JPS6040831B2 - 微生物培養液の処理方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、低分子量発酵生成物の限外炉過法による処理
方法に関する。

さらに詳しくは、微生物培養液より低分子量生成物を分
離するに際し、該培養液の液性を調整することにより凝
集する蛋白質等の爽雑物と微生物を、限外炉適法により
同時に単一の操作で分離除去し、微生物の除去と蛋白分
離のプロセスの合理化を可能にしようとするものである
。従来、微生物培養反応で生成した低分子生成物と微生
物の分離は、ドラバル型遠心分離器あるいはプレスフィ
ルター等が専ら使用されていた。

ドラバル型遠心分離器では、該培養液は微生物を含む重
液側と生成物を含む軽液側に分けられる。童液側は培養
液と同濃度の生成物を含むため、さらに適量の水を補給
して微生物の洗浄を行い、再度遠心分離器にかけ、重液
と軽液に分離し、生成物を水と共に回収する。この操作
を数度繰り返し、生成物を可能な限り収率よく回収する
。生成物は水で相当量希釈したものとして回収される。
遠心分離器を用いる場合、重液側には微生物のみが移行
し、竪液側には主生成物である低分子量反応物や炭素源
としての糟類等の低分子物の他に、該微生物反応の副生
成物の各種蛋白質や糠類等の高分子物、さらには該微生
物の破片やコロイド状物質などが移行する。また微生物
体内に目的とする生成物が存在する場合には、細胞壁を
トルェン等の薬品により破壊し、生成物を取り出すこと
が必要であり、この場合には、微生物体内より，細胞組
織がコロイド状物質となり系内に多量漏出し、これが軽
液側に移行する。以上の如く、遠Ｄ分離の軽液側には、
低分子量及び高分子量反応生成物や種々のコロィダル物
質が含まれており、繁雑なプロセスを経なければ、目的
とする低分子量生成物を得ることはできない。

さらにこれらの蛋白質やコロィダル物質は、後のイオン
交換樹脂や活性炭に付着し易く、種々の悪影響を及ぼす
。また微生物分離にプレスフィルターあるいはプレコー
トフィルターを使用する場合、炉液側には低分子量生成
物に加え、副生成物の高分子物や細胞の破片等は言うま
でもなく、微生物の一部も漏出する。以上の如く、従来
法では微生物除去工程の後、さらに除蛋白、除濁等の精
製工程が必要である。

特に該生成物が医薬品に用いられる場合は、アレルギー
等の副作用を示す高分子物あるいは発熱物質等の厳密な
除去が要求される。通常の除蛋白工程には、生成物の性
質や用途によるが、Ｐ苗調整による等電点沈澱、イオン
交換樹脂による吸着、生石灰処理あるいはタンニン処理
等が多用されている。

しかしながら、これら単一の操作だけではその目的は達
せられない。さらにまた等亀点沈澱の場合、凝集した蛋
白除去のため、炉過助剤を加えてプレスフィルターある
いはプレコート炉過処理等が必要であり、炉過助剤の溶
解操作、フィルターの洗浄及び炉連処理等の操作も繁雑
である等のか）えている問題も多い。また凝集した爽雑
物を粉末活性炭を加えてプレスフィルター炉遇する場合
、脱色されるが同時に目的とする低分子量生成物の吸着
ロスも相当認められ、低分子物の精製収率は低くなる。
本発明者らは、従来方法の微生物除去の不完全性、さら
に高分子副生成物、細胞よりのコロィダル物質の除去及
び効率に関しての分離方法を詳細に検討した結果、本発
明に到達した。

即ち、本発明は、微生物を該培養液から分離するに際し
、限外炉適法を適応することにより、微生物や微生物細
胞より漏出したコロィダル物質を完全に除去すると共に
、微生物の創生する高分子量物質を同時除去する方法で
あり、その際、該培養液の液性を調整することにより、
高分子量物質を凝集させ、その除去率を高めることが骨
子である。限外炉過勝とは膜表面に数十オングストロー
ムから数百オングストロームの微細なポアを持つ半透膜
であり、それを適応すれば、そのボアにより低分子量物
質と高分子量物質を選択的に分離できるばかりでなく、
さらに粒子の大きい各種コロィダル物質、ウイルス、バ
クテリア及び酵母とその胞子等を分離することができる
。

微生物培養液に限外炉過法を使用し、低分子量生成物を
取り出す場合、微生物、微生物の破砕物、微生物の細胞
を構成している微粒子、微生物の放出した各種蛋白質や
高分子量糖類、及び培地中の爽雑コロィダル物質や蛋白
質等を、該低分子量生成物と分離することができる。

