CN114618018A - 一种无菌胶原蛋白植入剂及其制备方法 - Google Patents

一种无菌胶原蛋白植入剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种无菌胶原蛋白植入剂及其制备方法，所述的方法包括如下步骤：向pH值为2.0‑3.0稀盐酸或稀醋酸溶液中加入胶原蛋白，进行第一次均质处理，得到胶原蛋白酸溶液，再加入缓冲溶液调节pH至中性，进行第二次均质处理，再加入抗氧化剂，进行第三次均质处理，电子束灭菌，2‑8℃下保存，得到所述的无菌胶原蛋白植入剂。本发明的植入剂为一种无菌产品，经过灭菌后未发生交联，本发明中还加入抗氧化剂，使电离出的自由基优先与抗氧化剂反应，从而降低胶原的交联程度，通过上述条件的控制，本发明制备的植入剂可以顺利的从针孔中推挤出。

Description

一种无菌胶原蛋白植入剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗美容领域，具体涉及一种无菌胶原蛋白植入剂及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，因其具有低免疫原性、可降解性以及可促进组织再生等特质，多年来一直被认为是理想的组织工程支架材料。在注射医美领域，较为常见的材料还包括肉毒素、透明质酸、聚乳酸等，胶原蛋白植入剂在其中的主要优势是可以起到诱导组织再生的作用，形成新生组织填充面部皱纹。
胶原蛋白植入剂是由动物组织提取的胶原蛋白经除杂、纯化等工艺，悬浮于磷酸盐缓冲液中，充填于无菌注射针筒，最后经辐照终端灭菌的无菌植入医疗器械。使用辐照灭菌作为终端灭菌方式是胶原蛋白植入剂最安全可靠的工艺方法。
产品经辐照灭菌时，辐射能量会使水电离产生·OH自由基，进而与蛋白质发生反应，这会导致胶原分子间的氨基、羧基产生键合，发生不可逆交联。目前，植入剂使用时通常会配备27G、30G甚至更细的注射针，其针孔内径约100-200μm。这种情况下，辐照灭菌后的胶原蛋白植入剂很难从针孔中顺利推挤出。
含水胶原蛋白的灭菌一直是行业内的一大难题，CN113384748A公开了一种重组胶原原料的胶原蛋白灭菌方法，而动物组织提取胶原蛋白具有与重组胶原不同的分子结构，高浓度的含水提取胶原蛋白产品在辐照灭菌会发生分子间交联，使产品成为凝胶态，改变其物理性能。环氧乙烷灭菌只适用可穿透性材料，因此不适用于含水胶原的灭菌。CN1304416A公开了通过过滤的方式对低浓度胶原溶液进行除菌，而对胶原蛋白植入剂来说，在过滤除菌后还需要在无菌工艺条件下进行浓缩、交联、粉碎、灌装等步骤，整体过程周期长、成本高、产能低。
鉴于以上原因，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种无菌胶原蛋白植入剂及其制备方法，本发明制备的植入剂的制备方法减少了胶原分子间交联，进而使产品可以顺利从注射器中推挤出来，本发明所述的植入剂为一种新型的无菌产品。
本发明的第一目的，提供了一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，所述的方法包括如下步骤：向pH值为2.0-3.0稀盐酸或稀醋酸溶液中加入胶原蛋白，进行第一次均质处理，得到胶原蛋白酸溶液，再加入缓冲溶液调节pH至中性，进行第二次均质处理，再加入抗氧化剂，进行第三次均质处理，电子束灭菌，2-8℃下保存，得到所述的无菌胶原蛋白植入剂。
进一步的，所述的抗氧化剂为芦丁、表儿茶素、儿茶素、甘露醇、抗坏血酸和甘油中的一种或多种，所述的抗氧化剂在所述的无菌胶原蛋白植入剂中的浓度为2-300mM。
进一步的，所述的抗氧化剂为甘油与芦丁、表儿茶素、儿茶素、甘露醇和抗坏血酸中的一种或几种混合。
各抗氧化剂的浓度分别优选为芦丁2-30mM、表儿茶素2-30mM、儿茶素2-30mM、甘露醇0.02-0.3M、抗坏血酸2-30mM、甘油0.02-0.3M。当抗氧化剂为两种物质混合时，各物质的比例可以为任意比例。
