CN116328039A - 一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料及其制备方法和应用 - Google Patents
一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料及其制备方法和应用；该材料为骨组织超声脱细胞脱矿后形成的矿化度细胞外基质；所述的矿化度为钙的质量含量为10‑20％。该方法具体为取天然骨切割成骨片并清洗，将骨片加工成不同的规格并清洗，进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、特定脱矿处理至钙的质量含量为10‑20％，进行末道清洗并检测残留，进行冻干和包装，进行灭菌。该材料其具有表面带电基团，可实现代谢物的选择性渗透，从而调控炎症，其具有表面胶原残基，可促进细胞粘附，且具有显著的促骨修复能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物材料，具体涉及一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料及其制备方法和应用。
背景技术
骨折、疾病或先天性缺陷引起的骨缺损的修复仍然是待解决的医学上重要的问题，随着人口老龄化的加快，骨科疾病频发引发的骨缺损患者人数不断增加。根据统计，我国骨缺损的患者病例为300万例/年，骨修复材料的需求患者是200万例/年，且目前的患者实际用量约为50万例/年，在中国市场的骨修复产品的平均价格约为2000元/人，据此测算国内骨修复材料实际市场约达到10亿元/年，潜在市场规模约为40亿元/年。同时，临床上大面积骨组织缺损多由于骨创伤、骨肿瘤的切除等各种原因造成，不仅造成患者身体的畸形和并引起各种机体功能障碍，而且对患者心理方面的也产生不良影响。因此，骨缺损问题造成了极大的社会经济负担和精神负担，亟须一款具有生物安全性和治疗有效性的国产创新骨修复产品上市。
对于骨缺损填充，目前临床上常用的骨缺损修复材料黄金标准为自体骨移植，将来源于患者本身的髂骨、腓骨或肋骨切除，并移植到缺损部位，因其存在骨来源有限、需要二次手术并增加了术后感染和可能传染疾病的风险、增加患者的经济负担等缺点，限制了其的广泛应用。而目前临床使用中最多的同种异体骨同样存在来源有限的问题，还具有免疫排斥反应和传播潜在疾病的风险。同时，近年来的前沿研究成果发现器官组织损伤，尤其是骨肌系统损伤中，损伤早期的过度炎症可能导致组织修复延迟甚至不愈合，因此，在骨缺损修复材料填充的基础上，应当调控早期炎症细胞稳态以保证远期愈合。因此，研发具有与人自体来源骨材料相似特性并具有炎症细胞调控能力的人工骨是目前骨修复材料产业化未来的发展方向。
组织工程骨因其广泛来源和天然结构，能够最大程度还原生物性功能，并避免异体排斥免疫反应导致的手术失败，现已成为组织工程学研究及临床应用的再生医学材料，被广大研究人员所关注和重视，经过20余年发展，逐渐涌现出许多革命性的创新研究和产品，他们将骨骼肌肉系统组织的完全修复再生变成可能。脱细胞作为组织工程代表性技术，是应用物理、化学、生物酶等方法，可以特异、精确的清除异种组织或器官内具有免疫原性的组分，同时保留具有高度生物活性和功能的组织结构，即细胞外基质(ECM，Extracellular Matrix)。在过去十年里，ECM材料在复杂器官构建研究(例如：心脏、肺、肝脏、肾脏等)和临床产品应用方面均表现出很好的器官/组织再生修复效果。近年来，已有异种骨植入产品上市，并运用于临床。该类产品通过去除天然骨基质的免疫原性组分并保留天然骨基质三维立体结构，以达到降低免疫原性而促进骨修复的目的。在上述涉及发明中，申请号为CN201210060651.0的专利公布了一种制备脱细胞骨的方法，将动物骨通过制备骨片、病毒灭活、脱脂、脱细胞、冻干、裁剪、成型、包装和辐照消毒工艺后得到脱细胞骨。申请号为CN201910244264.4的专利公布了一种用于鼻部整形填充的同种脱矿骨材料及其制备方法，以皮质骨作为原材料，进行脱脂脱矿处理，得到脱矿骨材料。
