KR20090071629A

KR20090071629A - 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형 다당류의 정제 방법

Info

Publication number: KR20090071629A
Application number: KR1020097009585A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 더글라스 발러; 에릭 헬러 휴즈; 추-순 리
Original assignee: 와이어쓰
Priority date: 2006-10-10
Filing date: 2007-10-09
Publication date: 2009-07-01
Also published as: HK1174836A1; JP5260531B2; CA2665169C; IL233893A0; DE602007007642D1; KR101467002B1; CN101522906A; AU2007307800B2; CN102648979A; AU2007307800C1; CN101522906B; CA2665169A1; JP2010505963A; BRPI0717834B8; US7659090B2; ATE473289T1; MX2009003730A; RU2009112453A; RU2460539C2; AU2007307800A1

Abstract

본 발명은 용해후 가열 또는 pH 조절에 관한 단계들을 포함하는 제3 혈청형 다당류를 포함하는 복합 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하는 개선된 방법을 제공한다. 몇몇 방법에서, 상기 용해물은, 상기 용해물에 존재하는 단백질을 변성시키고 이들의 응집 및 침전을 일으키기에 충분한 시간 동안 충분한 온도에서 가열된다. 한 양태에서, 상기 용해물을 30분 이상 동안 60℃ 이상으로, 보다 특히 약 30분 내지 약 50분 동안 약 60℃ 내지 약 70℃로, 보다 더 특히 약 40분 동안 약 65℃로 가열하여 단백질을 응집 및 침전시킨다. 다른 방법에서, 상기 용해물 또는 여과물의 pH를 8.0 이상으로, 보다 특히 약 8.0 내지 약 8.4로, 보다 더 특히 약 8.2로 증가하여 여과능을 개선시킨다. 추가의 방법에서, 가열 및 pH 조절 단계가 조합되어, 단백질의 응집 및 침전을 야기할 뿐만 아니라 상기 용해물 및 여과물의 여과능을 개선시킨다. 다른 방법에서, 상기 용해물 또는 여과물의 pH를 약 3.0 내지 약 5.0으로 낮추어 단백질을 응집 및 침전시킨다. 이러한 방법은 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 용해물 또는 여과물을 생성할 수 있게 한다.

스트렙토코쿠스 뉴모니애, 제3 혈청형 다당류, 단백질 불순물 제거, 여과능.

Description

스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형 다당류의 정제 방법 {Purification of Streptococcus pneumoniae type 3 polysaccharides}

본 발명은, 가열 또는 pH 조절 단계를 포함하는, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 복합 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 용해물 또는 여과물(centrate)로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.

유기체 스트렙토코쿠스 뉴모니애(이는 또한 폐렴구균(pneumococcus)으로도 공지되어 있다)에 의해 야기된 침투성 질환의 예방에 관한 다가 접합 폐렴구균 백신의 제조에서, 소정의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형이 성장하여 백신 생성에 필요한 다당류를 공급한다. 상기 세포는 나트륨 데옥시콜레이트(DOC) 또는 또 다른 용해제의 첨가에 의해 발효 말기에 용해가 유도되는 대형 발효기에서 성장한다. 이어서, 용해물 브로쓰(broth)를 수집하여 하류(downstream)에서 정제하고, 세균 세포를 둘러싼 협막 다당류를 회수한다. 운반체 단백질과의 접합 후, 상기 다당류를 최종 백신 제품에 포함시키고 소정의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형에 대한 백신 표적 군집에서의 면역성을 부여한다.

이러한 방법에서 제조된 세포 용해물이 표적 다당류를 함유함에도 불구하고, 이는 DNA, RNA, 단백질 및 잔여 배지 성분들을 포함하는 다량의 세포 조직파편도 함유한다. 기존의 공정은 용해제와 불순물 일부의 석출을 돕기 위해 아세트산을 첨가함으로써 용해물의 최소 pH를 6.6으로 감소시키는 단계를 포함하였다. 상기 물질은 원심분리된 후 여과에 의해 고형분의 대부분이 0.45㎛의 공칭 크기까지 제거된다. 그러나, 이러한 기존 가공 방법은 불순물을 최소 한도로 감소시키며, 후속적으로 정제된 다당류 규격을 충족시키기 위해 가용성 단백질을 제거하는 데 있어서 어려움이 있다.

가용성 단백질의 오염에 대한 높은 부담은 특정한 혈청형에 대한 수행에 있어서 특히 문제가 되어 왔다. 일부 혈청형, 특히 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형은 세포 용해에 대해 성장 배지 속으로 방출되는 커다란 점성 다당류 쇄(예를 들면, 제3형의 경우, 2 내지 3백만 달톤의 글루코즈/글루쿠론산의 쇄)를 생성한다. 이의 점도는 원심분리 후 여과를 어렵게 하며, 이러한 경우, 정제 공정을 통한 단백질 제거가 불충분하여 수행 불능을 유도한다.

따라서, 복합 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물, 특히 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형 다당류를 포함하는 용해물로부터 단백질 불순물을 제거하는 개선된 방법이 요구된다.

발명의 개요

제3 혈청형 다당류를 포함하는 복합 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하는 개선된 방법이 제공된다. 한 방법에서, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물은, 상기 용해물에 존재하는 단백질을 변성시키고 이들의 응집 및 침전을 일으키기에 충분한 시간 동안 충분한 온도에서 가열된다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 본 방법은 1) 상기 용해물을 30분 이상 60℃ 이상으로 가열하여 단백질을 응집 및 침전시키는 단계 및 2) 상기 용해물로부터 침전물을 분리시키는 단계를 포함하며, 이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 용해물이 생성된다. 특정 양태에서, 상기 용해물은 약 30분 내지 약 50분 동안 약 60℃ 내지 약 70℃로 가열된다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 용해물은 약 40분 동안 약 65℃로 가열된다. 추가의 양태에서, 상기 분리 단계는 멤브레인 필터, 특히 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터를 사용하여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 분리 단계는 심층 여과 필터(depth filter)를 사용하여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 용해물로부터 침전물을 분리하는 단계는 상기 용해물을 원심분리하여 침전물을 제거하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물의 pH 조절을 포함하는 단계를 포함하여, 상기 용해물 또는 여과물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하는 방법이 제공된다. 이러한 양태에서, 상기 pH 조절 단계는 여과능을 개선시킨다. 특정 양태에 서, 상기 용해물 또는 여과물의 pH는 여과 전 8.0 이상으로 증가하며, 특히 여과 전 약 8.0 내지 약 8.4로 증가하고, 보다 특히 여과 전 약 8.2로 증가한다. 추가의 양태에서, 상기 여과 단계는 멤브레인 필터, 특히 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터를 사용하여 상기 용해물 또는 여과물을 여과하는 과정을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 여과 단계는 심층 여과 필터를 사용하여 상기 용해물 또는 여과물을 여과하는 과정을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물의 가열 단계를 상기 용해물 또는 상기 용해물의 원심분리에 의해 생성된 여과물의 pH 조절을 포함하는 단계와 조합하여 포함하는, 상기 용해물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하는 방법이 제공된다. 이러한 양태에서, 상기 pH 조절 단계는 여과능을 개선시킨다. 따라서, 한 양태에서, 상기 방법은 1) 상기 용해물을 30분 이상 동안 60℃ 이상으로 가열하여 단백질을 응집 및 침전시키는 단계, 2) 상기 용해물을 원심분리하고 침전된 단백질을 상기 용해물로부터 분리하여 여과물을 생성하는 단계, 3) 상기 여과물의 pH를 8.0 이상으로 증가시키는 단계, 및 4) 상기 여과물을 여과하는 단계를 포함하며, 이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 여과물이 생성된다. 특정 양태에서, 상기 용해물은 원심분리 전 약 30분 내지 약 50분 동안 약 60℃ 내지 약 70℃로 가열되며, 보다 특히 약 40분 동안 약 60℃로 가열된다. 또 다른 양태에서, 상기 여과물의 pH는 여과 전 약 8.0 내지 약 8.4로, 특히 약 8.2로 증가된다. 추가의 양태에서, 상기 여과 단계는 멤브레인 필터, 보다 특히 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터를 사용하 여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 여과 단계는 심층 여과 필터를 사용하여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 단백질을 응집 및 침전시키는 pH 조절 단계를 포함하여, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하는 방법이 제공된다. 이러한 양태에서, 상기 방법은 1) 상기 용해물의 pH를 약 3.0 내지 약 5.0으로 낮추어 단백질을 응집 및 침전시키는 단계, 2) 상기 용해물을 원심분리하고 침전된 단백질을 상기 용해물로부터 분리하여 여과물을 생성하는 단계, 3) 상기 여과물의 pH를 8.0 이상으로 증가시키는 단계, 및 4) 상기 여과물을 여과하는 단계를 포함하며, 이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 여과물이 생성된다. 특정 양태에서, 상기 용해물의 pH를 원심분리 전 약 3.0으로 낮춘다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 여과물의 pH는 여과 전 약 8.0 내지 약 8.4로, 보다 특히 약 8.2로 증가시킨다. 추가의 양태에서, 단백질을 응집 및 침전시키는 pH 조절 단계는 상기 용해물을 30분 이상 동안 60℃ 이상으로, 보다 특히 약 30 내지 약 50분 동안 약 60 내지 약 70℃로, 심지어 보다 특히 약 40분 동안 약 60℃로 가열하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 양태에서, 상기 여과 단계는 멤브레인 필터를 사용하여, 보다 특히 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터를 사용하여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 여과 단계는 심층 여과 필터를 사용하여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거하는 단계를 포함한다.

도 1은 제3 혈청형 용해물에 대한 다양한 가열 조건 및 유지 시간의 실험실 연구로부터의 다당류 수율을 도시한다. 데이타는 처리된 샘플의 상대% 단백질 손실을 나타내기 위해 가열되지 않은 공정 샘플로부터의 값의 %로서 나타내었다(100%는 손실이 없는 것에 상응한다).

도 2는 제3 혈청형 용해물에 대한 다양한 가열 조건 및 유지 시간의 실험실 연구로부터의 단백질 수율을 도시한다. 데이타는 처리된 샘플의 상대% 단백질 손실을 나타내기 위해 가열되지 않은 공정 샘플로부터의 값의 %로서 나타내었다(100%는 손실이 없는 것에 상응한다).

도 3은 제3 혈청형 용해물 중의 단백질(위쪽) 및 다당류(PS, 아랫쪽) 농도에 대한 시간(왼쪽) 및 온도(오른쪽)의 영향에 대한 조절된 응답 그래프를 도시한다. "조절된 PS%" 및 "조절된 단백질%" 값은 시간 = 0분 및 실온(이는 단백질 및 다당류 농도에 대해 100% 값을 나타낸다)과 비교해서 다양한 시간 및 온도에서 각각 다당류 농도% 및 단백질 농도%를 나타낸다.

도 4는 온도 및 시간 조건에 의해 플롯팅된 제3 혈청형 용해물로부터의 단백질 전체 %의 등고선 플롯을 도시한다. 잔여 가용성 단백질의 %는 상기 그래프 상의 곡선 막대로 나타낸다. 30 내지 50분 동안 60 내지 70℃의 범위는 박스로 강조된다.

도 5는 열처리된 세포 용해물로부터의 가용성 단백질 제거를 도시한 SDS- PACE 겔을 도시한다. 열처리되지 않은 레인은 왼쪽(IPPPN3-007)이고, 열처리된 레인은 오른쪽(IPPPN3-011)이다.

도 6은 열처리된 제3 혈청형 용해물(오른쪽)과 열처리되지 않은 제3 혈청형 용해물(왼쪽)을 침전 침강에 대한 동일한 시간에 따라 비교한 사진을 도시한다.