进一步的，所述的第一次均质处理的温度为2-8℃，均质时间为48-72h；第二次均质处理的温度为15-35℃，均质时间为2-4h；第三次均质处理温度为15-25℃，均质时间为6-12h。
进一步的，胶原蛋白与稀盐酸或稀醋酸溶液的质量比1.25-6.25%，加入的缓冲溶液为5xPBS溶液，其体积为所述的胶原蛋白酸溶液体积的1/4 。
进一步的，所述的方法还包括在加入抗氧化剂前进行离心处理。
进一步的，第一次均质处理的温度为2-8℃，均质时间为6-12h；第二次均质处理的温度为15-25℃，均质时间为1-2h；第三次均质处理温度为15-25℃，均质时间为6-12h。
进一步的，胶原蛋白的质量为稀盐酸或稀醋酸溶液质量的0.15-0.75%，加入的缓冲溶液为4xPBS溶液，其体积为所述的胶原蛋白酸溶液体积的1/3 ，，离心处理，离心温度为3-5℃，离心转速为8000-12000rpm，离心时间为0.8-1.2h，离心后称取沉淀质量，再加入适量1xPBS缓冲液和抗氧化剂，使最终植入剂中胶原蛋白含量为1.0-5.0%。
进一步的，所述的PBS缓冲溶液中氯化钠的浓度为120-150mM，氯化钾的浓度为1-5mM，磷酸氢二钠的浓度为5-25mM，磷酸二氢钾1-5mM，pH值7.2-7.6。
本发明中所述的1xPBS缓冲液、4xPBS缓冲液和5xPBS缓冲液是1倍、4倍和5倍的PBS缓冲溶液，即n倍的PBS缓冲溶液中各盐的浓度分别乘以n。
1倍的PBS缓冲溶液中氯化钠的浓度为120-150mM，氯化钾的浓度为1-5mM，磷酸氢二钠的浓度为5-25mM，磷酸二氢钾1-5mM，pH值7.2-7.6。
进一步的，电子束灭菌的辐照剂量为15-25kGy，灭菌温度为-40-20℃。
灭菌温度控制通过将样品提前进行预冻或恒温处理，同时在灭菌过程中采用保温装置及降温措施进行温度控制，最终温度控制在-40-20℃。
本发明的方法通过三次均质处理后颗粒的粒径更小，更容易从针孔中推挤出。
本发明第二目的，提供了一种所述的方法制备的无菌胶原蛋白植入剂。
本发明的植入剂在使用前恢复到室温，配合一次性无菌针头使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的植入剂为一种无菌产品，经过灭菌后未发生交联，这是由于本发明中采用电子束灭菌，与Co-60灭菌方式相比，其经受辐射的时间缩短了近百倍；同时控制灭菌在低温下进行，可以有效减少水电离程度，从而减少自由基数量。本发明中还加入抗氧化剂，使电离出的自由基优先与抗氧化剂反应，从而降低胶原的交联程度。通过上述条件的控制，本发明制备的植入剂可以顺利地从针孔中推挤出。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，所述的方法包括如下步骤：向pH值为2.0-3.0稀盐酸溶液中加入胶原蛋白，胶原蛋白的质量为稀盐酸质量的1.25%，进行第一次均质处理，所述的第一次均质处理的温度为2℃，均质时间为72h，得到胶原蛋白酸溶液，加入所述的胶原蛋白酸溶液体积1/4的5xPBS溶液调节pH至中性；进行第二次均质处理，第二次均质处理的温度为15℃，均质时间为4h，再加入甘油，甘油在植入剂中的浓度为0.02M；进行第三次均质处理，第三次均质处理温度为15℃，均质时间为12h，电子束灭菌，辐照剂量为15kGy，灭菌温度为-40℃，2℃下保存，得到所述的无菌胶原蛋白植入剂。
本实施例中PBS溶液中氯化钠的浓度为120mM，氯化钾的浓度为5mM，磷酸氢二钠的浓度为5mM，磷酸二氢钾5mM。
实施例2