但诸如上述的发明或为完全矿化骨修复材料，表面微结构致密，细胞粘附能力弱，或为完全脱矿骨修复材料，力学性能差，无法形成有效支撑，此外，诸如上述的发明更无法合理调控骨损伤早期炎症细胞状态，以达到更加理想的骨修复效果。因此需要制备一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料，模拟天然骨修复所需要的特定微环境，有助于炎症抑制，促进骨组织修复。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料及其制备方法和应用。所述材料为骨组织超声脱细胞脱矿后形成的特定矿化度细胞外基质，模拟天然骨修复所需要的特定微环境，有助于炎症抑制，促进骨组织修复。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料，该材料为骨组织超声脱细胞脱矿后形成的矿化度细胞外基质；所述的矿化度为钙的质量含量为10-20％。
作为优选，所述的骨组织来源采用人来源的同种骨组织或猪、牛、羊、马来源的异种骨组织，更优选的，采用猪来源的异种骨组织。
作为优选，所述的骨组织类型包括皮质骨、松质骨、软骨及上述成分的复合骨，优选的，采用骨骺骨组织。
作为优选，骨组织规格包括骨粒、骨块、骨条和骨粉，优选的，采用骨粒。
一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
取天然骨切割成骨片并清洗，将骨片加工成不同的规格并清洗，进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、特定脱矿处理至钙的质量含量为10-20％，进行末道清洗并检测残留，进行冻干和包装，进行灭菌。
作为优选，所述的取天然骨切割成骨片并清洗，具体为：取新鲜的天然骨，去除其上所附的大部分骨肉，将骨骺、皮质骨或松质骨切割成合适规格的骨片，切割完成后用清洗液清洗骨片，去除骨片上大部分的血液和骨髓。
作为优选，所述的天然骨采用人来源的同种骨组织或猪、牛、羊、马来源的异种骨组织，更优选的，采用猪来源的异种骨组织。
作为优选，上述切割方式包括锯骨机、摆锯、半自动切割机、CNC数控机床、高压水刀等切割方式，优选的，采用锯骨机。
作为优选，上述清洗方式包括高压冲洗、振荡清洗、喷淋清洗或超声清洗等，优选的，采用高压冲洗。
作为优选，上述清洗液包括纯化水、超纯水、注射用水、生理盐水、磷酸缓冲液等，优选的，采用纯化水。
作为优选，所述的将骨片加工成不同的规格并清洗，具体为：
将骨片加工成骨粒、骨块、骨条或骨粉，优选的，采用骨粒，加工完成后用溶液清洗加工成型产品表面的骨渣及残存的血液、骨髓。
作为优选，上述加工方式包括切割、冲压、粉碎等方式。其中对于骨条、骨块、骨粒，优选的，选择切割工艺或冲压工艺，切割设备可采用锯骨机、摆锯、半自动切割机、CNC数控机床、高压水刀等，冲压设备采用冲压机，更优选的，采用锯骨机；对于骨粉，优选的，选择粉碎工艺，根据不同的骨粉粒径，可采用颚式粉碎仪、旋转式研磨仪、切割时研磨仪、盘式研磨仪等，更优选的，采用旋转式研磨仪。
作为优选，上述清洗方式包括高压冲洗、振荡清洗、喷淋清洗或超声清洗等，优选的，采用高压冲洗。
作为优选，上述清洗液包括纯化水、超纯水、注射用水、生理盐水、磷酸缓冲液等，优选的，采用纯化水。
作为优选，所述的消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、特定脱矿处理，具体为：
用消毒液将加工成型的产品进行消毒处理，消毒处理完成后用清洗液清洗，用脱脂液将消毒后的产品进行脱脂处理，脱脂处理完成后用清洗液清洗，脱脂后的产品进行脱细胞处理，脱细胞处理完成后用清洗溶液清洗，将脱细胞处理后的产品进行脱钙处理，使产品的含钙量降低到钙的质量含量为10-20％，脱钙处理完成后用清洗液清洗。
作为优选，所述的消毒液包括75％乙醇、异丙醇、过氧化氢、高锰酸钾溶液，优选的，采用75％乙醇。
作为优选，所述的消毒处理方式包括机械搅拌、恒温摇床振荡、超声高频振荡，优选的，采用超声高频振荡；所述的消毒处理条件为温度不高于37℃，消毒1-24小时，优选的，消毒4-8小时。
作为优选，所述的脱脂液包括乙醇、氢氧化钠、过氧化氢、丙酮、甲醇、氯仿、石油醚、正己烷中的一种或多种，优选的，采用乙醇。
作为优选，所述的脱脂处理方式包括机械搅拌、恒温摇床振荡、超声高频振荡等，优选的，采用超声高频振荡；所述的脱脂处理条件为温度不高于37℃，脱脂2-72小时，优选的，脱脂6-24小时。
作为优选，所述的脱细胞液包括Trition-X100、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠中的一种或多种，，优选的，采用Trition-X100、十二烷基硫酸钠组合，脱细胞液的质量浓度为0.5％-2.5％，更优选的，采用质量浓度为1.0％-2.0％；所述的脱细胞处理方式包括机械搅拌、恒温摇床振荡、超声高频振荡，优选的，采用超声高频振荡。
