CN109824763B

CN109824763B - 一种温敏多肽及其编码基因以及其制备方法及应用

Info

Publication number: CN109824763B
Application number: CN201910031265.0A
Authority: CN
Inventors: 王珊珊
Original assignee: Shaanxi University of Technology
Current assignee: Shaanxi University of Technology
Priority date: 2019-01-14
Filing date: 2019-01-14
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2039-01-14
Also published as: CN109824763A

Abstract

本发明涉及一种温敏多肽，包括多个短肽重复单元，每个所述短肽重复单元的序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及该温敏多肽的编码基因；还涉及带有该温敏多肽编码基因作为纯化标签的蛋白表达载体；还涉及该蛋白表达载体的制备方法；还涉及一种蛋白纯化方法。本发明合成的温敏多肽具有可逆相变特性，可通过可逆相变循环过程实现多肽分子的分离纯化。以温敏多肽作为标签赋予融合蛋白表现出可逆相变性质，开发简单快捷、纯化成本低、回收效率高、适用范围广的蛋白质分离纯化方法。

Description

一种温敏多肽及其编码基因以及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及蛋白分离与纯化领域，更特别地，涉及一种温敏多肽及其编码基因，其制备方法及应用。

背景技术

在蛋白质的分离纯化过程中，虽然色谱柱层析是最常用的分离技术，但是该技术费时耗力，需要特殊的分离设备和试剂，生产成本较高。

为了简化分离操作步骤，人们开始探索不同的分离方法。研究人员发现有些短肽对温度敏感，并随着环境温度的变化而发生可逆相变过程。一定浓度下，低温时为可溶态；当环境温度升高时，无规则卷曲伸展的结构逐渐形成β螺旋，进而通过疏水相互作用发生聚集，成为微粒、纳米粒或胶束。随着温度降低，又恢复至溶液态。在低盐和高盐离子浓度下，可会发生相应的可逆相变过程。

但是，目前尚无可用于蛋白分离纯化的温敏多肽标签。其主要原因有几点。第一，难以获得相变临界温度适用于蛋白分离纯化标签的温敏多肽；第二，温敏多肽一般为多个重复单元构成，其不好合成。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种温敏多肽，包括多个短肽重复单元，每个所述短肽重复单元的序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个优选实施方案中，所述温敏多肽包括50个所述短肽重复单元。

本发明还提供了一种温敏多肽编码基因，包括多个寡核苷酸重复单元，每个所述寡核苷酸重复单元的序列编码SEQ ID NO:1所示的短肽。

在一个优选实施方案中，所述温敏多肽编码基因包括50个所述寡核苷酸重复单元。

本发明还提供了一种蛋白表达载体，其带有上述温敏多肽编码基因作为纯化标签。

本发明还提供了一种带有温敏多肽标签蛋白表达载体的制备方法，包括以下步骤：

S1：合成所述寡核苷酸重复单元；

S2：将所述寡核苷酸重复单元克隆到表达载体上；

S3：在搭载有所述寡核苷酸重复单元的旁边继续插入方向相同所述寡核苷酸重复单元，直至达到期望个数的所述寡核苷酸重复单元。

在一个优选实施方案中，所述蛋白表达载体为pET 28a。

在一个优选实施方案中，S1中，合成5个所述寡核苷酸重复单元串联而成的串联单元；

S2中，将所述串联单元顺着T7启动子的方向插入至Xba I-BamH I位点，在插入时所述串联单元的两边引入了BseR I和Acu I位点，

并且S3包括以下步骤：

S31：依次向所述BseR I位点插入方向相同的4个所述串联单元，得到搭载有25个所述寡核苷酸重复单元的载体；

S32：将两个所述载有25个所述寡核苷酸重复单元的载体，分别用Acu I/Bgl I和BseR I/Bgl I双酶切，分别得到带有寡核苷酸重复单元的片段A和片段B；

S33：将所述片段A和B用T4 DNA连接酶酶连接，得到所述带有温敏多肽标签蛋白表达载体。

本发明还提供了上述温敏多肽在蛋白纯化中的应用。

本发明还提供了一种蛋白纯化方法，包括以下步骤：

1)将目的蛋白的编码基因插入到上述蛋白表达载体中，转入表达细胞，得到转化子；

2)将培养所述转化子，进行诱导表达，得到诱导表达的细胞；

3)破碎所述诱导表达的细胞，离心取上清；

4)将所述上清液置于45-60℃下，待蛋白完全析出；

5)离心取沉淀；

6)将所述沉淀在低温下复性，即为目的蛋白与所述温敏多肽的融合蛋白。

本发明利用基因工程技术合成一种具有可逆相变特性的温敏多肽，通过可逆相变循环过程实现多肽分子的分离纯化。以温敏多肽作为标签赋予融合蛋白表现出可逆相变性质，开发简单快捷、纯化成本低、回收效率高、适用范围广的蛋白质分离纯化方法。

本发明基于大肠杆菌密码子的偏好性和简并性，合理设计重复序列，结合依次插入单体基因和递归定向连接两种方案，成功合成了具有独特相变特性的多肽分子。

本发明合成的温敏多肽，在温度和盐浓度介导下，可实现可溶态和凝聚态之间的可逆相变，采用可逆相变循环法，仅需几次离心操作即可成功分离纯化获得多肽分子，与现有柱层析分离纯化技术相比，具有简单快速、成本低、处理量大、回收效率高的优势。

本发明合成的温敏多肽作为融合标签与目的蛋白融合表达，赋予融合蛋白亦具有可逆相变特性，仅需通过可逆相变循环的非色谱纯化法，即可选择性地分离纯化获得目的融合蛋白，且不影响目的蛋白自身的活性与功能。作为温敏标签适用范围广泛，在蛋白质的功能分析和大规模工业化生产中应用前景广阔。

附图说明

图1为单体基因依次插入pET 28a的示意图；

图2为递归定向连接示意图；

图3为可逆相变循环分离纯化流程图1)细胞破碎液；2)高温/高盐处理；3)离心后保留沉淀(a)弃去上清液(b)；4)复溶沉淀；5)低温/低盐处理；6)离心后弃去沉淀(a)保留上清液(b)

图4为纯化过程中各阶段的样品进行SDS-PAGE电泳检测图，其中，泳道M：相对分子质量标准蛋白；泳道1：重组菌BL21(DE3)/pET28-V₅₀-EG12B未诱导的全细胞蛋白；泳道2：重组菌BL21(DE3)/pET28-V₅₀-EG12B诱导的全细胞蛋白；泳道3：经可逆相变循环分离纯化后融合蛋白。

图5为融合蛋白溶液在不同温度下的状态的照片。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.材料与试剂

限制性内切酶、T4聚核苷酸激酶、牛小肠碱性磷酸酶、T4DNA连接酶均购于NEB公司。DNA Marker购于近岸蛋白质科技有限公司，预染蛋白Marker购于Thermo Scientific公司。质粒提取试剂盒购于OMEGA BIO-TEK，胶回收试剂盒购于北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。表达质粒pET-28a、菌株E.coli Top10和BL21(DE3)由本实验室保存。

2.设计温敏多肽的单体基因

我们在研究过程中发现，由GVGVP(SEQ ID NO:1)连续重复串联而成的多肽具有温敏的特性，并且可随着环境的温度变化而发生可逆的相变。相变特性主要取决于重复多肽序列的长度。多肽中涉及的氨基酸有甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)和脯氨酸(Pro)，此3种氨基酸均有4种遗传密码，具有四重简并性。根据大肠杆菌密码子的偏好性和简并性的不同，合理设计单体基因(GVGVP)₅的寡核苷酸序列，合成两条可互补的75 bp单链寡核苷酸片段，这两片段可退火形成编码如下序列的双链DNA：

5’-CGTAGGTGTCCCAGGTGTGGGCGTACCGGGCGTTGGTGTTCCTGGTGTCGGCGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGG-3’(SEQ ID NO:2)

该设计引入了不同的密码子，以驱动同工tRNA共同转运，缓解单一tRNA供给的不足，避免链的错配和突变的发生，以有效提高多肽的表达水平。

3.表达载体的改造

为了实现重复多肽基因的无缝连接，需先对表达质粒pET-28a进行分子改造。在pET-28a多克隆位点的Xba I-BamH I区设计一段替换序列，合成两条可互补的单链寡核苷酸片段(斜体加粗表示限制性内切酶的识别位点，BseR I(GAGGAG)，Acu I(CTTCAG)；下划线表示核糖体结合位点；粗体表示起始密码子)：

经过T4多聚核苷酸激酶的磷酸化和退火，形成具有Xba I/BamH I黏性末端的双链DNA片段，与Xba I/BamH I酶切后的pET-28a连接后转化至Top10中，涂布含卡那霉素的LB固体培养基过夜培养。

4.多肽单体基因的依次插入

采用依次插入单体基因方法，将磷酸化和退火后形成的多肽单体基因V₅，插入BseR I线性化的改造质粒pET-28a中，构建重组质粒pET28-V₅(图1)。依次插入单体基因直至获得插入连续5个单体基因的重组质粒，命名为pET28-V₂₅。修饰后的pET-28a经BseR I酶切后，添加牛小肠碱性磷酸酶37℃下温育1h进行5′末端去磷酸化，以防止载体自身环化，胶回收纯化线性化载体。F-V₅/R-V₅经磷酸化和退火后形成双链DNA片段在3′末端含有2bp的黏性末端，与BseR I酶切后的线性化质粒pET-28a连接后转化至E.coli Top¹⁰中，涂布含卡那霉素(50mg/L)抗性LB平板，37℃培养箱中倒置培养16h。以T7/T7ter作为引物进行菌落PCR筛选阳性克隆后，经DNA测序鉴定阳性重组子。

5.多肽基因的递归定向连接

以实施例3中获得的pET28-V₂₅为亲本质粒，采用递归定向连接的方法，经AcuI/BglI和BseR I/Bgl I双酶切后，将两个具有黏性末端的片段连接，构建含有10个单体连续的多肽基因(图2)。具体过程是：(1)利用限制性内切酶Acu I和Bgl I进行双酶切，37℃下反应3h后，获得3段不同大小的DNA片段，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收纯化较大分子量的DNA片段，即包含V₂₅基因的线性片段A；(2)利用限制性内切酶BseR I和Bgl I进行双酶切，37℃下反应3h后，获得2段不同大小的DNA片段，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收纯化较大分子量的DNA片段，即包含V₂₅基因的线性片段B；(3)利用T4DNA连接酶将线性片段A和B于16℃连接12h，连接产物转化至E.coli Top¹⁰中，涂布含卡那霉素(50mg/L)抗性LB平板，37℃培养箱中倒置培养16h。以T7/T7ter作为引物进行菌落PCR筛选阳性克隆后，经DNA测序鉴定阳性重组子pET28-V₅₀。

6.多肽的诱导表达与分离纯化

将实施例4中获得的pET28-V₅₀转化至BL21(DE3)感受态细胞后，涂布含卡那霉素(50mg/L)抗性LB平板，37℃培养箱中倒置培养16h，挑取单克隆接种至含卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，37℃下200r/min培养至OD₆₀₀约为0.8，添加终浓度为0.2mmol/L IPTG，30℃下诱导表达6h后，离心收集菌体，超声破碎后取上清液用于分离纯化。