本实施例的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，所述的方法包括如下步骤：向pH值为2.0-3.0稀醋酸溶液中加入胶原蛋白，胶原蛋白的质量为稀醋酸质量的3.75%，进行第一次均质处理，所述的第一次均质处理的温度为5℃，均质时间为60h，得到胶原蛋白酸溶液，加入所述的胶原蛋白酸溶液体积1/4的5xPBS溶液调节pH至中性；进行第二次均质处理，第二次均质处理的温度为25℃，均质时间为3h，再加入甘露醇，甘露醇在植入剂中的浓度为0.16M；进行第三次均质处理，第三次均质处理温度为20℃，均质时间为9h，电子束灭菌，辐照剂量为20kGy，灭菌温度为0℃，6℃下保存，得到所述的无菌胶原蛋白植入剂。
本实施例中PBS溶液中氯化钠的浓度为135mM，氯化钾的浓度为3mM，磷酸氢二钠的浓度为15mM，磷酸二氢钾3mM。
实施例3
本实施例的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，所述的方法包括如下步骤：向pH值为2.0-3.0稀盐酸溶液中加入胶原蛋白，胶原蛋白的质量为稀盐酸质量的6.25%，进行第一次均质处理，所述的第一次均质处理的温度为8℃，均质时间为48h，得到胶原蛋白酸溶液，加入所述的胶原蛋白酸溶液体积1/4的5xPBS溶液调节pH至中性；进行第二次均质处理，第二次均质处理的温度为35℃，均质时间为2h，再加入芦丁，芦丁在植入剂中的浓度为30mM；进行第三次均质处理，第三次均质处理温度为25℃，均质时间为6h，电子束灭菌，辐照剂量为25kGy，灭菌温度为20℃，8℃下保存，得到所述的无菌胶原蛋白植入剂。
本实施例中PBS溶液中氯化钠的浓度为150mM，氯化钾的浓度为1mM，磷酸氢二钠的浓度为25mM，磷酸二氢钾1mM。
实施例4
本实施例的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，所述的方法包括如下步骤：向pH值为2.0-3.0稀盐酸溶液中加入胶原蛋白，胶原蛋白的质量为稀盐酸溶液质量的0.15%，进行第一次均质处理，第一次均质处理的温度为2℃，均质时间为12h，得到胶原蛋白酸溶液，再加入缓冲溶液调节pH至中性，缓冲溶液为1/3体积的所述的胶原蛋白酸溶液的4xPBS缓冲溶液，再离心处理，离心温度为3℃，离心转速为12000rpm，离心时间为0.8h，离心去除上清液后，根据沉淀重量，再加入适量1xPBS缓冲液，使最终植入剂中胶原蛋白含量为1.0%；进行第二次均质处理，第二次均质处理的温度为15℃，均质时间为2h，再加入甘油，甘油在植入剂中的浓度为300mM；进行第三次均质处理，第三次均质处理温度为15℃，均质时间为12h，电子束灭菌，辐照剂量为15kGy，灭菌温度为-40℃，2℃下保存，得到所述的无菌胶原蛋白植入剂。
本实施例中PBS溶液中氯化钠的浓度为120mM，氯化钾的浓度为5mM，磷酸氢二钠的浓度为5mM，磷酸二氢钾5mM。
实施例5
本实施例的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，所述的方法包括如下步骤：向pH值为2.0-3.0稀盐酸溶液中加入胶原蛋白，胶原蛋白的质量为稀盐酸溶液质量的0.4%，进行第一次均质处理，第一次均质处理的温度为5℃，均质时间为9h，得到胶原蛋白酸溶液，再加入缓冲溶液调节pH至中性，缓冲溶液为1/3体积的所述的胶原蛋白酸溶液的4xPBS缓冲溶液，再离心处理，离心温度为4℃，离心转速为10000rpm，离心时间为1h，离心去除上清液后，根据沉淀重量，再加入适量1xPBS缓冲液，使最终植入剂中胶原蛋白含量为3.0%；进行第二次均质处理，第二次均质处理的温度为20℃，均质时间为1.5h，再加入儿茶素，儿茶素在植入剂中的浓度为30mM；进行第三次均质处理，第三次均质处理温度为20℃，均质时间为9h，电子束灭菌，辐照剂量为20kGy，灭菌温度为0℃，5℃下保存，得到所述的无菌胶原蛋白植入剂。
本实施例中PBS溶液中氯化钠的浓度为135mM，氯化钾的浓度为3mM，磷酸氢二钠的浓度为15mM，磷酸二氢钾3mM。
实施例6