作为优选，所述的脱细胞处理条件为温度不高于37℃，脱细胞2-72小时，优选的，采用24-36小时。
作为优选，所述的特定脱矿处理，采用脱钙液，脱钙液包括乙二胺四乙酸或这种螯合剂的类似物、柠檬酸、琥珀酸、肝素等钙螯合剂及甲酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸，所述脱钙液单一使用或组合使用；优选的，采用乙二胺四乙酸，质量浓度为2-20％，更优选的，采用质量浓度为8-15％17、根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的脱矿处理方式包括机械搅拌、恒温摇床振荡、超声高频振荡，优选的，采用超声高频振荡；脱矿处理条件为温度不高于37℃，脱钙0.1-24小时，优选的，采用10-60分钟。
作为优选，所述的用清洗液清洗的方式包括浸泡清洗、振荡清洗、流水冲洗、喷淋清洗、超声清洗或者高压水枪冲洗，优选的，采用超声清洗。
作为优选，所述的用清洗液清洗的清洗液包括纯化水、超纯水、注射用水、生理盐水、磷酸缓冲液，所述清洗液可以单一使用也可组合使用，优选的，采用纯化水；脱钙处理前清洗时间为1-72小时，优选的，采用6-12小时，脱钙处理完成后清洗时间为6-72小时，优选的，采用24-60小时。。
作为优选，进行冻干和包装，进行灭菌，具体为：
将脱钙处理完成并用清洗液清洗后的产品放入冻干模具中，进行冷冻干燥操作，将冻干后的产品进行包装和灭菌。
作为优选，上述冻干模具的材质应易导热、不影响产品特性，包括316L不锈钢、合金钢、医用玻璃等材质，优选的，采用316L不锈钢。
作为优选，上述包装应无毒性、不影响产品性能且满足灭菌的要求，包括纸塑袋、吸塑盒、特卫强纸、塑料袋、塑料瓶、玻璃瓶等材料，以上包装材料可单独使用或组合使用，优选的，采用纸塑袋和吸塑盒/特卫强纸组合使用，纸塑袋作为内包材，吸塑盒/特卫强作为保护性包装。
作为优选，所述的灭菌方式包括湿热灭菌、环氧乙烷(灭菌或者辐照灭菌等，优选的，采用环氧乙烷灭菌。
一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料在小鼠及人体骨上的应用
将本产品用于小鼠及人体骨缺损治疗，并验证其调控炎症代谢和促骨修复的能力。
上述验证内容包括材料性能表征、选择性渗透原理验证、转录及代谢组分析、在体调控炎症代谢治疗效果验证。
本发明的有益效果：
1)本发明提供的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料，其具有表面带电基团，可实现代谢物的选择性渗透，从而调控炎症。
2)本发明提供的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料，其具有表面胶原残基，可促进细胞粘附。
3)本发明提供的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料，其具有显著的促骨修复能力。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供以下附图进行说明：
图1为实施例1的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料在加工前后的组织学、荧光染色、DNA、胶原定量及电镜、CT表征，显示加工后DNA含量极低，胶原含量几乎不变、结构保存完好，说明加工过程充分去除免疫原性物质，并保留了目标成分。
图2为实施例1的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的细胞毒性试验及选择性透过能力验证，显示细胞增殖几乎不受影响，炎症得到抑制，同时葡萄糖、乳酸等物质的透过被选择性限制，说明产品细胞毒性低，并具有葡萄糖、乳酸等能量物质的选择性渗透能力和炎症抑制能力。
图3为实施例1的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的选择性渗透的代谢组分析与红外分析，显示酰胺类促炎物质不易透过，肉碱/甘油磷脂类抗炎物易透过，本材料的选择性渗透能力集中于限制带正电物质通过，这种能力与脱细胞脱矿后暴露的羧基负电基团相关。
