CN114634651B - 一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶及其制备方法，包括如下步骤：A相制备：2‑8℃下向醋酸或盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，加入抗氧化剂，混合得到A相，2‑8℃保存；B相制备：配制缓冲溶液体系；依次将A相和B相分别加入到压力容器中，再往压力容器中加入高压气体后密封压力容器，辐照灭菌，2‑8℃保存，使用时打开压力容器，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。本发明的方法通过压力改变气体在水中的溶解度的方式为胶原蛋白凝胶添加闭孔结构，更好的起到诱导组织再生的作用，本发明的胶原蛋白在特定的缓冲液、温度及pH值环境下，可以使胶原蛋白溶液发生液态向凝胶态的转变，并具有较好的临床应用前景。

Description

一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于凝胶技术领域，具体涉及一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，因其具有低免疫原性、可降解性以及可促进组织再生等特质，多年来一直被认为是理想的组织工程支架材料。目前全球范围内的胶原蛋白类产品主要分为两类，一类始终保持固态，如经冷冻干燥制成的胶原蛋白海绵或经脱细胞工艺得到的脱细胞动物组织（主要为胶原蛋白），通过外科手术的方式固定在缺损部位，发挥诱导再生的作用，另一类产品具有流动性，如胶原水凝胶、胶原蛋白植入剂等，可以微创手术或注射的方式打入体内，这类材料降解时间短、整体力学性能差，在体液丰沛的缺损处使用效果不佳。市场上急需一种接触体液后可由流动状态转变为固态的产品以拓宽胶原蛋白产品使用范围，该产品可以用在不规则组织缺损以及微创手术中。
鉴于以上原因，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶及其制备方法，本发明方法通过改变气体在水中溶解度的方式为胶原蛋白凝胶添加闭孔结构，平时处于高压状态，使用前释放压力，内部胶原溶液喷出同时被均匀混合，当接触体液环境后可以在短时间内迅速变为凝胶态。
本发明的第一目的，提供了一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：2-8℃下向醋酸或盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，加入抗氧化剂，混合得到A相，2-8℃保存；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种；
（3）将A相和B相加入到压力容器中，再往压力容器中加入高压气体后密封压力容器，电子束灭菌，2-8℃保存，使用时打开压力容器，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
进一步的，步骤（1）中醋酸的浓度为0.05-0.5M，盐酸浓度为0.005-0.05M。
进一步的，步骤（1）中胶原蛋白在A相中的质量分数为1-5%。
进一步的，步骤（1）中抗氧化剂在A相中的浓度为2-300mM。
进一步的，步骤（1）中所述的抗氧化剂为芦丁、表儿茶素、儿茶素、甘露醇、抗坏血酸和甘油中的一种或几种。
进一步的，步骤（1）中的抗氧化剂为甘油与芦丁、表儿茶素、儿茶素、甘露醇和抗坏血酸中的一种几种混合。
进一步的，步骤（2）中所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比（0.5-3）:（0.005-0.05）:（0.005-0.05）:（0.02-0.3）混合，加水至总磷酸盐的浓度为0.8-1.8M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成；
其中，各抗氧化剂的浓度分别优选为芦丁2-30mM、表儿茶素2-30mM、儿茶素2-30mM、甘露醇0.02-0.3M、抗坏血酸2-30mM、甘油0.02-0.3M。当抗氧化物为两种物质混合时，各物质的比例可以为任意比例。
所述的Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比（3-5）:（3-5）混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为0.5-1.1M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成；
所述的巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比（5-8）:（4-7）混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.35-0.7M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成。
本发明中缓冲溶液pH值大小与其中原料的配比有关，调节pH值前根据测定的pH值，通过酸和碱共同调节pH值达到所需的范围。
进一步的，步骤（3）中A相和B相的体积比为（5:1）:（10:1），A相和B相总体积与压力容器体积比为（0.5-1.5):2，高压气体质量为A相和B相总质量的30-50%。
本发明中上述各条件的确定是本发明人经过大量试验获得的，高压气体过多会使溶液结冰，导致胶原蛋白溶液不能喷出；高压气体太少，导致胶原蛋白溶液不能喷出，或者能喷出但不成胶。
进一步的，步骤（3）中所述的高压气体为氮气、氧气和二氧化碳中的至少一种。
进一步的，步骤（3）中电子束灭菌的辐照剂量为10-20kGy，灭菌温度为-40-20℃。
本发明中A相和B相加入压力容器中的加入顺序可以依次加入A相和B相，也可以是将A相和B相混合好后加入到压力容器中，或者先加B相再加A相，即只要将A相和B相加入即可。
本发明人经过大量试验，发现将A相和B相混合后加入压力容器，比A相和B相按顺序加入的成胶时间长，这是由于A相和B相混合后在压力容器中发生了部分交联，影响胶原蛋白的成胶时间。