在低温(≤室温)或低盐浓度(PBS缓冲液)条件下，多肽呈可溶态；在高温(45-60℃)或高盐浓度(饱和NaCl滴定)条件下，多肽相变发生凝聚形成沉淀，随着温度或盐浓度的降低，可逆为溶液态。通过控制温度和盐离子浓度，使多肽可溶或凝聚，通过可逆相变循环法分离纯化获得高纯度的多肽分子(图3)。

7.多肽作为标签与葡聚糖内切酶融合表达

以来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的葡聚糖内切酶(endoglucanase12B，EG12B)作为目的蛋白与多肽标签融合表达。设计合成一对引物，其中斜体下划线分别为Xba I和Nde I的酶切位点，加粗为柔性Linker，核苷酸序列如下：

以实验室保存的葡聚糖内切酶重组表达质粒pUC57-EG12B为模板，利用Q5DNA聚合酶和V-F/V-R引物PCR扩增葡聚糖内切酶基因EG12B。NdeI/Xba I双酶切PCR产物和质粒pET28-V₅₀，经胶回收后进行连接，经酶切和DNA测序鉴定，获得重组表达质粒pET28-V₅₀-EG12B，转化至BL21(DE3)感受态细胞中，涂布含卡那霉素(50mg/L)抗性LB平板，37℃培养箱中倒置培养16h，挑取单克隆接种至含卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，37℃下200r/min培养至OD₆₀₀约为0.8，添加终浓度为0.2mmol/L IPTG，30℃下诱导表达6h。全细胞蛋白的SDS-PAGE电泳检测表明，重组菌BL21(DE3)/pET28-V₅₀-EG12B经IPTG诱导后，在49kDa处有融合目的蛋白的表达，且分子量大小与理论预期一致，表明纤维素酶与多肽的融合基因大肠杆菌表达系统中得到了有效表达。由于多肽作为温敏标签与目的蛋白融合表达，赋予了融合蛋白具有可逆相变特性。采用上述的可逆相变循环法分离纯化获得高纯度的融合蛋白(图4)。含有融合蛋白的溶液在高温和低温下呈现析出和溶解两种状态，如图5所示。同时，酶活测定结果表明，相比单一葡聚糖内切酶，温敏标签融合后的葡聚糖内切酶的酶活力无明显变化，说明温敏融合标签不影响目的蛋白自身的活性与功能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 陕西理工大学

<120> 一种温敏多肽及其编码基因以及其制备方法及应用

<141> 2019-01-14

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Val Gly Val Pro

1 5

<210> 2

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtaggtgtc ccaggtgtgg gcgtaccggg cgttggtgtt cctggtgtcg gcgtgccggg 60

cgtgggtgtt ccggg 75

<210> 3

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gaggagtaca tatgggctac tgataatgat 60

cttcag 66

<210> 4

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatcctgaag atcattatca gtagcccata tgtactcctc cttcttaaat taaacaaaat 60

tattt 65

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat accatgagcg ttggcgccac 60

cgatattagc 70

<210> 6

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaattccat atgagagcca ccaccgccag agccaccacc gcctttaaca acttcaacgc 60

taaaatc 67

Claims

1.温敏多肽在蛋白纯化中的应用，所述温敏多肽，包括多个短肽重复单元，每个所述短肽重复单元的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将目的蛋白的编码基因插入到蛋白表达载体中，转入表达细胞，得到转化子，所述蛋白表达载体带有温敏多肽编码基因作为纯化标签，所述温敏多肽编码基因，包括多个寡核苷酸重复单元，每个所述寡核苷酸重复单元的序列编码SEQ ID NO:1所示的短肽；

2）将培养所述转化子，进行诱导表达，得到诱导表达的细胞；

3）破碎所述诱导表达的细胞，离心取上清；

4）将所述上清液置于45-60℃下，待蛋白完全析出；

5）离心取沉淀；

6）将所述沉淀在低温下复性，即为目的蛋白与所述温敏多肽的融合蛋白。