CN104804097B - 一种抑制血管新生或生长的融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抑制血管新生或生长的融合蛋白、其编码序列、包含该编码序列的载体、宿主细胞、药物组合物以及所述融合蛋白的制药用途。本发明融合蛋白的热稳定性高，其在发酵过程中的蛋白聚合体形成率明显下降，显著提高了蛋白纯度和产量，并且本发明的融合蛋白具有较优的生物学活性。

Description

一种抑制血管新生或生长的融合蛋白及其用途
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抑制血管新生或生长的融合蛋白。
背景技术
在正常生理条件下，血管的生成是一个受多个环节严密调节的过程，对修复和维持机体的正常功能具有重要的作用。然而，如果肿瘤内部血管快速生长，则是临床常见的现象之一。大量的动物模型和人体临床试验表明，阻断肿瘤内新生血管的形成可以有效地阻止肿瘤的生长和引发肿瘤细胞的死亡，从而达到对肿瘤的治疗作用。因此，抑制血管新生是目前抗肿瘤新药研究的重要方向之一。大分子抗新生血管药物如Avastin已经过美国FDA的上市批准，同时还有更多的药物处于不同的临床前和临床研究阶段。另外，对于老年性视网膜血管病变(Age-related macular degeneration，简称为AMD)、糖尿病视网膜病变、关节炎等多种与血管新生相关的疾病，抑制血管新生的治疗新药也有广泛和重要的作用。
血管新生是一个由多种活性生物因子进行调控的复杂过程，其中一个关键环节是内皮细胞表面受体与多种生长因子相结合从而被激活，然后经细胞内酪氨酸磷酸化的信号传递系统控制内皮细胞活动，从而促使血管新生。在多种生长因子中，血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor，简称为VEGF)是控制血管新生最重要的因子，是诱导和促进血管形成作用最强、最专一的血管生长因子，在几乎所有的人体肿瘤中都过量表达，是抗癌研究的一个重要分子靶标。VEGF在血管内皮细胞表面上有多种受体，其中包括VEGFR-1(又称为Flt-1)和VEGFR-2(又称为KDR或Flk-1)，它们的细胞外部分均由七个可与VEGF相结合的免疫球蛋白样区域(D1-D7)组成，细胞内部分均包括酪氨酸激酶基团。当受体被VEGF激活后，细胞内的酪氨酸激酶基团发生磷酸化，并导致一系列的信号传递，最终引发血管新生。由于VEGF信号传递对血管新生的重要性，阻断VEGF或VEGF受体从而达到抑制血管新生具有重要的抗癌作用，同时也对其他包括视网膜血管病变等与血管新生相关的疾病有着重要的治疗作用。
融合蛋白药物的稳定性对于生物技术应用具有重要影响，也是提高药物质量以及药物能够工业化生产的关键。蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，这种现象称为蛋白质变性。变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。蛋白热稳定检测能够有效的确定蛋白的变性，从而用于蛋白质药物研发过程中蛋白质稳定性的检测，其主要是采用紫外激发光照射蛋白质样品使其发射出荧光，由于蛋白质所发射荧光的波长和光强度与其结构的变化是一一对应的，所以据此可以精确地检测出蛋白质样品的变性温度Tm。另外，同时采用紫外激发光应用静态光散射(Static Light Scattering)技术检测蛋白质的聚集状况，蛋白质样品聚集和非聚集状态下其光强度有非常显著的变化，所以据此可以精确的检测出蛋白质样品的聚集温度Tagg(aggregation onset temperature)；蛋白的变性温度Tm和聚集温度Tagg能够有效的反映生物蛋白分子的稳定性。
生物大分子药物开发过程中制约因素包括药物疗效、药物的稳定性、药物是否能够工业化生产等等，寻求一种疗效确切、稳定性高的抑制血管新生或生长的药物是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种疗效确切、稳定性高的抑制血管新生或生长的融合蛋白，该融合蛋白通过阻断VEGF信号传递，从而抑制血管新生或生长。
为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明一方面提供一种抑制血管新生或生长的融合蛋白，该融合蛋白由人VEGF受体片段与人免疫球蛋白Fc片段连接而形成，其中所述VEGF受体片段的氨基酸序列如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示。
在进一步的实施方式中，所述融合蛋白的人免疫球蛋白Fc片段选自如下序列之一：IgG1Fc(氨基酸序列为SEQ ID NO:7)、IgG2Fc(氨基酸序列为SEQ ID NO:8)、IgG3Fc(氨基酸序列为SEQ ID NO:9)和IgG4Fc(氨基酸序列为SEQ ID NO:10)。
在更进一步的实施方式中，本发明的融合蛋白为：
KH02，其氨基酸如SEQ ID NO:14所示；
KH03，其氨基酸如SEQ ID NO:16所示；或
KH04，其氨基酸如SEQ ID NO:18所示。
在另一方面，本发明提供编码所述融合蛋白的核苷酸序列；优选地，所述核苷酸序列为：
kh02，编码融合蛋白KH02，其核苷酸如SEQ ID NO:13所示；
kh03，编码融合蛋白KH03，其核苷酸如SEQ ID NO:15所示；或
kh04，编码融合蛋白KH04，其核苷酸如SEQ ID NO:17所示。
在另一方面，本发明提供一种表达所述融合蛋白的表达载体或宿主细胞，所述表达载体包含上述融合蛋白的核苷酸序列。所述表达载体可以是重组真核表达载体，优选哺乳动物细胞表达载体；也可以是重组病毒表达载体，优选腺相关病毒或腺病毒载体。所述表达载体能在转化的宿主细胞中复制表达，优选地，所述宿主细胞为CHO细胞及其亚系或293细胞及其亚系。
在另一方面，本发明提供一种制备所述融合蛋白的方法，包括将上述表达载体引入合适的宿主细胞中，进行融合蛋白的表达。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，包括本发明的融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂；所述载体或赋形剂为本领域常规使用的载体或赋形剂。优选地，所述药物组合物的制剂形式为注射剂、注射用冻干粉针或眼用凝胶；可以用本领域已知的方法制备所述制剂。
在另一方面，本发明提供了上述融合蛋白在制备治疗由血管新生或生长引起的疾病的药物中的用途；其中所述由血管新生或生长引起的疾病优选为肿瘤或眼部新生血管引起的疾病，所述眼部新生血管引起的疾病优选为年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、脉络膜视网膜病变等。
本发明融合蛋白的热稳定性高，使得其在发酵过程中的蛋白聚合体形成率明显下降，显著提高了蛋白纯度和产量，同时本发明的融合蛋白具有较优的生物学活性。
附图说明
图1为VEGF受体融合蛋白的热变性倾向性检测结果图；图中曲线反映蛋白分子内在荧光峰值随温度升高情况，其中，纵坐标BCM(nm)为内在荧光峰值，横坐标为温度。
图2为VEGF受体融合蛋白的热聚合倾向性检测结果图；图中曲线反映蛋白分子的静态光散射强度随温度变化情况，其中，纵坐标SLS at 266nm为静态光散射强度，横坐标为温度。
图3为VEGF受体融合蛋白抑制VEGF诱导HUVEC细胞增殖作用结果图；其中，横坐标为融合蛋白浓度，纵坐标为CCK-8法检测细胞活力的吸光值。
图4为VEGF受体融合蛋白抑制VEGF诱导HUVEC细胞迁移作用结果图；其中，横坐标为融合蛋白与VEGF的摩尔浓度比，纵坐标为占总迁移的百分比(％总迁移率＝(Ffusion protein-Fbasal)/(F total-Fbasal)，Fbasal指培养基组的荧光均值，F total指VEGF组的荧光均值，Ffusion protein指不同摩尔比的融合蛋白与VEGF组的荧光均值。
具体实施方式
现通过以下实施例对本发明作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
序列说明：
人VEGF受体片段1：氨基酸序列为SEQ ID NO:1，核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
人VEGF受体片段2：氨基酸序列为SEQ ID NO:3，核苷酸序列为SEQ ID NO:4；
人VEGF受体片段3：氨基酸序列为SEQ ID NO:5，核苷酸序列为SEQ ID NO:6；
融合蛋白KH01：氨基酸序列为SEQ ID NO:12，核苷酸序列为SEQ ID NO:11；
融合蛋白KH02：氨基酸序列为SEQ ID NO:14，核苷酸序列为SEQ ID NO:13；
融合蛋白KH03：氨基酸序列为SEQ ID NO:16，核苷酸序列为SEQ ID NO:15；
融合蛋白KH04：氨基酸序列为SEQ ID NO:18，核苷酸序列为SEQ ID NO:17。
融合蛋白KH05：氨基酸序列为SEQ ID NO:20，核苷酸序列为SEQ ID NO:19。
实施例1：融合蛋白的制备
材料或试剂
PCR试剂盒(含5×缓冲液、dNTP和Phusion酶)：M0530L，NEB公司
琼脂糖凝胶电泳：IQ300，GE公司
缓冲液4(lot：0101201)：NEB公司
AvrⅡ：R0174L，NEB公司
BstZ17I：R0594L，NEB公司
PCR产物纯化试剂盒：QIAGEN公司，CAT:28106
10×T4缓冲液：B0202S，NEB公司
T4DNA连接酶：M0202L，NEB公司
Top10大肠杆菌：CB104，TIANGEN公司
2YT(AMP)平板培养基：上海锐聪实验室设备有限公司
FreedomTMCHO-STMKit试剂盒：A13696-01，LIFE TECHNOLOGIES公司
Clone Pix FL：Genetix公司
HiTrap蛋白A琼脂糖亲和层析柱：HiTrap蛋白A HP,5x 1ml；GE公司
PBS缓冲液(20mM磷酸盐，pH 7.4)：SD117-500ml，上海生物工程有限公司
ForteBio生物分子相互作用仪：Octet QKe,Pall公司
蛋白质热稳定性分析仪：Optim2，Avacta公司
VEGF：R&D公司
NHS-LCLC-Biotin：Thermo公司
1、包含融合蛋白编码序列的质粒的构建
1.1基因和引物合成
由北京金唯智公司合成合成片段1(SEQ ID NO:21)和2(SEQ ID NO:22)以及引物P1-P10(序列分别如SEQ ID NO:23-32所示)，并将合成片段1和2重组至质粒载体pUC19(北京金唯智公司)中。合成片段1包括编码人VEGF受体片段的核苷酸序列和信号肽序列，合成片段2包含人IgG1Fc的编码序列。合成片段1和2作为构建各融合蛋白的模板，利用下述引物通过PCR方法构建出本发明的融合蛋白的编码序列。
1.2融合蛋白编码序列的获得
每种融合蛋白的编码序列分为两个部分进行扩增，第一部分为人VEGF受体片段，第二部分为人IgG1Fc片段。每个部分通过各自的特异引物获得相应的目的片段，再通过叠加PCR的方式将人VEGF受体片段和人IgG1Fc片段拼接，最终获得全长基因序列。第一、二两个部分扩增PCR反应体系均为(总体积50μl)：5×缓冲液10μl、dNTP2μl、特异上下游引物各1μl、模板(上述合成片段1或合成片段2)1μl、Phusion酶(PCR保真酶)0.5μl，最后用双蒸水补至50μl；反应条件：98℃预变性30s，98℃10s、68℃2min，10个循环，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30个循环，最后72℃5min。具体实施方式为：kh02：第一部分引物对为P1和P6，模板为合成基因1；第二部分引物对为P5和P2，模板为合成基因2。kh03：第一部分引物对为P1和P8，模板为合成基因1；第二部分引物对为P7和P2，模板为合成基因2。kh04：第一部分引物对为P1和P10，模板为合成基因1；第二部分引物对为P9和P2，模板合成基因2。蛋白KH01的编码序列(kh01)：第一部分引物对为P1和P4，模板为合成基因1；第二部分引物对为P3和P2，模板合成基因2。基因产物以琼脂糖凝胶电泳检测。共获得8种相关片段，分别为kh01-Q、kh01-H、kh02-Q、kh02-H、kh03-Q、kh03-H、kh04-Q和kh04-H。重叠PCR反应体系为(总体积50μl)：5×缓冲液10μl、dNTP 2μl、模板为上述分别扩增的对应的第一和第二片段各1μl(如：扩增kh01全长，使用对应的kh01-Q和kh01-H回收PCR产物各1μl)、上下游引物各1μl(P1，P2)、Phusion酶0.5μl，最后用双蒸水补至50μl；反应条件：98℃预变性30s，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30个循环，最后72℃5min。基因产物以琼脂糖凝胶电泳(IQ300，GE公司产品)检测。共获得4种基因片段，分别命名为kh01-1(对应SEQ ID NO:11(PCR扩增产物同SEQ IND NO:11相比多了信号肽编码序列)、kh02-1(对应序列为SEQ ID NO:13(多了信号肽编码序列))、kh03-1(对应序列为SEQ ID NO:15(多了信号肽编码序列))、kh04-1(对应序列为SEQ ID NO:17(多了信号肽编码序列))。通过电泳检测，获得扩增片段大小与预期一致。
1.3载体和基因片段的酶切处理
对pCHO1.0质粒(购买自life technologies，货号：A13696-01)、kh01-1、kh02-1、kh03-1、kh04-1扩增片段分别进行双酶切处理，酶切体系为：在1.5ml EP管中分别加入如下成分：pCHO1.0质粒或kh01-1、kh02-1、kh03-1、kh04-1扩增片段40μl，10×缓冲液4(NEB)10μl，AvrⅡ(R0174L，NEB)和BstZ17I(R0594L，NEB公司产品)各5μl，灭菌水45μl，混匀后在37℃下反应5h，利用PCR产物纯化试剂盒(CAT:28106，QIAGEN)回收。
1.4重组质粒的连接转化
在T4DNA连接酶的作用下，将已用相同酶切后回收获得的pCHO1.0片段(AvrⅡ和BstZ17I酶切大片段，约13kb)和kh01-1、kh02-1、kh03-1、kh04-1(AvrⅡ和BstZ17I酶切)片段连接。连接反应体系如下：在1.5ml EP管中分别加入如下成分pCHO1.0片段(AvrⅡ和BstZ17I)2μl，kh01-1、kh02-1、kh03-1、kh04-1(AvrⅡ和BstZ17I酶切)片段6μl，10×T4缓冲液(B0202S，NEB)1μl，T4DNA连接酶(M0202L，NEB)1μl，混匀后在室温(20℃左右)下反应4h以上，连接产物转化至Top10大肠杆菌(CB104，TIANGEN)感受态细胞中，涂布于2YT(AMP)平板培养基(上海锐聪实验室设备有限公司产品)上37℃静止过夜，平板编号分别为kh01、kh02、kh03、kh04。
1.5重组质粒的菌落PCR筛选
从kh01、kh02、kh03、kh04平板中各挑取数个重组单菌落经过37℃，静止培养3-5h。培养后作为PCR模板，分别进行PCR筛选鉴定。菌液PCR扩增反应体系(总体积20μL):2×TaqHS(R013A，TAKATA)10μL、菌液模板2μL、上下游引物(P1和P2)各1μL(终浓度0.3μmol/L)，最后用双蒸水补至20μL；反应条件：94℃3min，94℃60s、53℃60s、72℃120s，30个循环，最后72℃5min。结果显示，所有菌落均能扩增出1.6Kbp左右的目的条带，表明均为阳性克隆。
1.6重组质粒的酶切鉴定
将通过菌落PCR鉴定正确的菌落接种后提取质粒再进行酶切鉴定。首先进行重组菌的质粒提取，然后进行酶切分析，酶切体系：在1.5ml EP管中加入如下成分：质粒2μl，10×缓冲液41μl，AvrⅡ和BstZ17I各1μl，补灭菌水至10μl，混匀后在37℃下反应4h。通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示均能酶切出1.6Kb左右目的条带，所挑取的克隆均为阳性克隆。
1.7重组质粒的测序鉴定