本发明的压力容器打开可以采用特定开启装置安全刺破压力容器，随着高压气体的释放，内部胶原溶液喷出同时被均匀混合，使用缓冲注射装置接住喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内可以迅速变为凝胶态，由于胶原溶液粘度高，因而气体无法完全释放出，在成胶后形成了闭孔结构，闭孔结构可以进一步促进组织修复，更好的起到诱导组织再生的作用。
本发明所述的压力容器为耐腐蚀的容器。
本发明的第二目的，提供了一所述方法制备的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）胶原蛋白本身具有可自组装成胶的特性，本发明的胶原蛋白在特定的缓冲液、温度及pH值环境下，可以使胶原蛋白溶液发生液态向凝胶态的转变，这其中温度由低温变为体温是启动凝胶转变的最重要因素，因此，本发明的胶原蛋白凝胶可以作为医疗器械产品使用，是一款较好的胶原蛋白凝胶，在临床使用时为流动状态，接触患者体温后短时间内转变为凝胶态；
（2）本发明的方法通过压力改变气体在水中的溶解度的方式为胶原蛋白凝胶添加闭孔结构，产品平时存放在高压状态下，使用前释放压力，气体从胶原蛋白溶液中释放，由于溶液粘度高，且随着凝胶化的过程逐渐升温，部分气孔留在了凝胶内部，从而形成闭孔，闭孔结构可以进一步促进组织修复，更好的起到诱导组织再生的作用，本发明的凝胶在使用前一直处于2-8℃下低温保存，是为了防止使用前成胶；
（3）胶原蛋白凝胶化过程中主要是胶原的氨基与羧基在适宜条件下发生键合，使胶原蛋白分子形成紧密相连的网状结构，从而锁住水分，由溶液变为凝胶，本发明的方法是在装入压力容器及加入高压气体并封口后进行辐照灭菌，而通常含水胶原蛋白辐照灭菌时，辐射能量会使水电离产生·OH自由基，进而与蛋白质发生反应，会导致胶原分子间的氨基、羧基产生键合，产生不可逆交联，最终产品无法在使用使再发生凝胶转变，为了避免上述问题的出现，本发明采用电子束灭菌方式与Co-60灭菌方式相比，其经受辐射的时间缩短了近百倍；同时控制灭菌在低温下进行，这样在低温下电子束灭菌可以有效减少水电离程度，从而减少自由基数量，本发明中还加入抗氧化剂，使电离出的自由基优先与抗氧化剂反应，从而降低胶原的交联程度；
（4）本发明方法制备的凝胶可无菌状态提供，经过灭菌后仍然可以保持成胶性能，接触体液环境后短时间内可迅速成胶，本发明的凝胶现用现配，更符合实际使用要求。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例的一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：2℃下向浓度为0.05M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，2℃保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为1%，甘油在A相中的浓度为0.02M；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比0.5:0.05:0.005:0.3混合，加水至总磷酸盐的浓度为0.8M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；
（3）将A相和B相混合后再加入到耐腐蚀的压力容器中，再往压力容器中加入高压气体二氧化碳后密封压力容器，A相和B相的体积比为5:1，A相和B相总体积与压力容器体积比为0.5:2，高压气体质量为A相和B相总质量的30%，电子束灭菌，辐照剂量为10kGy，灭菌温度为0℃，2℃保存，使用时用安全刺破压力容器，使用缓冲注射装置接喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内便可迅速变为凝胶态，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
实施例2
本实施例的一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：5℃下向浓度为0.25M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘露醇，混合得到A相，5℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为2%，甘露醇在A相中的浓度为0.16M；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比1.75:0.0275:0.0275:0.16混合，加水至总磷酸盐的浓度为1.3M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；
（3）将A相和B相混合后加入到耐腐蚀的压力容器中，再往压力容器中加入高压气体氮气后密封压力容器，A相和B相的体积比为6:1，A相和B相总体积与压力容器体积比为0.8:2，高压气体质量为A相和B相总质量的35%，电子束灭菌，辐照剂量为15kGy，灭菌温度为-30℃，5℃保存，使用时用安全刺破压力容器，使用缓冲注射装置接喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内便可迅速变为凝胶态，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
实施例3
本实施例的一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：8℃下向浓度为0.5M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入儿茶素，混合得到A相，8℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为2.5%，儿茶素在A相中的浓度为30mM；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比3:0.005:0.05:0.02混合，加水至总磷酸盐的浓度为1.8M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；
（3）依次将A相和B相混合后加入到耐腐蚀的压力容器中，再往压力容器中加入高压气体二氧化碳后密封压力容器，A相和B相的体积比为8:1，A相和B相总体积与压力容器体积比为1:2，高压气体质量为A相和B相总质量的40%，电子束灭菌，辐照剂量为15kGy，灭菌温度为-20℃，8℃保存，使用时用安全刺破压力容器，使用缓冲注射装置接喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内便可迅速变为凝胶态，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
实施例4
本实施例的一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：4℃下向浓度为0.005M的盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，在4℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为5%，甘油在A相中的浓度为300mM；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为Tris-HCl缓冲溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比3:5混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为0.5M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；
（3）将B相和A相按顺序依次加入到耐腐蚀的压力容器中，再往压力容器中加入高压气体二氧化碳后密封压力容器，A相和B相的体积比为8:1，A相和B相总体积与压力容器体积比为1.2:2，高压气体质量为A相和B相总质量的45%，电子束灭菌，辐照剂量为18kGy，灭菌温度为-40℃，4℃保存，使用时用安全刺破压力容器，使用缓冲注射装置接喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内便可迅速变为凝胶态，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
实施例5
本实施例的一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：6℃下向浓度为0.0275M的盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入抗坏血酸，混合得到A相，在6℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为3%，抗坏血酸在A相中的浓度为30mM；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为Tris-HCl缓冲溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比1:1混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为0.8M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；
（3）依次将A相和B相分别加入到耐腐蚀的压力容器中，再往压力容器中加入高压气体氧气后密封压力容器，A相和B相的体积比为10:1，A相和B相总体积与压力容器体积比为1.5:2，高压气体质量为A相和B相总质量的50%，电子束灭菌，辐照剂量为20kGy，灭菌温度为20℃，6℃保存，使用时用安全刺破压力容器，使用缓冲注射装置接喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内便可迅速变为凝胶态，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
实施例6
本实施例的一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：8℃下向浓度为0.04M的盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，8℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为4%，甘油在A相中的浓度为150mM；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为Tris-HCl缓冲溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比5:3混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为1.8M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；
（3）依次将A相和B相分别加入到耐腐蚀的压力容器中，再往压力容器中加入高压气体二氧化碳后密封压力容器，A相和B相的体积比为6:1，A相和B相总体积与压力容器体积比为1.2:2，高压气体质量为A相和B相总质量的42%，电子束灭菌，辐照剂量为19kGy，灭菌温度为15℃，8℃保存，使用时用安全刺破压力容器，使用缓冲注射装置接喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内便可迅速变为凝胶态，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
实施例7
本实施例的一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：2℃下向浓度为0.1M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，2℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为1%，甘油在A相中的浓度为100mM；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为巴比妥钠-盐酸缓冲液，所述的巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比5:7混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.35M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；
