WO2012060351A1 - 生体組織用細胞接着性材料 - Google Patents

生体組織用細胞接着性材料 Download PDF

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WO2012060351A1
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cell
sequence
cells
adhesive material
artificial peptide
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PCT/JP2011/075139
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Inventor
田畑泰彦
川端慎吾
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三洋化成工業株式会社
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    • A61L2420/02—Methods for coating medical devices

Definitions

  • the present invention relates to a cell adhesive material for living tissue.
  • biological tissue materials that retain antibacterial and antithrombotic properties such as artificial joints and artificial tooth roots are widely used.
  • materials for such biological tissue materials titanium, titanium alloys, Co—Cr alloys (such as vitalium), stainless steel, and tantalum are generally used.
  • such materials themselves are not familiar to biological tissues and are inactive, the adhesion and proliferation of cells with the materials are extremely poor, and adhesion between the materials for biological tissues and biological tissues There are problems with strength and infection at the interface.
  • a cell adhesion factor, a cell regulatory factor, or the like is coated on a biological tissue material.
  • a biological tissue material for example, there are known those in which collagen or the like is bonded to a biological tissue material by chemical bonding (Patent Document 1), and those in which laminin or the like is coated on the biological tissue material by immersion (Patent Document 2).
  • JP 2007-051127 A Japanese Patent Laid-Open No. 2005-021208
  • the problem of cell adhesion and proliferation is a particularly serious problem in the dental field.
  • titanium and titanium alloys are mainly used as biological tissue materials such as artificial tooth roots and dental implants because of in vivo stability and biocompatibility. Since some dental implants are exposed in the oral cavity, the weakness of the bond with the gingival epithelium causes periodontal disease, which makes it difficult to maintain the implant for a long time. In reality, there are still no effective means to solve the problem. In addition, there is still room for improvement in adhesion to cells and enhancement of cell adhesion and proliferation.
  • An object of the present invention is to provide a cell adhesive material for living tissue in which the surface of a material for living tissue (particularly a metal material) is strongly and strongly modified with a cell adhesive artificial peptide (P) having biological activity. is there.
  • the present invention is a cell adhesive material for living tissue in which a cell adhesive artificial peptide (P) is immobilized on the surface of the material for living tissue by an electrochemical reaction.
  • P cell adhesive artificial peptide
  • the cell-adhesive material for living tissue of the present invention has the effect of high cell adhesion and excellent cell proliferation.
  • the cell-adhesive artificial peptide (P) is artificially produced and can be easily produced by an organic synthesis method (enzyme method, solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method, etc.), a gene recombination method, or the like.
  • organic synthesis methods see "Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV (July 1, 1981, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.)” or "Second Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry” (Lower) (May 20, 1987, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.), etc.
  • the genetic recombination method the method described in Japanese Patent No.
  • Cell adhesion means the property that a specific minimum amino acid sequence is recognized by a cell's integrin receptor so that cells can easily adhere to a substrate (Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center, Vol. 8, No. 1, 58). 66 pages, 1992).
  • the cell adhesion artificial peptide (P) is a polypeptide synthesized from a genetically modified microorganism and having at least one cell adhesion minimal amino acid sequence (X) in one molecule from the viewpoint of eliminating animal-derived components. Is preferred.
  • Examples of the cell adhesion minimal amino acid sequence (X) include “Pathophysiology, Vol. 9, No. 7, pp. 527-535, 1990” and “Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center, Vol. 8, No. 1, No. 58”. -66 pages, 1992 "etc. are used.
  • the amino acid one-letter code indicates RGD sequence (1), LDV sequence (2), LRE sequence (10), HAV sequence (12), REDV sequence (3), YIGSR sequence (4), PDSGR sequence (5), RYVVLPR sequence (6), LGITIPG sequence (7), RNIAEIIKDI sequence (8), IKVAV sequence (9), DGEA sequence (11), GVGKGDKGNPGGWPGAP sequence (13), GEFYFDLRLKGD sequence (14), and at least one selected from the group consisting of YKLNVNDS sequence (15), AKPSYPPTYK sequence (16), NRWHSIYITRFG sequence (17), TWYKIAFQRNRK sequence (18), RKRLQVQLSTRT sequence (19) and PHSRN sequence (20) Good More preferably, from the viewpoint of cell adhesiveness, RGD sequence (1), LDV sequence (2), LRE sequence (10), HAV sequence (12), REDV sequence (3), YIGSR sequence (4), PDSGR At least one selected from the viewpoint of cell adhesiveness.
  • the cell adhesion artificial peptide (P) preferably has at least one cell adhesion minimal amino acid sequence (X) in one molecule, more preferably 3 to 50 in one molecule, from the viewpoint of cell adhesion. Then, further preferably 4 to 30 per molecule, particularly preferably 5 to 20 per molecule, and most preferably 13 per molecule.
  • the cell adhesion artificial peptide (P) preferably contains an auxiliary amino acid sequence (Y) in addition to the cell adhesion minimal amino acid sequence from the viewpoint of stability to heat.
  • the auxiliary amino acid sequence (Y) include the GAGAS sequence (21).
  • the content of the auxiliary amino acid sequence (Y) is preferably at least two in one molecule of the cell-adhesive artificial peptide (P) from the viewpoint of stability to heat. More preferably, it is 3 to 10,000, particularly preferably 10 to 3,000, and most preferably 30 to 1,000.
  • the auxiliary amino acid sequence (Y) is preferably included in a continuously repeated form such as (Y) a (a is an arbitrary integer).
  • (GAGAS) a (a is an arbitrary integer). From the viewpoint of productivity, the preferred range of the number of repetitions a is 2 to 33, more preferably 3 to 23, and particularly preferably 4 to 13.
  • the cell adhesion artificial peptide (P) contains the cell adhesion minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y), the cell adhesion minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence in the cell adhesion peptide (P)
  • the number ratio [(X) / (Y)] with the amino acid sequence (Y) is preferably 0.002 to 10, more preferably 0.01 to 2, particularly from the viewpoint of cell adhesion and heat stability. Preferably it is 0.05 to 0.5. Further, from the viewpoint that the cell adhesive artificial peptide (P) can easily have a ⁇ sheet structure, it is preferable that the cell adhesive minimal amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) are alternately positioned.
  • the cell-adhesive artificial peptide (P) preferably has an amino acid residue containing an amino group and / or a carboxyl group in the side chain from the viewpoint of modifying the surface of the biological tissue material in large quantities and strongly.
  • amino acids containing an amino group in the side chain include arginine (Arg), asparagine (Asn), histidine (His), and glutamine (Gln).
  • amino acids containing a carboxyl group in the side chain include aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu).
  • the cell adhesion artificial peptide (P) may be further modified with a compound (AM).
  • a compound (AM-2), a compound (AM-3) containing a sulfo group and a compound (AM-4) containing a hydroxyl group are included.
  • the cell adhesion material of the present invention for cell tissue is further improved, and the material for cell tissue is further abundant and strong with cell adhesion artificial peptide (P). Can be modified.
  • the compound (salt) (AM-1) containing a primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group and / or quaternary ammonio group polyamine, amino alcohol, halogen having an amino group
  • Polymers containing amino group-containing monomers and amino group-containing monomers as constituent monomers, and salts or quaternized compounds thereof can be used.
  • polyamine a polyamine having at least one primary amino group or secondary amino group (having 2 to 56 carbon atoms) is used, and aliphatic polyamines, alicyclic polyamines, heterocyclic polyamines, and aromatics are used. Polyamine or the like is used.
  • Aliphatic polyamines include alkylene diamines (ethylene diamine, propylene diamine, trimethylene diamine, tetramethylene diamine, hexamethylene diamine, etc.), polyalkylene polyamines having 2 to 6 carbon atoms in the alkylene group (diethylene triamine, iminobispropylamine, Triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, etc.), and alkyl (carbon number 1 to 18) substitution products thereof (dimethylaminopropylamine, diethylaminopropylamine, dipropylaminopropylamine, methylethylaminopropylamine, Trimethylhexamethylenediamine, N, N-dioctadecylethylenediamine, trioctadecylethylenediamine, methyliminobispropylamine, etc. Etc. The.
  • alicyclic polyamines examples include 1,3-diaminocyclohexane, 1,3-bis (methylamino) cyclohexane, 1,3-bis (dihydroxyamino) cyclohexane, isophorone diamine, menthane diamine, and 4,4′-methylene dicyclohexane. Examples include diamines.
  • heterocyclic polyamine examples include piperazine, N-methylpiperazine, N-aminoethylpiperazine and 1,4-diaminoethylpiperazine.
  • Aromatic polyamines include phenylenediamine, N, N′-dimethylphenylenediamine, N, N, N′-trimethylphenylenediamine, diphenylmethanediamine and 2,6-diaminopyridine, tolylenediamine, diethyltolylenediamine, 4, Examples thereof include 4′-bis (methylamino) diphenylmethane and 1-methyl-2-methylamino-4-aminobenzene.
  • an amino alcohol having 2 to 58 carbon atoms is used, and an alkanolamine having 2 to 10 carbon atoms [monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, monoisopropanolamine, monobutanolamine, triethanolamine, triethanolamine, Propanolamine, tributanolamine, N, N-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine and N, N, N ′, N′-tetrakis (hydroxyethyl) ethylenediamine, etc.], and alkyl (carbon number 1 to 18) substituted products thereof [ N, N-dimethylethanolamine, N, N-diethylethanolamine, N-ethyldiethanolamine, N-octadecyldiethanolamine, N, N-diethyl-N ′, N′-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine, N N- dioctadecyl -N ', N'-bis (hydroxyethyl)
  • halide having an amino group examples include halogenated (such as chlorine and bromine) of alkylamines having 2 to 17 carbon atoms, such as aminoethyl chloride, N-methylaminopropyl chloride, dimethylaminoethyl chloride, diethylaminoethyl chloride. , Dibenzylaminoethyl bromide, dimethylaminopropyl bromide, diethylaminopropyl chloride, dibenzylaminopropyl chloride and the like.