将通过菌落PCR和酶切鉴定正确的菌落送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序鉴定。测序结果与预期一致。表达质粒保存备用，将测序成功克隆进行如下编号：kh01-1编号为610，kh02-1编号为711，kh03-1编号为812，kh04-1编号为915。
2、质粒转染及细胞筛选
采用FreedomTMCHO-STMKit试剂盒(A13696-01，LIFE TECHNOLOGIES)中宿主细胞CHO-S，按说明书进行质粒转染。本实验分别转染4种质粒：610、915、812、711，转入质粒的细胞分别置于摇瓶培养，培养基为CD FortiCHO培养基(购买自life technologies)，培养条件为37℃、8％CO2、110rpm/min，培养48h，以细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。
转染48h后进行两步加压筛选：10P/100M，20P/200M(P＝10μg/mL嘌呤霉素，M＝nM甲氨蝶呤(MTX))；30P/500M，50P/1000M，培养基为CD-FortiCHO培养基，获得初筛细胞，即610、915、812、711(即分别包含上述对应的质粒)。继续进行单克隆细胞筛选，接种活细胞密度500个/mL，每个转染48h后获得的初筛细胞群体接种8个6孔板，细胞培养箱内培养一周。荧光显微镜下观察各孔板细胞克隆生长情况，采用Clone Pix FL(Genetix)挑取单克隆细胞，通过检测蛋白表达量以及纯度从中优选克隆逐级扩大培养。
3、蛋白表达、纯化和鉴定
选取高产克隆细胞，从96孔板扩至24孔板生长，然后扩至6孔板生长，之后扩至50mL摇瓶生长。
收集培养4-6天细胞培养上清液，离心除去细胞碎片，上清液以0.45μm滤膜过滤，调节pH至7.4，用HiTrap蛋白A亲和层析柱(HiTrap蛋白A HP，5×1ml；GE)纯化融合蛋白；用5倍柱床体积的去离子水冲洗柱子，再用5倍柱床体积的PBS缓冲液(20mM磷酸盐，pH 7.4)(SD117-500ml，上海生物工程有限公司)平衡柱子，上样，收集流出液检测，用10倍体积PBS缓冲液稀释液(0.02mol/L磷酸盐，pH 7.4)洗涤除去杂蛋白，然后使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH3)将目的蛋白从柱上洗脱，以SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)检测几种蛋白纯度都在90％以上。
实施例2蛋白纯度及表达产量分析
采用SEC-HPLC技术，分析检测发酵液蛋白纯度，另采用ForteBio生物分子相互作用仪(Octet QKe，Pall公司)检测实施例1中各蛋白表达量，结果如表1显示：融合蛋白KH02-KH04的表达量和纯度均优于KH01蛋白，其中融合蛋白KH02在纯度及产量上最具优势，即使在培养第9天，无营养物添加的条件下，蛋白纯度仍能维持在80％以上。
表1：蛋白的细胞培养上清纯度分析比较
实施例3 VEGF受体融合蛋白的热稳定性检测
(1)VEGF受体融合蛋白的热变性倾向性分析
蛋白分子在受热时其空间构象将发生去折叠，含有芳香基团的疏水氨基酸残基(如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)不断暴露外现。检测芳香基团内在荧光强度(IF)可反映蛋白分子去折叠程度。在蛋白分子去折叠过程中，其内在荧光基团的荧光光谱发生变化，天然结构(正常折叠)蛋白有较低的内在荧光强度，且峰值在330nm附近；而变性蛋白的内在荧光强度明显增加，且峰值位移至350nm附近。通过分析蛋白分子内在荧光强度变化以及峰值的位移程度可计算半数热变性温度Tm值，间接反应蛋白样品结构的热变性倾向性。
