CN110483620A - 一种海参卵源八肽及其钙纳米复合物的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参卵源八肽及其钙纳米复合物的制备方法与应用，所述海参卵源八肽的氨基酸序列如下所示：Glu‑Asp‑Leu‑Ala‑Ala‑Leu‑Glu‑Lys，分子量887.97Da。本发明所述海参卵源八肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成、高相液相色谱纯化、冷冻干燥而得。所述海参卵源八肽与Ca2+以1:1的摩尔比，通过C端谷氨酸和天冬氨酸的羧基氧原子结合，形成海参卵源八肽‑钙纳米复合物，与海参卵源八肽结合的Ca2+浓度为2mM，经Caco‑2细胞单层膜转运时间120min时，Ca2+转运量为41.99±3.55μg/mL；可增强Ca2+的递送能力，用于功能性保健品、营养强化食品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及功能性保健品、营养强化食品等领域，具体涉及一种海参卵源八肽及其钙纳米复合物的制备方法与应用。
背景技术
钙约占人体体重的1.5～2.2％，是人体内最丰富的无机元素。缺钙可诱发代谢性骨病，例如骨质疏松症和佝偻病。研究发现，50岁以上的中国女性中，超过三分之一的人预计会患上骨质疏松症。人们普遍认为钙和维生素D的结合在补钙过程中起到了很好的作用。然而最新临床研究发现，无论是补充钙剂，维生素D，还是钙剂/维生素D联合补充均不能降低50岁以上居住在社区的中老年人骨折的发生率，甚至大剂量补充维生素D还增加了骨折发生的风险。值得注意的是，临床试验中使用的补钙制剂通常为碳酸钙、柠檬酸钙和维生素D等无机或有机钙盐。此外，许多实验研究发现，许多无机和有机钙产品可在胃肠道环境中形成沉淀物，降低其生物利用度。
越来越多的研究表明，食源性钙离子结合肽可以作为一种有效的纳米载体运输钙离子，促进机体对钙的吸收。小分子的钙离子结合肽具有显著的优越性，其分子量小，易于修饰和改造，能够通过人工化学合成，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸无可比拟的优越性。对于钙补充剂而言，食源性钙离子结合肽已成为近年来的一个研究热点，因为它们已被证明具有良好的营养价值及补钙功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种经肽组学技术从海参卵胰蛋白酶水解物中获得的，具有自组装形成肽钙纳米复合物及促进钙离子吸收功能的海参卵源八肽，可应用于功能性保健品、营养强化食品等领域。本发明以Caco-2单层细胞转运模型来评价海参卵源八肽递送钙离子的功能。
一种海参卵源八肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，缩写为EDLAALEK，分子量887.97Da，序列为：Glu-Asp-Leu-Ala-Ala-Leu-Glu-Lys；其中，
Glu表示英文名称为Glutamic acid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基；
Asp表示英文名称为Aspartic acid，中文名称为天冬氨酸的氨基酸的相应残基；
Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；
Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Lys表示英文名称为Lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基。
本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。合成完毕，采用高效液相色谱进行纯化，液氮速冻，真空冷冻干燥，得到多肽成品。
一种海参卵源八肽-钙纳米复合物，该复合物是通过海参卵源八肽(EDLAALEK)与Ca2+以1:1的摩尔比，通过C端谷氨酸和天冬氨酸的羧基氧原子结合而形成；所述海参卵源八肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一个目的是提供一种海参卵源八肽-钙纳米复合物的制备方法，包括步骤：
S1、取所述海参卵源八肽与Ca2+混合，加入去离子水溶解，得螯合反应液；所述螯合反应液中，海参卵源八肽与Ca2+的终浓度摩尔比为1:1；所述海参卵源八肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2、将步骤S1所述螯合反应液在30～60℃、pH7.5～8.5连续搅拌0.5～1.5h，得海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液；
S3、将步骤S2所述海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液进行真空冷冻干燥处理，得海参卵源八肽-钙纳米复合物。
优选方式下，步骤S1所述Ca2+为氯化钙。
优选方式下，步骤S3所述真空冷冻干燥具体为：冷阱-50～-70℃，真空度1～20Pa，冻干时间48～72小时。
优选方式下，所述海参卵源八肽-钙纳米复合物的制备方法，包括步骤：
S1、将0.04mmol海参卵源八肽与0.04mmol CaCl2混合，加入20mL去离子水溶解，得螯合反应液；所述海参卵源八肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2、将步骤S1所述螯合反应液在50℃、pH8.0，1000rpm条件下连续搅拌1h，得海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液；所述螯合反应液的pH维持在8.0(pH计监测，1mol/LHCl或NaOH调整)；
S3、将步骤S2所述海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液置于冷阱-50℃、真空度1Pa、真空冻干燥48小时，得海参卵源八肽-钙纳米复合物。
本发明制备的海参卵源八肽-钙纳米复合物，其形貌比单纯海参卵源八肽EDLAALEK粒度均匀、有序，主要粒度分布范围为50～120nm，结果表明，海参卵源八肽EDLAALEK可以在钙离子诱导下发生自组装行为，形成海参卵源八肽-钙纳米复合物，其具有经Caco-2细胞递送钙离子的能力。
所述海参卵源八肽-钙纳米复合物，与海参卵源八肽结合的Ca2+浓度为2mM(即海参卵源八肽-钙纳米复合物浓度为2mM)，经Caco-2细胞单层膜转运时间120min时，Ca2+转运量为41.99±3.55μg/mL；而2mM CaCl2溶液，经Caco-2细胞单层膜转运时间120min时，Ca2+的转运量仅为19.21±2.98μg/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明首次合成了海参卵源八肽，并且应用于海参卵源八肽-钙纳米复合物的制备，所述海参卵源八肽可通过钙离子诱导的方式发生自组装行为，形成具有一定纳米尺度的肽钙复合物，其可以通过Caco-2细胞递送钙离子，具有促钙吸收的作用，能够在钙补充剂、功能性保健品、营养强化食品等领域应用。
附图说明
图1为本发明海参卵源八肽EDLAALEK与钙离子相互作用的热力学数据。
图2为本发明合成海参卵源八肽Glu-Asp-Leu-Ala-Ala-Leu-Glu-Lys的HPLC图。
图3为本发明合成海参卵源八肽Glu-Asp-Leu-Ala-Ala-Leu-Glu-Lys的ESI-MS图谱。
图4本发明海参卵源八肽EDLAALEK的原子力显微镜(AFM)成像图。
图5为本发明海参卵源八肽-钙纳米复合物的原子力显微镜(AFM)成像图。
图6为本发明Ca2+浓度为2mM时CaCl2、海参卵源八肽-钙纳米复合物纳米复合物经Caco-2细胞单层模型的钙转运结果图。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
本发明所述的海参卵源八肽缩写为EDLAALEK，分子量887.97Da。序列为：Glu-Asp-Leu-Ala-Ala-Leu-Glu-Lys。其中，
Glu表示英文名称为Glutamic acid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基；
Asp表示英文名称为Aspartic acid，中文名称为天冬氨酸的氨基酸的相应残基；
Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；
Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Lys表示英文名称为Lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基。
本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。合成完毕，采用高效液相色谱进行纯化，液氮速冻，真空冷冻干燥，得到多肽成品。
本发明将海参卵源八肽EDLAALEK与Ca2+混合，在30～60℃、pH7.5～8.5的条件下搅拌0.5～1.5h后，经真空冷冻干燥获得海参卵源八肽-钙纳米复合物，其形貌比单纯八肽EDLAALEK粒度均匀、有序，主要粒度分布范围为50～120nm，结果表明，海参卵源八肽EDLAALEK可以在钙离子诱导下发生自组装行为，形成海参卵源八肽-钙纳米复合物，其具有经Caco-2细胞递送钙离子的能力，能在功能性保健品、营养强化食品等领域应用。
本发明将海参卵源八肽-钙纳米复合物在Ca2+浓度为2mM时，经Caco-2细胞单层膜转运时间120min时，Ca2+转运量为41.99±3.55μg/mL，而相同Ca2+浓度水平的CaCl2产品Ca2+的转运量仅为19.21±2.98μg/mL。
实施例1：海参卵源八肽EDLAALEK的获取
1、海参卵蛋白水解物的制备：海参卵脱脂粉加水至底物蛋白浓度为2g/100mL制得酶解反应液，按3000U/g底物蛋白的比例向所述酶解反应液中加入胰蛋白酶，于pH8.0条件下进行酶解反应，反应3h；调pH至7.0，100℃灭酶10min，4000r/min离心20min，收集上清液，冷冻干燥即得海参卵胰蛋白酶水解物；其中，所述海参卵脱脂粉参照Cui P,Sun N,JiangP,et al.Optimised condition for preparing sea cucumber ovum hydrolysate–calcium complex and its structural analysis[J].International Journal of FoodScience&Technology,2017,52.制备。
2、海参卵蛋白水解物的UPLC-QTOF-MS/MS及肽组学分析：利用Microtof-II质谱仪对海参卵胰蛋白酶水解物中的活性肽进行分离及鉴定，并利用MASCOT从已建立的数据库中检索肽序列，通过肽组学等技术手段鉴定具有钙离子结合活性的序列。
实验结果：一条含有两个Glu和一个Asp残基，分子量为887.97Da的八肽Glu-Asp-Leu-Ala-Ala-Leu-Glu-Lys(EDLAALEK)含有潜在的钙离子结合位点，被成功鉴定出来，如图1所示，热力学实验证明，海参卵源八肽EDLAALEK与钙离子结合的化学计量数n为0.966±0.004，表明海参卵源八肽EDLAALEK具有较高的钙离子结合活性，可以1:1的摩尔比与钙离子结合，形成参卵源八肽-钙纳米复合物。
实施例2：固相合成海参卵源八肽EDLAALEK
选用高分子树脂(合肥赛曼诺生物科技有限公司)，按照氨基酸序列Glu-Asp-Leu-Ala-Ala-Leu-Glu-Lys(即SEQ ID NO.1)的特征，先将Lys的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Lys的氨基和Glu的羧基缩水反应，处理后，再添加Leu，Glu的氨基和Leu的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Glu氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为VYDAC-C18，尺寸4.6*250mm，流动相A:含有0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的水；流动相B:含有0.1％(v/v)TFA的乙腈；20min内B相由20.0％上升到90.0％，流速1.0mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得海参卵源八肽，要求纯度达到98.8％以上，实际纯度为98.89％，并经ESI-MS鉴定结构。图2为海参卵源八肽Glu-Asp-Leu-Ala-Ala-Leu-Glu-Lys的HPLC图。图3为海参卵源八肽Glu-Asp-Leu-Ala-Ala-Leu-Glu-Lys的ESI-MS图。
实施例3：
海参卵源八肽-钙纳米复合物的制备方法，包括步骤：
S1、将0.04mmol海参卵源八肽与0.04mmol CaCl2混合，加入20mL去离子水溶解，得螯合反应液；所述海参卵源八肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2、将步骤S1所述螯合反应液在50℃、pH8.0，1000rpm条件下连续搅拌1h，得海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液；所述螯合反应的pH维持在8.0(pH计监测，1mol/LHCl或NaOH调整)；
S3、将步骤S2所述海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液置于冷阱-50℃、真空度1Pa、真空冷冻干燥48小时，得海参卵源八肽-钙纳米复合物。
采用原子力显微镜观察海参卵源八肽-钙纳米复合物的表观形貌。
实验结果：通过原子力显微镜观察，可以确定海参卵源八肽-钙纳米复合物的形貌比单纯海参卵源八肽EDLAALEK粒度均匀、有序，主要粒度分布范围为50～120nm。如图4所示，单纯海参卵源八肽EDLAALEK表观形貌呈现出形态大小不一的簇状聚集结构；图5所示，海参卵源八肽-钙纳米复合物的形貌则呈现出粒度相对均一的点状纳米颗粒，其粒径分布范围主要集中在50～120nm。这表明海参卵源八肽EDLAALEK在钙离子诱导下发生了自组装行为，与钙离子一起相互反应形成了具有一定纳米尺度的海参卵源八肽-钙纳米复合物。
实施例4：海参卵源八肽-钙纳米复合物的促钙吸收效应分析
S1、配制待测试样：取实施例3制备的海参卵源八肽-钙纳米复合物和CaCl2，分别溶解于pH 7.4的HBSS缓冲液中，37℃、1000rpm搅拌30min配制成海参卵源八肽-钙纳米复合物溶液和CaCl2溶液；其中，所述海参卵源八肽-钙纳米复合物溶液中，与海参卵源八肽结合的Ca2+浓度为2mM；CaCl2溶液的浓度为2mM；