  • halogenated such as chlorine and bromine
  • amino group-containing monomer an amino group-containing vinyl compound having 5 to 21 carbon atoms, ethyleneimine, an amino acid having 2 to 20 carbon atoms, or the like is used.
  • amino group-containing vinyl compound amino group-containing (meth) acrylates, amino group-containing (meth) acrylamides, amino group-containing aromatic vinyl hydrocarbons, amino group-containing allyl ethers, and the like are used.
  • amino group-containing (meth) acrylates include aminoethyl (meth) acrylate, N-methylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-diethylaminopropyl (meth) acrylate, N, N-dipropylaminoethyl (meth) acrylate, N-benzyl-N-methylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dibenzylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dibenzylaminopropyl (meth) ) Acrylate, morpholinoethyl (meth) acrylate, N-methylpiperidinoethyl (meth) acrylate, and the like.
  • Amino group-containing (meth) acrylamides include aminoethyl acrylamide, N-methylaminopropyl acrylamide, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylamide, N, N-diethylaminopropyl (meth) acrylamide, and N, N-dipropyl. Examples thereof include aminoethyl (meth) acrylamide, N-benzyl-N-methylaminoethyl (meth) acrylamide, morpholinoethyl (meth) acrylamide, and N-methylpiperidinoethyl (meth) acrylamide.
  • amino group-containing aromatic vinyl hydrocarbons examples include aminoethylstyrene, N-methylaminoethylstyrene, N, N-dimethylaminostyrene, N, N-dipropylaminostyrene, and N-benzyl-N-methylaminostyrene. Can be mentioned.
  • amino group-containing allyl ether examples include aminoethyl allyl ether, N-methylaminoethyl allyl ether, N, N-dimethylaminoethyl allyl ether, N, N-diethylaminoethyl allyl ether, and the like.
  • amino acids As amino acids, arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, alanine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, proline, cysteine, lysine, serine, glycine, 3-aminopropionic acid , 8-aminoactanoic acid and 20-aminoeicosanoic acid.
  • polymer of the amino group-containing monomer examples include a vinyl polymer having an amino group-containing vinyl compound as an essential constituent monomer, polyethyleneimine, and a polypeptide (not including a cell adhesion artificial polypeptide (P)).
  • the weight average molecular weight of the polymer of amino group-containing monomers is preferably 500 to 1,000,000, more preferably 1,000 to 800,000, and particularly preferably 2,000 to 500,000.
  • the weight average molecular weight can be measured by gel permeation chromatography (GPC) ⁇ reference substance: polystyrene standard having a molecular weight of 420 to 20,600,000 (manufactured by Tosoh Corporation), etc. ⁇ .
  • These salts include inorganic salts (hydrochlorides, nitrates, and the like) of these amines (polyamines, amino alcohols, halides having amino groups, amino group-containing monomers, and polymers having amino group-containing monomers as constituent monomers). Perchlorate, etc.).
  • Examples of these quaternized products include those obtained by quaternizing these amines with a quaternizing agent (such as methyl chloride, ethyl chloride, benzyl chloride, dimethyl carbonate, dimethyl sulfate, and ethylene oxide).
  • a quaternizing agent such as methyl chloride, ethyl chloride, benzyl chloride, dimethyl carbonate, dimethyl sulfate, and ethylene oxide.
  • halides having amino groups and salts thereof More preferred are N, N-dimethylaminoethyl chloride, dimethylaminoethyl chloride and diethylaminoethyl chloride, and particularly preferred is dimethylaminoethyl chloride.
  • Examples of the compound (AM-2) containing a carboxyl group include carboxylic acids having 1 to 30 carbon atoms and halogen-substituted carboxylic acids having 2 to 30 carbon atoms.
  • Examples of the carboxylic acid having 1 to 30 carbon atoms include formic acid, acetic acid, propionic acid, succinic acid, glycolic acid, gluconic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, glucuronic acid, maleic acid, fumaric acid, Examples include pyruvic acid, aspartic acid, glutamic acid, benzoic acid, anthranilic acid, mesylic acid, salicylic acid, 4-hydroxybenzoic acid, phenylacetic acid, and tricosanoic acid.
  • halogen-substituted carboxylic acid having 1 to 30 carbon atoms examples include 3-chloropropionic acid, p-chlorobenzoic acid, ⁇ -bromotricosanoic acid and chloroformic acid.
  • carboxyl group-containing compounds AM-2
  • halogen-substituted carboxylic acids are preferred, and chloroacetic acid is more preferred.
  • Examples of the compound (AM-3) containing a sulfo group include sulfonic acids having 2 to 30 carbon atoms and halogen-substituted sulfonic acids having 2 to 30 carbon atoms.
  • sulfonic acid having 2 to 30 carbon atoms examples include ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, pantothenic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, sulfanilic acid, cyclohexylaminosulfonic acid, and tricosanesulfonic acid.
  • halogen-substituted sulfonic acid having 2 to 30 carbon atoms examples include chlorosulfonic acid, chloroethanesulfonic acid, 3-bromopropanesulfonic acid, p-chlorobenzenesulfonic acid, and ⁇ -bromotricosanesulfonic acid.
  • sulfo group-containing compounds AM-3
  • halogen-substituted sulfonic acid is preferable, and chloroethanesulfonic acid is more preferable.
  • the compound (AM-4) containing a hydroxyl group includes an alcohol having 1 to 4 carbon atoms and a hydroxyl group-containing halide having 1 to 4 carbon atoms.
  • Examples of the alcohol having 1 to 4 carbon atoms include methanol, ethanol, propanol, butanol and t-butanol.
  • hydroxyl group-containing halide examples include chloroethanol, chloropropanol, bromoethanol and 4-chlorobutanol.
  • hydroxyl group-containing compounds AM-4
  • a hydroxyl group-containing halide is preferred, and chloroethanol is more preferred.
  • the cell-adhesive artificial peptide before modification ( P ′) preferably contains an amino acid residue having a reactive group ⁇ hydroxyl group, carboxyl group, mercapto group, primary or secondary amino group, etc. ⁇ .
  • a hydroxyl group, a carboxyl group, and a primary amino group are preferable from the viewpoint of easy chemical bond formation, more preferably a hydroxyl group and a carboxyl group, and particularly preferably a hydroxyl group.
  • the amino acid residue having a reactive group includes an amino acid residue containing an amino group and / or a carboxyl group in the side chain.
  • the cell adhesive artificial peptide (P ′) before modification contains an amino acid residue having a reactive group
  • at least one reactive group is present in one molecule of the cell adhesive artificial peptide (P ′) before modification.
  • those having 2 to 50 per molecule More preferably, it has 3 to 30 per molecule, particularly preferably 5 to 20 per molecule.
  • a reaction solvent may be used for the chemical bond formation reaction, and a known solvent can be used, for example, water, lithium bromide aqueous solution, lithium perchlorate aqueous solution, methanol, ethanol, isopropanol, acetone, dimethyl Examples include sulfoxide, dimethylacetamide, and tetrahydrofuran.
  • the cell adhesion artificial peptide (P ′) before modification contains an amino acid containing a hydroxyl group in the side chain (for example, , Ser and Tyr) residues, a cell-adhesive artificial peptide (P ′) before modification and a compound (AM) halide having an amino group, halogen-substituted carboxylic acid, halogen-substituted sulfonic acid or hydroxyl group
  • a method in which an ether bond is formed by reacting with a contained halide (Uriamson synthesis method), and when the amino acid (eg, Asp and Glu) containing a carboxyl group is present in the side chain, cell adhesion before modification
  • Examples thereof include a method in which an artificial peptide (P ′) is reacted with an amino alcohol in the compound (AM) to form an ester bond.
  • a peptide (23) having a number average molecular weight (Mn) of about 110,000 having 13 structures of RGD sequence (1) and 12 pieces of (GAGAGS) 9 sequence (22) and having these alternately located ⁇ " Pronectin F ”and Pronectin are registered trademarks (Japan and the United States) of Sanyo Chemical Industries, Ltd. Manufactured by Sanyo Chemical Industries Co., Ltd.
  • pronectin F2 About 20,000 Mn peptides (25) (“pronectin F2") having 5 structures of RGD sequence (1) and 5 of (GAGAGS) 3 sequences (24) and having these alternately located;
  • pronectin F3 About 10,000 peptides of Mn (26) having a structure in which three of the RGD sequences (1) and three of the (GAGAGS) 3 sequences (24) are alternately located;
  • a peptide having an Mn of about 120,000 (“pronectin FT2”) obtained by chemically binding the amino acid sequence RKLPDA sequence (27) to the Ser residue of “pronectin F”.
  • the number average molecular weight (Mn) of the cell adhesion artificial peptide (P) is preferably from 300 to 3,000,000, more preferably from the viewpoints of cell adhesion, binding to biological tissue materials and stability to heat. 1,000 to 1,000,000, particularly preferably 3,000 to 300,000.
  • the number average molecular weight (Mn) of the cell-adhesive artificial peptide (P) is determined by separating the cell-adhesive artificial peptide (P) by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) and using the migration distance as a standard substance. Is obtained by comparing with SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis)
  • the electrochemical reaction in which the cell-adhesive artificial peptide (P) is immobilized on the surface of the biological tissue material is a reaction in which the electrochemical potential changes in the electrochemical system due to other dynamic factors, and moves toward the electrode surface of the substance. It is considered that the reaction progresses through processes such as movement of ions, adsorption on the electrode surface, dissociation on the electrode surface, and transfer of electrons. That is, a proton is added to the amino group of the cell-adhesive artificial peptide (P) to form an ammonium cation, which moves toward the cathode. The ammonium cation is adsorbed on the cathode surface.
  • a method for producing a cell adhesive material for living tissue of the present invention for example, the material for living tissue and an electrode are immersed in a solution in which a cell adhesive artificial peptide (P) is dissolved, and the material for living tissue is used as a cathode,
  • a method of fixing the cell-adhesive artificial peptide (P) to the surface of the biological tissue material by an electrochemical reaction can be applied by using an electrode as an anode and applying a voltage (charge) between both electrodes.
  • the solvent for dissolving the cell adhesive artificial peptide (P) is not limited as long as it can dissolve 1 ng / ml or more of the cell adhesive artificial peptide (P).
  • Examples thereof include water, methanol, ethanol, dimethyl sulfoxide, and a perchlorate aqueous solution (such as a lithium perchlorate aqueous solution). From the viewpoint of cell affinity, water and a perchlorate aqueous solution are preferable.
  • the inorganic electrolyte it is preferable to dissolve the inorganic electrolyte in the solvent that dissolves the cell adhesion artificial peptide (P).
  • chlorides of alkali metals and alkaline earth metals can be used, and examples thereof include sodium chloride, potassium chloride, and calcium chloride.
  • the cell-adhesive artificial peptide (P) solution has electrical conductivity, and by applying an electric charge, an electrochemical reaction easily proceeds, and it is suitable for a tissue material.
  • the cell adhesion artificial peptide (P) can be easily moved.
  • the concentration of the inorganic electrolyte is preferably 1 to 5% by weight, more preferably 2 to 4% by weight, based on the weight of the solvent. Within this range, the electrical conductivity of the aqueous solution can be further improved, and ions derived from the inorganic electrolyte can be suppressed from adsorbing to the metal surface.
  • the concentration of the cell-adhesive artificial peptide (P) is preferably 0.1 to 1000 ⁇ g / ml from the viewpoint of the ease of the electrochemical reaction based on the volume of the cell-adhesive artificial peptide (P) solution, More preferably, it is 1 to 100 ⁇ g / ml. When the amount is within this range, the amount of binding is further sufficient, and further sufficient cell adhesiveness and cell proliferation are expressed.
  • the voltage applied between the cathode (material for living tissue) and the anode is preferably 0.1 to 10V, more preferably 1 to 7V. Within this range, a more uniform film ⁇ film made of cell-adhesive artificial peptide (P) ⁇ is formed, and the film formation time can be further shortened.
  • the applied current density is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 7 to 5 ⁇ 10 ⁇ 5 A / dm 2 , more preferably 5 ⁇ 10 ⁇ 8 to 1 ⁇ 10 ⁇ 5 A / dm 2 with respect to the surface area of the cathode. is there. Within this range, a more uniform film ⁇ film made of cell-adhesive artificial peptide (P) ⁇ is formed, and the film formation time can be further shortened.
  • the cells that can adhere to the cell adhesive material for living tissue of the present invention include insect cells, plant cells, and animal cells. Of these cells, animal cells are preferred from the viewpoint of cell adhesion, and mammalian cells are particularly suitable. Mammals include marsupials (such as kangaroos), primates (such as monkeys, chimpanzees, and humans), rodents (such as squirrels, rats, and porcupines), cetaceans (such as dolphins, killer whales, and whales), and carnivores (such as dolphins, killer whales, and whales).
  • marsupials such as kangaroos
  • primates such as monkeys, chimpanzees, and humans
  • rodents such as squirrels, rats, and porcupines
  • cetaceans such as dolphins, killer whales, and whales
  • carnivores such as dolphins, killer whales, and whales.
  • Biological dictionaries such as dogs, foxes, bears, cats, lions and tigers), territorials (such as horses, donkeys and rhinoceros) and cloven-hoofed animals (such as wild boars, pigs, camels, deer, cows, goats and sheep) Mammals described in Iwanami Shoten, 1969].
  • territorials such as horses, donkeys and rhinoceros
  • cloven-hoofed animals such as wild boars, pigs, camels, deer, cows, goats and sheep
  • mammalian cells include cells involved in blood vessels (vascular endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, etc.), cells involved in muscles (muscle cells, etc.), cells involved in fat (fat cells, etc.), Cells involved in nerves (such as nerve cells), cells involved in liver (such as liver parenchymal cells), cells involved in pancreas (such as pancreatic islet cells), cells involved in kidney (renal epithelial cells, proximal tubules) Epithelial cells and mesangial cells), cells involved in the lungs and bronchi (epithelial cells, fibroblasts, vascular endothelial cells and smooth muscle cells), cells involved in the eyes (visual cells, corneal epithelial cells, corneal endothelial cells, etc.) Cells involved in prostate (epithelial cells, stromal cells and smooth muscle cells), cells involved in bone (osteoblasts, bone cells and osteoclasts, etc.), cells involved in cartilage (chondroblasts and chon
  • cells related to bone such as osteoblasts, bone cells and osteoclasts
  • cells related to cartilage such as chondroblasts and chondrocytes
  • cells related to teeth and gingiva gingival epithelial cells and osteoblasts
  • stem cells such as mesenchymal stem cells and embryonic stem cells
  • biological tissue materials include metals and electrically conductive ceramics.
  • metals include titanium, iron, stainless steel, zirconium, tantalum, platinum, gold, and composite materials having two or more of these (transplantation and artificial organs, Iwanami Lecture, Foundation of Modern Medicine 14, published by Iwanami Shoten Co., Ltd.) And JP-A-7-88174).
  • the composite material include titanium alloys (such as Ti-6Al-4V and Ti-6Al-2Nb-1Ta) and cobalt chromium alloys.
  • the electrically conductive ceramic include titanium boride (TiB 2 ), silicon carbide (SiC), and conductive zirconia. From the viewpoint of biocompatibility, titanium and titanium alloys are preferable.
  • the shape of the material for living tissue is not particularly limited.
  • the shape of an artificial hip joint the shape of an artificial knee joint, the shape of an artificial tooth root, the shape of a bone prosthesis / material, etc. Shapes described in "Basic 14),” issued by Iwanami Shoten Co., Ltd. ".
  • Ratio of area (N) to which cell-adhesive artificial peptide (P) is immobilized relative to surface area ⁇ surface area capable of adhering to cells ⁇ (M) of biological tissue material ⁇ (covering area ratio of cell-adhesive artificial peptide (P)) ) (N) ⁇ 100 / (M) ⁇ is preferably 50 to 100%, more preferably 80 to 100% from the viewpoint of cell adhesion.
  • the cell adhesion artificial polypeptide (P) is covered with the cell adhesion artificial peptide (P) by immunochemical staining using an antibody having antibody reactivity with the cell adhesion artificial peptide (P).
  • the area (N) is obtained ⁇ obtained by analyzing a photograph taken (Nikon Corporation single-lens reflex camera D70, magnification 10 times). ⁇ , And is calculated from this area (N) and the surface area of the material for living tissue ⁇ surface area capable of adhering to cells ⁇ (M).
  • the binding amount of the cell adhesion artificial peptide (P) is preferably 0.1 to 1000 ng / mm 2 and more preferably 1 to 100 ng / mm 2 from the viewpoint of cell adhesion, based on the surface area of the material for living tissue. 2 .
  • the binding amount of the cell-adhesive artificial peptide (P) is determined by immersing the cell-adhesive material for biological tissue in an acid solution, hydrolyzing the cell-adhesive artificial peptide (P) into amino acids, and then the concentration of the amino acid in the acid solution.
  • ( ⁇ ) (mol / L) is determined by the TNBS method (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid absorptiometric method), and this concentration ( ⁇ ) constitutes 1 mol of cell-adhesive artificial peptide (P).
  • the cell adhesive material for living tissue of the present invention has good adhesiveness with various cells, it can be used as a material for medical instruments that function in various living bodies, preferably from the viewpoint of cell adhesiveness. It can be used for artificial organ substrates, dental substrates, orthopedic substrates and ophthalmic substrates.
  • the cell adhesive material for living tissue of the present invention is a cell adhesive material for living tissue having good adhesion to various cells, it is an implant, bone fixing agent, and bone cage that are medical devices for living body implantation. Suitable as dental implants, catheters, guide wires, stents, and artificial joints.
  • Example 1 According to the method described in the examples in JP-T-3-502935 (corresponding PCT application; WO90 / 05177 pamphlet; the disclosure disclosed therein is incorporated herein by reference), the RGD sequence ( A peptide having a number average molecular weight (Mn) of about 110,000 having a structure in which 13 of (1) and 12 of (GAGAGS) 9 sequences (22) are alternately positioned (23) ⁇ cell adhesion artificial Peptide (P1-0) ⁇ was produced by genetically modified E. coli.
  • Mn number average molecular weight
  • reaction solution was dialyzed against 10 L of deionized water for 48 hours using a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 12,000 to 14,000. In the first 12 hours, deionized water was changed every 4 hours.
  • the obtained aqueous solution was lyophilized under the conditions of ⁇ 20 ° C. and 0.1 kPa or less for 24 hours to obtain a water-soluble cell adhesion artificial peptide (P1-1).
  • N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride introduced is disclosed in JP-T-10-500701 (corresponding PCT application; WO 96/16168 pamphlet; the disclosure disclosed therein is incorporated herein by reference).
  • the number was 12 in one molecule of the water-soluble cell-adhesive artificial peptide (P1-1).
  • 300 ml of an aqueous solution obtained by dissolving the cell-adhesive artificial peptide (P1-1) thus obtained in a 0.9 wt% sodium chloride aqueous solution so as to have a concentration of 5 ⁇ g / ml was 200 mm in height and 135 mm in inner diameter at the bottom.
  • the platinum electrode (rod-shaped) is used as an anode
  • the biological tissue material titanium plate, 100 mm ⁇ 100 mm ⁇ 0.1 mm rectangular parallelepiped) (manufactured by Niraco) (manufactured by Niraco) is used as a cathode to rotate the stirring bar with a magnetic stirrer to stir the aqueous solution.
