CN105671114B - 一种海参卵肽钙螯合物的制备方法 - Google Patents

一种海参卵肽钙螯合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海参卵肽钙螯合物的制备方法，包括步骤：海参卵预处理、脱脂、酶解、模拟回肠条件制备海参卵肽钙螯合物。本发明方法提高了海参加工过程中副产物的利用率，使其含有的活性物质得到充分开发利用，同时减少了对环境的污染；通过生物酶法制备海参卵生物活性肽，与钙离子结合形成的可溶性肽钙螯合物更有利于钙吸收，可用于开发高值化的海参卵肽‑钙补充剂；本发明涉及的操作过程简单，不需要复杂的设备，由胰蛋白酶酶解获取海参卵肽的肽得率和钙结合量最高，其中肽得率达到86％，钙结合量达0.38mmol/L，而且具有良好的促钙吸收能力，提高了生产效率，适合工业化生产。

Description

一种海参卵肽钙螯合物的制备方法
技术领域
本发明涉及基于海参的功能活性物质制备领域，更具体地说，涉及一种海参卵肽钙螯合物的制备方法。
背景技术
近年来，中国海参产业发展迅速，据2015年渔业年鉴报道，中国海参总产量约为20万吨。海参卵是海参加工过程中产生的副产物之一，然而海参卵的回收利用一直被人们所忽视，通常被当作工业废料，不仅是对生物资源的浪费，还会造成环境污染。
钙是人体必需的常量元素，不仅是骨骼和牙齿的重要组成成分，也是机体代谢活动的调节因子，参与肌肉收缩、神经传导、血液凝集、激素分泌、酶激活、细胞生长等生理活动。缺钙会影响儿童的正常生长发育，易引发佝偻病，而且还会导致中老年人患骨质疏松症。历次全国营养调查结果显示，钙是我国居民最容易缺乏的膳食营养素。我国人民的膳食以植物性食物为主，含钙量少，植物成分如草酸、植酸等还影响钙的吸收。因此开发高效的补钙制剂显得尤为重要。
目前市场上的无机钙和有机钙制剂在小肠弱碱性环境下会部分形成沉淀，导致钙的吸收率不足40％。研究发现活性肽(如酪蛋白磷酸肽、卵黄高磷蛋白磷酸肽、大豆肽、鱼鳞肽等)能与钙结合形成可溶性复合物，维持人体小肠内钙的可溶状态，具有良好的促钙吸收能力，这与其钙离子结合活性密切相关。利用生物酶法获取海参卵生物活性肽来制备肽钙螯合物的研究，还未见相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于开发一种海参制备高附加值产品的加工方法，提高海参的经济价值及利用率，避免资源浪费与环境污染；另一方面，根据海参卵中蛋白质高的特点，开发一种利用海参卵制备具有良好促钙吸收能力的肽钙螯合物的方法。
为达到上述目的，本发明提供了一种海参卵肽钙螯合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、海参卵预处理：将海参卵匀浆，沸水浴5～10min，得到海参卵匀浆液；
S2、向步骤S1制得的海参卵匀浆液中加入正己烷/无水乙醇混合液萃取脱脂，所述正己烷/无水乙醇混合液中正己烷与无水乙醇的体积比为2～3:1，所述海参卵匀浆液与所述正己烷/无水乙醇混合液的体积比为1:10～15，50℃萃取4～6h；
所述萃取脱脂过程重复1～2次；抽滤，所得滤饼自然风干、粉碎，得到海参卵脱脂粉，采用凯氏定氮仪测定蛋白含量；
S3、向步骤S2制得的海参卵脱脂粉加水至底物蛋白浓度为2～4g/100mL制得酶解反应液，按3000(U/g底物蛋白)的比例向所述酶解反应液中加入蛋白酶进行酶解反应，反应3～6h；调pH至7.0，100℃灭酶10min，4000r/min离心20min，收集上清液，冷冻干燥即得海参卵酶解物；
S4、将步骤S3制得的海参卵酶解物与CaCl2溶液、磷酸盐缓冲液混合，得到螯合反应液，所述螯合反应液中酶解物终浓度为0.5mg/mL，CaCl2终浓度为5mmol/L，磷酸盐缓冲液终浓度为20mmol/L；将所述螯合反应液在模拟人体回肠条件下进行螯合反应1h后，5000×g离心10min，取上清液经0.45μm水系微孔滤膜过滤后，冻干、粉碎即得海参卵肽钙螯合物；所述模拟回肠条件为控制反应液温度37℃、控制反应液pH为7.0。
优选方式下，步骤S3所述蛋白酶为胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或风味蛋白酶中的一种。
最优方式下，步骤S3所述蛋白酶为中性蛋白酶、风味蛋白酶或木瓜蛋白酶时，调节所述酶解反应液pH至7.0，温度为50℃；所述蛋白酶为碱性蛋白酶时，调节所述酶解反应液pH至8.5，温度为50℃；所述蛋白酶为胰蛋白酶时，调节所述酶解反应液pH至8.0，温度为37℃。
优选方式下，步骤S4所述模拟回肠条件控制反应液pH的方法为采用pH计监测反应液pH，采用1mol/L的HCl溶液或1mol/L的NaOH溶液调整pH。
本发明的技术创新在于：
1、本发明方法提高了海参加工过程中副产物的利用率，使其含有的活性物质得到充分开发利用，同时减少了对环境的污染。
2、本发明通过生物酶法获取海参卵生物活性肽，与钙离子结合形成的可溶性肽钙螯合物，更有利于钙吸收，可用于开发高值化的海参卵肽-钙补充剂。
3、肽钙螯合物主要在人体回肠部位被吸收，本发明在模拟回肠条件下制备海参卵肽钙螯合物，其在小肠弱碱性环境下不会形成沉淀，到达回肠时仍可维持钙的可溶状态，具有良好的促钙吸收能力。
4、本发明涉及的操作过程简单，不需要复杂的设备，由胰蛋白酶酶解获取海参卵肽的肽得率和钙结合量最高，其中肽得率达到86％，钙结合量达0.38mmol/L，而且具有良好的促钙吸收能力，提高了生产效率，适合工业化生产。
附图说明
图1为5种商业酶酶解海参卵的肽得率结果。
图2为5种商业酶酶解制备的海参卵肽的钙离子结合量。
图3为海参卵肽钙螯合物经肠道细胞的促钙吸收效应。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
1、海参卵流水解冻，用去离子水冲洗干净，匀浆后，沸水浴中煮沸5min进行变性预处理，得到海参卵匀浆液；
2、取海参卵匀浆液，加入10倍体积的正己烷/无水乙醇(3：1)混合液100mL，在50℃萃取6h，重复1～2次，除去脂肪，抽滤后所得滤饼自然风干，获到海参卵脱脂粉，采用凯氏定氮仪测定蛋白含量；
3、准确称取海参卵脱脂粉，补水至底物蛋白浓度为2g/100mL，分别加入胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶在最适酶解条件下(本专利里的最适条件是根据酶自身的最适条件确定的，如表1所示)对海参卵酶解3h，酶解后调pH至7.0，在100℃灭酶10min，4000r/min离心20min，收集上清液，冷冻干燥即得海参卵酶解物。
表1为海参卵脱脂粉的酶解条件。
表1
实施例2：肽得率的测定
1、配制0.5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)标准溶液：精密分析天平准确称取0.05g BSA于100mL洁净烧杯中，超纯水溶解，定容至100mL。
2、Folin-酚法绘制BSA标准曲线：本实验以BSA作为标准品绘制标准曲线。取18个2.0mL离心管分成3组。分别加0，20，40，60，80，100μL标准品溶液，并用超纯水补足到100μL，以上每种浓度做3个平行。各管浓度依次为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。按顺序向各管内依次加入500μL Folin-酚甲液，混匀。室温下放置10min，再加入50μL Folin-酚乙液，立即振荡均匀，室温下放置30min。每管取200μL溶液加入96孔板中，且每管加2次。在500nm波长下，用酶标仪测定光密度值。以BSA浓度为横坐标，光密度值(OD500)为纵坐标，绘制标准曲线。
3、海参卵酶解物中TCA-可溶性寡肽含量的测定：在酶解液中加入等体积预冷的20％TCA溶液，振荡均匀，室温下静置20min，12000rpm离心10min，取上清液，稀释一定倍数，采用Folin-酚法测定海参卵酶解物中TCA-可溶性寡肽的含量，每个样品做3个平行。
4、以牛血清蛋白为标准品，试验得到标准曲线的回归方程为y＝0.7697x+0.0584(R2＝0.9931)。根据下式计算肽得率：
肽得率(％)＝m1/m0×100
式中m1为酶解物中TCA可溶性寡肽质量，mg；m0为酶解物中底物蛋白量，mg。
实验结果：由胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶酶解海参卵的肽得率测定结果如图1所示。海参卵经不同蛋白酶酶解后得到的肽得率有显著性差异，胰蛋白酶酶解后获得的TCA-可溶性寡肽含量最高，肽得率达86％；其次，经木瓜蛋白酶酶解后得到的肽得率为78％；而碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶处理的TCA-可溶性寡肽得率相对较低，分别为68％、73％、63％。
实施例3：海参卵肽钙螯合物的制备
1、将海参卵酶解物与CaCl2溶液、磷酸盐缓冲液混合，制得螯合反应液，其中酶解物终浓度为0.5mg/mL，CaCl2终浓度为5mmol/L，磷酸盐缓冲液终浓度为20mmol/L；将制得的螯合反应液在模拟回肠条件下(37℃、pH 7.0)进行螯合反应1h，pH维持在7.0(pH计监测，1mol/L HCl或NaOH调整)；
2、螯合反应后混合液经5000×g离心10min去除磷酸钙沉淀，上清液过0.45μm水系微孔滤膜后，冷冻干燥即得海参卵肽钙螯合物。
采用钙分析试剂盒测定钙结合量。
实验结果：通过测定肽钙螯合物中的可溶性钙含量可以确定海参卵经蛋白酶水解得到的海参卵肽的钙离子结合活性。如图2所示，由胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解得到的海参卵肽比其他3种蛋白酶酶解得到的海参卵肽有更高的钙离子结合活性，其钙结合量分别为为0.38±0.05mmol/L、0.37±0.08mmol/L。这表明胰蛋白酶、木瓜蛋白酶水解得到的海参卵肽可能拥有更多的钙结合位点。
实施例4：海参卵肽钙螯合物促钙吸收效应分析
1、Caco-2细胞培养：Caco-2细胞在含有20％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的Eagle's MEM培养基中，37℃、5％CO2条件下培养；
2、Caco-2细胞接种：将细胞接种到10cm培养皿中，培养过夜后，细胞染色缓冲液冲洗，将细胞吹下来，转移到1.5mL离心管中，再冲洗2次；
3、钙离子荧光探针染色：以106-107/mL的密度重悬于1mL含有2.5μM钙离子荧光探针Fluo-3AM的细胞染色缓冲液中，37℃下避光孵育30min后，冲洗2次，离心并重悬；
4、细胞内钙离子水平测定：将1×105细胞接种到黑色96孔酶标板，检测基础的Ca2+水平，45s时加入10-3g/mL海参卵肽钙螯合物、酪蛋白磷酸肽钙螯合物(阳性对照)，连续测定360s，采用荧光酶标仪检测激发波长488nm、发射波长525nm下的荧光值。
其中，[Ca2+]i的计算公式为[Ca2+]i＝Kd[(F–Fmin)/(Fmax–F)]。其中，Kd为荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数，为400nM。Fmin是荧光剂没有结合Ca2+时荧光最小值，含有5mMEGTA的PBS缓冲液处理细胞；Fmax是荧光剂被Ca2+饱和时的荧光最大值，采用0.1％Triton X-100处理细胞。
实验结果：本发明以酪蛋白磷酸肽钙螯合物为阳性对照，采用人肠道细胞模型Caco-2细胞分析海参卵肽钙螯合物经肠道细胞的促钙吸收效应。如图3所示，海参卵肽钙螯合物诱发的细胞内钙离子水平显著高于酪蛋白磷酸肽钙螯合物(P<0.05)，表明海参卵肽钙螯合物具有良好的促钙吸收能力。
结论：本发明制备了一种海参卵肽钙螯合物，其中胰蛋白酶是酶解海参卵获得具有最高肽得率和钙离子结合量的海参卵肽的最优酶制剂，而且海参卵肽钙螯合物具有良好的促钙吸收能力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种海参卵肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、海参卵预处理：将海参卵匀浆，沸水浴5～10min，得到海参卵匀浆液；
S2、向步骤S1制得的海参卵匀浆液中加入正己烷/无水乙醇混合液萃取脱脂，所述正己烷/无水乙醇混合液中正己烷与无水乙醇的体积比为2～3:1，所述海参卵匀浆液与所述正己烷/无水乙醇混合液的体积比为1:10～15，50℃萃取4～6h；
所述萃取脱脂过程重复1～2次；抽滤，所得滤饼自然风干、粉碎，得到海参卵脱脂粉，采用凯氏定氮仪测定蛋白含量；
S3、向步骤S2制得的海参卵脱脂粉加水至底物蛋白浓度为2～4g/100mL制得酶解反应液，按3000U/g底物蛋白的比例向所述酶解反应液中加入蛋白酶进行酶解反应，反应3～6h；调pH至7.0，100℃灭酶10min，4000r/min离心20min，收集上清液，冷冻干燥即得海参卵酶解物；
所述蛋白酶为胰蛋白酶，调节所述酶解反应液pH至8.0，温度为37℃；
S4、将步骤S3制得的海参卵酶解物与CaCl2溶液、磷酸盐缓冲液混合，得到螯合反应液，所述螯合反应液中酶解物终浓度为0.5mg/mL，CaCl2终浓度为5mmol/L，磷酸盐缓冲液终浓度为20mmol/L；将所述螯合反应液在模拟人体回肠条件下进行螯合反应1h后，5000×g离心10min，取上清液经0.45μm水系微孔滤膜过滤后，冻干、粉碎即得海参卵肽钙螯合物；所述模拟回肠条件为控制反应液温度37℃、控制反应液pH为7.0。
2.根据权利要求1所述海参卵肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，步骤S4所述模拟回肠条件控制反应液pH的方法为采用pH计监测反应液pH，采用1mol/L的HCl溶液或1mol/L的NaOH溶液调整pH。
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