利用蛋白质热稳定性分析仪(Optim2，Avacta公司)检测VEGF受体融合蛋白的热变性倾向性。取待测样品(1mg/ml PBS，pH7.2，纯度大于90％)约15μl，加至Optim2样品反应管中，设置温度扫描范围为25℃～95℃，每个温度点孵育60s；利用Optim2分析软件处理数据，结果如图1及表2所示，表明实施例1中表达的系列融合蛋白中，KH02的变性温度相对最高，说明其热变性倾向性相对最低，也即是说其蛋白热稳定性相对最高。
表2：VEGF受体融合蛋白的热变性参数
(2)VEGF受体融合蛋白的热聚合倾向性分析
紫外光照射至蛋白分子会发生光散射，静态光散射强度在一定范围内与蛋白分子大小(10～600KD)成线性相关。检测光散射SCS(Static Light Scattering)强度可反映蛋白分子大小变化，通过计算其蛋白发生聚合起始温度Tagg可间接反映蛋白样品的聚合倾向性。
利用蛋白质热稳定性分析仪(Optim2，Avacta公司)检测VEGF受体融合蛋白的热聚合倾向性。取待测样品(1mg/ml PBS，pH7.2，纯度大于90％)约15μl，加至Optim2样品反应管中，设置温度扫描范围为25℃-95℃，每个温度点孵育60s；利用Optim2分析软件处理数据，实验结果如图2及表3所示：随着温度增加，融合蛋白样品的静态光散射强度不断增加。其中，KH02的起始聚合温度Tagg值相对最高，这表明其热聚合倾向性相对最低。
表3：VEGF受体融合蛋白的热聚合倾向性参数
实施例4 VEGF受体融合蛋白的生物学活性检测
(1)HUVEC细胞增殖
将生长良好的人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC，ScienCell公司)接种于96孔培养板中，3×103细胞/孔，100μl/孔，37℃，5％CO2培养20h；用含2％胎牛血清的ECM培养基(内皮细胞培养基，货号1001，Sciencell公司)配制不同摩尔浓度(0.0023、0.007、0.023、0.065、0.19、0.57、1.7、5、15、45、135nM)的VEGF受体融合蛋白，分别与40ng/ml的VEGF(R&D公司)混匀，孵育2h；再加至接种有HUVEC细胞的96孔板上，100μl/孔，每组3复孔，5％CO2继续孵育96h，加入CCK-8试剂(Dojindo公司)，以EC50表示本发明的抑制作用。结果如图3及表4所示，本发明的VEGF融合蛋白均可有效抑制VEGF刺激的HUVEC细胞增殖作用，表明本发明的VEGF受体融合蛋白具有较好抑制VEGF的生物学活性。
表4：VEGF受体融合蛋白抑制VEGF诱导HUVEC细胞增殖作用
(2)HUVEC细胞迁移
利用改良型的Boyden小室(FluoroBlokTM Biocoat angiogenesis system:Endothelial cell migration，BD公司)检测本发明融合蛋白对HUVEC细胞迁移作用。将生长状态良好的HUVEC细胞以3×105细胞/ml密度接种于Boyden小室上层孔，75μl/孔；用含2％胎牛血清的ECM基础培养基(货号1001，Sciencell公司)配制不同摩尔浓度(13333nM、4444nM、1481nM、494nM、164.5nM、54.8nM、18.3nM、6.1nM)的VEGF受体融合蛋白，分别与500pM的VEGF(R&D公司)混匀，孵育2h后加入Boyden小室下层孔中，225μl/孔；整个小室于37℃，5％CO2继续孵育20～24h。移去下层孔中的培养基，加入用HBSS缓冲液(汉克斯平衡盐)配制的终浓度为5μg/ml的荧光染料Calcein AM(Anaspec公司)，37℃，5％CO2，避光孵育90min后，于多功能酶标仪上检测荧光值，激发波长为494nm，检测波长为517nm。计算细胞相对迁移率。实验结果如图4所示，本发明所述的VEGF受体融合蛋白抑制VEGF诱导HUVEC细胞迁移作用基本相当，再次证实本发明的融合蛋白KH02具有较高抑制VEGF的生物学活性。
实施例5 VEGF受体融合蛋白与VEGF结合的亲和性检测