图4为实施例1的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料对于细胞炎症调控能力的转录-代谢组联合分析，显示炎症细胞具有高磷酸戊糖途径、低三羧酸循环、低脂肪酸氧化的代谢特征，而经过本材料基于选择性渗透的炎症代谢调控后，炎症细胞的磷酸戊糖途径、三羧酸循环、脂肪酸氧化代谢水平恢复正常，说明本材料具有显著的炎症代谢调控能力。
图5为实施例1的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料对小鼠骨修复的炎症相关蛋白转录水平的调控，显示Il-6、Nos2、Tnfa、Il1b、Cd86基因表达水平相对于骨损伤对照组显著下调，说明本材料具有动物试验水平的骨修复炎症调控能力。
图6为实施例1的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料对人体骨修复的炎症相关指标的调控，显示术后1周、12周的白细胞、中性粒细胞和C反应蛋白水平相对于对照组医疗器械均显著下降，说明本材料具有人体试验水平的骨修复炎症调控能力。
图7为实施例1的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料对人体骨修复的骨修复促进效果的分析，显示术后12周相对于对照组医疗器械的骨植入物降解率和新骨形成率显著上升，说明本材料具有人体试验水平的促骨修复能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1、猪来源骨骺骨制备可调控炎症代谢的特定矿化度骨粒
步骤1、取天然骨切割成合适规格的骨片并清洗，由以下方式进行：
取新鲜的天然猪骨，去除其上所附的大部分骨肉，将骨骺切割成合适规格的骨片，切割完成后用清洗液清洗骨片，去除骨片上大部分的血液和骨髓。上述切割方式采用锯骨机，清洗方式采用高压冲洗，清洗液采用纯化水。
步骤2、将骨片加工成不同的规格并清洗，由以下方式进行：
将骨片加工成不同规格骨粒，加工完成后用溶液清洗加工成型产品表面的骨渣及残存的血液、骨髓。上述加工方式采用锯骨机，清洗方式采用高压冲洗，清洗液采用纯化水。
步骤3、消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、特定脱矿处理，由以下方式进行：
用消毒液将加工成型的产品进行消毒处理，消毒处理完成后用溶液清洗，用脱脂液将消毒后的产品进行脱脂处理，脱脂处理完成后用溶液清洗，脱脂后的产品进行脱细胞处理，脱细胞处理完成后用清洗溶液清洗，将脱细胞处理后的产品进行脱钙处理，使产品的含钙量降低到需要的水平，脱钙处理完成后用清洗溶液清洗。上述消毒液采用75％乙醇，消毒处理方式采用超声高频振荡，消毒处理条件为温度为35℃，消毒4小时。上述脱脂液采用乙醇，脱脂处理方式采用超声高频振荡，脱脂处理条件为温度为32℃，脱脂5小时。上述脱细胞液采用Trition-X100、十二烷基硫酸钠组合，脱细胞液的浓度为1.0％，脱细胞处理方式采用超声高频振荡，脱细胞处理条件为温度为33℃，脱细胞24小时。上述脱钙液采用乙二胺四乙酸(EDTA)，浓度为2％，，脱钙处理方式采用超声高频振荡，脱钙处理条件为温度为36℃，脱钙10分钟，脱钙处理目标为钙含量15％。上述清洗方式采用超声清洗，清洗液采用纯化水，清洗时间为采用6小时。
步骤4、末道清洗，由以下方式进行：
脱钙处理后的产品用溶液进行末道清洗，直至所有试剂的残留达到规定的限量。上述清洗方式采用超声清洗，上述清洗液采用纯化水，清洗时间采用24小时。
步骤5、进行冻干和包装，进行灭菌，由以下方式进行：
将清洗后的产品放入冻干模具中，进行冷冻干燥操作，将冻干后的产品进行包装和灭菌。上述冻干模具采用316L不锈钢。上述包装采用纸塑袋和吸塑盒/特卫强纸组合使用，纸塑袋作为内包材，吸塑盒/特卫强作为保护性包装。上述灭菌方式包括采用环氧乙烷灭菌。
实施例2、猪来源骨皮质骨制备可调控炎症代谢的特定矿化度骨丝
步骤1、取天然骨切割成合适规格的骨片并清洗，由以下方式进行：
取新鲜的天然猪骨，去除其上所附的大部分骨肉，将皮质骨切割成合适规格的骨片，切割完成后用清洗液清洗骨片，去除骨片上大部分的血液和骨髓。上述切割方式采用锯骨机，清洗方式采用高压冲洗，清洗液采用纯化水。
步骤2、将骨片加工成不同的规格并清洗，由以下方式进行：
将骨片加工成不同规格骨丝，长度约1mm至约100mm、宽度约0.1mm至约10mm，厚度约0.05mm至约1.5mm，加工完成后用溶液清洗加工成型产品表面的骨渣及残存的血液、骨髓。上述加工方式采用锯骨机，清洗方式采用高压冲洗，清洗液采用纯化水。
步骤3、消毒处理、脱脂处理、特定脱矿处理，由以下方式进行：
用消毒液将加工成型的产品进行消毒处理，消毒处理完成后用溶液清洗，用脱脂液将消毒后的产品进行脱脂处理，脱脂处理完成后用溶液清洗，脱脂后的产品进行脱钙处理，使产品的含钙量降低到需要的水平，脱钙处理完成后用清洗溶液清洗。上述消毒液采用75％乙醇，消毒处理方式采用超声高频振荡，消毒处理条件为温度不高于37℃，消毒8小时。上述脱脂液采用乙醇和氢氧化钠，脱脂处理方式采用超声高频振荡，脱脂处理条件为温度为30℃，脱脂24小时；上述脱钙液采用盐酸，脱钙处理方式采用超声高频振荡，脱钙处理条件为温度为35℃，脱钙50分钟，脱钙处理目标为钙含量16％。上述清洗方式采用超声清洗，清洗液采用纯化水，清洗时间为采用12小时。
步骤4、末道清洗，由以下方式进行：
脱钙处理后的产品用溶液进行末道清洗，直至所有试剂的残留达到规定的限量。上述清洗方式采用超声清洗，上述清洗液采用纯化水，清洗时间采用60小时。
步骤5、进行冻干和包装，进行灭菌，由以下方式进行：
将清洗后的产品放入冻干模具中，进行冷冻干燥操作，将冻干后的产品进行包装和灭菌。上述冻干模具采用316L不锈钢。上述包装采用使用医用包装瓶。
实施例3、人来源骨皮质骨制备可调控炎症代谢的特定矿化度骨粉
步骤1、取天然骨切割成合适规格的骨片并清洗，由以下方式进行：
取新鲜的天然人骨，去除其上所附的大部分骨肉，将皮质骨切割成合适规格的骨片，切割完成后用清洗液清洗骨片，去除骨片上大部分的血液和骨髓。上述切割方式采用锯骨机，清洗方式采用高压冲洗，清洗液采用纯化水。
步骤2、将骨片加工成不同的规格并清洗，由以下方式进行：
将骨片加工成不同规格骨粉，粒径1um-1mm，加工完成后用溶液清洗加工成型产品表面的骨渣及残存的血液、骨髓。上述加工方式采用旋转研磨仪，清洗方式采用高压冲洗，清洗液采用纯化水。
步骤3、消毒处理、脱脂处理、特定脱矿处理，由以下方式进行：
用消毒液将加工成型的产品进行消毒处理，消毒处理完成后用溶液清洗，用脱脂液将消毒后的产品进行脱脂处理，脱脂处理完成后用溶液清洗，脱脂后的产品进行脱钙处理，使产品的含钙量降低到需要的水平，脱钙处理完成后用清洗溶液清洗。上述消毒液采用75％乙醇，消毒处理方式采用超声高频振荡，消毒处理条件为温度为37℃，消毒6小时。上述脱脂液采用乙醇，脱脂处理方式采用超声高频振荡，脱脂处理条件为温度为36℃，脱脂12小时。上述脱钙液采用盐酸，脱钙处理方式采用超声高频振荡，脱钙处理条件为温度为36℃，脱钙60分钟，脱钙处理目标为钙含量18％。上述清洗方式采用超声清洗，清洗液采用纯化水，清洗时间为采用8小时。
步骤4、末道清洗，由以下方式进行：
脱钙处理后的产品用溶液进行末道清洗，直至所有试剂的残留达到规定的限量。上述清洗方式采用超声清洗，上述清洗液采用纯化水，清洗时间采用30小时。
步骤5、进行冻干和包装，进行灭菌，由以下方式进行：
将清洗后的产品放入冻干模具中，进行冷冻干燥操作，将冻干后的产品进行包装和灭菌。上述冻干模具采用316L不锈钢。上述包装采用使用医用包装瓶。
实施例4、猪来源骨骺骨制备可调控炎症代谢的特定矿化度骨粒
步骤1、取天然骨切割成合适规格的骨片并清洗，由以下方式进行：
取新鲜的天然猪骨，去除其上所附的大部分骨肉，将骨骺切割成合适规格的骨片，切割完成后用清洗液清洗骨片，去除骨片上大部分的血液和骨髓。上述切割方式采用锯骨机，清洗方式采用高压冲洗，清洗液采用纯化水。
步骤2、将骨片加工成不同的规格并清洗，由以下方式进行：
将骨片加工成不同规格骨粒，加工完成后用溶液清洗加工成型产品表面的骨渣及残存的血液、骨髓。上述加工方式采用锯骨机，清洗方式采用高压冲洗，清洗液采用纯化水。
步骤3、消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、特定脱矿处理，由以下方式进行：
用消毒液将加工成型的产品进行消毒处理，消毒处理完成后用溶液清洗，用脱脂液将消毒后的产品进行脱脂处理，脱脂处理完成后用溶液清洗，脱脂后的产品进行脱细胞处理，脱细胞处理完成后用清洗溶液清洗，将脱细胞处理后的产品进行脱钙处理，使产品的含钙量降低到需要的水平，脱钙处理完成后用清洗溶液清洗。上述消毒液采用异丙醇，消毒处理方式采用恒温摇床振荡，消毒处理条件为温度为35℃，消毒24小时。上述脱脂液采用乙醇和氢氧化钠，脱脂处理方式采用机械搅拌，脱脂处理条件为温度为35℃，脱脂70小时。上述脱细胞液采用十二烷基苯磺酸钠，脱细胞液的浓度为2.5％，脱细胞处理方式采用超声高频振荡，脱细胞处理条件为温度为35℃，脱细胞72小时。上述脱钙液采用乙二胺四乙酸(EDTA)，浓度为20％，，脱钙处理方式采用超声高频振荡，脱钙处理条件为温度为36℃，脱钙20小时，脱钙处理目标为钙含量10％。上述清洗方式采用超声清洗，清洗液采用纯化水，清洗时间为采用8小时。
步骤4、末道清洗，由以下方式进行：
脱钙处理后的产品用溶液进行末道清洗，直至所有试剂的残留达到规定的限量。上述清洗方式采用超声清洗，上述清洗液采用纯化水，清洗时间采用60小时。
步骤5、进行冻干和包装，进行灭菌，由以下方式进行：
将清洗后的产品放入冻干模具中，进行冷冻干燥操作，将冻干后的产品进行包装和灭菌。上述冻干模具采用316L不锈钢。上述包装采用纸塑袋和吸塑盒/特卫强纸组合使用，纸塑袋作为内包材，吸塑盒/特卫强作为保护性包装。上述灭菌方式包括采用环氧乙烷灭菌。
实施例1中的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料在加工前后的组织学、荧光染色、DNA、胶原定量及电镜、CT表征
1、将加工前后的材料进行组织切片，分别进行H&E染色、DAPI染色、Masson染色、胶原I染色。
2、将加工前后的材料分别测定DNA含量及胶原I含量
3、将加工前后的材料分别进行扫描电镜拍摄及Micro-CT检测。
4、结果显示材料加工后DNA含量极低，胶原含量几乎不变、结构保存完好，说明加工过程充分去除免疫原性物质，并保留了目标成分。如图1。
实施例1中的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的细胞毒性试验及选择性透过能力验证
1、将材料浸提液加入巨噬细胞细胞培养基，测定一周内细胞增殖情况并进行荧光显微镜观察，测定上清葡萄糖及乳酸含量。
2、将材料铺设于Transwell小室上，分别测定GSH、Glucose、Spemidine、Lactate的上室浓度。
3、结果显示细胞增殖几乎不受影响，炎症得到抑制，同时葡萄糖、乳酸等物质的透过被选择性限制，说明产品细胞毒性低，并具有葡萄糖、乳酸等能量物质的选择性渗透能力和炎症抑制能力。如图2。
实施例1中的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的选择性渗透的代谢组分析与红外分析
1、将透过材料的上清进行代谢物分析，对不同性质代谢物进行聚类。
2、分析各个簇的电离能力、电荷性质、分子量大小等指标。
3、对材料进行红外光谱检测，分析主要作用基团。
4、显示酰胺类促炎物质不易透过，肉碱/甘油磷脂类抗炎物易透过，本材料的选择性渗透能力集中于限制带正电物质通过，这种能力与脱细胞脱矿后暴露的羧基负电基团相关。如图3。
实施例1中的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料对于细胞炎症调控能力的转录-代谢组联合分析
1、将材料作用下的炎症细胞进行RNA抽提，分析其转录组变化。
2、将材料作用下的炎症细胞进行代谢物质谱检测，分析其代谢组变化。
3、将转录组与代谢组进行联合分析，描述细胞整体代谢通路变化。
4、显示炎症细胞具有高磷酸戊糖途径、低三羧酸循环、低脂肪酸氧化的代谢特征，而经过本材料基于选择性渗透的炎症代谢调控后，炎症细胞的磷酸戊糖途径、三羧酸循环、脂肪酸氧化代谢水平恢复正常，说明本材料具有显著的炎症代谢调控能力。如图4。
实施例1中的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料对小鼠骨修复的炎症相关蛋白转录水平的调控
1、构建小鼠骨缺损模型，将材料及对照器械材料植入小鼠骨缺损。
2、提取小鼠骨缺损部位细胞，提取RNA并进行炎症相关基因qPCR检测。
3、显示Il-6、Nos2、Tnfa、Il1b、Cd86基因表达水平相对于骨损伤对照组显著下调，说明本材料具有动物试验水平的骨修复炎症调控能力。如图5。
实施例1中的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料对人体骨修复的炎症相关指标的调控
1、进行临床试验，将材料及对照器械材料植入患者骨缺损部位。
2、持续监测患者外周血白细胞、中性粒细胞、CRP等炎症相关指标。
3、显示术后1周、12周的白细胞、中性粒细胞和C反应蛋白水平相对于对照组医疗器械均显著下降，说明本材料具有人体试验水平的骨修复炎症调控能力。如图6。
