CN113185575B

CN113185575B - 一种花生抗氧化多肽及其制备方法

Info

Publication number: CN113185575B
Application number: CN202110511611.2A
Authority: CN
Inventors: 卜迁; 黄玉婷; 高鸿; 钟凯
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2021-05-11
Filing date: 2021-05-11
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-05-11
Also published as: CN113185575A

Abstract

本发明公开了一种花生抗氧化多肽及其制备方法，所述抗氧化多肽的氨基酸序列为Pro‑Gly‑Cys‑Pro‑Ser‑Thr。以花生为原料，采用胃蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽。本发明抗氧化多肽缓解了人工抗氧化剂可能引起的副作用，提供了一种新的天然抗氧化剂，可以取代传统的合成食品抗氧化剂。

Description

一种花生抗氧化多肽及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生抗氧化多肽及其制备方法。

背景技术

氧化是所有生物在氧化代谢过程中形成自由基的过程，是生物体发展某些重要功能所必需的，常见的活性氧包括羟基自由基、超氧阴离子自由基和过氧化氢。活性氧的过度积累导致细胞生物分子的氧化损伤，如DNA片段化、蛋白质变性和膜脂过氧化，与人体多种疾病相关，包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等。此外，在食品中，氧化不仅会引发营养流失、腐烂、异味，造成食品品质的下降，严重时还会对摄入者的身体健康造成影响。因此，使用安全的抗氧化剂抑制过氧化物的产生是一个不错的选择。

人工合成抗氧化剂如叔丁基羟基茴香醚(BHA)、2，6-二叔丁羟基甲酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)等在食品中应用广泛，具有防止食品氧化变质、防止毒素产生、保持营养成分的作用，但是这些合成的抗氧化剂可能会对人体健康造成伤害：如不当使用BHA可致癌，BHT有抑制人体呼吸酶活性的嫌疑，TBHQ有致畸致癌的危险。为缓解众人对人工合成抗氧化剂安全性的担忧，开发天然抗氧化剂越来越受到食品工业和科学界的关注。

食源性生物活性肽是蛋白质经特定蛋白水解酶酶解或发酵后形成的从二肽到具有复杂线性、环状结构的不同肽类的总称。食源性抗氧化肽作为一种理想的天然替代品正受到越来越多的关注，其抗氧化活性不仅体现在体外清除自由基，还体现在体内调节抗氧化途径。用于制备抗氧化肽的动植物原料主要包括未充分利用的蛋白质丰富的食物和富含蛋白质的工业副产物，或者蛋白质中含有特定药理价值的多肽序列或氨基酸残基，不同来源的多肽均有可能具有抗氧化活性。

花生是一种主要的农业作物，广泛用于榨油。脱脂花生粕是花生油生产过程中的主要副产品，富含蛋白质和大量必需氨基酸。但由于蛋白质溶解性差、颜色深、风味不佳、营养价值低，至今仍被用作动物饲料和肥料，造成资源浪费。为进一步提高花生副产物的功能利用度，可将其作为一种潜在的抗氧化肽来源。

发明内容

本发明的目的在于针对天然抗氧化剂的不足和人工合成抗氧化剂的安全缺陷，以及花生生物利用度不足的现状，提供一种花生抗氧化多肽及其制备方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种花生抗氧化多肽，其氨基酸序列为Pro-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr。

在本发明的另一方面，提供了所述花生抗氧化多肽的制备方法，以花生为原料，采用胃蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽。

所述的酶解条件为：pH为1.5-3.5、温度37℃、酶解时间为3.0h、底物浓度为4％，酶添加量为1％。

肽酶的类型是决定肽的大小、组成和氨基酸序列的主要因素，不同类型的酶可以特异性切割肽的不同位置，最终影响蛋白质水解产物的抗氧化活性。蛋白酶的专一性主要是由于形成肽键的两个氨基酸的性质不同所决定的。