（3）将A相和B相混合后加入到耐腐蚀的压力容器中，再往压力容器中加入高压气体氮气后密封压力容器，A相和B相的体积比为8:1，A相和B相总体积与压力容器体积比为0.8:2，高压气体质量为A相和B相总质量的33%，电子束灭菌，辐照剂量为11kGy，灭菌温度为-35℃，2℃保存，使用时用安全刺破压力容器，使用缓冲注射装置接喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内便可迅速变为凝胶态，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
实施例8
本实施例的一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：3℃下向浓度为0.1M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油和甘露醇，混合得到A相，3℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为3%，甘油和甘露醇在A相中的总浓度为100mM，甘油和甘露醇质量比为1:1；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为巴比妥钠-盐酸缓冲液，所述的巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比7:5混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.525M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；
（3）将A相和B相混合后加入到耐腐蚀的压力容器中，再往压力容器中加入高压气体二氧化碳后密封压力容器，A相和B相的体积比为7:1，A相和B相总体积与压力容器体积比为0.9:2，高压气体质量为A相和B相总质量的38%，电子束灭菌，辐照剂量为11kGy，灭菌温度为-25℃，3℃保存，使用时用安全刺破压力容器，使用缓冲注射装置接喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内便可迅速变为凝胶态，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
实施例9
本实施例的一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备： 7℃下向浓度为0.2M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，7℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为4%，甘油在A相中的浓度为100mM；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为巴比妥钠-盐酸缓冲液，所述的巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比8:4混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.7M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；
（3）依次将A相和B相分别加入到耐腐蚀的压力容器中，再往压力容器中加入高压气体二氧化碳后密封压力容器，A相和B相的体积比为7.5:1，A相和B相总体积与压力容器体积比为1.1:2，高压气体质量为A相和B相总质量的42%，电子束灭菌，辐照剂量为18kGy，灭菌温度为-10℃，7℃保存，使用时用安全刺破压力容器，使用缓冲注射装置接喷出溶液，再由注射装置将溶液打入患者体内，接触体液环境后短时间内便可迅速变为凝胶态，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
对比例1
本对比例的凝胶的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤（1）的A相中不加抗氧化剂。
对比例2
本对比例的凝胶的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤（3）中不做灭菌处理。
对比例3
本对比例的凝胶的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤（1）中不加抗氧化剂，步骤（3）中不做灭菌。
实施例10本实施例的凝胶的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤（3）中依次将A相和B相加入到耐腐蚀的压力容器中。
试验例1成胶时间
测定实施例1-3、实施例10和对比例1-3制备的凝胶的成胶时间，如表1所示，将A相和B相混合后，在37℃环境下以固定频率进行检测，30min内每隔10s取一次点，记录储能模量，以储能模量达到储能模量最大值90%的首个时间点作为成胶时间。
Figure 665059DEST_PATH_IMAGE001
对于流变仪实验，首先要主观观察产品成胶后的性状，储能模量及损耗模量测值的客观比较是以具有相近成胶性状为前提的，此时，储能模量越高越趋向于固体，代表具有更好的力学性能，而如果主观认为胶体不成胶，则储能模量失去了比较意义。
从表1中可以看出，对比例1不添加抗氧化剂时，经辐照灭菌后不成胶，同时喷出样品多呈现颗粒状，证明在释放压力前的灭菌过程中已发生分子间交联。实施例1-3与对比例2相比，成胶时间有增加，力学性能有下降，但整体性能仍在可接受范围之内，这说明即便加入了抗氧化剂，灭菌过程仍会引起一定程度的分子间交联，从而影响后续成胶性能。比较对比例2和对比例3，发现加入抗氧化剂后，成胶时间及成胶后力学性能也有所下降，这表明抗氧化剂抑制了自组装成胶过程。对比实施例1与实施例10结果表明，A、B分别加入相比于A、B混合后加入具有更好的成胶性能，这是由于即使在低于37℃的环境下，A、B混合后也会缓慢发生不可逆的分子间交联，而这种反应必然会减弱后续的成胶过程。
本发明人对其他实施例制备的凝胶也进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。