通常、限外炉適法を微生物培養液陛下で適応する場合、
低分子化合物と微生物及びコロイダル物質は完全に分離
除去されるが、蛋白質の分離は満足できるものではない
。

その理由として、微生物から生成される蛋白質種は数多
〈、その化学的性質、分子の形状及び分子量分布等が多
岐にわたり、しかも、該培養液に含まれるブロテアーゼ
の作用により経時的に分解される等、非常に複雑な組成
になっているためである。しかしながら、本発明者らは
、蛋白質が等露点を持つことに着目し、新事実を見し、
出した。

すなわち、限外炉過法を適応する際に単に培養条件の液
性で処理するのでなく、液性ををアルカリ性あるいは酸
性に調整して、蛋白質を等露点による等霞点沈澱あるい
は等亀点付近による蛋白質分子の集合、粗大化させて限
外炉過処理すれば、蛋白質の除去効果が大幅に上昇する
。さらに限外炉過処理により得られた炉液の液性を、上
述とは逆の酸性またはアルカリ性に調整すると、上述の
液Ｉ性では可溶性であり逆の液性側に等電点をもつ蛋白
質は、凝集あるいは粗大化し、限外炉過処理により十分
に分離される。しかも、蛋白質が凝集する際、他の爽雑
高分子物質を吸豚沈澱を起す効果があり、本発明の方法
は、単なる限外炉過の適応に比べ、非常に効果的な蛋白
質等の除去手段になることが明確となった。本発明に用
いる限外炉過膜は、通常の半透膜素材でよく特に問わな
い。

セルローズアセテート系のものは、ＰＨ範囲が３〜８ま
でゞ適応範囲が限られる。ポリアミド、ポリアクリロニ
トリル、ポリビニルクロラィド系等はＰＨ範囲が広く、
好都合に適応できる。膜の形式はチューブ状、スパイラ
ル状、中空糸状膜等があるが特に問わない。微生物濃度
や液の粘性の高い時は、チューブ状か太い中空糸状膜が
良好に利用される。膜の炉過限界分子量は５００〜数十
万の範囲で適応できるが、蛋白質等の除去率、炉過速度
、対象低分子生成物分子量等から勘案すれば、３０００
〜１００００紙塁度が好都合に利用できる。適応ＰＨ範
囲は酸性側では１〜５、アルカリ性側では９〜１４であ
るが、ＰＨの選択は該低分子生成物の安定性及び爽雑す
る蛋白質等の等電点によって変動するが、実際には多種
蛋白質の混合物のため、蛋白質除去率の最も高いＰＨ値
を、酸及びアルカリ性側で実験的に決定するのが得策で
ある。

ＰＨの調整の酸、アルカリ側の順序は問わない。微生物
の粘性が低い側を最初にする方が炉過速度の効率は良好
である。また該生成物のＰＨ安定性により、どちらか一
方を省略することは本発明の範囲を越えるものではない
。炉過時の温度は該生成物の熱的安定性及び限外炉過膜
の耐熱性で決めなければよい。

また温度が高いほど炉過速度は早い。本発明の適応でき
る微生物培養による低分子量生成物とは、アミノ酸、ア
ミノ酸オリゴマー、有機酸、糠類、核酸系低分子物及び
抗生物質等をさす。

また、これら低分子物の誘導体あるいは異性体を製造す
る場合、微生物を利用して目的する生成物を製造する際
に、菌体内酵素反応、菌体外酵素反応液への適応も本発
明の範囲に属する。本発明によれば、微生物分離と蛋白
除去及びコロィダル物質除去が単一の膜分離操作で同時
に実施でき、これらのプロセスが大幅に合理化される。
また、それらの除去率が非常に高いため、その後のイオ
ン交換樹脂精製工程、活性炭処理工程等の負荷が軽くな
る。さらにまた抗生物質の製造工程では、生成した抗生
物質を分解する酵素が副生成物として生成される場合が
多いが、本発明を利用するならば、微生物培養液を各工
程を経ることなく、即座に微生物と共にこれら不要酵素
を除去できるため、培養液の安定性が高まり、かつその
収率も上昇する。以上の如く本発明は、微生物培養液の
処理には極めて、有効な発明である。以下実施例を挙げ
て本発明を詳細に説明する。

実施例 １ＭＷ５４８の抗生物質を含む菌体培養液（蒸
発残留物４．２％）１８０そを苛性ソーダでＰＨを１０
．５に調整し、限外炉過装置の濃縮タンクに移した。

濃縮タンクと限外炉過装置とを接続し、限外炉過装魔か
らの濃縮液が再び濃縮タンクへ還る循環炉過系統が組ま
れている。液の粘性３．枕ｐ、液温１がｏ、炉過圧１．
５ｋ９／地、膜表面の線速２．１ｍ／ｓｅｃの条件で、
菌体培養液をバッチ方式で濃縮炉過した。炉週速度３．
５夕／側の速度で開始し、７０分後に１６２その炉液を
取り出し、１ぴ苦まで濃縮した。炉過液の濁度は０であ
った。この時点の抗生物質の回収率は８７．８％であり
、かつ蛋白除去率は８６．３％であった。１８夕に濃縮
された濃縮液の粘性は７父ｐであり、ＰＨＩＯ．５に調
整された水を１８〆投入したところ、液粘性は７．次ｐ
となった。

再度炉過し、１８その炉液を取り出した。さらに、この
操作を一度繰り返し、１８その炉液を得た。炉液の合計
２０８そ中の抗生物質の回収率は９６．６％であり、蛋
白除去率は８３．０％であった。なお、炉液中には菌体
は認められなかった。得られた限外炉過液２０８そに塩
酸を加えてＰＨを３．７に調整し、上述と同じ方式で接
続された眼外炉過装置によりバッチ方式で炉過した。

炉液１９５そを５０分で得た。濃縮液にＰＨ３．７に調
整された水２０そを加えて再び炉遇し、炉液２０そを得
た。本操作での抗生物質の回収率は９７．１％であり、
蛋白除去率は７２．３％であった。以上の二操作後の医
薬品の回収率は９３．８％であり、蛋白除去率は９５．
３％であった。

なお、本実施例で使用した限外炉過膜は膜素材ポリアク
リロニトリル系中空糸状膜であり、眼外炉過モジュール
は外径２．４側、内径１．４肌の中空糸を８００本束ね
、有効膜面積２．８肘／モジュールであった。

また限外炉過モジュールは次亜塩素酸ソーダ５０岬ｐｍ
で殺菌し、水洗を繰り返し、炉過液は無菌状態であった
。実施例 ２ ウリゼン系医薬の菌体培養液（蒸発残留物１２．４％）
１８０そをＰＨ３．９に調整し、、実施例１の装置の濃
縮タンクにフロートバルブを付し、限外炉過液と同量の
ＰＨ３．１の水溶液を連続的に導入できるように準備し
て、炉過圧２．０ｋ９／均条件で炉過した。

２．８夕／側モジュールの炉過速度で処理した。

２時間後での医薬品抽出率は７６％であり、豚蛋白率は
８７％であった。

さらに淀過を続け、通算３．親時間で積算炉液量６００
〆を抜き出した。この時点で濃縮タンク槽へのＰＨ調整
液の導入を打ち切り、バッチ的に濃縮し、７０そまで濃
縮した。菌体は２．３音まで濃縮した。、この時、医薬
品抽出率は９９％、除蛋白率は８２％であった。得られ
た炉液７２０夕をＰＨ９．８に調整し、バッチ的に炉過
し、７００その炉液を抜き出した。

酸性及びアルカリ性操作後の医薬品抽出率は９７％、除
蛋白率は９２％であった。比較例 １ 実施例２と同一のウリジン系医薬品菌体培養液１８０〆
をウエストフアリア遠心分離器にかけ、童液側と軽液側
に分離した。

童液側にはさらに１００その水を加えて再度遠心分離操
作し、この操作を２回繰り返した。得られた軽液３回分
を併せＰＨ３．９に調整し、活性炭２ｋ９を添加してプ
レスフィルターで炉過した。本操作後の、医薬品回収率
は７１％、除蛋白率は５５％であった。

比較例 ２ 実施例２の培養液ｉ８０そをＰＨ未調整で（培養液ＰＨ
７．５）、実施例２と同一の操作で限外炉遇した。

濃縮タンクに導入する液はＰＨ７．５に調整し、炉液と
同一量加えた。６００その炉液を抜出し後、バッチ操作
で炉過し、積算炉液を７２０そとした。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 微生物培養液の処理において、限外濾過法で微生物
   と低分子量生成物を分離するに際し、該培養液の液性を
   アルカリ性もしくは酸性に調整することにより凝集する
   夾雑物を微生物と同時に除去し、続いて得られた該濾過
   液を酸性もしくはアルカリ性に逆転させて調整し、該液
   性下で凝集する夾雑物を再び限外濾過法で濾過すること
   を特徴とする微生物培養液の処理方法。