胃蛋白酶是一种内切酶，作用于蛋白质分子内部肽键，不会切割末端产生游离氨基酸，保证产生的都是多肽链。胃蛋白酶消化过程中，优选涉及芳香族氨基酸，包括Phe、Trp和Tyr的肽键被裂解，导致疏水性增加，从而使蛋白水解物与DPPH等自由基反应，具有抗氧化活性。同时，胃蛋白酶不会在含有缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸的键上裂解。本次发明的肽段前一位相连的氨基酸与后一位相连的氨基酸均是芳香族氨基酸，为胃蛋白酶特异性切割的位点，而本发明肽段中的甘氨酸Gly相关的肽键不会被裂解，从而保留半胱氨酸，半胱氨酸中的巯基由于其与自由基的直接相互作用而具有独立的重要抗氧化作用。胃蛋白酶为动物来源的蛋白酶，酶切位点的专一性较微生物来源的蛋白酶也更加严格精准。

所述的分离纯化的方法包括超滤、Sephadex LH-20分子筛、Sephadex G-25分子筛和RP-HPLC反相高效液相色谱。

所述的分离纯化的具体步骤为：

1)首先利用超滤离心管对花生多肽溶液进行超滤分离，得到不同分子量的多肽组分；

2)收集具有最佳抗氧化活性的组分，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱进行分离，洗脱液为去离子水，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；

3)收集具有最佳抗氧化活性的组分，用Sephadex G-25凝胶色谱柱进行分离，洗脱液为去离子水，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；

4)收集具有最佳抗氧化活性的组分，采用DPPH自由基消除法，利用RP-HPLC反相液相色谱进行进一步分离，收集加入DPPH后消除的洗脱峰，得到抗氧化多肽。

进一步的，步骤1)得到的多肽组分包括分子量≥30000Da、3000-30000Da、≤3000Da的多肽。其中≤3000Da的小肽抗氧化活性更强。

进一步的，步骤2)和3)中流速为2.5mL/min，在280nm下进行测量。

本发明的有益效果为：

本发明改变了现有抗氧化剂的提取与运用的思路和方法，缓解了人工抗氧化剂可能引起的副作用，提供了一种新的天然抗氧化剂，可以取代传统的合成食品抗氧化剂。另外，本发明还可改善我国花生粕中蛋白经济效益偏低的情况，为花生副产物的再开发提供新思路，对科技、经济和食品业的发展将具有深远意义。

附图说明

图1是本发明实施例1中Sephadex LH-20分离组分的吸收峰图；

图2是本发明实施例1中Sephadex LH-20分离组分的DPPH自由基清除能力；

图3是本发明实施例1中Sephadex LH-20分离组分的ABTS自由基清除能力；

图4是本发明实施例1中Sephadex LH-20分离组分的羟基自由基清除能力；

图5是本发明实施例1中Sephadex G-25分离组分的吸收峰图；

图6是本发明实施例1中Sephadex G-25分离组分的抗氧化活性；

图7是本发明实施例1中RP-HPLC反相液相色谱分离组分的抗氧化多肽峰。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1)花生蛋白的提取

花生去壳去皮，破碎成粉末，加20％正己烷脱脂2h，然后加入10％超纯水，调节pH为9.0，搅拌2h。然后静置分层，取水层并调节pH为3.0，收集沉淀，冷冻干燥后得到花生蛋白。

2)花生蛋白的酶解

酶购自上海阿拉丁公司(中国·上海)。

采用胃蛋白酶酶解花生蛋白，蛋白浓度为4％，酶添加量为1％、酶解条件取pH为3.0、温度37℃、酶解3.0h后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，11000r/min离心30min，取上清液备用。

