JPH10500701A

JPH10500701A - 水溶性を増大させるための繰返しポリマーの化学修飾

Info

Publication number: JPH10500701A
Application number: JP8516831A
Authority: JP
Inventors: ステッドロンスキー，アーウィン，アール．
Original assignee: プロテインポリマーテクノロジーズ，インコーポレイティド
Priority date: 1994-11-21
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 1998-01-20
Anticipated expiration: 2015-09-29
Also published as: AU3891595A; CA2205219A1; US5760004A; US6034220A; ATE301711T1; AU697605B2; DE69534373D1; WO1996016168A1; EP0792357B1; DE69534373T2; EP0792357A4; JP3121019B2; EP0792357A1

Abstract

(57)【要約】相対的に水に不溶性である高度に繰返しを有する蛋白質は、溶解度を増加させるように化学修飾される。その蛋白質は更なる極性官能性を導入し、その蛋白質の整列を破壊するように官能基化剤と反応させられる。その蛋白質の水溶性が化学修飾により増加され、他方接着及び界面活性剤特性は保持される。

Description

【発明の詳細な説明】水溶性を増大させるための繰返しポリマーの化学修飾導入技術分野本発明の分野は化学修飾された水溶性蛋白質ポリマーである。背景蛋白質ポリマーは種々のブロックサイズ及び質量比の繰返しドメインで合成されている。繰返しドメインの性質により、この類のポリマーはβ−プリーツシートの高度に整列された構造を形成し得る。一般に、ポリマー中のこのようなブロックの総数が増加するにつれ、ポリマーの溶解度は減少する。また、これらの合成された繰返し単位蛋白質の規則正しさは、その合成蛋白質ポリマーがそれから設計される天然の繰返し単位蛋白質より極めて大きい。最も極端な場合、ほぼ 1 00％の絹様ブロックからなる蛋白質は水に全く溶けない。ほとんどの主要なプラスチックは疎水性表面を有する。細胞培養及び免疫診断のような多くの適用のために、水性流体が湿るであろう親水性表面を有することが重要である。商業的に用いられる現在の処理は、表面上のイオン化可能化学基の形成、照射の条件下での酸化、又は表面上の界面活性剤の析出を引きおこすためのプラズマ処理を含む。多くのこのような適用のために、このような高度に整列した蛋白質ポリマーを水溶液から疎水性表面上に析出させることによりこのような蛋白質の界面活性剤及び接着剤特性を利用することが要求される。しかしながら、水に不溶性であるため、このような蛋白質ポリマーは85％超のギ酸のような強力に水素結合する溶媒を用いて、又は 4.5Ｍ過塩素酸リチウムもしくは臭化リチウムのようなホーフマイスター系列において高い塩の濃水溶液を用いて可溶化されなければならない。このような溶媒は毎日の使用に欠点がある。85％超のギ酸は優れた溶媒であり、十分に揮発するが、それは腐食性であり、その蒸気は有害である。塩水溶液を用いる場合、その塩残物は腐食性で有害である。先に記載されるもののような溶媒中に比較的高濃度の蛋白質ポリマーの保存溶液を調製することにより始め、次に希釈剤として水を用いて正確な作用濃度に希釈するコーティング過程を工夫することができるが、この試みは先に指摘される問題を解決しない。更にしばしば、これらの希釈された作用溶液は準安定であり、時間によりそれらの析出特性が変化する。現在の溶媒システムの有害かつ腐食性の化合物は高度に整列した構造を有する蛋白質ポリマーに関連するコーティング方法の設計を複雑にする。