试验例2热变性温度
将实施例1-3和对比例1-3制备的凝胶在37℃环境下反应30min后冷冻干燥，加入适量PBS溶液，进行同步热分析，规定胶原蛋白变性吸热峰的峰值为热变性温度，峰面积积分为焓变值，焓变值是测试材料的固有属性，结果见表2。
Figure 184902DEST_PATH_IMAGE002
对比例1的热变性温度和焓变值明显低于实施例1-3，且出现40℃以下的吸热峰，表明不加抗氧化剂灭菌处理使得胶原发生交联，同时三螺旋结构遭到破坏，实施例1-3和对比例2的热变性温度相近，表明加入抗氧化剂抑制了上述变化。比较对比例2和对比例3的结果表明，加入抗氧化剂并不会改变胶原的热变性温度相关性能。本发明人对其他实施例制备的凝胶也进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。
试验例3交联性能
不添加抗氧化剂的对比例1在灭菌后喷出样品多为颗粒状，因此我们对其交联情况进行了研究分析。茚三酮与游离氨基在适宜条件下会生成蓝色物质，通过特定波长的吸光度可以得出自由氨基的含量，将交联前后胶原产品的自由氨基数量进行比较，既可得出有氨基参与交联过程的交联程度。测试实施例1-3和对比例1-3制备的凝胶的交联度结果见表3。
其中，戊二醛交联样品为按照CN102924731B中比较例1制备的一重胶原蛋白纤维；
碳化二亚胺交联样品为按照CN102924731B中比较例4制备的一重胶原蛋白纤维。
Figure 61592DEST_PATH_IMAGE003
实验结果表明，实施例1-3和对比例1-3的交联度数据无明显差异，而常用化学交联的交联度在60%、80%左右。胶原的化学交联是在氨基、羧基间形成牢固的化学键，而成纤维或自组装等分子间交联过程是形成键能较弱的氢键，这种结构在茚三酮显色反应条件下会被破坏。
灭菌过程实际上是在辐射能量的作用下，胶原发生了类似自组装的分子间交联，这种交联并不是化学交联。
试验例4
只改变步骤（3）中灭菌的温度，其他均与实施例1相同，考察温度对胶原蛋白成胶时间的影响，成胶时间测定同试验例1，结果如表4所示。
Figure 11618DEST_PATH_IMAGE004
从表4中可以看出，采用本发明的灭菌温度才可以成胶。
试验例5
只改变抗氧剂的种类，总浓度不变，其他均与实施例1相同，考察抗氧化剂种类对胶原蛋白成胶时间的影响，成胶时间测定同试验例1，结果如表5所示。
Figure 403285DEST_PATH_IMAGE005
从表5中可以看出，本发明人经过大量的试验发现，抗氧化剂选择甘油与其他物质混合后凝胶的成胶时间会缩短。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
（1）A相制备：2-8℃下向醋酸或盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，加入抗氧化剂，混合得到A相，2-8℃保存；
（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种；
（3）将A相和B相加入到压力容器中，再往压力容器中加入高压气体后密封压力容器，电子束灭菌，2-8℃保存，使用时打开压力容器，得到所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶；
其中，步骤（2）中所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比（0.5-3）:（0.005-0.05）:（0.005-0.05）:（0.02-0.3）混合，加水至总磷酸盐的浓度为0.8-1.8M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成；
所述的Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比（3-5）:（3-5）混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为0.5-1.1M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成；
所述的巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比（5-8）:（4-7）混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.35-0.7M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成。
2.根据权利要求1所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中醋酸的浓度为0.05-0.5M，盐酸浓度为0.005-0.05M。
3.根据权利要求1或2所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中胶原蛋白在A相中的质量分数为1-5%。
4.根据权利要求1所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中抗氧化剂在A相中的浓度为2-300mM。
5.根据权利要求1或4所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的抗氧化剂为芦丁、表儿茶素、儿茶素、甘露醇、抗坏血酸和甘油中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中A相和B相的体积比为（5:1）-（10:1），A相和B相总体积与压力容器体积比为（0.5-1.5）:2，高压气体质量为A相和B相总质量的30-50%。
7.根据权利要求1所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的高压气体为氮气、氧气和二氧化碳中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中电子束灭菌的辐照剂量为10-20kGy，灭菌温度为-40-20℃。
9.一种权利要求1-8任一方法制备的无菌多孔胶原蛋白修复凝胶。
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