨基酸序列，从多种沙蚕的cDNA文库中克隆沙蚕激酶编码基因，通过基因重组技术，在真核表达系统或原核表达系统中获得重组表达，具有溶栓生物学活性。

李荣贵2007年报道了沙蚕溶栓活性蛋白酶，将表达裁体pMAL-PPA转化入E.coliDH5a大量表达麦芽糖结合蛋白-沙蚕溶栓活性蛋白酶(MBP-PPA),融合蛋白经Amylose-resin亲和层析与DEAE-Scpharose FF离子交换层析得到了纯化，热稳定性好，最适pH 8.0。

李琦 2008年报告了沙蚕蛋白酶及其同工酶的分离纯化工艺，应用硫酸铵盐析、凝胶过滤层析、疏水层析等技术从沙蚕体内分离得到沙蚕蛋白酶，证明:沙蚕蛋白酶具有很强的纤维蛋白原及纤维蛋白溶解活性;对凝血功能未见有影响;有显著的抑制血小板聚集作用;有显著改善血液流变学作用;有抗血栓形成作用。

邓志会 2008年报告了从一种海洋生物日本刺沙蚕体内分离纯化出一种高纯度、单一组分的新型纤溶酶, 在体外有较强的溶解纤维蛋白和纤维蛋白原作用, 通过酶的初提、硫酸铵盐析、Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析、DEAE Sepharose FF阴离子离子交换层析和Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析,获得日本刺沙蚕纤溶酶,其在SDS-PAGE和常规PAGE电泳中为单一条带,用高效液相凝胶过滤色谱法检测其纯度不低于95%。日本刺沙蚕纤溶酶是一条单链蛋白，分子量在28-32kDa,等电点为4.4，具有较好的热稳定性和pH稳定性，在40～80℃和pH7～11范围内表现出良好的稳定性，最适温度为60℃,最适pH为9.0。

张连芝 2011年公开了日本刺沙蚕纤溶酶(NJF)的最适反应温度和最适反应pH值以及金属阳离子和蛋白酶抑制剂对酶活性的影响，确定NJF的酶学分类。结果:NJF具有较宽的热稳定性及pH稳定性范围，在40～80℃及pH7～11范围内有较好的稳定性，NJF酶最适温度为60℃,最适pH值为9，是一种典型的丝氨酸蛋白酶。

孙东升2012年报道了沙蚕金属蛋白酶(NVMP)体外的抗凝血和血栓溶解作用，采用SDS-PAGE电泳法观察NVMP对纤维蛋白原的降解作用；能够直接溶解纤维蛋白，也具有激活纤溶酶原将其转变成纤溶酶，间接水解纤维蛋白的激酶活性。

这些报道多局限于纤溶酶类和活性蛋白分子的研究，为弥补已有技术的不足和有别于已有技术，本发明公开一种沙蚕抗血栓活性物质的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙蚕抗血栓活性物质的制备方法，制得的天然抗血栓剂可以有效延长寡血小板血浆的凝血四项指标，可用于药品的研发，预防和治疗血栓性疾病，也可用作保健品，改善血栓病人的健康状况。

本发明以沙蚕为原料，如双齿围沙蚕、日本刺沙蚕、疣吻沙蚕，但不限于这三种沙蚕，采用沸水煮提、等电点沉聚、乙醇沉降和凝胶柱层析法从沙蚕中提取抗血栓活性物质，所有沙蚕在本发明中制备技术方法相同。具体步骤是：

1）取新鲜沙蚕，用水清洗，除沙蚕体表面杂质，-20℃冻融处理1-2次，匀浆破碎，加2-3倍体积的去离子水，静置0.5-1h,加热至沸腾 0.5-3h，用100-150rpm的转速搅拌,煎煮后过滤，上清液冻干得到初步提取物SCRS01。

2）将本发明技术步骤1）中得到的提取物SCRS01加入10-30倍去离子水，用2-3M的盐酸和2-3M的氢氧化钠溶液依次将SCRS01溶液调节pH,分别调pH值至0.8-1.2、2.8-3.2、4.8-5.2和12.8-13.2，每次调节pH值后将溶液置于水浴锅中在40-70℃的条件下孵育0.5-3h，随后以5000g离心15-20min以去除沉淀物；最后将样品溶液的pH值调节至6.5-7.2，得到样品液SCRS02。

3）将本发明技术步骤2）得到的样品液SCRS02中加入无水乙醇，使样品溶液中的乙醇含量达到45-55%，搅拌速度为200-300rpm，将样品于4-8℃静置8-12h，5000-8000g离心10min取上清，然后继续向上清液中入无水乙醇，重复上述操作，样品溶液中乙醇含量依次分别达到60%-66%，70%-75%，80%-85%，取最终的上清液，60-80℃负压干燥，得到次级纯化样品SCRS03。