S2、Caco-2细胞培养：人肠道Caco-2细胞(购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：TCHu146)在含有体积分数20％胎牛血清，1％青霉素-链霉素-新霉素(PSN)抗生素混合物的Eagle′s MEM培养基中，37℃、5％CO2条件下培养至跨膜电阻值超过800Ω×cm2形成细胞单层模型；
S3、使用跨膜电阻值超过800Ω×cm2的Caco-2细胞单层模型用于钙转运实验。用Hank′s平衡盐溶液将单层Caco-2细胞轻轻冲洗2次，然后转移到含有1.5mL HBSS缓冲液的新12孔板上。随后，将0.5mL待测试样加入到上室小孔侧，在37℃、5％CO2中孵育2h。然后从下室小孔侧收集1mL溶液，采用原子吸收分光光度计测定钙含量；其中，所述待测试样为步骤S1所述海参卵源八肽-钙纳米复合物溶液(与海参卵源八肽结合的Ca2+浓度为2mM)或2mMCaCl2溶液。
实验结果：本发明以2mM的CaCl2为对照，采用人肠道细胞模型Caco-2细胞分析海参卵源八肽-钙纳米复合物经肠道细胞的促钙吸收效应。如图6所示，所述海参卵源八肽-钙纳米复合物溶液中，与海参卵源八肽结合的Ca2+浓度为2mM时，经Caco-2细胞单层膜转运时间120min时，Ca2+转运量为41.99±3.55μg/mL；显著高于CaCl2(19.21±2.98μg/mL)(P<0.05)，表明海参卵源八肽-钙纳米复合物具有良好的递送钙离子的功能。
结论：本发明首次合成了海参卵源八肽EDLAALEK，并且应用于海参卵源八肽-钙纳米复合物的制备，所述海参卵源八肽EDLAALEK可通过钙离子诱导的方式发生自组装行为，形成具有一定纳米尺度的肽钙复合物(即海参卵源八肽-钙纳米复合物)，且海参卵源八肽-钙纳米复合物具有经Caco-2细胞递送钙离子的能力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 大连工业大学
<120> 一种海参卵源八肽及其钙纳米复合物的制备方法与应用
<130> ZR191334LQ
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Asp Leu Ala Ala Leu Glu Lys
1 5
Claims (7)
1.一种海参卵源八肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子量为887.97Da。
2.一种海参卵源八肽-钙纳米复合物，其特征在于，由权利要求1所述海参卵源八肽与Ca2+以1:1的摩尔比，通过C端谷氨酸和天冬氨酸的羧基氧原子结合而成；所述海参卵源八肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求2所述海参卵源八肽-钙纳米复合物，其特征在于，与海参卵源八肽结合的Ca2+浓度为2mM，经Caco-2细胞单层膜转运时间120min时，Ca2+转运量为41.99±3.55μg/mL。
4.一种如权利要求2或3所述海参卵源八肽-钙纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1、取海参卵源八肽与Ca2+混合，加入去离子水溶解，得螯合反应液；所述螯合反应液中，海参卵源八肽与Ca2+的终浓度摩尔比为1:1；所述海参卵源八肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；
S2、将步骤S1所述螯合反应液在30～60℃、pH7.5～8.5搅拌0.5～1.5h，得海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液；
S3、将步骤S2所述海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液真空冷冻干燥，得海参卵源八肽-钙纳米复合物。
5.根据权利要求4所述海参卵源八肽-钙纳米复合物的制备方法，其特征在于，步骤S1所述Ca2+为氯化钙。
6.根据权利要求4所述海参卵源八肽-钙纳米复合物的制备方法，其特征在于，步骤S3所述真空冷冻干燥具体为：冷阱-50～-70℃，真空度1～20Pa，时间48～72小时。
7.根据权利要求4所述海参卵源八肽-钙纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1、将0.04mmol海参卵源八肽与0.04mmol CaCl2混合，加入20mL去离子水溶解，得螯合反应液；所述海参卵源八肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2、将步骤S1所述螯合反应液在50℃、pH8.0，1000rpm搅拌1h，得海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液；所述螯合反应液的pH维持在8.0；
S3、将步骤S2所述海参卵源八肽-钙纳米复合物制备液置于冷阱-50℃、真空度1Pa、真空冷冻干燥48小时，得海参卵源八肽-钙纳米复合物。
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