3)酶解产物的分离纯化

利用超滤离心管对花生多肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到不同分子量的多肽，包括≥30000Da，3000-30000Da，≤3000Da等组分，因小肽抗氧化活性更强，故收集≤3000Da的组分；再经过Sephadex LH-20凝胶色谱柱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2.5mL/min，27mL接1管，在280nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性，组分吸收峰见附图1，DPPH自由基清除能力见附图2，ABTS自由基清除能力见附图3，羟基自由基清除能力见附图4；收集具有最佳抗氧化活性的组分，用Sephadex G-25凝胶色谱柱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2.5mL/min，10mL接1管，在280nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性，组分吸收峰见附图5，组分对应抗氧化活性见附图6；收集具有最佳抗氧化活性的组分，采用DPPH·自由基消除法，利用RP-HPLC反相液相色谱进行进一步确认抗氧化多肽峰，加入DPPH后消除的洗脱峰为抗氧化多肽峰，即收集保留时间为14-14.5分钟的组分，见附图7，得到抗氧化多肽。

超滤管：可通过一定分子量大小的膜，小于等于该分子量的物质穿过该膜流到管子下部，大于该分子量的物质留在膜上方，通过搭配使用不同分子量的超滤膜，即可实现分子量的截流。另一方面使用透析袋、膜澄清分离设备同样可以实现。

凝胶色谱柱：分子筛效应，分子量大的先流出，分子量小的物质后流出，从而实现物质的分离纯化。另一方面使用Sephadex G-50凝胶色谱柱替换Sephadex G-25也可实现本发明目的。

DPPH消去法定位抗氧化组分：让样品与DPPH自由基反应后，测定高效液相色谱，对比原样品的高效液相色谱，若某物质具有抗氧化活性，则与DPPH自由基反应，物质含量减少，故与原样品相比，高效液相色谱结果中峰面积减少的峰具有抗氧化活性，由此获得抗氧化多肽。另一方面使用ABTS等其他试剂也可实现。

实施例2抗氧化活性的测定

1)DPPH自由基清除能力的测定

以95％的乙醇为溶剂，配制浓度为0.1mmol/L的DPPH(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)溶液，此溶液需现配现用。将2mL不同浓度的样品与2mL DPPH溶液混合，25℃避光孵育30min，于517nm处测定反应溶液的吸光度，95％乙醇溶液为空白对照。

样品的DPPH自由基清除率根据下式进行计算：

式中：A_s为样品组吸光值；A_c为空白组吸光值。

2)ABTS自由基清除能力

用超纯水配制ABTS(7mmol/L)与过硫酸钾(2.45mmol/L)的混和溶液，置于23℃避光孵育12-16h，制备ABTS自由基阳离子基液。用纯水稀释基液至波长734nm处吸光度为0.700±0.050，得到ABTS自由基阳离子工作液。取0.1mL不同浓度样品同3.9mL工作也混合，23℃孵育6min，测量反应混合物在734nm处的吸光度，超纯水为空白对照。

样品的ABTS自由基清除率根据下式进行计算：

式中：A_s为样品组吸光值；A_c为空白组吸光值。

3)羟基自由基清除能力

1mL样品与0.6mL 1,10-菲啰嗪(5mmol/L)、0.4mL磷酸缓冲液(0.2mmol/L，pH＝7.4)、0.6mL FeSO₄(50mmol/L)、0.6mL EDTA(15mmol/L)及0.4mL 0.1％H₂O₂，37℃避光反应1h，超纯水代替样品为空白对照，加样品但是不含过氧化氢溶液为阴性对照组。

样品的羟基自由基清除率根据下式进行计算：

式中：A_s为样品组吸光值；A_c为空白组吸光值；A_n为阴性对照组吸光值。

5)氨基酸序列测定

利用UPLC/Q-TOF-MS鉴定本发明的抗氧化多肽的氨基酸全序为Pro-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr，分子量为617Da。测定其抗氧化活性见表1所示，其中DPPH自由基清除率(77.71±0.39)％，ABTS自由基清除率(51.96±0.38)％，抗氧化活性与阳性对照谷胱甘肽(GSH)接近。

表1抗氧化肽抗氧化活性

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种花生抗氧化多肽及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 花生抗氧化多肽(PGCPST)

<400> 1

Pro Gly Cys Pro Ser Thr

1 5

Claims

1.一种花生抗氧化多肽在制备抗氧化剂中的应用，其特征在于，花生抗氧化多肽的氨基酸序列为Pro-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr。