CN103370089A

CN103370089A - 组织再生用材料、含有该组织再生用材料的蛋白质水溶液和使该组织再生用材料凝胶化的方法

Info

Publication number: CN103370089A
Application number: CN2012800086834A
Authority: CN
Inventors: 铃木茂彦; 河合胜也; 川端慎吾
Original assignee: Kyoto University; Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Kyoto University; Sanyo Chemical Industries Ltd; Kyoto University NUC
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2012-02-01
Publication date: 2013-10-23
Also published as: EP2676683A4; JPWO2012111438A1; EP2676683A1; JP5979673B2; WO2012111438A1; EP2676683B1

Abstract

本发明的目的在于提供抑制细菌的增殖、并且促进肉芽组织形成或上皮化的组织再生用材料。本发明的组织再生用材料是由人工蛋白聚合物(A)构成的组织再生用材料，其中，(A)具有多肽链(Y)和/或多肽链(Y’)，多肽链(Y)是VPGVG序列(2)、GVGVP序列(3)、GPP序列、GAP序列和GAHGPAGPK序列(4)中的任意1种氨基酸序列(X)连续2～200个而成的多肽链；多肽链(Y’)是(Y)中的1～100个氨基酸被赖氨酸和/或精氨酸取代了的多肽链；(A)中的(Y)与(Y’)的合计个数为1～100个；(A)的疏水度为0.2～1.2。

Description

组织再生用材料、含有该组织再生用材料的蛋白质水溶液和使该组织再生用材料凝胶化的方法

技术领域

本发明涉及组织再生用材料、含有该组织再生用材料的蛋白质水溶液和使该组织再生用材料凝胶化的方法。

背景技术

作为用于对烫伤、去皮、皮肤剥落和外伤性皮肤缺损等疾病或创伤所致的患部进行保护、暂时应用于患部的创伤被覆材料，以往使用纱布和脱脂绵等。它们可快速吸收渗出液，但另一方面，易于受到细菌感染，若创面干燥，在去除时会伴有疼痛、出血这样的问题。另外，为了使创面不干燥，也将创伤被覆材料与软膏等合用，但这具有渗出液的吸收不充分、创面处于过度湿润状态的问题。

此外，作为替代纱布和脱脂绵等、在大范围的情况下适用于创面的材料，已知有人工材料的被覆膜(硅胶纱布、硅橡胶、具有丝绒状表面结构的尼龙和聚四氟乙烯等的合成树脂片材)。但是，人工材料的被覆膜具有与患部的密合性差、水蒸气透过性低、易于龟裂等各种问题。

此外，作为不仅可保护患部、而且还可促进肉芽组织形成及上皮化的组织再生用材料，已知有胶原蛋白海绵(专利文献1)。胶原蛋白海绵具有生物体亲和性好等特征，但其具有易于受到细菌感染、细菌容易增殖、受渗出液作用而发生劣化、以及材料难以获得等问题。为了解决易于受到细菌感染的问题，已知在使用抗菌剂对创伤部进行杀菌后还使用生物体来源材料的被覆膜。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平10-080438号公报

发明内容

发明所要解决的课题

但是，若在创伤部使用抗菌剂，则会损伤正常组织，具有出现肉芽组织形成和上皮化的延迟的问题。

本发明的目的在于提供可抑制细菌的增殖、且可促进肉芽组织形成或上皮化的组织再生用材料。

解决课题的手段

本发明涉及组织再生用材料，其是由人工蛋白聚合物(A)构成的组织再生用材料，其中，(A)具有多肽链(Y)和/或下述多肽链(Y’)，多肽链(Y)是VPGVG序列(2)、GVGVP序列(3)、GPP序列、GAP序列和GAHGPAGPK序列(4)中的任意1种氨基酸序列(X)连续2～200个而成的多肽链；(A)中的(Y)与(Y’)的合计个数为1～100个；(A)的疏水度为0.2～1.2。

多肽链(Y’)：(Y)中的1～100个氨基酸被赖氨酸和/或精氨酸取代了的多肽链。

发明的效果

本申请发明的组织再生用材料具有抑制细菌增殖作用，并且可发挥出肉芽组织形成或上皮化促进作用优异的效果。

附图说明

图1为在评价1中使用实施例1的组织再生用材料而得到的病理标本(HE染色)的组织碎片的照片。

图2为在评价1中使用比较例1的组织再生用材料而得到的病理标本(HE染色)的组织碎片的照片。

具体实施方式

本发明中，对于人工蛋白聚合物(A)，为了排除动物来源成分，使用人工制造品，可通过有机合成法(酶法、固相合成法和液相合成法等)和基因重组法等进行制造。关于有机合成法，可以应用“生化学実験講座I、タンパク質の化学IV(生化学实验讲座1、蛋白质化学IV)(1981年7月1日、日本生化学会编、株式会社东京化学同人发行)”或“続生化学実験講座2、タンパク質の化学(下)(续生化学实验讲座2、蛋白质的化学(下)(昭和62年5月20日、日本生化学会编、株式会社东京化学同人发行)”中记载的方法等。关于基因重组法，可以应用日本专利第3338441号公报中记载的方法等。有机合成法和基因重组法均可制作人工蛋白聚合物(A)，从可更为简便地变更氨基酸序列、可低成本地大量生产等方面考虑，优选基因重组法。

本发明中，人工蛋白聚合物(A)具有多肽链(Y)和/或下述多肽链(Y’)，多肽链(Y)是VPGVG序列(2)、GVGVP序列(3)、GPP序列、GAP序列和GAHGPAGPK序列(4)中的任意1种氨基酸序列(X)连续2～200个而成的多肽链；(A)中的(Y)与(Y’)的合计个数为1～100个；(A)的疏水度为0.2～1.2。

人工蛋白聚合物(A)具有VPGVG序列(2)、GVGVP序列(3)、GPP序列、GAP序列和GAHGPAGPK序列(4)中的任意1种氨基酸序列(X)即可，也可以具有选自由VPGVG序列(2)、GVGVP序列(3)、GPP序列、GAP序列和GAHGPAGPK序列(4)组成的组中的2种以上的(X)。在具有2种以上的(X)的情况下，2～200个各种(X)连续而成的多肽链为(Y)。作为具有2种以上的(X)的蛋白质聚合物(A)，具体地说，其是多肽链(Y)为选自(VPGVG)_b序列、(GVGVP)_c序列、(GPP)_d序列、(GAP)_e序列和(GAHGPAGPK)_f序列中的2种以上的序列的人工蛋白聚合物(A)(需要说明的是，b～f分别为氨基酸序列(X)的连续个数，为2～200的整数)。

作为氨基酸序列(X)，从细胞亲和性的方面出发，优选VPGVG序列(2)或GVGVP序列(3)。即，从细胞亲和性的方面出发，(A)优选具有(VPGVG)_b序列作为多肽链(Y)、或者具有(GVGVP)_c序列作为多肽链(Y)。

作为氨基酸序列(X)，在其具有选自由VPGVG序列(2)、GVGVP序列(3)、GPP序列、GAP序列和GAHGPAGPK序列(4)组成的组中的2种以上的序列的情况下，从细胞亲和性的方面出发，优选为选自GPP序列、GVGVP序列(3)和GAHGPAGPK序列(4)中的2种以上的序列，特别优选为GVGVP序列(3)和GAHGPAGPK序列(4)。

此外，在人工蛋白聚合物(A)中具有两条以上氨基酸序列(X)为同种的多肽链(Y)的情况下，上述(X)的连续个数在每一(Y)中可以相同也可以不同。即，可以具有两条以上上述b～f相同的多肽链(Y)，也可以具有两条以上(X)的连续个数b～f不同的多肽链(Y)。

多肽链(Y)是氨基酸序列(X)连续2～200个(上述b～f为2～200)而成的序列，从促进肉芽组织形成的方面考虑，连续个数优选为2～50个(上述b～f为2～50)、进一步优选为2～30个(上述b～f为2～30)。

本发明中，(A)可以具有氨基酸序列(X)中的1～5个氨基酸被赖氨酸和/或精氨酸取代了的氨基酸序列(X’)。氨基酸序列(X’)中，从亲水性(在水中的溶解性)的方面出发，氨基酸序列(X)中氨基酸的取代数目(被赖氨酸和/或精氨酸取代的数目)优选为1～4、进一步优选为1～3。

作为氨基酸序列(X’)，从亲水性的方面出发，优选为选自GKGVP序列(13)、GKGKP序列(14)、GKGRP序列(15)和GRGRP序列(16)中的1种以上的序列，进一步优选为GKGVP序列(13)和GKGKP序列(14)。

多肽链(Y’)是构成多肽链(Y)的氨基酸序列(X)部分被氨基酸序列(X’)取代、多肽(Y)中的1～100个氨基酸被K(赖氨酸)和/或R(精氨酸)取代了的多肽链。是否为多肽链(Y’)可如下判断：即，将人工蛋白聚合物(A)序列中的全部K和R取代为其它氨基酸(G、A、V、P或H)时，是否构成多肽链(Y)。

(Y’)中，从在水中的溶解性的方面出发，(Y)中被取代的氨基酸数目优选为1～70个、进一步优选为1～30个。

在人工蛋白聚合物(A)中具有(X)的种类和/或连续个数不同的(Y)的情况下，分别作为1个来计数，(Y)的个数为其合计。(Y’)也是同样的。

对于人工蛋白聚合物(A)来说，在1分子(A)中具有合计1～100个的多肽链(Y)和/或多肽链(Y’)，从促进肉芽组织形成的方面考虑，优选具有1～80个、特别优选具有1～60个。

本发明中，(A)的疏水度为0.2～1.2；从(A)的溶解性和凝胶化的方面考虑，优选为0.3～1.1、进一步优选为0.4～1.0、特别优选为0.5～1.0。

(A)的疏水度表示(A)分子的疏水性程度，可以通过将构成(A)分子的各氨基酸的数目(M_α)、各氨基酸的疏水度(N_α)和1分子(A)中的氨基酸总数代入到下述数学式中来计算出(A)的疏水度。需要说明的是，对于各氨基酸的疏水度，在非专利文献(レーニンジャーの新生化学上，p.346-347)中记载为下述数值。

疏水度=Σ(M_α×N_α)/(M_T)

M_α：1分子(A)中的各氨基酸数目

N_α：各氨基酸的疏水度

M_T：1分子(A)中的氨基酸总数

A(丙氨酸)：1.8

R(精氨酸)：-4.5

N(天冬酰胺)：-3.5

D(天冬氨酸)：-3.5

C(半胱氨酸)：2.5

Q(谷氨酰胺)：-3.5

E(谷氨酸)：-3.5

G(甘氨酸)：-0.4

H(组氨酸)：-3.2

I(异亮氨酸)：4.5

L(亮氨酸)：3.8

K(赖氨酸)：-3.9

M(甲硫氨酸)：1.9

F(苯基丙氨酸)：2.8

P(脯氨酸)：-1.6

S(丝氨酸)：-0.8

T(苏氨酸)：-0.7

W(色氨酸)：-0.9

Y(酪氨酸)：-1.3

V(缬氨酸)：4.2

例如，在(A)为(GVGVP)₄GKGVP(GVGVP)₃序列(8)的情况下，(A)的疏水度=｛16(G的数目)×(-0.4)+15(V的数目)×4.2+8(P的数目)×(-1.6)+1(K的数目)×(-3.9)｝/40(氨基酸的总数)=1.00。

本发明中，通过使人工蛋白聚合物(A)具有上述多肽链(Y)和/或多肽链(Y’)，可制成细胞亲和性高、肉芽组织形成和上皮化促进效果优异的组织再生用材料。此外，通过具有上述多肽链(Y)和/或多肽链(Y’)、且使(A)的疏水度在上述范围内，能够将作为组织再生用材料的人工蛋白聚合物(A)溶解在水中，并且能够将该水溶液凝胶化。进而，通过将该水溶液凝胶化，能够在作为组织再生用材料使用时使组织再生用材料与创伤部密合、抑制细菌的增殖。

本发明中，人工蛋白聚合物(A)可以进一步具有GAGAGS序列(1)。(A)具有GAGAGS序列(1)的情况下，从(A)凝胶化的方面考虑，优选具有多肽链(S)，该多肽链(S)是2～100个GAGAGS序列(1)连续结合而成的。

多肽链(S)中，从凝胶化的方面考虑，序列(1)的连续数目优选为2～100个、更优选为2～50个、进一步优选为3～40个、特别优选为4～30个。

在(A)具有多肽链(S)时，在1分子(A)中具有1个(S)即可，从凝胶化的方面考虑，优选为1～20个、进一步优选为3～10个。

人工蛋白聚合物(A)中，在合计具有2个以上的多肽链(Y)、多肽链(Y’)和多肽链(S)的情况下，在多肽链与多肽链之间可以具有间隔氨基酸序列(Z)。(Z)为1个氨基酸、1个氨基酸序列(X)、或2个以上氨基酸结合而成的肽序列。从细胞亲和性的方面出发，构成(Z)的氨基酸数目优选为1～30个、进一步优选为1～15个、特别优选为1～10个。作为(Z)，具体地说，可以举出VAAGY序列(5)、GAAGY序列(6)和LGP序列等。

人工蛋白聚合物(A)中，在两末端的各多肽链(Y)、多肽链(Y’)和多肽链(S)的N末端和/或C末端可以具有末端氨基酸序列(T)。(T)为1个氨基酸、1个氨基酸序列(X)、或2个以上氨基酸结合而成的肽序列。从细胞亲和性的方面出发，构成(T)的氨基酸数目优选为1～100个、进一步优选为1～50个、特别优选为1～40个。作为(T)，具体地说，可以举出MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM序列(7)等。

人工蛋白聚合物(A)中，除上述(T)以外，为了容易地对所表达的(A)进行提纯或检测，也可以在(A)的N末端和/或C末端具备带有特殊氨基酸序列的蛋白质或肽(下文中将它们称为“提纯标签(Tag)”)。作为提纯标签，可利用亲和提纯用的标签。作为这样的提纯标签，有由多聚组氨酸构成的6×His标签、V5标签、Xpress标签、AU1标签、T7标签、VSV-G标签、DDDDK标签、S标签、CruzTag09^TM、CruzTag22^TM、CruzTag41^TM、Glu-Glu标签、Ha.11标签和KT3标签等。

下面给出各提纯标签(i)与识别并结合该标签的配体(ii)的组合的一例。

(i-1)谷胱甘肽-S-转移酶(GTS) (ii-1)谷胱甘肽

(i-2)麦芽糖结合蛋白(MBP) (ii-2)直链淀粉

(i-3)HQ标签 (ii-3)镍

(i-4)Myc标签 (ii-4)抗Myc抗体

(i-5)HA标签 (ii-5)抗HA抗体

(i-6)FLAG标签 (ii-6)抗FLAG抗体

(i-7)6×His标签 (ii-7)镍或钴

作为上述提纯标签序列的导入方法，可以举出：在表达用载体中的编码人工蛋白聚合物(A)的核酸的5’或3’末端插入编码提纯标签的核酸的方法；或者使用市售的提纯标签导入用载体的方法；等等。

从促进肉芽组织形成的方面考虑，以(A)的分子量为基准，1分子人工蛋白聚合物(A)中的氨基酸序列(X)和氨基酸序列(X’)的总含量(重量%)优选为10重量%～80重量%、进一步优选为15重量%～75重量%。

人工蛋白聚合物(A)中的氨基酸序列(X)和氨基酸序列(X’)的总含量可利用蛋白质测序仪来求出。具体地说，可通过下述测定法求出。

<氨基酸序列(X)和氨基酸序列(X’)的含量的测定法>

从可利用特定氨基酸残基进行切断的切断方法中选用两种以上，将人工蛋白聚合物(A)分解至30残基以下的程度。其后利用高速液相色谱法(HPLC)进行分离，之后利用蛋白质测序仪读取氨基酸序列。由所得到的氨基酸序列进行肽图分析，确定人工蛋白聚合物(A)的全序列。其后利用下述记载的测定式来测定出氨基酸序列(X)和氨基酸序列(X’)的总含量。

氨基酸序列(X)和氨基酸序列(X’)的总含量(%)=[｛氨基酸序列(X)的分子量｝×｛氨基酸序列(X)的数目｝+｛氨基酸序列(X’)的分子量｝×｛氨基酸序列(X’)的数目｝]/｛(A)的分子量｝×100

从凝胶化的方面考虑，1分子蛋白质聚合物(A)中的GAGAGS序列(1)与氨基酸序列(X)和氨基酸序列(X’)的序列数的比例(GAGAGS序列(1)：氨基酸序列(X)和(X’)的合计)优选为1：2～1：20、进一步优选为1：2～1：10。

从抑制细菌增殖的方面出发，人工蛋白聚合物(A)的分子量优选为15kDa～200kDa、进一步优选为15kDa～100kDa。

需要说明的是，人工蛋白聚合物(A)的分子量可如下求得：利用SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)法分离出测定样品，将泳动距离与标准物质进行比较，从而求得该分子量。

由于人工蛋白聚合物(A)具有上述的多肽链(Y)和/或多肽链(Y’)，从而在将(A)制成后述的蛋白质水溶液(B)时，有时会由于热等刺激而导致(B)的流动性降低。若1分子人工蛋白聚合物(A)中的氨基酸序列(X)和氨基酸序列(X’)的总含量(重量%)增多，则(A)受到刺激而导致流动性降低的可能性会增高；若(X)和(X’)的总含量为50重量%以上，则该可能性非常高。

此外，若疏水度过低，则亲水性增高、不能凝胶化；并且若疏水度过高，则无法溶解在水中、制成蛋白质水溶液。

此外，只要(A)具有多肽链(Y)和/或多肽链(Y’)、疏水度为0.2～1.2，即会凝胶化；若(A)具有GAGAGS序列(1)，则可进一步提高(A)的凝胶化能力。特别是通过使GAGAGS序列(1)与氨基酸序列(X)和(X’)之比为1：2～1：20，可更进一步提高凝胶化能力。

在受到热等刺激而使(B)发生凝胶化、流动性降低时，则将(B)给予到患部时起不易流出，并且能够增高抑制细菌增殖的效果。

在施加热作为上述刺激的情况下，作为后述蛋白质水溶液(B)的温度，从人工蛋白聚合物(A)的热稳定性的方面出发优选为25℃～80℃、进一步优选为25℃～50℃、特别优选为30℃～40℃。

下面示出优选的人工蛋白聚合物(A)的一部分。

(1)氨基酸序列(X)为GVGVP序列(3)的人工蛋白聚合物

(1-1)具有多肽链(Y’1)的人工蛋白聚合物(A1)，该多肽链(Y’1)是GVGVP序列(3)连续而成的多肽链(Y1)中有1个氨基酸被K(赖氨酸)所取代而得到的；进一步优选具有作为(GVGVP)₄GKGVP(GVGVP)₃序列(8)的多肽链(Y’11)和作为(GAGAGS)₄序列(9)的多肽链(S1-1)的人工蛋白聚合物(A11)；具有多肽链(Y’11)和作为(GAGAGS)₂序列(10)的多肽链(S1-2)的人工蛋白聚合物(A12)；以及具有多肽链(Y’11)、多肽链(S1-1)和多肽链(S1-2)的人工蛋白聚合物(A13)。

具体地说，为具有下述结构的分子量为约80kDa的序列(11)的人工蛋白聚合物(SELP8K聚合物、疏水度0.618)，该结构是在具有12个多肽链(S1-1)(所述多肽链(S1-1)是4个GAGAGS序列(1)连续而成的(GAGAGS)₄序列(9))和13个(GVGVP)₄GKGVP(GVGVP)₃序列(8)(Y’11)(所述(GVGVP)₄GKGVP(GVGVP)₃序列(8)是8个GVGVP序列(3)连续而成的多肽链(Y11)中有1个V(缬氨酸)被K(赖氨酸)取代而成的)、且它们交互化学结合而成的序列中化学结合了1个多肽链(S1-2)(所述多肽链(S1-2)是2个GAGAGS序列(1)连续而成的(GAGAGS)₂序列(10)的多肽链)而成的；或者为具有下述结构的分子量为约82kDa的序列(12)的人工蛋白聚合物(SELP0K聚合物、疏水度0.718)，该结构是分别具有17个多肽链(S1-2)(所述多肽链(S1-2)是2个GAGAGS序列(1)连续而成的(GAGAGS)₂序列(10)的多肽链)和多肽链(Y’11)(所述多肽链(Y’11)是(GVGVP)₄GKGVP(GVGVP)₃序列(8)的多肽链)、且它们交互化学结合而成的；等等。

(1-2)为具有GVGVP序列(3)连续而成的多肽链(Y2)的人工蛋白聚合物(A2)，进一步优选为具有2个GVGVP序列(3)连续而成的多肽链(Y21)和6个GAGAGS序列(1)连续而成的多肽链(S2-1)的人工蛋白聚合物(A21)，具体地说，为具有29个氨基酸嵌段(L-1)反复化学结合而成的结构、且分子量为约93kDa的序列(18)的人工蛋白聚合物(SLP4.1聚合物、疏水度0.47)，该氨基酸嵌段(L-1)是多肽链(Y21)与多肽链(S2-1)结合而成的。

(1-3)为具有多肽链(Y’3)的人工蛋白聚合物(A3)，该多肽链(Y’3)是GVGVP序列(3)连续而成的多肽链(Y1)中有2个氨基酸被K(赖氨酸)取代而成的；进一步优为具有2个GKGVP序列(13)连续而成的多肽链(Y’31)、6个GAGAGS序列(1)结合而成的多肽链(S2-1)和10个GAGAGS序列(1)结合而成的多肽链(S2-2)的人工蛋白聚合物(A31)。

具体地说，为具有10个氨基酸嵌段(L-2)(该氨基酸嵌段(L-2)是在多肽链(S2-1)上结合多肽链(Y’31)、进一步结合多肽链(S2-2)而成的)反复化学结合而成的结构、且分子量为约73kDa的序列(26)的人工蛋白聚合物(SLP4.2聚合物、疏水度0.2)；等等。

(2)氨基酸序列(X)为VPGVG序列(2)的人工蛋白聚合物

(2-1)为具有VPGVG序列(2)连续而成的多肽链(Y4)的人工蛋白聚合物(A4)，具体地说，为具有160个VPGVG序列(2)连续而成的多肽链(Y41)且分子量为约65kDa的序列(21)的人工蛋白聚合物(ELP1、疏水度1.2)。

(2-2)为具有4个VPGVG序列(2)连续而成的多肽链(Y5-1)和8个VPGVG序列(2)连续而成的多肽链(Y5-2)的人工蛋白聚合物(A5)，进一步优选为具有4个VPGVG序列(2)连续而成的多肽链(Y5-1)、8个VPGVG序列(2)连续而成的多肽链(Y5-2)、以及GAGAGS序列(1)的人工蛋白聚合物(A51)，具体地说，为具有40个氨基酸嵌段(L-3)反复化学结合而成的结构、且分子量为约220kDa的序列(17)的人工蛋白聚合物(ELP1.1聚合物、疏水度1.12)，该氨基酸嵌段(L-3)是在多肽链(Y5-1)上结合GAGAGS序列(1)、进一步结合多肽链(Y5-2)而成的。