实施例1中的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料对人体骨修复的骨修复促进效果的分析
1、进行临床试验，将材料及对照器械材料植入患者骨缺损部位。
2、术后12周对患者CT数据进行分析，检测骨修复情况。
3、显示术后12周相对于对照组医疗器械的骨植入物降解率和新骨形成率显著上升，说明本材料具有人体试验水平的促骨修复能力。如图7。
对实施例2、3所得的可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料分别进行组织学、荧光染色、DNA、胶原定量及电镜、CT表征、细胞毒性试验及选择性透过能力验证、选择性渗透的代谢组分析与红外分析、对于细胞炎症调控能力的转录-代谢组联合分析、对小鼠骨修复的炎症相关蛋白转录水平的调控检测，与实施例1中猪来源骨骺骨制备可调控炎症代谢的特定矿化度骨粒具有相似的技术效果和生物效果，这表明可通过上述其他骨组织来源、类型、规格及其他加工方式，可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备和应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本技术领域的技术人员来应当理解，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围，不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (22)
1.一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料，其特征在于：该材料为骨组织超声脱细胞脱矿后形成的矿化度细胞外基质；所述的矿化度为钙的质量含量为10-20％。
2.根据权利要求1所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料，其特征在于：所述的骨组织来源采用人来源的同种骨组织或猪、牛、羊、马来源的异种骨组织，更优选的，采用猪来源的异种骨组织。
3.根据权利要求1或2所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料，其特征在于：所述的骨组织类型包括皮质骨、松质骨、软骨及上述成分的复合骨，优选的，采用骨骺骨组织。
4.根据权利要求1或2所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料，其特征在于：骨组织规格包括骨粒、骨块、骨条和骨粉，优选的，采用骨粒。
5.一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取天然骨切割成骨片并清洗，将骨片加工成不同的规格并清洗，进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、特定脱矿处理至钙的质量含量为10-20％，进行末道清洗并检测残留，进行冻干和包装，进行灭菌。
6.根据权利要求5所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的取天然骨切割成骨片并清洗，具体为：取新鲜的天然骨，去除其上所附的大部分骨肉，将骨骺、皮质骨或松质骨切割成合适规格的骨片，切割完成后用清洗液清洗骨片，去除骨片上大部分的血液和骨髓。
7.根据权利要求5或6所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的天然骨采用人来源的同种骨组织或猪、牛、羊、马来源的异种骨组织，更优选的，采用猪来源的异种骨组织。
8.根据权利要求5所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的将骨片加工成不同的规格并清洗，具体为：
将骨片加工成骨粒、骨块、骨条或骨粉，优选的，采用骨粒，加工完成后用溶液清洗加工成型产品表面的骨渣及残存的血液、骨髓。
9.根据权利要求5所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、特定脱矿处理，具体为：
用消毒液将加工成型的产品进行消毒处理，消毒处理完成后用清洗液清洗，用脱脂液将消毒后的产品进行脱脂处理，脱脂处理完成后用清洗液清洗，脱脂后的产品进行脱细胞处理，脱细胞处理完成后用清洗溶液清洗，将脱细胞处理后的产品进行脱钙处理，使产品的含钙量降低到钙的质量含量为10-20％，脱钙处理完成后用清洗液清洗。