それゆえ、それらの水溶性を改善するためにこのような蛋白質ポリマーを修飾する方法を提供することはかなりの価値がある。関連文献組換え繰返しブロック蛋白質を作るための方法は、93年７月９日に発行された米国特許第 5,243,038号；及び国際出願 PCT／US89／05016 に記載される。発明の概要アミノ酸配列の繰返しブロックからなる水不溶性繰返し単位蛋白質の化学修飾による水溶性繰返し単位蛋白質の調製及び使用のための方法及び組成物を提供する。水中の蛋白質の溶解度はその蛋白質上の利用できる官能性との極性低分子量反応物の反応により増加される。その結果として生ずる生成物は水溶性であり、プラスチック上に被覆され得、強く接着し得、親の化合物中に存在する活性機能配列、特に生物機能配列を保持する。特定の実施形態の記載低い水溶性を有する蛋白質が、利用できる官能性に低分子量有機基を加えることにより化学修飾されることにより、水溶性であるが長期間の水性媒体の存在中でさえプラスチック表面に強く接着する生成物を作るための方法及び組成物を提供する。特に関心のものは小さな繰返し単位の広い伸縮性が蛋白質の主要部を含む高分子量蛋白質である。その蛋白質は典型的には約６kD超、通常約10kD超、好ましくは20kD超及び一般に約 250kD未満、通常約 150kD未満、更に通常は約 125kD未満である比較的高い分子量である。その蛋白質は、繰返し、即ちその個々の単位が一般に少くとも１のアミノ酸により分離された同じ単位内に少くとも２回現れる同じアミノ酸を通常有する３〜30アミノ酸（９〜90nt）、更に通常は３〜25アミノ酸（９〜75nt）、特に４〜15アミノ酸（12〜45nt）、更に特に４〜12アミノ酸（12〜36nt）を有するであろう繰返し単位からなるであろう。大部分は、天然の繰返し単位は約４〜８アミノ酸繰返し単位、特に４〜６アミノ酸単位であろう。異なるアミノ酸繰返し単位の組合成は一緒に連結されてブロックコポリマー又はかわりのブロックコポリマーを形成し得る。蛋白質は、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、及びアミノ、特にヒドロキシ又はスルフヒドリル基、例えばセリン、トレオニン、チロシン、システイン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む反応官能性を有する大きな割合の全アミノ酸を有するであろう。通常、アミノ酸の数の少くとも約２％、更に通常少くとも約５％、好ましくは少くとも約10％、そして通常約30％以下、更に通常約20％以下が蛋白質の官能基化に関連する反応官能体を有するだろう。必要に応じて、その反応性基はヒドロキシルであり、ここで官能基化に関連するヒドロキシル基は官能基化基、例えばオキシランと反応するチロシン及びスルトンと反応するセリンと共に種々であり得る。修飾のための適切な蛋白質は、高度に整列された、高度の伸長したβ及びβ− ターン構造を有する通常半結晶構造を有するだろう。脱イオン水中の蛋白質溶解度は周囲条件下で通常約 1.0mg／ml未満、更に通常は約 0.1mg／ml未満であろう。対象の化学修飾の後、溶解度は周囲条件下で少くとも約10mg／ml、更に通常は少くとも約 100mg／mlであろう。蛋白質は、官能基化試薬、例えばアルキル化剤又はアシル化剤との反応により修飾されよう。ここで単一の試薬又は試薬の組合せ、通常約３以下の試薬、更に通常は約２以下の試薬が用いられ得る。適切な試薬は、特にアミノとして１〜４置換基を有するカルコゲン（酸素及び硫黄）、及び窒素であろう１〜４ヘテロ原子を有する、アンモニオ以外について約２〜８、頻繁に２〜６炭素原子、通常２〜４炭素原子、及びアンモニオについて通常５〜８炭素原子のものであろう。