本发明的组织再生用材料含有上述人工蛋白聚合物(A)。作为将组织再生用材料应用到患部的方法，可以举出下述方法。

(1)在4℃～25℃制作含有特定量的本发明组织再生用材料和水的后述蛋白质水溶液(B)。(B)可以根据需要含有无机盐和/或磷酸(盐)。此外，也可根据需要在即将施用至患部之前对(B)进行加温。

(2)对患部施用(B)。

(3)施用后，利用适当的包扎材料覆盖，使(B)不会从患部流出。

蛋白质水溶液(B)中各成分的量与后述本发明的蛋白质水溶液(B)是同样的，优选的范围也相同。

此外，作为对(B)进行加温的温度，优选的温度与后述使本发明的(A)凝胶化的方法中相同。

作为对患部的施用方法，只要可覆盖患部就没有特别限制，从促进肉芽组织形成和上皮化的方面出发，优选填埋患部的缺损部分来进行注入。

作为上述(3)中使用的包扎用品的材质没有特别限定，可以举出聚氨酯、硅酮、聚乙烯醇、聚丙烯、聚酯、聚苯乙烯、聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯共聚物和尼龙等。

作为包扎用品的形状，只要在施用(B)后可以进行覆盖从而使(B)不会从患部流出，就能够没有限制地使用，优选膜状。

由于本发明的组织再生用材料不含有动物来源的血清等，因而推测其抗原性低。此外，由于人工蛋白聚合物(A)具有生物来源序列，因而推测其生物体亲和性高。进一步地，由于人工蛋白聚合物(A)可利用大肠杆菌等细菌以低成本进行大量生产，因而能够容易地获得组织再生用材料。

本发明的蛋白质水溶液(B)为含有组织再生用材料和水的蛋白质水溶液，其中，蛋白质水溶液中的组织再生用材料的含量为5重量%～30重量%、水的含量为70～95量%。

从创伤治愈的方面出发，以蛋白质水溶液(B)的重量为基准，蛋白质水溶液(B)中组织再生用材料的含量(重量%)优选为10重量%～30重量%、进一步优选为15重量%～30重量%。

作为蛋白质水溶液(B)中的水，只要是灭菌后的水就没有特别限定，作为灭菌方法，可以举出：通过了具有0.2μm以下孔径的微滤膜的水；通过了超滤膜的水；通过了反渗透膜的水；以及利用高压釜在121℃加热20分钟进行了过热灭菌的离子交换水等。

从蛋白质聚合物溶解性的方面出发，以蛋白质水溶液(B)的重量为基准，蛋白质水溶液(B)中的水含量(重量%)优选为70重量%～90重量%、进一步优选为70重量%～85重量%。

在蛋白质水溶液(B)中，除上述组织再生用材料和水以外，还可以含有无机盐和磷酸(盐)。

作为无机盐，可以举出氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、硫酸镁、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙和碳酸氢镁等。磷酸盐不包含在无机盐中。

从与人的体液等同的方面考虑，以蛋白质水溶液(B)的重量为基准，蛋白质水溶液(B)中的盐的含量(重量%)优选为0.5重量%～1.3重量%、进一步优选为0.7重量%～1.1重量%、特别优选为0.85重量%～0.95重量%。

磷酸(盐)意味着磷酸和/或磷酸盐。

作为蛋白质水溶液(B)中的磷酸(盐)，可以举出磷酸和磷酸盐。

作为盐，可以举出碱金属盐和碱土金属盐，具体地说，可以举出钠盐、钾盐、钙盐和镁盐等。

从创伤治愈的方面出发，以蛋白质水溶液(B)的重量为基准，蛋白质水溶液(B)中的磷酸(盐)的含量(重量%)优选为0.10重量%～0.30重量%、进一步优选为0.12重量%～0.28重量%、特别优选为0.14重量%～0.26重量%。

从组织亲和性的方面出发，蛋白质水溶液(B)的pH优选为5～9、进一步优选为6～8。

本发明的蛋白质水溶液含有具有抑制细菌增殖作用、且肉芽组织形成作用及上皮化促进作用优异的上述组织再生用材料，因而对于烫伤、去皮、皮肤剥落和外伤性皮肤缺损等疾病或创伤所致的患部的肉芽组织形成及上皮化的促进是有效的，可作为创伤部的被覆材料或填充材料来利用。

使本发明的组织再生用材料凝胶化的方法为将组织再生用材料和水混合来使组织再生用材料凝胶化的方法。

对于组织再生用材料，通过与水混合制成蛋白质水溶液(B)，即使在室温(4℃～25℃)下也为低流动性、并进行凝胶化，但从在短时间内使其凝胶化的方面考虑，可在超过25℃且为80℃以下的温度下对蛋白质水溶液(B)进行加温。若为80℃以下，则可在不降低组织再生用材料的功能的情况下使其凝胶化，并且至凝胶化为止的时间适度。

此外，从组织再生用材料的热稳定性和处理性的方面出发，蛋白质水溶液(B)的温度优选为4℃～80℃、更优选为4℃～60℃、进一步优选为25℃～50℃、特别优选为30℃～40℃。