  • the titanium plate was immersed in 500 mL of deionized water and immediately removed three times, then dried in a circulating dryer at 60 ° C. for 2 hours, and the cell adhesion artificial peptide on the titanium surface.
  • a cell-adhesive material (A1) for living tissue of the present invention on which (P1-1) was fixed was obtained.
  • the binding amount of the cell-adhesive artificial peptide (P1-1) bound to the cell-adhesive material for biological tissue (A1) was determined using the known trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) method ⁇ Biochemical Experiment Course 1, Protein Chemistry As a result of quantification by IV (July 1, 1981, edited by The Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.), etc., the bond amount (J) immediately after production was 70 ng / mm 2 .
  • TNBS trinitrobenzene sulfonic acid
  • Example 2 A cell adhesive material (A2) for living tissue of the present invention is obtained in the same manner as in Example 1 except that the cell adhesive artificial peptide (P1-1) is changed to the cell adhesive artificial peptide (P1-0). It was.
  • the binding amount (J) immediately after production of the cell-adhesive artificial peptide (P1-0) bound to the cell-adhesive material for biological tissue (A2) was 70 ng / mm 2 .
  • Example 3 A cell adhesion artificial peptide (P1-2) was obtained in the same manner as in Example 1 except that N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride (special grade reagent) was changed to chloroacetic acid (special grade reagent). The number of chloroacetic acids introduced into the cell adhesion artificial peptide (P1-2) was 12 per molecule.
  • the cell adhesive material (A3) for living tissue of the present invention was used. Obtained.
  • the binding amount (J) immediately after production of the cell-adhesive artificial peptide (P1-2) bound to the cell-adhesive material for biological tissue (A3) was 60 ng / mm 2 .
  • the cell adhesion artificial peptide (P1-1) has 5 RGD sequences and 5 (GAGAGS) 3 sequences (24) and has a structure in which these are alternately positioned. Number average molecular weight (Mn) of about 20,000
  • the cell for living tissue of the present invention was the same as in Example 1 except that the peptide (P2-0) (prepared according to the method described in the Example in JP-T-3-502935) was changed to An adhesive material (A4) was obtained.
  • the binding amount (J) immediately after production of the cell-adhesive artificial peptide (P2-0) bound to the cell-adhesive material for biological tissue (A4) was 60 ng / mm 2 .
  • Example 5 A cell adhesive artificial peptide (P2-1) was obtained in the same manner as in Example 1 except that the cell adhesive artificial peptide (P1-0) was changed to the cell adhesive artificial peptide (P2-0). The number of N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride introduced into the cell adhesion artificial peptide (P2-1) was 6 per molecule.
  • the cell adhesive artificial peptide (P1-1) was changed to the cell adhesive artificial peptide (P2-1)
  • the cell adhesive material (A5) for living tissue of the present invention was used. Obtained.
  • the binding amount (J) immediately after production of the cell-adhesive artificial peptide (P2-1) bound to the cell-adhesive material for biological tissue (A5) was 60 ng / mm 2 .
  • Example 6 Number average molecular weight (Mn) having 5 structures of YIGSR sequence (4) and 5 sequences of (GAGAGS) 3 sequence (24), and a structure in which these are alternately located, as cell adhesion artificial peptide (P1-1)
  • the living body of the present invention was the same as Example 1 except that it was changed to about 20,000 peptides (P3-0) (prepared according to the method described in Examples in JP-T-3-502935).
  • a cell adhesive material for tissue (A6) was obtained.
  • the binding amount (J) immediately after production of the cell-adhesive artificial peptide (P3-0) bound to the cell-adhesive material for biological tissue (A6) was 60 ng / mm 2 .
  • Example 7 Number average molecular weight (Mn) having a structure in which cell adhesion artificial peptide (P1-1) has 5 of IKVAV sequence (9) and 5 of (GAGAGS) 3 sequence (24) and these are alternately located
  • the living body of the present invention was the same as Example 1 except that it was changed to about 20,000 peptides (P4-0) (prepared according to the method described in the Example in JP-T-3-502935).
  • a cell adhesive material for tissue (A7) was obtained.
  • the binding amount (J) immediately after production of the cell-adhesive artificial peptide (P4-0) bound to the cell-adhesive material for biological tissue (A7) was 60 ng / mm 2 .
  • ⁇ Comparative Example 2> A solution prepared by dissolving the cell adhesion artificial peptide (P1-1) and 3-glycidoxypropyltriethoxysilane in deionized water at a concentration of 200 ⁇ g / g each was prepared, and living tissue was mixed in 200 mL of an equal amount of these solutions.
  • the material titanium plate, 100 mm ⁇ 100 mm ⁇ 0.1 mm rectangular parallelepiped
  • a comparative cell adhesive material for biological tissue (B4) was obtained in the same manner as in Example 1 except that the cell adhesive artificial peptide (P1-1) was changed to bovine serum albumin (BSA).
  • the amount of binding (J) immediately after production of bovine serum albumin (BSA) bound to the cell adhesive material for biological tissue (B4) was 50 ng / mm 2 .
  • ⁇ Evaluation 1> (Evaluation of binding strength between titanium plate and cell-adhesive artificial peptide: amount of binding after ultrasonic cleaning)
  • the test specimen ⁇ cell adhesive material for living tissue (A1) to (A7) and (B1) to (B4) ⁇ is immersed in 500 mL of a 0.5 wt% aqueous solution of sodium dodecyl sulfate (special grade reagent), and an ultrasonic cleaner ( After applying ultrasonic waves for 10 minutes in Tech-Jam (WS-600-28S, 28 kHz), the test piece was taken out, washed 3 times immediately after being immersed in 500 mL of deionized water, and then circulated at 60 ° C. Dry in an air dryer for 2 hours.
  • the amount of cell-adhesive artificial peptide or bovine serum albumin (BSA) bound to the test piece was quantified by the trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) method in the same manner as in Example 1. These results are shown in Table 1.
  • ⁇ Evaluation 2> (Gingival epithelial proliferation test evaluation) Using test specimens (cuboids obtained by cutting cell adhesive materials (A1) to (A7) and (B1) to (B4) for living tissue into 6 ⁇ 6 mm ⁇ 0.1 mm), gingival epithelial proliferation as follows The rate (%) was determined.
  • Rabbit maxillary buccal gingiva is removed with a biopsy trepan (diameter 6 mm), the front side of the anterior teeth is exposed, and a test piece (6 x 6 mm x 0.1 mm) is attached to the exposed side of the anterior teeth.
  • the test piece was fixed by covering the four corners of the piece with gums.
  • test piece was photographed in the same manner as described above, and the area of the test piece exposed in the obtained photographic image was measured (area H).
  • ⁇ Evaluation 4> (Evaluation of adhesive strength between titanium plate and rat maxillary buccal gingiva) Using test specimens ⁇ cubes obtained by cutting cell adhesive materials (A1) to (A7) and (B1) to (B4) for living tissue into 4 x 0.1 x 0.1 mm ⁇ as follows Asked.
  • the rat maxillary buccal gingiva was peeled off with a scalpel to expose the teeth, and then a hole with a depth of 4 mm and 1 ⁇ mm was drilled in the exposed teeth. A test piece (4 ⁇ 0.1 ⁇ 0.1 mm) was inserted into this hole.
  • the cell adhesive material for biological tissue of the present invention (Examples 1 to 7) and the cell adhesive material for biological tissue for comparison (Comparative Examples 2 and 4) It can be seen that the cell-adhesive artificial peptide (or BSA) is more firmly bound to the biological tissue material than the cell-adhesive material for biological tissue (Comparative Examples 1 and 3) bonded by immersion.
  • the cell adhesive material for living tissue of the present invention (Examples 1 to 7) is more than the cell adhesive material for living tissue for comparison (Comparative Examples 1 to 4). It can be seen that the gingival epithelial proliferation rate is significantly high and the cell proliferation is excellent. Furthermore, from the results of the maximum tensile strength ⁇ Evaluation 3 and 4>, the cell adhesive material for living tissue of the present invention (Example 1) was used both when the rabbit maxillary buccal gingiva was used and when the rat maxillary buccal gingiva was used. It can be seen that (7) to (7) have a significantly higher maximum tensile strength than the comparative cell adhesive material for biological tissue (Comparative Examples 1 to 4), and are excellent in adhesion between the biological tissue material and cells.
  • the cell-adhesive material for biological tissue of the present invention is immobilized in a large amount in a state where the cell-adhesive artificial peptide (P) retaining the biological activity maintains the biological activity. It can be seen that the present invention can be applied to a medical device that has excellent properties and tissue adhesion.
  • the cell adhesive material for living tissue of the present invention is excellent in cell adhesion, cell proliferation and adhesion to living tissue, an implant, a bone fixing agent, a bone cage, a dental implant, a catheter, a guide wire, It can be widely used as medical devices such as stents and artificial joints.