10.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的消毒液包括75％乙醇、异丙醇、过氧化氢、高锰酸钾溶液，优选的，采用75％乙醇。
11.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的消毒处理方式包括机械搅拌、恒温摇床振荡、超声高频振荡，优选的，采用超声高频振荡；所述的消毒处理条件为温度不高于37℃，消毒1-24小时，优选的，消毒4-8小时。
12.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的脱脂液包括乙醇、氢氧化钠、过氧化氢、丙酮、甲醇、氯仿、石油醚、正己烷中的一种或多种，优选的，采用乙醇。
13.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的脱脂处理方式包括机械搅拌、恒温摇床振荡、超声高频振荡等，优选的，采用超声高频振荡；所述的脱脂处理条件为温度不高于37℃，脱脂2-72小时，优选的，脱脂6-24小时。
14.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的脱细胞液包括Trition-X100、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠中的一种或多种，优选的，采用Trition-X100、十二烷基硫酸钠组合，脱细胞液的质量浓度为0.5％-2.5％，更优选的，采用质量浓度为1.0％-2.0％；所述的脱细胞处理方式包括机械搅拌、恒温摇床振荡、超声高频振荡，优选的，采用超声高频振荡。
15.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的脱细胞处理条件为温度不高于37℃，脱细胞2-72小时，优选的，采用24-36小时。
16.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的特定脱矿处理，采用脱钙液，脱钙液包括乙二胺四乙酸或这种螯合剂的类似物、柠檬酸、琥珀酸、肝素等钙螯合剂及甲酸、乙酸、柠檬酸、丙酸、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸，所述脱钙液单一使用或组合使用；优选的，采用乙二胺四乙酸，质量浓度为2-20％，更优选的，采用质量浓度为8-15％。
17.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的脱矿处理方式包括机械搅拌、恒温摇床振荡、超声高频振荡，优选的，采用超声高频振荡；脱矿处理条件为温度不高于37℃，脱钙0.1-24小时，优选的，采用10-60分钟。
18.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的用清洗液清洗的方式包括浸泡清洗、振荡清洗、流水冲洗、喷淋清洗、超声清洗或者高压水枪冲洗，优选的，采用超声清洗。
19.根据权利要求9所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的用清洗液清洗的清洗液包括纯化水、超纯水、注射用水、生理盐水、磷酸缓冲液，所述清洗液可以单一使用也可组合使用，优选的，采用纯化水；脱钙处理前清洗时间为1-72小时，优选的，采用6-12小时，脱钙处理完成后清洗时间为6-72小时，优选的，采用24-60小时。
20.根据权利要求5所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：进行冻干和包装，进行灭菌，具体为：
将脱钙处理完成并用清洗液清洗后的产品放入冻干模具中，进行冷冻干燥操作，将冻干后的产品进行包装和灭菌。
21.根据权利要求5或20所述的一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的灭菌方式包括湿热灭菌、环氧乙烷，优选的，采用环氧乙烷灭菌。
22.一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料在小鼠及人体骨上的应用。
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