도 7은 다당류(PS) 농도, 단백질 농도, 및 제3 혈청형 여과물의 상대적인 여과능을 여과물 pH의 함수로서 나타낸 그래프를 도시한다. 5회의 실험 수행에 상응하는 막대 그래프 다섯 그룹이 도시되어 있다. 다당류 농도(mg/mL) 및 단백질 농도(g/10L) 값은 왼쪽 y 축에 제공된다. 상대적인 여과능 값은 오른쪽 y 축상에 제공되며, 이는 0.45㎛ 시린지(syringe) 필터를 통해 상기 제3 혈청형 여과물 약 3mL를 미는 데 필요한 상대적인 힘에 상응한다(1 = 용이함, 5 = 어려움).

도 8은 여과물 pH의 함수로서 심층 여과 필터를 통해 제3 혈청형 여과물 샘플의 시간 경과에 따른 유속을 비교한 그래프를 도시한다. 유속(y축)은, 시간(분)이 상기 분에서 필터를 통과하는 여과물의 총 중량(g)으로 나눈, 각각의 여과 시간(분)에 대한 비를 계산함으로써 측정되었다(상기 비가 낮을 수록 상기 유속이 더 높아진다), 여과물 샘플은 상이한 pH 수준(5.0 내지 8.5)으로 조절되고 상이한 상압 조건(5 내지 20lb/in²(psi))하에 상기 필터를 통해 가압된다.

본 발명은 용해후 가열 또는 pH 조절에 관한 단계를 포함하는 제3 혈청형 다당류를 포함하는 복합 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 특정 방법에서, 상기 용해물을, 상기 용해물에 존재하는 단백질을 변성시키기에 충분한 시간 동안 충분한 온도에서 가열되어 이들을 응집 및 침전시킨다. 기타 방법에서, 상기 용해물, 또는 상기 용해물을 원심분리시켜 생성한 여과물은 단백질을 여과능을 개선시키거나 단백질을 응집 및 침전시키기 위해 pH 조절된다. 추가의 방법에서, 가열 및 pH 조절 단계는 조합되어 단백질을 응집 및 침전시킬 뿐만 아니라 상기 용해물 또는 응축물의 여과능을 개선시킨다. 이러한 방법은 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류를 함유하는 용해물 또는 여과물을 생성시킨다.

본원에서 사용되는 용어 "상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 용해물" 또는 "상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 여과물"은, 상기 용해물 또는 여과물의 상대 단백질 농도가 단백질 제거 전에 용해물 또는 여과물 중의 단백질의 농도에 비해 단백질이 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 1% 적도록 단백질이 제거된 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3 혈청형 용해물 또는 여과물을 지칭한다. 세포상 용해물 또는 여과물에서 단백질 농도의 정량화 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면, 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석, 크로마토그래피, 및 전기영동을 포함한다[참조: Deutscher, M.P.(ed.), Guide to Protein Purification, San Diego: Academic Press, Inc.(1990)].

한 양태에서, 본 발명은 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하기 위한 가열 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 열 노출은 다당류에 영향을 미치지 않으면서 단백질의 원래 구조를 파괴하고 이들을 변성시킨다. 후속적으로, 변성된 단백질을 응집 및 침전시켜, 용해물 분리를 개선시키고, 원심분리 또는 여과에 의해 고형분을 용이하게 제거할 수 있다. 이러한 가열단계는 상당 수준의 가용성 단백질 불순물을 함유하는 생물학적 혼합물로부터 임의의 열 안정성 다당류를 회수하거나 정제하는 데 효과적일 것이므로, 가용성 단백질 수준이 문제로 남는 임의의 액상(예를 들면, DNA, RNA, 다당류, 올리고당, 당류, 지방산 및 지질을 포함하는 생물학적 혼합물)에서 사용될 수 있다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하기 위한 방법으로서, 1) 상기 용해물을 15분 이상 또는 30분 이상 동안 50℃ 이상, 55℃ 이상 또는 60℃ 이상으로 가열하여 단백질을 응집 및 침전시키는 단계, 및 2) 상기 용해물로부터 침전물을 분리하는 단계를 포함하며, 이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 용해물이 생성되는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 용해물은 약 15분 내지 약 60분 동안 약 50℃ 내지 약 80℃로 가열된다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 용해물은 약 30분 내지 약 50분 동안 약 60℃ 내지 약 70℃로 가열된다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 용해물은 약 40분 동안 약 65℃로 가열된다. 하기 실험 부분에서 보다 상세하게 기술되는 바와 같이, 열 안정성 제3 혈청형 다당류의 경우, 80%를 넘는 단백질이 다당류를 최소한으로 손실하면서 40분 동안 65℃에서 가열에 의해 제거되었다. 추가의 양태에서, 상기 분리 단계는 상기 용해물로부터 단백질을 제거하거나 감소시키기 위한 원심분리 또는 여과를 포함한다. 특히, 하나의 양태에서, 상기 분리 단계는 멤브레인 필터, 특히 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터를 사용하여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 분리 단계는 심층 여과 필터를 사용하여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거함을 포함한다.