4）将本发明技术步骤3）得到的样品液SCRS03 溶于去离子水，加入水量是样品的10-30倍，用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50，柱床为2×30cm，上样量为柱床体积的5-8%，洗脱液为去离子水，用量是柱床体积的两倍，流速为7μl/s，收集前20%的洗脱样品，冷冻干燥即得进一步纯化的本发明SCRSC。

5）本发明从沙蚕中提取的抗血栓活性物质SCRSC中蛋白质含量低于0.2%，取100μg的SCRSC经SDS-PAGE检测，没有发现蛋白条带，具有热稳定性，经过100℃煮沸3小时，仍然具有优良体外抗血栓活性，具有酸碱稳定性，对pH 0.8-13.2处理后，仍然具有抗血栓活性。

本发明具有操作简便、制备技术工艺精简以及制造成本低廉等优点。在制备过程中经历了沸水煎煮和强酸碱环境下等电点沉聚的过程，得到的样品具有优良的热稳定性和pH值稳定性。本发明的重要意义在于不仅是得到了一种具有优良热稳定性和pH值稳定性的高效抗血栓活性物质，后续的生产工艺可选择面更广泛，而且丰富了沙蚕抗血栓活性物质的制备方法，为沙蚕抗血栓活性物质的制备开拓了新道路，该项发明技术具有良好的开发应用潜力。

具体实施方式：

1）新鲜冷冻沙蚕解冻后置于筛网中用去离子水冲洗，以去除沙蚕虫体表面的杂质和血污，-20℃冻融处理1-2次，将沙蚕匀浆破碎（150W，5-10min），补加匀浆液2-3倍体积的蒸馏水，静置0.5-1h，加热至沸腾，匀浆液在沸水中煎煮0.5-3h，煎煮期间用搅拌器以100-150rpm的转速搅拌。煎煮结束后过滤，收集上清液，将上清液冷冻干燥48-72h得到初步提取物SCRS01。

2）将初步提取物SCRS01复溶于10倍-30倍去离子水中，使用2-3M的盐酸和2-3M的氢氧化钠溶液依次将初步纯化的样品的pH值调节至0.8-1.2、2.8-3.2、4.8-5.2和12.8-13.2，每次调节完pH值后将样品溶液置于水浴锅中在40-70℃的条件下孵育0.5-3h，随后以5000g离心15-20min去除等电点沉聚产生的沉淀。最后将样品溶液的pH值调至6.5-7.2，即得样品液SCRS02。

3）将样品液SCRS02进行分级醇沉，搅拌中逐滴加入无水乙醇，使样品溶液中的乙醇含量依次达到45-55%，搅拌速度为200-300rpm，将样品于4-8℃静置8-12h，5000-8000g离心10min取上清，重复上述操作，继续向上清液中逐滴加入无水乙醇，使样品溶液中乙醇含量依次分别达到60%-66%，70%-75%和80%-85%，取最终的上清液，60-80℃负压干燥，得到次级纯化样品SCRS03。

4）将次级纯化样品SCRS03复溶于10-30倍的去离子水中，使用凝胶柱层析法进行层析，选用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50，柱床为2×30cm，上样量为柱床体积的5-8%，洗脱液为去离子水，用量与柱床体积的两倍，流速为7μl/s，收集前20%的洗脱样品，冷冻干燥48-72h即得本发明SCRSC。

实施例1

将500g新鲜沙蚕置于筛网中用蒸馏水冲洗, -20℃冻融处理1次后将沙蚕匀浆破碎（150W，5min），补加匀浆液2倍体积的蒸馏水，静置0.5h，加热至沸腾2h，煎煮期间用搅拌器以100rpm的转速搅拌，煎煮结束后过滤，收集上清液，将上清液冷冻干燥72h得到初步提取物SCRS01，将初步提取物SCRS01复溶到10倍体积去离子水中，使用2M的盐酸和2M的氢氧化钠溶液依次将初步纯化的样品的pH值调节至1，3，5和13，每次调节完pH值后将样品溶液置于水浴锅中在60℃的条件下孵育1h，5000g离心15min去除沉淀，将样品溶液的pH值调至6.5，得到样品液SCRS02，对SCRS02进行分级醇沉，200rpm搅拌过程中逐滴加入无水乙醇，使样品溶液中的乙醇含量达到50%，将样品于4℃静置12h，5000g离心10min取上清，重复上述操作，继续向上清液中逐滴加入无水乙醇，使样品溶液中乙醇含量依次达到60%，70%和80%，取最终的上清液，60℃负压干燥，得到次级纯化样品SCRS03，将次级纯化样品SCRS03复溶于10倍体积去离子水中，使用凝胶柱层析法进行层析，选用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50，柱床为2×30cm，上样量为柱床体积的5%，洗脱液为去离子水，用量为柱床体积的两倍，流速为7μl/s，收集前20%的洗脱样品，冷冻干燥72h即得本发明SCRSC。

实施例2

将500g新鲜沙蚕置于筛网中用蒸馏水冲洗, -20℃冻融处理1次后将沙蚕匀浆破碎（150W，10min），补加匀浆液2.5倍体积的蒸馏水，静置1h，加热至沸腾0.5h，煎煮期间用搅拌器以150rpm的转速搅拌，煎煮结束后过滤，收集上清液，将上清液冷冻干燥72h得到初步提取物SCRS01，将初步提取物SCRS01复溶到20倍体积去离子水中，使用2M的盐酸和2M的氢氧化钠溶液依次将初步纯化的样品的pH值调节至0.8，2.8，4.8和12.8，每次调节完pH值后将样品溶液置于水浴锅中在40℃的条件下孵育3h，5000g离心15min去除沉淀，将样品溶液的pH值调调至6.8，得到样品液SCRS02，对SCRS02进行分级醇沉，200rpm搅拌过程中逐滴加入无水乙醇，使样品溶液中的乙醇含量达到45%，将样品于6℃静置10h，6000g离心10min取上清，重复上述操作，继续向上清液中逐滴加无水乙醇，使样品溶液中乙醇含量依次达到66%，75%和85%，取最终的上清液，70℃负压干燥，得到次级纯化样品SCRS03，将次级纯化样品SCRS03复溶于20倍体积去离子水中，使用凝胶柱层析法进行层析，选用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50，柱床为2×30cm，上样量为柱床体积的6%，洗脱液为去离子水，用量为柱床体积的两倍，流速为7μl/s，收集前20%的洗脱样品，冷冻干燥72h即得本发明SCRSC。

实施例3

将500g新鲜沙蚕置于筛网中用蒸馏水冲洗, -20℃冻融处理2次后将沙蚕匀浆破碎（150W，7min），补加匀浆液3倍体积的蒸馏水，静置1h，加热至沸腾3h，煎煮期间用搅拌器以150rpm的转速搅拌，煎煮结束后过滤，收集上清液，将上清液冷冻干燥48h得到初步提取物SCRS01，将初步提取物SCRS01复溶到30倍体积去离子水中，使用3M的盐酸和3M的氢氧化钠溶液依次将初步纯化的样品的pH值调节至1.2，3.2，5.2和13.2，每次调节完pH值后将样品溶液置于水浴锅中在70℃的条件下孵育0.5h，5000g离心20min去除沉淀。将样品溶液的pH值调调至7.2，得到样品液SCRS02，对SCRS02进行分级醇沉，300rpm搅拌过程中逐滴加入无水乙醇，使样品溶液中的乙醇含量达到55%，将样品于8℃静置8h，8000g离心10min取上清，重复上述操作，继续向上清液中逐滴加无水乙醇，使样品溶液中乙醇含量依次达到66%，75%和85%，取最终的上清液，80℃负压干燥，得到次级纯化样品SCRS03，将次级纯化样品SCRS03复溶于30倍体积去离子水中，使用凝胶柱层析法进行层析，选用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50，柱床为2×30cm，上样量为柱床体积的8%，洗脱液为去离子水，用量为柱床体积的两倍，流速为7μl/s，收集前20%的洗脱样品，冷冻干燥48h即得本发明SCRSC。

抗血栓研究

本发明探究了SCRSC对血栓性疾病的重要诊断指标之一——凝血四项时间的影响，结果证明，随着SCRSC浓度的增加，所有检测项目的时间均明显延长，表明SCRSC可以延长凝血时间，具有显著的抗血栓作用，因此在抗血栓药品和保健品开发方面具有良好的应用前景。

Claims

1.本发明公开了一种沙蚕抗血栓活性物质的制备方法，其特征是采用鲜活沙蚕为原料，将鲜活沙蚕-20℃冻融处理，沸水煮提初步提取物，其后依次通过盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值进行等电点沉聚，加入无水乙醇分级沉降和Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱层析的方法分离得到本产品。

2.根据权利要求1所述的沙蚕抗血栓活性物质的制备方法，其特征是鲜活沙蚕反复冻融次数为1-2次，沸水煮提时间为0.5-3h，等电点沉聚过程中用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值依次至0.8-1.2、2.8-3.2、4.8-5.2和12.8-13.2，乙醇分级沉降过程中，使溶液中乙醇的浓度依次达到45-55%、60-66%、70-75%、80-85%，Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱层析过程中，上样体积为柱床体积的5%-8%。