官能性は２〜４、通常２〜３炭素原子のエポキシド、２〜８、通常２〜６炭素原子のアシル基（ここでアシル基は０〜２炭素原子の０〜２酸素原子を有し得る）、又は０〜４炭素原子のアミノ基、特にアンモニオ、３〜５炭素原子のラクトン、特に約３〜８炭素原子のスルホネートラクトン、並びに先に記載のように通常１〜３ヘテロ原子を有する置換されたアンモニオ以外について約２〜８炭素原子、通常２〜６炭素原子、好ましくは２〜３炭素原子を有する置換された活性オレフィン又は活性ハロゲンを含むだろう。結果として生ずる置換基は、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ジヒドロキシプロピル、ジヒドロキシブチル、カルボキシメチル、カルボキシエチル、シアノエチル、トリメチルアンモニオエチル、２−ヒドロキシ−４−ジメチルアンモニオブチル、スルホネートプロピル、トリメチルアンモニオアセチル及びメトキシアセチル等により表される。特に反応物は、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ヒドロキシプロピレンオキシド、エピクロロヒドリン、クロロ酢酸、トリエチルアンモニオエチルクロライド、トリメチルアンモニオプロピレンオキシド、アクリロニトリル、メタクリルアミド、ジメチルアミノエチルクロライドヒドロクロライド等を含む。その反応は、アミノ酸ヘテロ原子の保持を伴う試薬の炭素の求核置換により、特に塩基触媒求核置換により通常行われよう。最初のステップとして、蛋白質は、通常少くとも約２Ｍ濃度、更に通常少くとも 4.5Ｍにおいて、通常ホーフマイスター系列が両方とも高く、そのアニオンが官能基化試薬に実質的に不活性である濃塩水溶液を用いて、その反応がおこり得る適切な溶液中に溶解されよう。適切なホーフマイスター塩の例は過塩素酸リチウム及び硫酸カリウムである。塩基触媒反応のために、後に溶液のpHは有機反応物の性質により少くとも約９、更に通常少くとも約11、又は少くとも約10mMに上げられ得る。官能基化試薬は通常、特定の反応のための蛋白質組成物中の利用できる反応基に基づいて少くとも２倍モーラー過剰に、通常少くとも約10倍過剰に加えられるだろう。その反応は、少くとも約１％の反応性アミノ酸残基が修飾され、更に通常は少くとも約10％の反応性残基が修飾され、そして通常約80％以下、更に通常は約60％以下の反応性残基が修飾されるまで行われるだろう。室温において、その反応は約６時間、更に通常約３時間で完了するだろう。その反応はpHを約 7.0〜7.5 に下げることにより停止される。その修飾された蛋白質は慣用的方法により精製され得る。選択された条件により、いくらかの蛋白質のデグラデーションがおこり得る。過剰な濃度、例えば２Ｍ超、過剰な時間、例えば１時間超、特に高イオン強度、例えば２M LiClO₄超のために強塩基条件を用いることにより、蛋白質の分子量は約半分に削減され得る。それゆえ、反応条件を選択することにより、より低い又はほぼ同じ蛋白質の分子量＋反応物の付加的重量を有する生成物を供し得る。関心の蛋白質はエラスチン−、コラーゲン−、ケラチン−、及び絹様蛋白質、好ましくは合成蛋白質ポリマー、特に繰返し単位のブロック、一般に２〜50繰返し単位のブロックが化学的又は物理的活性、例えば基底膜蛋白質レセプターのためのリガンド、ホーミング蛋白質等のような細胞レセプター結合を有する約３〜 50、更に通常３〜35アミノ酸の配列により分離されている絹様蛋白質繰返し単位で設計された蛋白質のような構造蛋白質を含む。これらの蛋白質は、引用により本明細書に組み込まれる多数の繰返し単位蛋白質及び異なる介在配列が記載される米国特許出願第 609,716号及び 114,618号、並びに PCT／US87／02822 及び P CT／US89／05016 に記載されるようなRGDS配列（フィブロネクチン）、IKVAV配列（ラミニン）、システイン、リシン、アスパラギン酸、ヒスチジン等及び他の群を含む。