제3 혈청형 다당류의 정제와 같은 고용적 여과 공정에 통상적으로 사용되는 필터는 멤브레인(또는 표면) 필터 및 심층 여과 필터를 포함한다. 멤브레인 필터는 주로 크기 배제에 의해 작용하며, 여기서 멤브레인 필터의 세트 공극 크기에 비해 보다 큰, 여과될 용액 중의 모든 불순물이 필터 표면 위에 포획된다. 반면, 심층 여과 필터는 여과될 용액이 통과하는 랜덤(random) 다공성 구조를 갖는 섬유상 또는 과립상 매트릭스를 함유하며, 상기 매트릭스의 깊이를 통해 불순물의 랜덤 흡수와 기계적 포획을 통해 주로 작용한다. 본 발명의 방법 내에서, 멤브레인 필터와 심층 여과 필터는 둘 다 조합하여 사용될 수 있으며, 심층 여과 필터는 비교적 큰 불순물을 수집하고 표면 필터는 비교적 작은 불순물을 포획한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물의 pH 조절을 포함하는 단계를 포함하는, 상기 융해물 또는 상기 용해물의 원심분리에 의해 생성된 여과물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하기 위한 방법이 또한 제공된다. 이러한 양태에서, 상기 pH 조절 단계는 여과능을 개선시킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물의 "여과능"은 상기 용해물 또는 여과물이 멤브레인 또는 심층 여과 필터와 같은 필터를 통과하는 능력을 지칭한다. 그러므로, 용해물 또는 여과물의 개선된 여과능은, 예를 들면, 필터를 통과하는 상기 용해물 또는 여과물의 유속 증가, 상기 용해물 또는 여과물에 의한 필터 막힘 감소, 또는 소정 용적의 용해물 또는 여과물이 필터를 통과하는 데 필요한 압력의 감소와 연관된다.

제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물로부터 불순물을 제거하기 위한 기존의 방법은 아세트산을 첨가하여 상기 용해물의 최소 pH를 6.6으로 감소시킨 다음, 연속적으로 원심분리하고 0.45㎛까지 여과시키는 과정을 포함한다. 이러한 가공 방법은 상기 생성물을 정제 가공에 보내기 전 멤브레인 또는 심층 여과 필터를 통해 가용성 단백질을 제거하는 능력에 있어서 후속적인 어려움을 가지면서 최소한의 불순물 감소를 나타낸다. 그러나, 본 발명의 방법은, 이러한 고분자량 다당류의 여과능이 pH의 직접적인 함수로서 변경될 수 있다는 발견과 용해물 또는 여과물의 pH가 여과능을 개선시키면서도 다당류 제3 혈청형 분자량 크기 또는 관능성을 현저하게 손실시키지 않는다는 발견에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 한 양태에 있어서, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물, 또는 상기 용해물의 원심분리에 의해 생성된 여과물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하기 위한 방법으로서, 여과 전 상기 여과물 또는 용해물의 pH를 8.0 이상으로 증가시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 상기 여과물 또는 용해물의 pH는 여과 전 약 8.0 내지 약 8.4, 보다 특히 약 8.2로 증가된다. 상기 용해물 또는 여과물의 pH 조절 이후의 여과는 멤브레인 필터, 특히 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터를 사용하여 상기 용해물 또는 여과물을 여과시키는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 용해물 또는 여과물의 여과는 심층 여과 필터의 사용을 포함할 수 있다.

추가의 양태에서, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하기 위한 방법으로서, 용해물 가열 단계를 상기 용해물의 pH 조절을 포함하는 단계와 조합하여 포함하는 방법이 제공된다. 한 양태에서, 상기 방법은 1) 상기 용해물을 15분 이상 또는 30분 이상 동안 50℃ 이상, 55℃ 이상 또는 60℃ 이상으로 가열하여 단백질을 응집 및 침전시키는 단계, 2) 상기 용해물을 원심분리하고 상기 용해물로부터 침전된 단백질을 분리하여 여과물을 생성하는 단계, 3) 여과물의 pH를 8.0 이상으로 증가시키는 단계 및 4) 상기 여과물을 여과하는 단계를 포함하며, 이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 여과물이 생성된다. 특정 양태에서, 상기 용해물을 원심분리 전 약 15분 내지 약 60분 동안 약 50℃ 내지 약 80℃로 가열한다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 용해물은 원심분리 전 약 30분 내지 약 50분 동안 약 60℃ 내지 약 70℃로 가열된다. 추가 양태에서, 상기 용해물은 원심분리 전 약 40분 동안 약 65℃로 가열된다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 여과물의 pH는 원심분리 전 약 8.0 내지 약 8.4로, 보다 특히 약 8.2로 증가된다. 추가의 양태에서, 상기 여과 단계는 멤브레인 필터, 특히 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터를 사용하여 상기 여과물을 여과하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 여과 단계는 심층 여과 필터를 사용하여 상기 용해물을 여과하고 침전물을 제거함을 포함한다.

추가의 양태에서, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하기 위한 방법으로서, 단백질을 응집 및 침전시키는 pH 조절 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 한 양태에서, 상기 방법은 1) 상기 용해물의 pH를 약 5.0, 4.5, 3.5, 또는 3.0 미만으로, 또는 약 3.0 내지 5.0으로 저하시켜 단백질을 응집 및 침전시키는 단계, 2) 상기 용해물을 원심분리하고 상기 용해물로부터 침전된 단백질을 분리하여 여과물을 생성시키는 단계, 3) 상기 여과물의 pH를 8.0 이상으로 증가시키는 단계 및 4) 상기 여과물을 여과하는 단계를 포함하며, 이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 여과물이 생성된다. 특정 양태에서, 상기 용해물의 pH를 원심분리 전 약 3.0으로 저하시킨다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 여과물의 pH를 여과 전 약 8.0 내지 약 8.4로, 보다 특히 약 8.2로 증가시킨다. 특정 양태에서, 상기 여과 단계는 멤브레인 필터, 보다 특히 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터를 사용하여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 여과 단계는 심층 여과 필터를 사용하여 상기 용해물을 여과하여 침전물을 제거함을 포함한다.

추가의 양태에서, 제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하기 위한 방법으로서, 단백질을 응집 및 침전시키는 pH 조절 단계를 포함하고 추가로 단백질을 응집 및 침전시키도록 15분 이상 또는 30분 이상 동안 50℃ 이상, 55℃ 이상 또는 60℃ 이상으로 상기 용해물을 가열하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 상기 용해물은 원심분리 전 약 15분 내지 약 60분 동안 약 50℃ 내지 약 80℃로 가열된다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 용해물은 원심분리 전 약 30분 내지 약 50분 동안 약 60℃ 내지 약 70℃로 가열된다. 추가의 양태에서, 상기 용해물은 원심분리 전 약 40분 동안 약 65℃로 가열된다.

다음 실시예는 예시용으로 제공되었으며 이로 제한되지는 않는다.

스트렘토코쿠스 뉴모니애 제3형은 세포 용해시 성장 배지로 방출되는 매우 크고 점성이 있는 다당류를 생성한다. 이러한 용해는 현재 발효 말기에서 나트륨 데옥시콜레이트(DOC)로 유도된다. 제3형 다당류는 넓은 온도 및 pH 범위에 걸쳐서 매우 안정한 것으로 보이지만, 이의 점도로 인해 원심분리 후 여과하기 어려워지며, 이는 세포 비함유 브로쓰(CFB)의 낮은 회수를 유도한다. 하기 실시예는 단백질을 변성 및 석출하기 위한 용해후 가열 뿐만 아니라 상기 용해물의 여과능을 개선시키기 위한 pH 조절에 관한 연구를 기술한다.

실시예 1. 가열 단계

스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3 혈청형 회수를 위한 가열 단계의 이행은 정제 단계 전 단백질 로드를 감소시키려는 요구에 의해 촉발되었다. 정제된 다당류의 배치(batch)는 5% w/w 단백질/다당류의 세트 규격 수준을 넘는 잔여 단백질 수준으로 인해 배치로서 불합격이기 쉽다. 그러므로, 하기 실험용 연구는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3 혈청형의 정제 및 회수에서 가열 단계의 사용에 대한 효율 및 범위를 확인하기 위해 수행된다. 이러한 가열 단계를 포함하는 목적은 높은 다당류 수준을 유지하면서 단백질 수준를 감소시키는 것이다.

실험실에서, 파일럿 플랜트(pilot plant) 수행으로부터 수득한 발효 세포상 용해물 물질은 팔콘(Falcon)^TM 튜브(제조원: BD Biosciences, 미국 마이애미주 베드포드 소재) 속으로 분취되고, 수욕에서 다양한 온도로 가열된다. 연구된 온도는 50 내지 80℃의 범위이고, 유지 시간은 15분 내지 240분이다. 대조용 샘플은 주변 실온(약 21℃)에 남겨둔다. 이어서, 모든 샘플을 주변 조건에서 밤새 유지시키고, 이후 상기 샘플을 원심분리시키고 0.45㎛ 시린지 필터(HT 터프린(Tuffryn)^R 멤브레인 25mm 시린지 필터, 낮은 단백질 결합, 제조원: Pall Life Science, 미국 마이애미주 앤 아보 소재)를 통해 수행하여 다당류 및 단백질 분석을 위한 물질을 제공한다. 실험 데이타를 통계학적 소프트웨어 팩키지(Conerstone^TM, 제조원: Applied Systems Technologies, Inc., 미국 플로리다주 더넬론 소재)에 의해 분석하여 다당류 및 단백질 수준에 대한 온도 및 시간의 영향을 확인하였다.

다당류 및 단백질 분석

다당류 분석은 당해 분야에 익히 공지된 표준 방법론을 사용하여 HPLC- SEC(고성능 액체 크로마토그래피-크기 배제 컬럼)에 의해 수행하였다[참조: Aquilar, M. "HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols: Totowa, NJ: Humana Press(2004)]. 도 1은 다양한 가열 시간의 실험실 연구로부터의 다당류 수율을 도시한다. 보고된 데이타는 대조용 다당류 수준의 %이며, 100%는 손실 없음을 지시한다. 도 1에 도시한 바와 같이, 다당류 수율은 가열 시간 및 온도에 대해 안정하다.

파일럿 규모 데이타가 또한 수집되고 도 1에 "IPP" 약어로 표기된 데이타 포인트로서 도시된다. 열거된 시간은 가열 승온, 지정된 조건에서의 가열 유지, 및 냉각 주기를 반영한다. 이들 샘플은 실험실에서의 가열과 대비되는 실제 발효기에서의 열 가공 후 취해졌다. 파일럿 규모로 시험되는 상기 온도 및 시간 범위 내에서(30 내지 50분 및 60℃ 내지 70℃), 다당류 손실은 0 내지 18%이고, 대부분의 시험 손실은 10% 이하이다. 이는 상기 물질의 하류 가공에 허용되는 범위 내이다.

단백질 분석은 당해 분야에 널리 공지된 표준 SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 방법을 사용하여 수행하였다[참조: Walker, J.M. "The Protein Protocols Handbook" Totowa, NJ: Humana Press(2002)]. 상기 겔의 분석은 겔 이미징 시스템(gel imaging system)(랩웍스(Labworks)^TM V.3 소프트웨어를 갖는 UVP 이미지 형성기, 제조원: UVP Inc., 캐나다 업랜드 소재)의 조력하에 수행되어 단백질 표준에 대한 총 밴드(레인) 밀도를 해석한다.

도 2에 도시한 바와 같이, 50 내지 80℃의 온도가 실험실 규모와 파일럿 규 모 둘 다에서 연구된다("IPP" 약어로 지정된 데이타 포인트). 단백질 데이타는 처리된 샘플의 단백질 손실 상대%를 도시하기 위해 가열되지 않은 공정 샘플로부터의 대조 값에 대한 %로서 나타내었다. 15분의 가열 시간은 60℃의 온도에서 가열 침전을 통해 가용성 단백질의 60%를 제거하기에 충분하다(도 2 참조). 현저한 단백질 감소는 50℃ 및 55℃에서 일어나는 반면, 60℃는 보다 견고한 단백질 제거 수준으로 인해 파일럿 플랜트 작업을 위한 최소 온도로 설정된다.

도 3은 시간 및 온도에 의해 플롯팅된 단백질 및 다당류 농도의 조절된 응답 그래프를 도시한다. 도시된 데이타는 시간 = 0분 및 실온에서의 값(이는 단백질 및 다당류에 대한 100% 값을 나타낸다)과 비교한 다양한 시간 및 온도에서의 단백질 및 다당류 농도의 %를 나타낸다. 도 3에 도시한 바와 같이, 유지 온도는 가용성 단백질 제거에 현저한 영향을 미치는 반면, 유지 기간은 15분 유지 초과시 중요하지 않다. 다당류(PS) 수율의 경우, 시간과 온도는 둘 다 PS 손실(20% 미만, 이는 하류 가공에 허용된다)에 대해 제한된 영향을 나타낸다.

도 4는 온도 및 시간 조건에 의해 플롯팅된 제3 혈청형 용해물로부터의 단백질 전체%의 등고선 플롯을 도시한다. 잔여 가용성 단백질의 %는 상기 그래프 상의 곡선 막대로 도시하였다. 30 내지 50분 동안 60℃ 내지 70℃의 범위가 박스로 강조되었으며, 본원에 기술된 가열 단계의 실행에 선택된 바람직한 범위를 나타낸다. 그러나, 상술한 바와 같이, 보다 넓은 범위가 또한 분석되어 효과적인 것으로 나타내었다.

도 5는 파일럿 규모에서 상기 가열 단계의 시험에 따르는 가용성 단백질의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 왼쪽의 겔은 가열 단계 없는 파일럿 규모 발효 배치(IPPPN3-007)로부터의 결과를 도시하며, 회수 공정을 통한 비손상 단백질 수준(pH 조절 전, pH 조절 후, 원심분리 후, 및 탱크 pH 조절 후)을 도시한다. "탱크 pH 조절 후"는 여과 전 소정의 pH 수준으로의 조절 이후 상기 여과물의 유지 탱크로부터 취한 샘플을 지칭한다. 100킬로달톤(KD) 접선 유동 정제 한외여과(UF)(tangential flow purification ultrafitration) 공정을 사용하여, 원래의 현탁액 배지를 연속식 순환 및 여과를 사용하여 완충된 용액으로 서서히 대체한 다음, 상기 용액을 농축시킴으로써 용질을 100KD 미만으로 제거하였다. 이러한 UF 공정 단계에 따라, 배치 IPPPN3-007의 단백질 함량은 중량 대 중량 기준으로 31% 단백질/다당류에서 보고되었다. 정제 공정을 완료한 후 최종 단백질 수준은 9.9%(다당류에 대한 중량 대 중량 기준)이므로, 상기 배치는 5% 이하의 단백질의 최종 배치 여과물(FBC) 규격을 맞추는 데 불합격이다. 배치 IPPPN3-011의 경우, 30분 동안 60℃ 유지되는 가열 단계는 상기 용해물 유지 후 하류 가공 전에 포함되었다. 100K UF 여과 후 상기 단백질 수준은 6.7%이고, 상기 FBC 단백질 수준은 2.5%이며, 이는 FBC 약물 중간체 규격에 합격이었다. 도 5의 오른쪽 상의 겔 이미지에 지시된 바와 같이, 상기 가열 단계는 회수 작업 동안 단백질 수준을 현저하게 감소시켰다.

상기 가열 단계에 관한 파일럿 규모 데이타의 개요가 또한 표 1에 나타난다. 수행 -001, -004, -005, -007 및 -013이 가열 단계를 사용하지 않았다. 이들 수행 중에서, -001 및 -004만이 5중량% 이하의 표적 단백질 규격을 통과하며, 이는 UF 공정 단계 후 20 내지 35%의 단백질 로드를 제거하는 정제 공정의 어려움이 지속됨을 나타낸다. 수행 -011, -012, -014, -015 및 -017에 대한 표 1에 지시한 바와 같은 가열 유지 단계를 포함함에 의해, 단백질 로드는 상기 UF 공정 단계 후 3.1% 내지 6.7%로 감소되며, 정제된 다당류 중의 최종 단백질 수준은 0.6% 내지 2.5%였다.

다양한 가열 조건 및 유지 시간에 대한, 한외여과 이후의 최종 배치 여과물(FBC) 중의 단백질%

공정	배치	UF 단백질%	FBC 단백질%
비가열	IPPPN3-001	32	4.8
비가열	IPPPN3-004	35	3.5
비가열	IPPPN3-005	20	7.4
비가열	IPPPN3-007	31	9.9
비가열	IPPPN3-013	22	6.1
60℃/30분 가열	IPPPN3-011	6.7	2.5
70℃/50분 가열	IPPPN3-012	4.3	1.7
65℃/40분 가열	IPPPN3-014	3.1	0.9
65℃/40분 가열	IPPPN3-015	3.7	0.6
65℃/40분 가열	IPPPN3-017	3.4	1.7

상기 가열 단계의 실행은 또한, 보다 효율적인 원심분리를 허용하는 단백질의 응집을 증가시킴으로써 분리 효율을 개선시켰다. 이러한 단계의 효과는 도 6에 도시되며, 여기서 사진은 주변 조건에서 밤새 비진탕(non-agitated) 유지시킨 후 가열되지 않은 세포상 용해물(왼쪽) 및 가열된 세포상 용해물(오른쪽)의 비교를 제공한다. 상기 배지는 열처리에 따라 훨씬 더 맑아지는데, 이는 단백질이 더 많이 응집 및 침전됨을 반영한다.

상술한 데이타에 의해 도시된 바와 같이, 가열 단계의 포함은 다당류 생성을 위해 단백질 불순물을 제거하는 데 있어서 중요하였다. 최종 다당류는 5중량% 이하(단백질/다당류)의 약물 중간체 방출 기준을 충족시키며, 이는 열처리에 대한 생성물 안정성을 나타낸다.

실시예 2. pH 조절 및 여과 단계

프레브나르(Prevnar)^R 백신에 포함된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 다당류에 대한 기존의 여과는 세포상 용해물을 연속식 원심분리와 후속적인 심층 여과 및 멤브레인 여과를 포함한다. 상술한 바와 같이, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형은 용액 중에서 점성이고 기존의 가공 조건하에서 잘 여과되지 않는 거대 다당류이다. 이러한 여과 실패 때문에, 상기 다당류의 여과 특성을 개질시키는 작업이 수행된다. 그러므로, 제3 혈청형 다당류 용액의 여과능을 개선시키기 위한 수단을 확인하기 위한 연구가 수행되었다.

변수로서 pH를 사용하여, 단백질 제거에 대한 pH의 영향과 25mm 직경 0.45㎛ HT 터프린(Tuffryn)^R 시린지 필터(제조원: Pall Life Sciences, 미국 미시간주 앤 아버 소재)를 통한 제3 혈청형 용해액의 후속적인 여과능의 초기 연구가 실험실에서 수행되었다. 원심분리 전, 제3 혈청형의 발효 용해물의 샘플은 가용성 단백질을 제거하기 위한 시도에서 아세트산 또는 황산을 사용하여 6.6(2회의 실험 수행), 5.0(2회 실험 수행) 또는 3.0(1회 실험 수행)으로 pH 조절되었다. 용해물은 원심분리되고, pH가 3N NaOH(수산화나트륨 용액)을 사용하여 다음과 같이 조절되는 4가지 상태 중의 하나의 상태로 팔콘(Falcon)^TM 튜브(제조원: BD Bioscience, 미국 마이애미 주 베드포드 소재)들 속으로 분취된다: 1) 대조용(pH 조절되지 않음); 2) pH가 7.0으로 조절됨; 3) pH가 8.0으로 조절됨; 4) pH가 9.0으로 조절됨. 이어서, 여과물은 약 3mL의 물질을 여과하는 데 필요한 상대적인 힘에 의해 0.45㎛ 시린지 필터를 통과하도록 밀린다.

상술한 5회의 실험 수행으로부터의 결과는 도 7에 도시되어 있으며, 도 7은 다당류(PS) 농도, 단백질 농도, 및 여과물 pH의 함수로서의 제3혈청형 여과물의 상대적인 여과능의 그래프를 도시한다. 다당류 농도(mg/mL) 및 단백질 농도(g/10L) 값은 왼쪽 y축 상에 제공된다. 상대적인 여과능 값은 오른쪽 y축 상에 제공되며, 이는 제3 혈청형 여과물 약 3mL를 0.45㎛ 시린지 필터를 통과하도록 미는데 필요한 상대적인 힘에 상응하며, 1 내지 5의 척도(1 = 용이함, 5 = 어려움)로 나타낸다. 도 7에 도시한 바와 같이, 실험 수행 중의 하나를 제외한 전부에서 보다 높은 pH 수준은 개선된 여과물 여과능과 관련되었다. 도 7에 도시된 결과는 또한, 3.0의 매우 낮은 pH가 단백질을 성공적으로 제거할 수 있지만 여과의 어려움의 증가와 관련됨을 나타낸다.

확인된 pH의 영향에 대하여, 여과 성능에 대한 pH의 영향을 측정하기 위한 조절된 실험실 연구가 후속적으로 수행되었다. 후-여과물 물질(post-centrate material)은 파일럿 플랜트 수행으로부터 수득되며, 실험실에서 재원심분리되었다. 상기 용해물이 분할되며, 5.0 내지 8.5의 범위로 pH 조절되었다. 상기 용해물은 상압이 인가되는 가압 용기에 놓였다. 상기 용해물을 CUNO 60SP 심층 여과 필터(제조원: CUNO Inc., 미국 코넥티컷주 메리덴 소재) 상에서 튜빙(tubing)을 통과시켜, 상기 필터의 성능을 분석하였다. 이는 시험된 각각의 pH(5.0 내지 8.5)에 대해 상이한 상압 조건(5 내지 20lb/in²(psi))하에 수행되었다. 결과는 도 8에 도시되며, 상기 결과는 심층 여과 필터를 통과하는 제3 혈청형 여과물 샘플의 시간 경과에 따른 유속을 여과물 pH의 함수로 비교한 것이다. 유속(y축)은, 시간(분)을 상기 시간(분)에서의 필터를 통과하는 여과물의 총 중량(g)으로 나눈 각각의 여과 시간(분)에 대한 비를 계산함으로써 측정하였다(상기 비가 낮을수록 유속이 더 빨라진다). 도 8에 도시된 바와 같이, 7.0 내지 8.5의 상승된 pH에서의 가공은, 동일한 상압 조건(10psi)하에서의 5.0 또는 6.0의 보다 낮은 pH에서의 가공과 비교하여 유속이 보다 빨라진다. 8.0의 pH에서, 10psi 또는 20psi의 상압은 또한 5psi에 서와 비교하여 보다 빠른 유속과 관련된다.

상술한 pH 조절 단계를 혼입한 파일럿 규모의 수행이 수행된다(표 2에서 하기 열거된 파일럿 규모의 수행). 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형 접종물을 함유하는 종균 배양병(seed bottle)을 발효기에서 성장시켰다. 상기 세포는 화학적으로 용해되며, 상기 용해물은 원심분리되거나, 열처리된 다음 원심분리된다. 원심분리에 이어서, pH가 조절되며(IPPPN3-015 수행 제외), 상기 용해물은 심층 여과 필터 및 0.45㎛ 멤브레인 필터를 통해 여과된 다음, 하류로 보내져 정제된다. 다양한 수행으로부터 용해물을 가공하는 데 필요한 필터의 수가 여과능의 척도로서 사용되었다(여과능이 낮을수록, 필터 막힘이 더 빈번해지고 상기 용해물을 가공하는 데 필요한 필터의 수가 더 많아진다). 표 2는, 7.5 또는 그 이상의 상이한 pH로 조절되는 다양한 수행으로부터 용해물을 가열하거나 가열하지 않으면서 가공하는 데 단 하나의 심층 여과 필터 및 하나의 멤브레인 필터가 필요함을 보여준다. 수행 -015에 대해, 여과능에 대한 pH 6.6의 영향이 평가되었다. 기재된 바와 같이, 수행 -015의 경우, 단지 37L를 가공하는 데 3개의 필터 세트가 필요했다. 수행 -015 내에서 단백질 제거를 위한 가열 단계가 존재함에도 불구하고 이러한 결과가 얻어졌다. 수행 -015로부터의 나머지 용해물 물질을 pH 8.2로 조절한 후, 필터의 한 세트로 나머지 68L를 가공하였다.