利用生物膜干涉技术(Biolyayer-Interferometry，BLI)，在ForteBio生物分子相互作用仪(OctetQKe，Pall公司)上检测人VEGF受体融合蛋白与人VEGF结合亲和力。将人VEGF(货号293-VE-010，R&D公司)与NHS-LCLC-生物素(货号:21338，Thermo公司)以摩尔比1:3混匀，于室温放置1h后去除剩余的NHS-LCLC-生物素，得到最终的标记产物50μg/ml生物素-hVEGF；通过上样将50μg/ml生物素-hVEGF结合于链霉亲和素感受器上；用样品稀释缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.02％吐温-20，0.003％NaN3)配制不同浓度(浓度分别为：600nM、200nM、66.7nm、22.2nM、7.4nm、2.46nM、0.82nM)的待测样品，以样品稀释缓冲液为空白对照；于动力学分析模式进行hVEGF与受体融合蛋白的结合动力学参数检测。实验结果表5，表明实施例1中表达的VEGF受体融合蛋白与人VEGF均有显著的结合；其中，KH02的KD值约为0.33nM，尤其是其与VEGF结合复合物的动态解离速率慢于其他融合蛋白，表明其结合亲和力相对最高。
表5：VEGF受体融合蛋白与人VEGF结合亲和力参数
注：Kon：结合常数，Kdis：解离常数
实施例6融合蛋白的亲和力实验
1.1实验试剂
表6：实验试剂列表
表7：实验仪器列表
1.2实验方法
1)试剂的配制
i.10×PBS缓冲液：NaCl 80.1g、KCl 2.0g、KH2PO42.0g、Na2HPO4·12H2O 29.0g，加纯水溶解，定容至1000ml；
ii.1×PBS缓冲液：取10×PBS缓冲液100ml加入纯水850ml溶解，调pH 7.2～7.4，最终定容至1000ml；
iii.碳酸盐缓冲液：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，溶解于1000ml超纯水中，pH应为9.6-9.8，室温保存。使用前需用0.22μm孔径滤器过滤；
iv.BSA(牛血清白蛋白)：4℃保存；
v.洗液：含0.05％(v/v)聚山梨酯20的1×PBS；
vi.封闭液与样品稀释液：含1％(w/v)BSA的1×PBS；
vii.终止液(2N H2SO4)：浓硫酸27.8ml缓慢加入到472.2ml纯水中，浓硫酸为强腐蚀性液体，加入时用玻棒不断搅动，使用时注意防护；
viii.rhVEGF165(R&D，293-VE，50μg/支规格)储备液：取3ml 1×PBS用0.22μm孔径滤器过滤。取一支未开封的rhVEGF165，先加入800μl已过滤PBS，待瓶内肉眼可见固态物质溶解后，补加200μl已过滤PBS。室温放置10分钟，使得rhVEGF165充分溶解。溶解后的rhVEGF165储备液浓度为50μg/ml；将储备液按25μl/支分装，-20℃放置可保存6个月；
ix.人IgG-Fc抗体HRP检测抗体(BETHYL A80-104P)：浓度1mg/ml，4℃保存。
2)包被
将20μl rhVEGF165储备液加入7980μl碳酸盐缓冲液中，混匀后即为包被工作液A，浓度为125ng/ml；再取2500μl包被工作液A加入2500μl碳酸盐缓冲液中，混匀后即为包被工作液B。先用包被工作液A包被一块酶标板的1-6列，再用包被工作液B包被同一块酶标板的7-12列，包被量为100μl/孔，封板胶封闭，室温静置过夜。
3)洗板
洗板程序为250μl洗液/孔，浸泡120秒/次，洗涤3遍。洗涤后在干净的吸水纸垫上将孔内液体拍至纸垫上无明显水迹。
4)封板
使用8通道移液器加封闭液300μl/孔，封板胶封闭，37℃孵育2h。
5)样品准备
根据样品(融合蛋白KH02、KH05)的起始蛋白浓度，分别将其先稀释至1600ng/ml，保证1600ng/ml样品至少有800μl，再向下以200μl样品加600μl稀释液的方式四倍稀释八个梯度(包括1600ng/ml)；
6)上样
洗板，同上。将样品分别依次加入酶标板中，100μl/孔，封板胶封闭。加样依次由高浓度加到低浓度，双复孔。加样完毕后，37℃孵育1h。
7)加检测抗体
洗板，同上。取人IgG-Fc抗体HRP 0.5μl加10ml封闭液稀释，混匀，将稀释后的检测抗体按照100μl/孔加入孔中，37℃孵育1h。
8)显色