そのポリペプチドは変異体及び融合生成物のような改良形態を含む天然、化学合成、又は組換え蛋白質であり得る。絹様蛋白質は繰返し単位としてGAGAGS（Ｇ＝グリシン；Ａ＝アラニン；Ｓ＝セリン）を有する。この繰返し単位は天然の絹フィブロイン蛋白質中に見い出される。そのＮ末端及びＣ末端は一般に約１〜125 アミノ酸、通常約１〜60アミノ酸、通常蛋白質の全アミノ酸の20％未満、更に通常は約10％未満、異なる配列であり得る。ほとんどの場合、末端配列においてアミノ酸の特定のパターンはないであろう。特に関心なのは、Bombyx mori の絹の組成及び物理特性に似た蛋白質である。一般に、異なる末端は融合蛋白質の発現を生ずる様式でのベクター内への遺伝子の挿入の結果であろう。生成物の要求される特性を妨害しないいすれの蛋白質も１又は両方の末端を供し得る。特に、内因性宿主蛋白質、例えばバクテリア蛋白質が用いられ得る。末端は本発明に重大でなく、主に便利さのためであるが、蛋白質の要求される特性を妨害しないべきであり、蛋白質分解性開裂のために設計され得る。特に関心なのは、通常、蛋白質の物理特性及び構造の改変を生ずるであろう３〜30アミノ酸の個々の繰返し単位から異なる内部の繰返しを含み得る約５〜160 アミノ酸、通常、８〜50アミノ酸の配列により通常分離される約２〜10、好ましくは約８〜９の個々の繰返し単位の塩基配列を有するモチーフである。例えば、フィブロイン様ポリマー内にエラスチンの繰返しを導入することにより、フィブロイン様ポリマーと比較してより大きな弾性及びフレキシビリティーを供し得る。これにより、それはその特性が個々の繰返し単位のホモポリマーの性質の間で種々であり得るブロックコポリマーを有し得る。塩基繰返し単位の総数は一般に、約50〜300、通常75〜250 の範囲内であろう。組換え技術及び後に記載される技術により調製された精製された絹様蛋白質の物理的測定により、Bombyx moriの結晶性領域のためのアンチ・パラレル鎖プリーツシート構造のモデルが確認される。円二色性（CD）及びフーリエ変換赤外（ FTIR）分光光度分析は、高い程度の伸びたＢ−及びＢ−ターン構造で一貫している。種々の溶媒中の天然の絹フィブロインのそれとの絹様蛋白質（先に示される特許文献に記載されるSlpIII）から得られたスペクトルの比較は、溶液中のSlpIIIが絹フィブロインで見られるランダム及び高度に整列した構造の混合物からなることを示す。（先に示される特許文献においてSLPF又は FCB−SLP 蛋白質とし .，San Diego，CAとして販売される）介在RGDS配列を含む絹様蛋白質は強力な接着特性を有することを特徴とする。プラスチック又はガラス表面、例えばポリスチレン、Bioglas、ポリアクリレート等、特に熱成形及び押出プラスチックを被覆することにより、長期間、例えば30日間にわたり、更に細胞培養において安定である強く接着したコーティングが得られる。修飾した後、先に同定されるような接着特性は実質的に変わらない。蛋白質化合物はその塩含量が１Ｍ以下、通常約 0.5Ｍ以下であり、脱イオン水であり得る水溶液として供され得る。通常、蛋白質化合物は少くとも約 0.001重量％で、0.01重量％以上で、そして通常約90重量％以下で水溶液中に存在し得、少くとも約10重量％の濃度として、又はその意図された目的に適した他の構成物との組成物としてコーティング又は他の目的のために直接用いるための溶液として供され得る。溶液中の蛋白質の特定の濃度は、蛋白質の性質、その溶解度、意図される適用及び溶液中の他の構成物等の性質によるだろう。例えば、プラスチック基体上への生物機能性蛋白質のコーティングは極めて低い濃度で行われ得るが、繊維のスピニングのための溶液は高度に濃縮されるだろう。修飾蛋白質はプラスチック表面を被覆するのに特に役立つ。水溶性の増加は、先に用いられた溶媒の危険性について考慮することなく種々の便利な適用の方法が用いられ得る非毒性溶媒系においてコーティング手順が行われることを許容する。生きている細胞又は組織との接触に多数の適用があるので、生物適合性プラスチックが特に好ましい。生物適合性プラスチックは典型的には非毒性で生化学的に不活性である。典型的な生物適合性プラスチックはポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン（シリコーンゴム）、ポリジオキサノン、ポリエーテルウレタン、ポリエチレン及びポリエチレンテレフタレート、ポリグリコール酸及びポリ乳酸並びにPLGA コポリマー、ポリスチレン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（HEMA）、ポリメチルメタクリレート（acrylic）、ポリビニルクロライド（PVC）等を含む。プラスチック基体は多くの形態をとり得る。そのプラスチック基体は、例えば細胞が増殖し得る研究用製品、例えばペトリ皿、培養ボトル、エーレンマイヤーフラスコ、スライド、ローラーボトル、マルチウェルプレート、又は接着性コーティングが要求される他の研究用製品；その装置の裸のプラスチック表面が不利な生理的応答を引きおこし得る生体内に導入される装置のような接着性蛋白質コーティングが要求される装置；並びに材料の表面の特徴を改良することが望まれる繊維もしくはフィルム等であり得る。その溶液は、塗ること、スプレーすること、浸すこと、又は漬けることによりその表面に適用され得る。安定剤、緩衝剤、界面活性剤又は展着剤等のような添加物が溶液中に含まれ得る。それは全体で一般に、その溶液の約５重量％未満、一般にその溶液の約１重量％未満で存在する。以下の実施例は詳説するために供され、限定のためではない。実験ポリマー及びそれらの調製物の名前は米国特許第 5,243,038号及び1990年11月６日に出願された出願番号07／609,716 号による。ヒドロキシプロピル化SLPF an Diego，CA）（100mg）を水中 4.5Ｍ過塩素酸リチウム 5.0ml中に溶かした。固体NaOH（19mg）を室温で撹拌しながらその混合物中に溶かした。プロピレンオキシド（600μｌ）を各々 300μｌの２つの部分に加え、各々加えた後に２時間、室温で撹拌した。その反応混合物を45mlの水中に注ぎ、希塩酸水溶液を用いて pH 7.0〜7.5 まで中和した。その混合物を 13kDaカットオフセルロース膜（Spec trum Medical Devices）を用いて脱イオン水に対して24時間、透析した。少量の沈殿物（4.8mg）を風袋を計ったろ紙を通すろ過により除去した。残った極めて少量の曇ったものを、Celite 545のパッドを通してのろ過により除去してpH 6.5 の透明な溶液を生成した。この溶液を約10mlまでロータリーエバポレーターで濃縮し、その後 13kDaカットオフセルロース膜を用いて24時間脱イオン水に対して再び透析した。透析バッグの成分を 100ml西洋ナシ形状のフラスコ内にシェル凍結し、25℃で 75mTorrの最終圧に凍結乾燥した。白色けば状繊維状固体（42.8mg ）を回収した。この材料をHP−PnF とし、脱イオン水中に直ちに溶けることを観察した。この材料のゲル電気泳動は、開始材料のほぼ半分の分子量に移動する一セットのバンドを示し、これは、化学反応の間におこる分子当り約１の加水分解性鎖切断を示す。HP−PnF に対する絹フィブロイン抗体の反応性は、ゲル上の展開したバンドの強度及びゲルに適用された蛋白質サンプルの周知の質量から判断してネイティブSLPFのより弱い強度であることが観察された。ヒドロキシプロピル化SLP3.0 粗SLP3.0(100mg)を 4.5Ｍ過塩素酸リチウム 4.5ml中にスラリー化し、室温で2 4時間、撹拌して粘性溶液中茶色の粒子懸濁液を生成した。Celite 454（50mg）を加え、撹拌して遠心し、茶色のペレット（約 0.3ml 容量）に成形し、透明な上清溶液を供した。