【实施例】

下面通过实施例和比较例进一步说明本发明，但本发明并不限于这些。

<制造例1>

○SELP8K聚合物的生产

按照日本专利第4088341号公报的实施例记载的方法来制作编码SELP8K的质粒pPT0345。

将制作出的质粒转化到大肠杆菌中，得到SELP8K生产株。下面示出使用SELP8K生产株来生产SELP8K聚合物的方法。

使用在30℃进行生长的SELP8K生产株的一夜培养液，接种在250ml烧瓶中的LB培养基50ml中。加入卡那霉素使最终浓度为50μg/ml，在30℃搅拌下(200rpm)对该培养液进行培养。在培养液的OD600=0.8(吸光度计UV1700：使用岛津制作所制)时，将40ml转移到事先加温到42℃的烧瓶中，在同样温度下培养约2小时。将该培养体在冰上冷却，测定培养液的OD600。离心分离收集大肠杆菌。为了从集菌的大肠杆菌中取出蛋白质聚合物，进行超声波破碎(4℃、30秒×10次)来溶菌。

将由该大肠杆菌产生的蛋白质聚合物供于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。其后，一次抗体使用抗兔SELP8K抗体、2次抗体使用抗兔IgG-HRP标记抗体(GE Healthcare社制造)，进行Western印迹分析。该生成物的表观分子量为约80kDa。由此可知，SELP8K生产株生产出了表观分子量为80,000且具有抗兔SELP8K抗体反应性的SELP8K聚合物。

○SELP8K聚合物提纯

通过菌体溶解、基于离心分离的不溶性细片的去除、以及亲和色谱法从大肠杆菌生物物质中对上述得到的SELP8K聚合物进行提纯。由此得到作为分子量为约80kDa的人工蛋白聚合物的SELP8K聚合物(A-1)。在实施例1中，使用该SELP8K聚合物(A-1)作为组织再生用材料。

○SELP8K聚合物的鉴定

通过下述步骤对所得到的SELP8K聚合物(A-1)进行鉴定。

使用抗兔SELP8K抗体和针对C末端序列的6×His标签的抗兔6×His抗体(Roland社制造)通过Western印迹进行分析。表观分子量为80,000的蛋白质区域对各抗体显示出抗体反应性。并且，将所得到的蛋白质供于氨基酸分析，结果该生成物富含甘氨酸(43.7%)、丙氨酸(12.3%)、丝氨酸(5.3%)、脯氨酸(11.7%)和缬氨酸(21.2%)。并且，该生成物含有1.5%的赖氨酸。下述表1中示出了所提纯的生成物的组成与由合成基因序列推测出的预测理论组成的相关关系。

从而确认到，SELP8K聚合物(A-1)为序列(11)的人工蛋白聚合物，该序列(11)是在具有13个(GVGVP)₄GKGVP(GVGVP)₃序列(8)(Y’11)和12个多肽链(S1-1)、且它们交互化学结合而成的序列中化学结合了多肽链(S1-2)而成的，所述(GVGVP)₄GKGVP(GVGVP)₃序列(8)(Y’11)是8个GVGVP序列(3)连续而成的多肽链(Y)中有1个V被取代为K而成的序列，所述多肽链(S1-1)是4个GAGAGS序列(1)连续而成的(GAGAGS)₄序列(9)的多肽链，所述多肽链(S1-2)是2个GAGAGS序列(1)连续而成的(GAGAGS)₂序列(10)的多肽链。

【表1】

<制造例2>

在制造例1中，使用“编码SELP0K的质粒pPT0364”来替换“编码SELP8K的质粒pPT0345”，除此以外，同样地得到分子量为约82kDa的序列(12)的人工蛋白聚合物(A-2)。

<制造例3>

在制造例1中，使用“编码ELP1.1的质粒pPT0102-1”来替换“编码SELP8K的质粒pPT0345”，除此以外同样地得到分子量为约220kDa的序列(17)的人工蛋白聚合物(A-3)。

<制造例4>

在制造例1中，使用“编码SLP4.1的pSY1398-1”来替换“编码SELP8K的质粒pPT0345”，除此以外同样地得到分子量为约93kDa的序列(18)的人工蛋白聚合物(A-4)。

<制造例5>

在制造例1中，使用“编码ELP1的质粒pPT0102”来替换“编码SELP8K的质粒pPT0345”，除此以外同样地得到分子量为约65kDa的序列(21)的人工蛋白聚合物(A-5)。

<制造例6>

在制造例1中，使用“编码SLP4.2的pSY1398-2”来替换“编码SELP8K的质粒pPT0345”，除此以外同样地得到分子量为约73kDa的序列(23)的人工蛋白聚合物(A-6)。

<制造例7>

在制造例1中，使用“编码SLP4的pSY1398”来替换“编码SELP8K的质粒pPT0345”，除此以外同样地得到分子量为约70kDa的序列(19)的人工蛋白聚合物(A’-1)。

<制造例8>

在制造例1中，使用“编码CLP3.7的pPT0312”来替换“编码SELP8K的质粒pPT0345”，除此以外同样地得到分子量为约66kDa的序列(20)的人工蛋白聚合物(A’-2)。

<制造例9>

在制造例1中，使用“编码DCP2的质粒pPT0161”来替换“编码SELP8K的质粒pPT0345”，除此以外同样地得到分子量为约80kDa的序列(22)的人工蛋白聚合物(A’-3)。

<制造例10>

在制造例1中，使用“编码ELP1.2的质粒pPT0102-2”来替换“编码SELP8K的质粒pPT0345”，除此以外同样地得到分子量为约37kDa的序列(24)的人工蛋白聚合物(A’-4)。

<可否凝胶化的测定>

在塑料管容器中中，将制造例1～10中得到的人工蛋白聚合物(A-1)～(A-6)和(A’-1)～(A’-4)20mg分别溶解在80μL的4℃的磷酸缓冲液(PBS)中，制作蛋白质水溶液(B1)～(B10)。将该蛋白质水溶液在37℃静置，在2小时后和4小时后确认是否凝胶化。在是否凝胶化的确认中，将加入有蛋白质水溶液的塑料管容器倒转，在没有溶液垂下的情况下判断为发生了凝胶化，在有溶液垂下的情况下判断为未凝胶化。结果列于表2。需要说明的是，表中，将蛋白质水溶液凝胶化的情况记为○、将未凝胶化的情况记为×。

由表2的结果可知，具有多肽链(Y)和/或多肽链(Y’)、疏水度为0.2～1.2的人工蛋白聚合物(A-1)～(A-6)在4小时后凝胶化。特别是含有人工蛋白聚合物(A-1)的蛋白质水溶液(B1)和含有人工蛋白聚合物(A-2)的蛋白质水溶液(B2)在2小时后就凝胶化，可知其在更为迅速地覆盖、封锁创伤部方面是有效的。

另外可知，既不具有多肽链(Y)也不具有多肽链(Y’)的人工蛋白聚合物(A’-1)和(A’-2)、以及疏水度为0.2～1.2的范围之外的人工蛋白聚合物(A’-3)和(A’-4)未凝胶化。

将制造例1和2中得到的人工蛋白聚合物(A-1)和(A-2)分别调整为下述表3的浓度，制作蛋白质水溶液(B1-1)～(B1-5)和(B2-1)～(B2-4)。对于各蛋白质水溶液，在25℃、37℃和50℃静置，测定直至凝胶化为止的时间。结果列于表3。

由表3的结果可知，若蛋白质浓度增高，则凝胶化时间变短；并且若加热温度增高，则凝胶化时间变短。

<实施例1>

○蛋白质水溶液的制作

将作为组织再生用材料的SELP8K聚合物(A-1)200mg溶解在800μL的4℃的磷酸缓冲液(PBS)中，制作SELP8K聚合物(A-1)的20重量%水溶液(B-1)。

<比较例1>

使用作为人工真皮使用的胶原蛋白海绵(B’-1)(Gunze株式会社制造)。

<评价1>

(使用糖尿病小鼠的IV度褥疮模型中的治疗实验)

在麻醉下，对8周龄的遗传糖尿病小鼠♀(日本Clea社制造)进行除毛，对大腿第三关节部的皮肤进行压迫(400g/8mm×2小时×4)，制作褥疮(直径8mm)。在压迫终止后第5日去除坏死组织，注入SELP8K聚合物(A-1)的20重量%水溶液(B-1)56μl，贴上聚氨酯膜。2小时后、(B-1)凝胶化。其后，在创伤部的上面放上纱布，利用Silkytex(Alcare社制造)固定。在治疗期间的第14日将检体处死，采集包括创伤部的皮肤，制作病理标本(HE染色)。

不使用(B-1)，将胶原蛋白海绵(B’-1)加工成直径8mm，利用尼龙丝固定创伤部，同样地制作病理标本。

对于病理标本，分别制作使用(B-1)或(B’-1)的9个标本。

使用所制作出的病理标本，实施组织学检査。检査项目如下。评价结果列于表4。

(检査项目1)表皮再生

利用下述5级评价基准对表皮再生进行评价、并进行分数化。评价结果的分数为9个病理标本的平均分。需要说明的是，分数越高，越表明上皮化得到促进、组织再生用材料的上皮化促进作用优异。

1分：缺损部全部表皮未再生的状态

2分：缺损部全部面积中的表皮再生面积率大于0%且小于25%

3分：缺损部全部面积中的表皮再生面积率为25%以上且小于50%

4分：缺损部全部面积中的表皮再生面积率为50%以上且小于75%

5分：缺损部全部面积中的表皮再生面积率为75%以上

(检査项目2)肉芽组织的形成

未成熟的毛细血管与纤维芽细胞呈一体的良好肉芽组织被看作是肉芽组织。含有含气囊泡或胆固醇血浆的肉芽组织被认为不是肉芽组织。利用下述5级的评价基准对肉芽组织的形成进行评价、并进行分数化。评价结果的分数为9个病理标本的平均分。需要说明的是，分数越高，越表明肉芽组织形成得到促进、组织再生用材料的肉芽组织形成促进作用优异。

1分：缺损部全部未形成肉芽组织的状态

2分：缺损部全部面积中的肉芽组织形成面积率大于0%且小于25%

3分：缺损部全部面积中的肉芽组织形成面积率为25%以上且小于50%

4分：缺损部全部面积中的肉芽组织形成面积率为50%以上且小于75%

5分：缺损部全部面积中的肉芽组织形成面积率为75%以上

(检査项目3)细菌菌落

利用5级评价基准由组织切片(HE染色)的紫色块(细菌菌落)的数目及尺寸来进行评价、并进行分数化。评价结果的分数为9个病理标本的平均分。需要说明的是，分数越低，越表明细菌增殖性越低、组织再生用材料能抑制细菌增殖。

1分：完全没有细菌菌落

2分：细菌菌落位于缺损部的一部分，数目少且尺寸小

3分：细菌菌落位于缺损部的一部分，数目多或尺寸大

4分：细菌菌落位于缺损部的一部分，数目多且尺寸大

5分：细菌菌落在整个缺损部存在

(检査项目4)含气囊泡

根据产气菌产生的含气囊泡的分布，利用5级评价基准对于产气菌的感染率进行评价、并进行分数化。评价结果的分数为9个病理标本的平均分。需要说明的是，分数越低，越表明细菌感染率低、组织再生用材料不易被细菌感染。

1分：在缺损部全部无含气囊泡分布的状态

2分：缺损部全部面积中的含气囊泡感染率大于0%且小于25%

3分：缺损部全部面积中的含气囊泡感染率为25%以上且小于50%

4分：缺损部全部面积中的含气囊泡感染率为50%以上且小于75%

5分：缺损部全部面积中的含气囊泡感染率为75%以上

【表4】

<评价2>

(使用糖尿病小鼠的IV度褥疮模型中的细菌感染性试验)