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Abstract

本発明の目的は、生体組織用材料（特に金属材料）の表面を生物活性を保持した細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）で多量かつ強固に修飾した生体組織用細胞接着性材料を提供することである。 本発明は、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が生体組織用材料の表面に電気化学反応により固定された生体組織用材料である。細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は遺伝子組換微生物によって合成され、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ１）が好ましい。ポリペプチド（Ｐ１）１分子中の細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）の数は３～５０個が好ましい。

Description

生体組織用細胞接着性材料
　本発明は、生体組織用細胞接着性材料に関する。
　現在、医科及び歯科領域において、人工関節や人工歯根等の抗菌性や抗血栓性等を保持させた生体組織用材料が多用されている。このような生体組織用材料の素材としては、チタン、チタン合金、Ｃｏ－Ｃｒ合金（バイタリウム等）、ステンレス及びタンタルが一般に用いられている。しかし、このような素材自身が生体組織に対してなじみが小さく、不活性であることから、素材との細胞の接着性や増殖性が著しく悪く、生体組織用材料と生体組織との間の接着強度やその界面における感染等に問題がある。
　このような問題を解決するために、細胞接着因子や細胞調節因子等を生体組織用材料の上に被覆することが行われている。例えば、コラーゲン等を化学結合によって生体組織用材料上に結合したもの（特許文献１）、浸漬によってラミニン等を生体組織用材料上に被覆したもの（特許文献２）が知られている。
特開２００７－０５１１２７号公報 特開２００５－０２１２０８号公報
　しかしながら、化学結合によって細胞接着因子や細胞調節因子を生体組織用材料の上に固定すると、細胞接着因子や細胞調節因子等の生理活性が損なわれたり、結合量が不十分であるという問題がある。また、化学結合法は金属表面の修飾工程が多く、煩雑であるという問題もある。また、浸漬による物理的な吸着によって被覆する場合、細胞接着因子や細胞調節因子と生体組織用材料との結合力が十分ではなく剥離や脱離を引き起こす問題がある。
　細胞の接着性や増殖性の問題は、歯科領域において特に深刻な問題となっている。歯科領域では、人工歯根や歯科用インプラント等の生体組織用材料として、生体内安定性や生体適合性から、チタン及びチタン合金が主に使用されている。歯科用インプラントでは、その一部が口腔内に露出していることから、その歯肉上皮組織との結合の脆弱性が、歯周病の原因となり、結果としてインプラントの長期維持が困難となる問題が多く、未だその問題を解決する有効な手段がないのが実状である。加えて、骨組織との接着にも細胞の接着や増殖性の増強に改良の余地が残されている。
　本発明の目的は、生体組織用材料（特に金属材料）の表面を生物活性を保持した細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）で多量かつ強固に修飾した生体組織用細胞接着性材料を提供することである。
　本発明は、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が生体組織用材料の表面に電気化学反応により固定された生体組織用細胞接着性材料である。
　本発明の生体組織用細胞接着性材料は、細胞接着性が高く、細胞増殖性に優れているという効果を奏する。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は、人工的に製造されるものであり、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって容易に製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報（対応するＰＣＴ出願；ＷＯ９０／０５１７７号パンフレット；これに開示された開示内容を参照により本出願に取り込む。）に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を作製できるが、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）のアミノ酸配列を容易に設計・変更でき、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
　「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８～６６頁、１９９２年）。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は、動物由来成分の排除という観点から、遺伝子組換微生物によって合成され、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチドであることが好ましい。細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、例えば、「病態生理、第９巻 第７号、５２７～５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８～６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
　これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、アミノ酸一文字表記で現わすと、ＲＧＤ配列（１）、ＬＤＶ配列（２）、ＬＲＥ配列（１０）、ＨＡＶ配列（１２）、ＲＥＤＶ配列（３）、ＹＩＧＳＲ配列（４）、ＰＤＳＧＲ配列（５）、ＲＹＶＶＬＰＲ配列（６）、ＬＧＴＩＰＧ配列（７）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列（８）、ＩＫＶＡＶ配列（９）、ＤＧＥＡ配列（１１）、ＧＶＫＧＤＫＧＮＰＧＷＰＧＡＰ配列（１３）、ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ配列（１４）、及びＹＫＬＮＶＮＤＳ配列（１５）、ＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ配列（１６）、ＮＲＷＨＳＩＹＩＴＲＦＧ配列（１７）、ＴＷＹＫＩＡＦＱＲＮＲＫ配列（１８）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＴＲＴ配列（１９）及びＰＨＳＲＮ配列（２０）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはＲＧＤ配列（１）、ＬＤＶ配列（２）、ＬＲＥ配列（１０）、ＨＡＶ配列（１２）、ＲＥＤＶ配列（３）、ＹＩＧＳＲ配列（４）、ＰＤＳＧＲ配列（５）、ＲＹＶＶＬＰＲ配列（６）、ＬＧＴＩＰＧ配列（７）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列（８）、ＩＫＶＡＶ配列（９）、ＤＧＥＡ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはＲＧＤ配列（１）、ＹＩＧＳＲ配列（４）及びＩＫＶＡＶ配列（９）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は、細胞接着性の観点から、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有することが好ましく、さらに好ましくは１分子中に３～５０個、つぎにさらに好ましくは１分子中に４～３０個、特に好ましくは１分子中に５～２０個、最も好ましくは１分子中に１３個である。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は、熱に対する安定性の観点から、細胞接着性最小アミノ酸配列以外に、補助アミノ酸配列（Ｙ）を含んでいることが好ましい。補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、ＧＡＧＡＳ配列（２１）等が挙げられる。補助アミノ酸配列（Ｙ）を含んでなる場合、補助アミノ酸配列（Ｙ）の含有量は、熱に対する安定性の観点から、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の１分子中に、少なくとも２個が好ましく、さらに好ましくは３～１０，０００個、特に好ましくは１０～３，０００個、最も好ましくは３０～１，０００個である。また、熱的安定性の観点から、補助アミノ酸配列（Ｙ）は、（Ｙ）ａ（ａは任意の整数）のように連続して繰返した形で含まれることが好ましく、例えば、（ＧＡＧＡＳ）ａ（ａは任意の整数）が挙げられる。生産性の観点から、繰返し回数ａの好ましい範囲は２～３３であり、さらに好ましくは３～２３、特に好ましくは４～１３である。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）を含有する場合、細胞接着性ペプチド（Ｐ）中の細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との個数比率［（Ｘ）／（Ｙ）］は、細胞接着性と熱に対する安定性の観点から、０．００２～１０が好ましく、さらに好ましくは０．０１～２、特に好ましくは０．０５～０．５である。また、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）がβシート構造を取りやすいという観点から、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に位置することが好ましい。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は、生体組織用材料の表面を多量かつ強固に修飾する観点から、側鎖にアミノ基及び／又はカルボキシル基を含有するアミノ酸の残基を持つことが好ましい。側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）が挙げられる。また、側鎖にカルボキシル基を含有するアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）が挙げられる。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は、化合物（ＡＭ）でさらに修飾されていてもよい。化合物（ＡＭ）としては、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基及び／又は第４級アンモニオ基を含有する化合物（塩）（ＡＭ－１）、カルボキシル基を含有する化合物（ＡＭ－２）、スルホ基を含有する化合物（ＡＭ－３）及びヒドロキシル基を含有する化合物（ＡＭ－４）が含まれる。化合物（ＡＭ）で修飾されていると、本発明の生体組織用細胞接着性材料の細胞接着性がさらに良好となると共に、生体組織用材料を細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）でさらに多量かつ強固に修飾できる。
　第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基及び／又は第４級アンモニオ基を含有する化合物（塩）（ＡＭ－１）としては、ポリアミン、アミノアルコール、アミノ基を有するハロゲン化物、アミノ基含有モノマー及びアミノ基含有モノマーを構成単量体とする重合体、並びにこれらの塩又は４級化物等が使用できる。
　ポリアミンとしては、少なくとも１個の第１級アミノ基又は第２級アミノ基を有するポリアミン（炭素数２～５６）等が用いられ、脂肪族ポリアミン、脂環式ポリアミン、複素環式ポリアミン及び芳香族ポリアミン等が用いられる。
　脂肪族ポリアミンとしては、アルキレンジアミン（エチレンジアミン、プロピレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン及びヘキサメチレンジアミン等）、アルキレン基の炭素数が２～６であるポリアルキレンポリアミン（ジエチレントリアミン、イミノビスプロピルアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン及びペンタエチレンヘキサミン等）、及びこれらのアルキル（炭素数１～１８）置換体（ジメチルアミノプロピルアミン、ジエチルアミノプロピルアミン、ジプロピルアミノプロピルアミン、メチルエチルアミノプロピルアミン、トリメチルヘキサメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルエチレンジアミン、トリオクタデシルエチレンジアミン及びメチルイミノビスプロピルアミン等）等が挙げられる。
　脂環式ポリアミンとしては、１，３－ジアミノシクロヘキサン、１，３－ビス（メチルアミノ）シクロヘキサン、１，３－ビス（ジヒドロキシアミノ）シクロヘキサン、イソホロンジアミン、メンタンジアミン及び４，４’－メチレンジシクロヘキサンジアミン等が挙げられる。
　複素環式ポリアミンとしては、ピペラジン、Ｎ－メチルピペラジン、Ｎ－アミノエチルピペラジン及び１，４－ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。
　芳香族ポリアミンとしては、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ’－ジメチルフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’－トリメチルフェニレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン及び２，６－ジアミノピリジン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、４，４’－ビス（メチルアミノ）ジフェニルメタン及び１－メチル－２－メチルアミノ－４－アミノベンゼン等が挙げられる。
　アミノアルコールとしては、炭素数２～５８のアミノアルコール等が用いられ、炭素数２～１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、モノブタノールアミン、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ－ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］、これらのアルキル（炭素数１～１８）置換体［Ｎ，Ｎ－ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルエタノールアミン、Ｎ－エチルジエタノールアミン、Ｎ－オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチル－Ｎ’，Ｎ’－ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ－ジオクタデシル－Ｎ’，Ｎ’－ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’－トリオクタデシル－Ｎ’－ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。
　アミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２～１７のアルキルアミンのハロゲン（塩素及び臭素等）化物等が用いられ、アミノエチルクロリド、Ｎ－メチルアミノプロピルクロリド、ジメチルアミノエチルクロリド、ジエチルアミノエチルクロリド、ジベンジルアミノエチルブロミド、ジメチルアミノプロピルブロミド、ジエチルアミノプロピルクロリド及びジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。
　アミノ基含有モノマーとしては、炭素数５～２１のアミノ基含有ビニル化合物、エチレンイミン及び炭素数２～２０のアミノ酸等が用いられる。
　アミノ基含有ビニル化合物としては、アミノ基含有（メタ）アクリレート、アミノ基含有（メタ）アクリルアミド、アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素及びアミノ基含有アリルエーテル等が用いられる。
　アミノ基含有（メタ）アクリレートとしては、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ－メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジベンジルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジベンジルアミノプロピル（メタ）アクリレート、モルホリノエチル（メタ）アクリレート及びＮ－メチルピペリジノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
　アミノ基含有（メタ）アクリルアミドとしては、アミノエチルアクリルアミド、Ｎ－メチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、モルホリノエチル（メタ）アクリルアミド及びＮ－メチルピペリジノエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
　アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素としては、アミノエチルスチレン、Ｎ－メチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ－ジプロピルアミノスチレン及びＮ－ベンジル－Ｎ－メチルアミノスチレン等が挙げられる。
　アミノ基含有アリルエーテルとしては、アミノエチルアリルエーテル、Ｎ－メチルアミノエチルアリルエーテル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアリルエーテル及びＮ，Ｎ－ジエチルアミノエチルアリルエーテル等が挙げられる。
　アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、システイン、リシン、セリン、グリシン、３－アミノプロピオン酸、８－アミノアクタン酸及び２０－アミノエイコサン酸等が挙げられる。
　アミノ基含有モノマーの重合体としては、アミノ基含有ビニル化合物を必須構成単量体とするビニルポリマー、ポリエチレンイミン及びポリペプチド（細胞接着性人工ポリペプチド（Ｐ）は含まない。）等が挙げられる。
　アミノ基含有モノマーの重合体の重量平均分子量は、５００～１００万が好ましく、さらに好ましくは１，０００～８０万、特に好ましくは２，０００～５０万である。なお、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定することができる｛基準物質：分子量４２０～２０,６００,０００のポリスチレンスタンダード（東ソー製）等｝。
　これらの塩としては、これらのアミン（ポリアミン、アミノアルコール、アミノ基を有するハロゲン化物、アミノ基含有モノマー及びアミノ基含有モノマーを構成単量体とする重合体）の無機塩（塩酸塩、硝酸塩及び過塩素酸塩等）等が挙げられる。
　これらの４級化物としては、これらのアミンを４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化したもの等が挙げられる。
　これらのアミノ基（第１～３級）及び／又は第４級アンモニオ基を含有する化合物（塩）（ＡＭ－１）のうち、細胞接着性の観点から、アミノ基を有するハロゲン化物及びこの塩が好ましく、さらに好ましくは塩酸Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルクロリド、ジメチルアミノエチルクロリド及びジエチルアミノエチルクロリド、特に好ましくはジメチルアミノエチルクロリドである。
　カルボキシル基を含有する化合物（ＡＭ－２）としては、炭素数１～３０のカルボン酸及び炭素数２～３０のハロゲン置換カルボン酸が含まれる。
　炭素数１～３０のカルボン酸としては、ぎ酸、酢酸、プロピオン酸、こはく酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、４－ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸及びトリコサン酸等が挙げられる。
　炭素数１～３０のハロゲン置換カルボン酸としては、３-クロロプロピオン酸、ｐ－クロロ安息香酸、ω－ブロモトリコサン酸及びクロロぎ酸が挙げられる。
　これらのカルボキシル基を含有する化合物（ＡＭ－２）のうち、細胞接着性の観点から、ハロゲン置換カルボン酸が好ましく、さらに好ましくはクロロ酢酸である。
　スルホ基を含有する化合物（ＡＭ－３）としては、炭素数２～３０のスルホン酸及び炭素数２～３０のハロゲン置換スルホン酸が含まれる。
　炭素数２～３０のスルホン酸としては、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸及びトリコサンスルホン酸等が挙げられる。
　炭素数２～３０のハロゲン置換スルホン酸としては、クロロスルホン酸、クロロエタンスルホン酸、３－ブロモプロパンスルホン酸、ｐ－クロロベンゼンスルホン酸及びω－ブロモトリコサンスルホン酸等が挙げられる。
　これらのスルホ基を含有する化合物（ＡＭ－３）のうち、細胞接着の観点から、ハロゲン置換スルホン酸が好ましく、さらに好ましくはクロロエタンスルホン酸である。
　ヒドロキシル基を含有する化合物（ＡＭ－４）としては、炭素数１～４のアルコール及び炭素数１～４の水酸基含有ハロゲン化物が含まれる。
　炭素数１～４のアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びｔ－ブタノール等が挙げられる。
　水酸基含有ハロゲン化物としては、クロロエタノール、クロロプロパノール、ブロモエタノール及び４－クロロブタノール等が挙げられる。
　これらのヒドロキシル基を含有する化合物（ＡＭ－４）のうち、細胞接着性の観点から、水酸基含有ハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロエタノールである。
　化合物（ＡＭ）で修飾する方法としては、（１）化合物（ＡＭ）と、修飾前の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ’）とを化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法、並びに、（２）化合物（ＡＭ）を修飾前の細胞接着性人工ポリペプチド（Ｐ’）に物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）させる方法等が適用できる。
　これらのうち、結合強度の観点等から、（１）の化学結合させる方法が好ましく、さらに好ましくは共有結合させる方法である。
　（１）化合物（ＡＭ）と、修飾前の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ’）とを化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる場合、修飾前の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ’）は、反応性基｛水酸基、カルボキシル基、メルカプト基、及び１級又は２級アミノ基等｝をもつアミノ酸残基を含むことが好ましい。反応性基のうち、化学結合形成の容易さの観点から、水酸基、カルボキシル基及び１級アミノ基が好ましく、さらに好ましくは水酸基及びカルボキシル基、特に好ましくは水酸基である。反応性基をもつアミノ酸残基としては、上記の側鎖にアミノ基及び／又はカルボキシル基を含有するアミノ酸の残基が含まれる。
　修飾前の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ’）が反応性基をもつアミノ酸残基を含む場合、修飾前の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ’）の１分子中に反応性基を少なくとも１個有すればよいが、生体組織用材料に対する結合性の観点から（生体組織用材料を細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）でさらに多量かつ強固に修飾するため）、１分子中に２～５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは１分子中に３～３０個、特に好ましくは１分子中に５～２０個有するものである。
　化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、たとえば、特許文献１（特開２００７－５１１２７号公報）等に記載の方法が挙げられる。化学結合形成反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルフォキシド、ジメチルアセトアミド及びテトラヒドロフランが挙げられる。
　化合物（ＡＭ）と修飾前の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ’）とを共有結合させる具体例としては、修飾前の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ’）が側鎖に水酸基を含有するアミノ酸（例えば、Ｓｅｒ及びＴｙｒ）残基をもつ場合、修飾前の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ’）と、化合物（ＡＭ）のうち、アミノ基を有するハロゲン化物、ハロゲン置換カルボン酸、ハロゲン置換スルホン酸又は水酸基含有ハロゲン化物とを反応（ウリアムソン合成法）させて、エーテル結合を形成させる方法、及び側鎖にカルボキシル基を含有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕ）残基をもつ場合、修飾前の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ’）と、化合物（ＡＭ）のうち、アミノアルコールとを反応させて、エステル結合を形成させる方法等が挙げられる。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の好適な例を以下に示す。
　ＲＧＤ配列（１）の１３個と（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２２）の１２個とを有し、これらが交互に位置する構造を有する数平均分子量（Ｍｎ）約１１万のペプチド（２３）｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
　ＲＧＤ配列（１）の５個と（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（２４）の５個とを有しこれらが交互に位置する構造を有するＭｎ約２万のペプチド（２５）（「プロネクチンＦ２」）；
　ＲＧＤ配列（１）の３個と（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（２４）の３個とを有しこれらが交互に位置する構造を有するＭｎ約１万のペプチド（２６）（「プロネクチンＦ３」）；
　ＲＧＤ配列（１）の６個とＲＫＬＰＤＡ配列（２７）の６個と（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２２）の１２個とを有し、これらがＲＧＤ配列（１）、（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（２７）、（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２２）の順に交互に位置する構造を有するＭｎ約１１万のペプチド（２８）（「プロネクチンＦＴ」）；
　「プロネクチンＦ」のＳｅｒ残基に対してアミノ酸配列ＲＫＬＰＤＡ配列（２７）を化学結合したＭｎ約１２万のペプチド（「プロネクチンＦＴ２」）等。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、細胞接着性、生体組織用材料に対する結合性及び熱に対する安定性の観点から、３００～３，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは１，０００～１，０００，０００、特に好ましくは３，０００～３００，０００である。なお、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法で、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求めるものである。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を生体組織用材料の表面に固定する電気化学反応とは、電気化学系において電気化学ポテンシャルが他動的要因によって変化する反応であり、物質の電極面へ向かっての移動、電極面への吸着、電極面での解離及び電子の授受等の過程を経過する反応であると考えられる。すなわち、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）のアミノ基にプロトンが付加してアンモニウム陽イオンとなり、陰極に向かって移動し、アンモニウム陽イオンは、陰極面に吸着され、陰極面において、アミノ基とプロトンに解離し、プロトンに陰極から電子が与えられ、水素ガスが発生するものと考えられる。一方、アミノ基の孤立電子対の電子は、陰極である金属の自由電子と共有され、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）のアミノ基と陰極である生体組織用材料との間には強い結合が形成され、通電を停止した後もこの強い結合が保持されるものと考えられる。