本实施例的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，所述的方法包括如下步骤：向pH值为2.0-3.0稀盐酸溶液中加入胶原蛋白，胶原蛋白的质量为稀盐酸溶液质量的0.75%，进行第一次均质处理，第一次均质处理的温度为8℃，均质时间为6h，得到胶原蛋白酸溶液，再加入缓冲溶液调节pH至中性，缓冲溶液为1/3体积的所述的胶原蛋白酸溶液的4xPBS缓冲溶液，再离心处理，离心温度为5℃，离心转速为8000rpm，离心时间为1.2h，离心去除上清液后，根据沉淀重量，再加入适量1xPBS缓冲液，使最终植入剂中胶原蛋白含量为5.0%；进行第二次均质处理，第二次均质处理的温度为25℃，均质时间为1h，再加入抗坏血酸，抗坏血酸在植入剂中的浓度为20mM；进行第三次均质处理，第三次均质处理温度为25℃，均质时间为6h，电子束灭菌，辐照剂量为25kGy，灭菌温度为20℃，8℃下保存，得到所述的无菌胶原蛋白植入剂。
本实施例中PBS溶液中氯化钠的浓度为150mM，氯化钾的浓度为1mM，磷酸氢二钠的浓度为25mM，磷酸二氢钾1mM。
对比例1
本对比例的植入剂的制备方法与实施例1相同，不同之处，不加甘油。
对比例2
本对比例的植入剂的制备方法与实施例1相同，不同之处，不进行电子束灭菌处理。
试验例1
测试实施例1-6和对比例1制备的植入剂的推挤力
具体测试方法如下：使用拉力机参照ISO7886-1标准进行推挤力测试，推挤速度为25mm/min，注射器装量为1mL，推挤长度为10mm，30G针头，规定在稳定推挤过程中的平均推挤力为产品的推挤力，对于出现力值波动的测量结果，规定力值大于平均推挤力2倍的为异常力值波动，记录异常波动次数，结果如表1所示。
Figure 795690DEST_PATH_IMAGE001
从表1中可以看出，实施例1-6与对比例相比具有更小的推挤力，且不存在异常力值，说明添加抗氧化剂可以有效改善推挤时的顺畅度。此外，实施例4-6比实施例1-3的推挤力更低，说明加入低浓度的胶原蛋白再离心浓缩得到的植入剂的推挤力更低。
试验例2
动物组织提取天然胶原蛋白具有生物活性的基础是具有三螺旋结构，相反三螺旋结构被破坏则认为胶原发生了变性，因此胶原蛋白中三螺旋结构的多少可以代表胶原蛋白生物活性强弱。在适宜条件下，胰蛋白酶不酶解具有三螺旋结构的胶原分子区域，而只剪切非螺旋区域的特定氨基酸序列。将胶原蛋白进行胰蛋白酶酶解，测量其酶解液以及非酶解样品的羟脯氨酸含量，定义两者的比值即为胶原蛋白材料的变性程度，测试实施例1-6和对比例1制备的植入剂的变性程度，如表2所示。
酶解条件：中性Tris-HCl缓冲溶液中，22℃酶解36h，胰蛋白酶：底物=500U：1mg。
羟脯氨酸测量方法：参照YY/T 1511-2017中附录B。
Figure 377850DEST_PATH_IMAGE002
由于动物提取胶原蛋白分子的稳定性不佳，在高温，高剪切导致高温，辐射，强酸，强碱等诸多条件下都可能发生变性。上述检测结果中，实施例1-6的变性程度大于对比例1，但小于对比例2，说明本专利工艺中的匀浆、粉碎、搅拌等过程并未让胶原变性，同时添加抗氧化剂可以减弱灭菌过程中胶原蛋白发生的变性，保障了产品的有效性。
试验例3热变性温度
胶原蛋白的三螺旋结构是由三条多肽链通过氢键来维持的，胶原的热变性温度反应了分子间及分子内氢键数目及稳定性等信息，一定程度反映了胶原的活性。参照YY/T1453-2016附录C规定方法，将实施例1-6和对比例1的植入剂分别冷冻干燥，放入密封坩埚中，同时加入适量纯水，氮气气氛下，2℃/min升温速度，在范围20℃-150℃进行扫描，记录样品吸热峰对应的温度值以及焓变值（吸热峰积分），如表3所示。
Figure 319786DEST_PATH_IMAGE003
从表3中可以看出，对比例1的热变性温度和焓变值明显低于实施例1-6，且出现40℃以下的吸热峰，表明不加抗氧化剂灭菌处理使得胶原发生交联，结构破坏，实施例1-6和对比例2的热变性温度相近，表明抗氧化剂对胶原蛋白的结构有保护作用。
试验例4