利用与评价1相同的方法制作IV度褥疮模型，利用相同的方法将(B-1)或(B’-1)施用或固定在创伤部。制作7个施用了(B-1)的检体和6个施用了(B’-1)的检体。在治疗期间的第7日将检体处死，采集包括创伤部的皮肤。将采集的皮肤在灭菌生理食盐水中细小地剪裁并使其悬浮。将适宜稀释的悬浮液涂布在普通琼脂培养基上，在37℃培养12小时。对于在培养后的琼脂微板上得到的菌落数进行测定。(B-1)的评价结果为7个的平均、(B’-1)的评价结果为6个的平均。评价结果列于表5。

【表5】

	组织再生用材料	菌体数(×10⁶)
			实施例1(B-1)	SELP8K聚合物	17
比较例1(B’-1)	胶原蛋白海绵	117

<评价3>

(使用健康豚鼠的全层缺损层模型中的治疗试验)

在麻醉下，对7周龄的健康豚鼠♀std Hartley(日本SLC社制造)进行除毛，在消毒后的豚鼠背部皮肤上制作脂肪层完全露出的创面为10×10mm的全层皮肤缺损，止血、干燥后，注入SELP8K聚合物(A-1)的20重量%水溶液(B-1)，贴上聚氨酯膜。其后在各创伤部上放上纱布，利用尼龙丝与创伤部周围固定。在治疗期间的第5、第10日将检体处死，采集包括创伤部的皮肤，制作病理标本(HE染色)。制作10个治疗期间第5日的病理标本和11个治疗期间第10日的病理标本。

不使用(B-1)，将胶原蛋白海绵(B’-1)加工成直径8mm，利用尼龙丝固定在创伤部，同样地制作病理标本。制作6个治疗期间第5日的病理标本和12个治疗期间第10日的病理标本。

使用所制作出的治疗期间第5日的病理标本，使用MicroRuler测定来自脂膜(肌样膜)的肉芽组织高度。(B-1)的评价结果为10个的平均、(B’-1)的评价结果为6个的平均。评价结果列于表6。此外，使用治疗期间第10日的病理标本，使用MicroRuler测定由正常组织伸长的上皮化长度。(B-1)的评价结果为11个的平均、(B’-1)的评价结果为12个的平均。评价结果如表7所示。

【表6】

	组织再生用材料	肉芽形成高度(mm)
			实施例1(B-1)	SELP8K聚合物	0.64
比较例1(B’-1)	胶原蛋白海绵	0.44

【表7】

	组织再生用材料	上皮化长度(mm)
			实施例1(B-1)	SELP8K聚合物	3.90
比较例1(B’-1)	胶原蛋白海绵	2.23

由评价1(表4中的检査项目1和2)和评价3(表6～7)的结果可知，与比较例1的胶原蛋白海绵相比，具有多肽链(Y’)的实施例1的组织再生用材料的肉芽组织形成与上皮化促进作用均优异。此外，由评价1(表4中的检査项目3和4)和评价2(表5)的结果可知，实施例1的组织再生用材料的抑制细菌增殖作用极为优异。

【工业实用性】

本发明的组织再生用材料的抑制细菌增殖作用、肉芽组织形成和上皮化促进作用优异。因而，其不仅作为对烫伤、去皮、皮肤剥落和外伤性皮肤缺损等疾病或创伤所致的患部进行保护的创伤被覆材料是有效的，而且作为促进肉芽组织形成及上皮化的组织再生用材料也是有效的。

Claims

1.一种组织再生用材料，其是由人工蛋白聚合物(A)构成的组织再生用材料，其中，

(A)具有多肽链(Y)和/或多肽链(Y’)，多肽链(Y)是VPGVG序列(2)、GVGVP序列(3)、GPP序列、GAP序列和GAHGPAGPK序列(4)中的任意1种氨基酸序列(X)连续2～200个而成的多肽链，多肽链(Y’)为(Y)中的1～100个氨基酸被赖氨酸和/或精氨酸取代了的多肽链；

(A)中的(Y)与(Y’)的合计个数为1～100个；

(A)的疏水度为0.2～1.2。

2.如权利要求1所述的组织再生用材料，其中，人工蛋白聚合物(A)进一步具有多肽链(S)，该多肽链(S)是2～50个GAGAGS序列(1)连续并结合而成的。

3.如权利要求2所述的组织再生用材料，其中，1分子人工蛋白聚合物(A)中的GAGAGS序列(1)与氨基酸序列(X)和下述氨基酸序列(X’)的合计的序列数的比例、也即序列(1)：氨基酸序列(X)和(X’)的合计为1：2～1：20；

所述氨基酸序列(X’)为氨基酸序列(X)中的1～5个氨基酸被赖氨酸和/或精氨酸取代了的氨基酸序列。

4.如权利要求1～3的任一项所述的组织再生用材料，其中，人工蛋白聚合物(A)的分子量为15kDa～200kDa，该分子量是利用SDS-PAGE法、也即SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法求得的。

5.如权利要求1～4的任一项所述的组织再生用材料，其中，人工蛋白聚合物(A)是具有多肽链(Y’1)的人工蛋白聚合物(A1)，该多肽链(Y’1)是氨基酸序列(X)为GVGVP序列(3)的多肽链(Y1)中有1个氨基酸被赖氨酸取代了的多肽链。

6.如权利要求2～5的任一项所述的组织再生用材料，其中，人工蛋白聚合物(A)为具有多肽链(S1-1)和多肽链(Y’1)的人工蛋白聚合物(A11)，所述多肽链(S1-1)为(GAGAGS)₄序列(9)，所述多肽链(Y’1)为(GVGVP)₄GKGVP(GVGVP)₃序列(8)。

7.一种蛋白质水溶液，其为含有权利要求1～6的任一项所述的组织再生用材料和水的蛋白质水溶液，其中，蛋白质水溶液中的组织再生用材料的含量为5重量%～30重量%，水的含量为70重量%～95重量%。

8.一种使组织再生用材料凝胶化的方法，该方法中，将权利要求1～6的任一项所述的组织再生用材料及水混合，在4℃～60℃使组织再生用材料凝胶化。