도 7 및 도 8에 제시된 실험실 데이타 및 파일럿 플랜트의 pH 조절능에 기초하면, 제3 혈청형 용해물의 여과능 개선을 위한 공정 작업용으로 8.2 ±0.2의 바람직한 pH 범위가 확인된다.

본원에서 단수 표현이 사용되었어도 단수 뿐만 아니라 복수(즉, 하나 이상)도 지칭하는 것이다. 예를 들면, "하나의 부재(an element)"는 하나 이상의 부재를 의미한다.

본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허원은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가 수준의 지표이다. 본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허원은 각각의 개별 공보 또는 특허원이 구체적이고 개별적으로 참고로 인용되는 것으로 지시되는 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 인용된다.

전술한 발명이 이해를 명확하게 할 목적으로 설명 및 예를 통해 보다 상세하게 기술되었으나, 다소의 변화 및 수정이 첨부된 청구의 범위 내에서 실행될 수 있다.

Claims

제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 용해물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하는 방법으로서,

a) 상기 용해물을 30분 이상 60℃ 이상으로 가열하여 단백질을 응집 및 침전시키는 단계, 및

b) 상기 용해물로부터 침전물을 분리시키는 단계를 포함하며,

이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 용해물이 생성되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물을 약 60℃ 내지 약 70℃로 가열함을 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물을 약 30분 내지 약 50분 동안 가열함을 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물을 약 40분 동안 약 65℃로 가열함을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 b)가 상기 용해물을 여과하여 상기 용해물로부터 침전물을 제거함을 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 용해물이 멤브레인 필터 및 심층 여과 필터(depth filter)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 필터를 사용하여 여과되는 방법.
제6항에 있어서, 상기 멤브레인 필터가 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터인 방법.
제1항에 있어서, 단계 b)가 상기 용해물을 원심분리하여 상기 용해물로부터 침전물을 제거함을 포함하는 방법.
제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물 또는 여과물(centrate)로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하는 방법으로서,

a) 상기 용해물 또는 여과물의 pH를 8.0 이상으로 증가시키는 단계, 및

b) 상기 용해물 또는 여과물을 여과하는 단계를 포함하며,

이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 용해물 또는 여과물이 생성되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 용해물 또는 여과물의 pH가 여과 전에 약 8.0 내지 약 8.4의 범위로 증가되는 방법.
제10항에 있어서, 상기 용해물 또는 여과물의 pH가 여과 전에 약 8.2로 증가되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 용해물이 멤브레인 필터 및 심층 여과 필터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 필터를 사용하여 여과되는 방법.
제12항에 있어서, 상기 멤브레인 필터가 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터인 방법.
제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하는 방법으로서,

a) 상기 용해물을 30분 이상 동안 60℃ 이상으로 가열하여 단백질을 응집 및 침전시키는 단계,

b) 상기 용해물을 원심분리하고 침전된 단백질을 상기 용해물로부터 분리하여 여과물을 생성하는 단계,

c) 상기 여과물의 pH를 8.0 이상으로 증가시키는 단계, 및

d) 상기 여과물을 여과하는 단계를 포함하며,

이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 여과물이 생성되는 방법.
제14항에 있어서, 단계(a)가 상기 용해물을 약 60℃ 내지 약 70℃로 가열함을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물을 약 30분 내지 약 50분 동안 가열함을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물을 약 40분 동안 약 60℃로 가열함을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 단계 c)가 상기 여과물의 pH를 약 8.0 내지 약 8.4로 증가시킴을 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 단계 c)가 상기 여과물의 pH를 약 8.2로 증가시킴을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 단계 d)가 멤브레인 필터 및 심층 여과 필터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 필터를 사용하여 상기 여과물을 여과하는 과정을 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 멤브레인 필터가 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터인 방법.
제3 혈청형 다당류를 포함하는 세포 스트렙토코쿠스 뉴모니애 용해물로부터 단백질 불순물을 감소시키거나 제거하는 방법으로서,

a) 상기 용해물의 pH를 약 3.0 내지 약 5.0으로 낮추어 단백질을 응집 및 침전시키는 단계,

b) 상기 용해물을 원심분리하고 침전된 단백질을 상기 용해물로부터 분리하여 여과물을 생성하는 단계,

c) 상기 여과물의 pH를 8.0 이상으로 증가시키는 단계, 및

d) 상기 여과물을 여과하는 단계를 포함하며,

이로써 상당히 정제된 제3 혈청형 다당류-함유 여과물이 생성되는 방법.
제22항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물의 pH를 약 3.0으로 낮추어 단백질을 응집 및 침전시킴을 포함하는 방법.
제22항에 있어서, 단계 c)가 상기 여과물의 pH를 약 8.0 내지 약 8.4로 증가시킴을 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 단계 c)가 상기 여과물의 pH를 약 8.2로 증가시킴을 포함하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 여과물을 멤브레인 필터 및 심층 여과 필터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 필터를 사용하여 여과하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 멤브레인 필터가 0.45㎛ 공극 크기 멤브레인 필터인 방법.
제22항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물을 30분 이상 동안 60℃ 이상으로 가열함을 추가로 포함하는 방법.
제22항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물을 약 60℃ 내지 약 70℃로 가열함을 추가로 포함하는 방법.
제22항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물을 약 30분 내지 약 50분 동안 가열함을 추가로 포함하는 방법.
제22항에 있어서, 단계 a)가 상기 용해물을 약 40분 동안 약 60℃로 가열함을 추가로 포함하는 방법.