洗板，同上。加入TMB显色液100μl/孔，室温避光温育显色5min。
9)终止与读数
加入终止液50μl/孔，终止反应。将酶标板置于酶标仪中于450nm波长条件下读数。
1.3亲和力检测结果
表8：样品亲和力检测结果
由表8的亲和力检测结果可见，KH02经过高温10天后的亲和力仍在可接受范围(22～84pM)内，而KH05在高温10天的亲和力远远超出可接受的范围。可见在活性方面KH02的稳定性优于KH05。
实施例7 高温纯度检测实验
1.1 实验试剂和设备
表9：实验试剂列表
表10：主要仪器设备列表
1.2实验方法：
1)试剂的配制
i.PBS流动相：称取7.16g Na2HPO4·12H2O、8.77g NaCl和42.2g Arg，溶解于800ml超纯水中，用HCl调节至pH7.2，定容到1000ml，使用Ф0.22μm滤膜过滤；
ii.色谱柱保护液(0.05％NaN3)：称取NaN30.5g，溶解于1000ml超纯水。用Ф0.22μm滤膜过滤；
iii.超纯水：使用Ф0.22μm滤膜过滤。
2)样品制备
由于各样品(KH02、KH05)浓度均为1mg/ml，所以取各样品直接进样。
3)色谱分析条件
流动相：PBS流动相；
色谱柱：TSK G3000SWXL(5μm,7.8*300mm)；
柱温：25℃；流速：0.5ml/min；检测波长：280nm；进样量：50μl。
1.3实验结果：
表11：SEC-HPLC检测样品纯度结果表
由表11知，KH05在高温第5天时其纯度已经下降至54％左右，到第10天时样品纯度仅为25％；KH02在高温第5天时下降并不明显，即使高温第10天时，其样品纯度还高达65％。

Claims (15)

1.一种抑制血管新生或生长的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为：
KH02，其氨基酸如SEQ ID NO:14所示。
2.一种编码如权利要求1所述的融合蛋白的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示序列。
4.一种表达如权利要求1所述的融合蛋白的表达载体或宿主细胞，其包含如权利要求2所述的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的表达载体或宿主细胞，其包含如权利要求3所述的核苷酸序列。
6.如权利要求4或5所述的表达载体或宿主细胞，所述表达载体是真核表达载体或病毒表达载体。
7.如权利要求6所述的表达载体或宿主细胞，所述真核表达载体为哺乳动物细胞表达载体，所述病毒表达载体为腺相关病毒载体或腺病毒载体。
8.如权利要求4或5所述的表达载体或宿主细胞，所述宿主细胞为CHO细胞或293细胞。
9.一种制备如权利要求1所述的融合蛋白的方法，包括将权利要求4-7中任一项所述的表达载体引入合适的宿主细胞中，进行融合蛋白的表达。
10.一种药物组合物，包括如权利要求1所述的融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。
11.如权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物的制剂形式为注射剂或眼用凝胶。
12.如权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物为注射用冻干粉针。
13.根据权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗由血管新生或生长引起的疾病的药物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，所述由血管新生或生长引起的疾病为肿瘤或眼部新生血管引起的疾病。
15.如权利要求14所述的用途，所述眼部新生血管引起的疾病为年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变或脉络膜视网膜病变。
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