　本発明の生体組織用細胞接着性材料の製造方法としては、例えば、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を溶解した溶液に生体組織用材料と電極とを浸漬し、生体組織用材料を陰極とし、電極を陽極とし、両極間に電圧（電荷）を加えることにより、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を生体組織用材料の表面に電気化学反応により固定する方法が適用できる。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を溶解する溶媒としては、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を１ｎｇ／ｍｌ以上溶解できるものであれば限定されない。例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルスルホオキシド及び過塩素酸塩水溶液（過塩素酸リチウム水溶液等）等が挙げられ、細胞親和性の観点から、水及び過塩素酸塩水溶液が好ましい。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を溶解する溶媒には、無機電解質を溶解しておくことが好ましい。溶解する無機電解質としては、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の塩化物を用いることができ、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び塩化カルシウム等が挙げられる。無機電解質を溶解しておくことにより、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の溶液が電気伝導性を有し、電荷を印可することにより電気化学反応が進行しやすくなると共に、生体組織用材料に向かって細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が移動しやすくなる。無機電解質を用いる場合、無機電解質の濃度は、溶媒の重量に対し、１～５重量％が好ましく、さらに好ましくは２～４重量％である。この範囲であると、水溶液の電気伝導性がさらに向上し、また、無機電解質に由来するイオンが金属表面に吸着することを抑制できる。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の濃度は、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の溶液の体積を基準として、電気化学反応の進行しやすさの観点から、０.１～１０００μｇ／ｍｌが好ましく、さらに好ましくは１～１００μｇ／ｍｌである。この範囲であると、結合量がさらに十分となり、さらに十分な細胞接着性や細胞増殖性を発現する。
　陰極（生体組織用材料）と陽極との間に与える電圧は、０．１～１０Ｖが好ましく、さらに好ましくは１～７Ｖである。この範囲であると、さらに均一な皮膜｛細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）からなる皮膜｝が形成され、皮膜の形成時間がさらに短縮できる。
　印可する電流密度は、陰極の表面積に対して、１×１０－７～５×１０－５Ａ／ｄｍ２が好ましく、さらに好ましくは５×１０－８～１×１０－５Ａ／ｄｍ２である。この範囲であると、さらに均一な皮膜｛細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）からなる皮膜｝が形成され、皮膜の形成時間がさらに短縮できる。
　本発明の生体組織用細胞接着性材料に接着できる細胞としては、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞が含まれる。これらの細胞のうち、細胞接着性の観点から、動物細胞が好適であり、哺乳動物細胞が特に適している。哺乳動物としては、有袋目（カンガルー等）、霊長目（サル、チンパンジー及びヒト等）、齧歯目（リス、ネズミ及びヤマアラシ等）、鯨目（イルカ、シャチ及びクジラ等）、食肉目（イヌ、キツネ、クマ、ネコ、ライオン及びトラ等）、奇蹄目（ウマ、ロバ及びサイ等）及び偶蹄目（イノシシ、ブタ、ラクダ、シカ、ウシ、ヤギ及びヒツジ等）等の生物学辞典［岩波書店発行、１９６９年］に記載されている哺乳動物が挙げられる。哺乳動物のうち、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ及びブタが好ましく、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物細胞としては、例えば、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝実質細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞、歯髄細胞、エナメル芽細胞、象牙芽細胞、エナメル細胞及び象牙細胞）、及びこれらの幹細胞が挙げられる。これらの細胞のうち、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯、歯肉に関与する細胞（歯根膜細胞、歯肉上皮細胞及び骨芽細胞）、及びこれらの幹細胞（間葉系幹細胞及び胚性幹細胞等）が好ましい。
　生体組織用材料としては、金属や電気伝導性セラミックス等が挙げられる。金属としては、チタン、鉄、ステンレス鋼、ジルコニウム、タンタル、白金、金及びこれらを二種以上有する複合材料等が挙げられる（移植と人工臓器、岩波講座　現代医学の基礎１４、株式会社岩波書店発行及び特開平７－８８１７４号公報等）。複合材料としては、チタン合金（Ｔｉ－６Ａｌ－４Ｖ及びＴｉ－６Ａｌ－２Ｎｂ－１Ｔａ等）及びコバルトクロム合金等が挙げられる。また、電気伝導性セラミックスとしては、ホウ化チタン（ＴｉＢ２）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）及び導電性ジルコニア等が挙げられる。生体適合性の観点から、チタン及びチタン合金が好ましい。
　生体組織用材料の形状は、特に制限が無く、例えば、人工股関節の形状、人工膝関節の形状、人工歯根の形状、及び骨補・材料の形状など「移植と人工臓器（岩波講座　現代医学の基礎１４）、株式会社岩波書店発行」に記載の形状等が挙げられる。
　生体組織用材料の表面積｛細胞と接着し得る表面積｝（Ｍ）に対する細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が固定される面積（Ｎ）の比率｛（細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の被覆面積率）＝（Ｎ）×１００／（Ｍ）｝は、細胞接着性の観点から、５０～１００％が好ましく、さらに好ましくは８０～１００％である。
　細胞接着性人工ポリペプチド（Ｐ）の被覆面積率は、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）と抗体反応性を示す抗体を用いた免疫化学染色により、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が固定される面積（Ｎ）を求め｛写真撮影（株式会社ニコン製一眼レフカメラＤ７０、倍率１０倍）した画像を解析することにより求められる。｝、この面積（Ｎ）と生体組織用材料の表面積｛細胞と接着し得る表面積｝（Ｍ）とから算出される。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の結合量としては、生体組織用材料の表面積に基づいて、細胞接着性の観点から、０.１～１０００ｎｇ／ｍｍ２が好ましく、さらに好ましくは１～１００ｎｇ／ｍｍ２である。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の結合量は、生体組織用細胞接着性材料を酸溶液に浸漬し、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）をアミノ酸に加水分解した後、酸溶液中のアミノ酸の濃度（α）（ｍｏｌ／Ｌ）をＴＮＢＳ法（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸吸光光度法）により求めて、この濃度（α）と、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）１モルを構成するアミノ酸のモル数（β）と、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の分子量（γ）と、生体組織用材料の表面積｛細胞と接着し得る表面積｝（Ｍ）とから、式：（結合量）＝｛（α／β）×γ｝／Ｍにより算出される。
　本発明の生体組織用細胞接着性材料は、各種細胞との良好な接着性を有するので、様々な生体内で機能する医療用器具の材料として用いることができ、細胞接着性の観点から好ましくは人工臓器用基材、歯科用基材、整形外科用基材及び眼科用基材に用いることができる。
　本発明の生体組織用細胞接着性材料は、各種細胞との良好な接着性を有する生体組織用細胞接着性材料であるので、生体埋め込み用の医療用器具であるインプラント、骨固定剤、骨ケージ、歯科用インプラント、カテーテル、ガイドワイヤ、ステント、及び人工関節として好適である。
　以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
　特表平３－５０２９３５号公報（対応するＰＣＴ出願；ＷＯ９０／０５１７７号パンフレット；これに開示された開示内容を参照により本出願に取り込む。）中の実施例記載の方法に準じて、ＲＧＤ配列（１）の１３個と（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２２）の１２個とを有し、これらが交互に位置する構造を有する数平均分子量（Ｍｎ）約１１万のペプチド（２３）｛細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－０）｝を遺伝子組換え大腸菌により製造した。
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－０）５０ｍｇと塩酸Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルクロリド（特級試薬）１５０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに２０～４０℃で溶解した後、その溶液を２０～４０℃で攪拌しながら、水酸化ナトリウム（特級試薬）１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを４５～５０秒間かけて一定速度で滴下し仕込んだ。室温（２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を分画分子量１２，０００～１４，０００の透析膜を用いて、脱イオン水１０Ｌに対して４８時間透析した。なお、最初の１２時間は、4時間経過毎に脱イオン水を交換した。得られた水溶液を、－２０℃、０．１ｋＰａ以下の条件で、２４時間凍結乾燥して、水溶性の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）を得た。
　導入された塩酸Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルクロリドの数は、特表平１０－５００７０１公報（対応するＰＣＴ出願；ＷＯ９６／１６１６８号パンフレット；これに開示された開示内容を参照により本出願に取り込む。）中の実施例記載の方法に準じて、測定した結果、水溶性の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）１分子中に１２個であった。
　このようにして得た細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）が５μｇ／ｍｌとなるように０.９重量％塩化ナトリウム水溶液に溶解して得た水溶液３００ｍｌを、高さ２００ｍｍ、底面の内径１３５ｍｍのガラス製電解槽に入れた。そして、白金電極（棒状）を陽極とし、生体組織用材料（チタンプレート、１００ｍｍ×１００ｍｍ×０．１ｍｍの直方体）（ニラコ社製）を陰極としマグネチックスターラーで撹拌子を回転して水溶液を撹拌しながら、両極間に３．０Ｖの電圧を加えて１０分間通電し、電気化学反応を行った（電流密度３×１０－５Ａ／ｄｍ２、電極間距離５ｃｍ、水溶液の温度４℃）。
　通電を停止したのち、チタンプレートを脱イオン水５００ｍＬに浸漬し直ぐに取り出す洗浄操作を３回行い、次いで、６０℃の循風乾燥機の中で２時間乾燥し、チタン表面に細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）が固定された本発明の生体組織用細胞接着性材料（Ａ１）を得た。
　この生体組織用細胞接着性材料（Ａ１）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）の結合量を、公知のトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法｛生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）等｝により定量した結果、製造直後の結合量（Ｊ）は７０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜実施例２＞
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）を細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－０）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の生体組織用細胞接着性材料（Ａ２）を得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ａ２）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－０）の製造直後の結合量（Ｊ）は、７０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜実施例３＞
　塩酸Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルクロリド（特級試薬）をクロロ酢酸（特級試薬）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－２）を得た。細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－２）に導入されたクロロ酢酸の数は、１分子中に１２個であった。
　さらに細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）を細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－２）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の生体組織用細胞接着性材料（Ａ３）を得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ａ３）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－２）の製造直後の結合量（Ｊ）は、６０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜実施例４＞
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）をＲＧＤ配列の５個と（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（２４）の５個とを有しこれらが交互に位置する構造を有する数平均分子量（Ｍｎ）約２万のペプチド（Ｐ２－０）（特表平３－５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて調製した）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の生体組織用細胞接着性材料（Ａ４）を得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ａ４）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ２－０）の製造直後の結合量（Ｊ）は、６０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜実施例５＞