その上清をデカントした。その上清に、4.5モーラーの過塩素酸リチウム溶液0.50ml中に溶かされたNaOH（20mg）を加えた。１部分にプロピレンオキシド（300μｌ）を加え、その混合物を35℃で６時間、撹拌した。プロピレンオキシドの第２の部分（300μｌ）を加え、その混合物を２時間、撹拌した。水（5.0ml）を加え、次にその反応混合物を希塩酸水溶液でpH７に中和した。その溶液を脱イオン水に対して48時間、13kDaカットオフセルロース膜を通して透析した。その生成溶液中の少しの曇りを遠心により除去して透明な上清及びペレット（約0.2ml）を生成した。その上清をシェル凍結して25℃で 75mTorrの最終圧に凍結乾燥して白色けば状材料（39mg）を生成した。この材料をHP−SLP3.0とし、脱イオン水中に直ちに溶解されることを観察した。この材料のゲル電気泳動は、開始材料の分子量の約半分だけ移動する一セットのバンドを示した。これは、分子当り１の加水分解性鎖切断を示す。HP−SLP3.0 に対する絹フィブロイン抗体の反応性は、ゲル上の展開したバンドの強度及びゲルに適用された蛋白質サンプルの周知の質量から判断してネイティブSLP3.0のそれより弱い強度であることが観察された。ジメチルアミノエチル化SLP3 粗SLP3.0(1.0ｇ)を16時間、4.5M LiClO₄25mlと共に撹拌した。溶けていない懸濁された固体を、20分間、15,000rpmでのS534ローターを用いる遠心により除去した。明るい黄色の透明な上清（23.5ml）を回収して次に用いた。ジメチルアミノエチルクロライド・HCl(0.72ｇ、５mMole)及び水酸化ナトリウム(0.40ｇ、10m Mole)の４部を加え、各々の部を加えた後、撹拌した。酢酸（1140μｌ）を加えてpH 6.5に調節した。その中和された溶液を 13kDaカットオフ透析バッグ内に入れ、24時間、脱イオン水に対して透析した。その保持物をブフナー漏斗上のCe lite 545のパッドを通してろ過し、ロータリーエバポレーター上で濃縮し、脱イオン水に対して24時間、13kDaカットオフ透析バッグを通して透析した。その保持物をシェル凍結し、凍結乾燥して39.5mgの白色生成物を生成した。この材料を DMA−SLP3.0とし、脱イオン水中で直ちに溶解されることが観察された。スルホプロピル化SLP3 粗SLP3.0（1.0ｇ）を16時間、25mlの 4.5M LiClO₄と共に撹拌した。溶けていない懸濁された固体を20分間、15,000rpmでのS534ローターを用いる遠心により除去した。明るい黄色の透明な上清（23.5ml）を回収して次に用いた。プロパンスルトン(1.22ｇ；876μｌ；10mMole)及び水酸化ナトリウム(0.40ｇ、10mMole) を加え、その後30分、撹拌した。酢酸（600μｌ）を加えてpH 6.5に調節した。その中和した溶液を 13kDaカットオフ透析バッグに入れ、脱イオン水に対して24 時間、透析した。その保持物をブフナー漏斗上でCelite 545のパッドを通してろ過し、ロータリーエバポレーター上で濃縮し、脱イオン水に対して 13kDaカットオフ透析バッグを通して、24時間、透析した。その保持物をシェル凍結して凍結乾燥して 160mgの白色生成物を生成した。この材料をSP−SLP3.0とし、脱イオン水中で直ちに溶けることが観察された。スルホプロピル化SLPF SLPF(103mg)及び 4.5モーラー過塩素酸リチウム水溶液 3.0mlをゴム隔壁キャップを備えた10mlエーレンマイヤーフラスコに加え、マグネチック・スターラーにより撹拌した。上部空き高を窒素でパージして、周囲温度で撹拌を開始した。 2.0mlのテトラヒドロフランに溶かされたプロパンスルトンを一部に加えて均一な混合物を生成した。