只改变抗氧剂的种类，总浓度不变，其他均与实施例1相同，考察抗氧化剂种类对推挤力和异常力值的影响，测试方法同试验例1，结果见表4。
Figure 266882DEST_PATH_IMAGE004
从表4中可以看出，当抗氧化剂选择甘油与其他组分混合时，胶原蛋白植入剂的推挤力更低。
试验例5
只改变灭菌温度，其他均与实施例1相同，考察灭菌温度对推挤力和异常力值的影响，测试方法同试验例1，结果见表5。
Figure 658549DEST_PATH_IMAGE005
上述结果中，超出本发明的灭菌温度范围时推挤力变大，出现多次异常力值，只有在本发明的灭菌温度下制备的植入剂才具有较好的推挤力。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：向pH值为2.0-3.0稀盐酸或稀醋酸溶液中加入胶原蛋白，进行第一次均质处理，得到胶原蛋白酸溶液，再加入缓冲溶液调节pH至中性，进行第二次均质处理，再加入抗氧化剂，进行第三次均质处理，电子束灭菌，2-8℃下保存，得到所述的无菌胶原蛋白植入剂。
2.根据权利要求1所述的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，其特征在于，所述的抗氧化剂为芦丁、表儿茶素、儿茶素、甘露醇、抗坏血酸和甘油中的一种或多种，所述的抗氧化剂在所述的无菌胶原蛋白植入剂中的浓度为2-300mM。
3.根据权利要求1或2所述的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，其特征在于，所述的第一次均质处理的温度为2-8℃，均质时间为48-72h；第二次均质处理的温度为15-35℃，均质时间为2-4h；第三次均质处理温度为15-25℃，均质时间为6-12h。
4.根据权利要求1所述的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，其特征在于，胶原蛋白与稀盐酸或稀醋酸溶液质量比为1.25-6.25%，加入的缓冲溶液为5xPBS溶液，其体积为所述的胶原蛋白酸溶液体积1/4 。
5.根据权利要求1所述的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，其特征在于，所述的方法还包括在加入抗氧化剂前进行离心处理。
6.根据权利要求5所述的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，其特征在于，第一次均质处理的温度为2-8℃，均质时间为6-12h；第二次均质处理的温度为15-25℃，均质时间为1-2h；第三次均质处理温度为15-25℃，均质时间为6-12h。
7.根据权利要求6所述的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，其特征在于，胶原蛋白的质量为稀盐酸或稀醋酸溶液质量的0.15-0.75%，加入的缓冲溶液为4xPBS缓冲溶液，其体积为所述胶原蛋白酸溶液的1/3，离心处理，离心温度为3-5℃，离心转速为8000-12000rpm，离心时间为0.8-1.2h，离心后称取沉淀质量，再加入适量1xPBS缓冲液和抗氧化剂，使最终植入剂中胶原蛋白含量为1.0-5.0%。
8.根据权利要求4或7所述的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，其特征在于，所述的PBS缓冲溶液中氯化钠的浓度为120-150mM，氯化钾的浓度为1-5mM，磷酸氢二钠的浓度为5-25mM，磷酸二氢钾1-5mM，pH值7.2-7.6。
9.根据权利要求1所述的一种无菌胶原蛋白植入剂的制备方法，其特征在于，电子束灭菌的辐照剂量为15-25kGy，灭菌温度为-40-20℃。
10.一种权利要求1-9任一所述的方法制备的无菌胶原蛋白植入剂。
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