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－０）を細胞接着性人工ペプチド（Ｐ２－０）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ２－１）を得た。細胞接着性人工ペプチド（Ｐ２－１）に導入された塩酸Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルクロリドの数は、１分子中に６個であった。
　さらに細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）を細胞接着性人工ペプチド（Ｐ２－１）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の生体組織用細胞接着性材料（Ａ５）を得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ａ５）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ２－１）の製造直後の結合量（Ｊ）は、６０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜実施例６＞
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）をＹＩＧＳＲ配列（４）の５個と（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（２４）の５個とを有しこれらが交互に位置する構造を有する数平均分子量（Ｍｎ）約２万のペプチド（Ｐ３－０）（特表平３－５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて調製した）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の生体組織用細胞接着性材料（Ａ６）を得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ａ６）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ３－０）の製造直後の結合量（Ｊ）は、６０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜実施例７＞
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）をＩＫＶＡＶ配列（９）の５個と（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（２４）の５個とを有しこれらが交互に位置する構造を有する数平均分子量（Ｍｎ）約２万のペプチド（Ｐ４－０）（特表平３－５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて調製した）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、本発明の生体組織用細胞接着性材料（Ａ７）を得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ａ７）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ４－０）の製造直後の結合量（Ｊ）は、６０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜比較例１＞
　「両極間に３．０Ｖの電圧を加えて１０分間通電し、電気化学反応を行った」を実施しなかったこと以外、実施例１と同様にして、比較用の生体組織用細胞接着性材料（Ｂ１）を得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ｂ１）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）の製造直後の結合量（Ｊ）は、６０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜比較例２＞
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）と３－グリシドキシプロピルトリエトキシシラン各々２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作製し、これらを等量混合した溶液２００ｍＬ中に生体組織用材料（チタンプレート、１００ｍｍ×１００ｍｍ×０．１ｍｍの直方体）を浸漬し、２０～３０℃で２時間放置した。その後、チタンプレートを取り出し、脱イオン水２００ｍＬに浸漬し直ぐに取り出す洗浄操作を３回行い、次いで、６０℃の循風乾燥機の中で２時間乾燥して、比較用の生体組織用細胞接着性材料（Ｂ２）を得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ｂ２）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）の製造直後の結合量（Ｊ）は、９０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜比較例３＞
　「両極間に３．０Ｖの電圧を加えて１０分間通電し、電気化学反応を行った」を実施しなかったこと、及び細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）を細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－０）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、比較用の生体組織用細胞接着性材料（Ｂ３）得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ｂ３）に結合された細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）の製造直後の結合量（Ｊ）は、６０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜比較例４＞
　細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１－１）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に変更したこと以外、実施例１と同様にして、比較用の生体組織用細胞接着性材料（Ｂ４）得た。この生体組織用細胞接着性材料（Ｂ４）に結合されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の製造直後の結合量（Ｊ）は、５０ｎｇ／ｍｍ２であった。
＜評価１＞
　（チタンプレートと細胞接着性人工ペプチドの結合強度評価：超音波洗浄後の結合量）
　試験片｛生体組織用細胞接着性材料（Ａ１）～（Ａ７）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）｝を０.５重量％ドデシル硫酸ナトリウム（特級試薬）水溶液５００ｍＬに浸漬し、超音波洗浄器（テックジャム社製ＷＳ－６００－２８Ｓ、２８ｋＨｚ）内で１０分間超音波を加えた後、試験片を取り出し、脱イオン水５００ｍＬに浸漬し直ぐに取り出す洗浄操作を３回行い、次いで、６０℃の循風乾燥機の中で２時間乾燥した。試験片に結合している細胞接着性人工ペプチド又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合量を実施例１と同様にしてトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法により定量した。これらの結果を表１に示す。
＜評価２＞
　（歯肉上皮増殖試験評価）
　試験片｛生体組織用細胞接着性材料（Ａ１）～（Ａ７）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）を６×６ｍｍ×０．１ｍｍに切断した直方体｝を用いて、以下のようにして歯肉上皮増殖率（％）を求めた。
　ウサギ上顎頬側歯肉を生検トレパン（直径６ｍｍ）にて歯肉を取り除き、前歯側面を剥き出しにした後、剥き出しとなった前歯側面に試験片（６×６ｍｍ×０．１ｍｍ）を装着し、試験片の四隅に歯肉を被せて、試験片を固定した。
　試験片の固定直後に、試験片の６×６ｍｍの面に対して垂直方向から写真撮影（株式会社ニコン製一眼レフカメラＤ７０、倍率１０倍）して、得られた写真画像において露出している試験片の面積を測定した（面積Ｇ）。
　３日後、試験片を上記と同様に写真撮影して、得られた写真画像において露出している試験片の面積を測定した（面積Ｈ）。
　上記の測定した面積から、歯肉上皮増殖率（％）を下記式から算出し、結果を表１に示した。
　
歯肉上皮増殖率（％）＝〔１－（面積Ｈ／面積Ｇ）〕×１００
　
＜評価３＞
　（チタンプレートとウサギ上顎頬側歯肉との接着強度評価）
　試験片｛生体組織用細胞接着性材料（Ａ１）～（Ａ７）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）を４×８ｍｍ×０．１ｍｍに切断した直方体｝を用いて、以下のようにして接着強度を求めた。
　ウサギ上顎頬側歯肉にメスにて口側から喉側の方向に４ｍｍ程度の切れ込みを入れた後、この切れ込みに試験片（４×８ｍｍ×０．１ｍｍ）を前歯に平行になるようにして挿入した。
　８日後、試験片を挿入した上顎を摘出して、オートグラフ（島津製作所社製ＡＧ－５００）を使って、歯肉と試験片とを引っ張り試験し、最大引張強度（ＭＰａ）を測定した。これらの結果を表１に示す。
＜評価４＞
　（チタンプレートとラット上顎頬側歯肉との接着強度評価）
　試験片｛生体組織用細胞接着性材料（Ａ１）～（Ａ７）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）を４×０．１×０．１ｍｍに切断した立方体｝を用いて以下のようにして接着強度を求めた。
　ラット上顎頬側歯肉をメスにて剥ぎ取り、歯を露出させた後、露出させた歯にドリルで深さ４ｍｍ、１φｍｍの穴を空けた。この穴に試験片（４×０．１×０．１ｍｍ）を挿入した。
　８日後、試験片を挿入した上顎を摘出して、オートグラフ（島津製作所社製ＡＧ－５００）を使って、上顎と試験片とを引っ張り試験し、最大引張強度（ＭＰａ）を測定した。これらの結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　
　
　細胞接着性人工ペプチド又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の製造直後の結合量の測定結果＜評価１＞から、実施例１～７及び比較例１～３のすべてについて６０ｎｇ／ｍｍ２以上であり、細胞接着性人工ペプチドを用いた場合がＢＳＡを用いた場合（比較例４）よりもチタンプレートへの結合力が強いことが分かる。また、製造直後と超音波洗浄後の比較から、本発明の生体組織用細胞接着性材料（実施例１～７）及び比較用の生体組織用細胞接着性材料（比較例２及び４）は、浸漬接着させた生体組織用細胞接着性材料（比較例１及び３）よりも、細胞接着性人工ペプチド（またはＢＳＡ）が生体組織用材料に強固に結合していることが分かる。
　歯肉表皮増殖率の結果＜評価２＞から、本発明の生体組織用細胞接着性材料（実施例１～７）は、比較用の生体組織用細胞接着性材料（比較例１～４）よりも有意に歯肉上皮増殖率が高く、細胞増殖性に優れていることが分かる。さらに、最大引張強度の結果＜評価３、４＞から、ウサギ上顎頬側歯肉を使用した場合及びラット上顎頬側歯肉を使用した場合共に、本発明の生体組織用細胞接着性材料（実施例１～７）は、比較用の生体組織用細胞接着性材料（比較例１～４）よりも有意に最大引張強度が高く、生体組織用材料と細胞の接着性にも優れていることが分かる。
　以上の結果から、本発明の生体組織用細胞接着性材料は、生物活性を保持した細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が生物活性を維持した状態で多量に固定化され、細胞接着性、細胞増殖性及び組織接着性に優れた医用機器に適用できることが分かる。
　本発明の生体組織用細胞接着性材料は、細胞接着性、細胞増殖性及び生体組織との接着性に優れているため、インプラント、骨固定剤、骨ケージ、歯科用インプラント、カテーテル、ガイドワイヤ、ステント、及び人工関節のような医用機器として幅広く使用できる。

Claims (8)

  1. 細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が生体組織用材料の表面に電気化学反応により固定された生体組織用細胞接着性材料。
  2. 細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が、遺伝子組換微生物によって合成され、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ１）である請求項１に記載の生体組織用細胞接着性材料。
  3. ポリペプチド（Ｐ１）１分子中の細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）の数が３～５０個である請求項２に記載の生体組織用細胞接着性材料。
  4. 細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）が、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列（１）、ＬＤＶ配列（２）、ＲＥＤＶ配列（３）、ＹＩＧＳＲ配列（４）、ＰＤＳＧＲ配列（５）、ＲＹＶＶＬＰＲ配列（６）、ＬＧＴＩＰＧ配列（７）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列（８）、ＩＫＶＡＶ配列（９）、ＬＲＥ配列（１０）、ＤＧＥＡ配列（１１）及びＨＡＶ配列（１２）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列である請求項２又は３に記載の生体組織用細胞接着性材料。
  5. ポリペプチド（Ｐ１）が、さらにＧＡＧＡＧＳ（２１）で表されるアミノ酸配列を１分子中に少なくとも２個有してなる請求項２～４のいずれかに記載の生体組織用細胞接着性材料。
  6. 血管内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、神経細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞、腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞、メサンギウム細胞、上皮細胞、視細胞、角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、間質細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、歯根膜細胞及びこれらの幹細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞を接着させるために用いられる請求項１～５のいずれかに記載の生体組織用細胞接着性材料。
  7. 人工臓器用基材、歯科用基材、整形外科用基材又は眼科用基材に用いる請求項１～６のいずれかに記載の生体組織用細胞接着性材料。
  8. 請求項１～７のいずれかに記載された生体組織用細胞接着性材料から構成される医療用器具。
    　
    　
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