次に 4.5モーラー過塩素酸リチウム水溶液中に溶かされた水酸化ナトリウムの溶液(1 .0ml)を0.019ml／分の速度でシリンジポンプにより加えた。更に30分、撹拌した後、水(1.0ml)中の酢酸（60mg）の溶液を一部に加えた。その反応混合物を 13kD aカットオフ透析バッグに移して、脱イオン水15Ｌに対して24時間、透析した。その水を置換して透析を更に24時間続けた。その保持物をシェル凍結して凍結乾燥し、90mgの白色生成物を生成した。この材料をSP−SLPFとし、脱イオン水中で直ちに溶解されることを観察した。ジメチルアミノエチル化SLPF SLPF(103mg)、ジメチルアミノエチルクロライドヒドロクロライド(360mg)、及び 4.5モーラー過塩素酸リチウム水溶液 3.0mlをゴム隔壁キャップを備えた10ml エーレンマイヤーフラスコに加え、マグネチックスターラーにより撹拌した。上部空き高を窒素でパージし、周囲温度で撹拌を開始した。次に 4.5モーラー過塩素酸リチウム水溶液（2.65ml）中に溶かされた水酸化ナトリウム(200mg)の溶液を 0.174ml／分の速度でシリンジポンプにより加えた。更に60分、撹拌した後、酢酸を用いてpH 6.0〜6.5 に調節し、その反応混合物を 13kDaカットオフ透析バッグに移し、脱イオン水15Ｌに対して24時間、透析した。その保持物をシェル凍結して凍結乾燥して63mgの白色生成物を生成した。この材料を DMA−SLPFとして、脱イオン水中で直ちに溶解することを観察した。アミノ酸組成得られた蛋白質ポリマーのアミノ酸組成をHenrickson and Meredith(1984)の PTC誘導体化手順により決定した。蛋白質サンプルを真空下で24時間、108℃で 5 .7Ｎ沸騰中塩酸で加水分解した。PITCとの反応の後、移動相として 0.1モーラー酢酸アンモニウムpH6.78 中の０〜50％アセトニトリルの直線勾配でのHeulett Packard 1090システム及び Supelco C18カラム(4.6mm×25cm)を用いるHPLC逆相クロマトグラフィーにより 254nmにおいてアミノ酸誘導体を検出した(Henrickson，R.L．and Meredith，S.C ．（1984）Amino Analysis by Reverse Phase High Performance Liquid Chroma tography，Anal.Biochem ．137：65〜74)。これらの分析の標準化した結果を、HP −PnF、HP−SLP3.0、DMA−SLP3.0、SP−SLP3.0、及びSP−PnF各々について表１〜５に示す。 SP−SLP3.0及びSP−PnF の場合、蛋白質の要素組成の機械的分析及び窒素に対する硫黄のモル比の計算によりアミノ酸の欠損が証明され得る。SLP3.0及びSLPF の両方の分子は最初は硫黄が全くないが、各々の官能基化で単一の３−スルホプロピル成分が導入される。これにより窒素に対する硫黄のモル比は官能基化反応の程度の基準である。 SP−SLP3.0において観察されたアミノ酸の欠損から、Ｓ／Ｎ＝0.120 の比率が予測される。この官能基化蛋白質の要素組成の微小分析からＳ／Ｎ＝0.119 の比率が測定される。SP−PnF において観察されたアミノ酸の欠損から、Ｓ／Ｎ＝0. 042 の比率が予測される。官能基化蛋白質の要素組成の微小分析から、Ｓ／Ｎ＝ 0.034 の比率が測定される。これにより要素組成及びアミノ酸組成に基づくデータは互いに一貫している。表１〜５のデータは絹様領域を含むこれらの蛋白質ポリマーの絹フィブロイン領域（GAGAGS）を作るアミノ酸に焦点がある。全ての場合において、標準化された比率はＬ−セリンの減少を示す。このような結果は、側鎖ヒドロキシル上の反応を通して、種々のエーテル化反応の最初の部位としてのＬ−セリン残基を意味する。修飾蛋白質ポリマー中のＬ−セリンのＯ−アルキル化残基はアミノ酸の後ろを加水分解するが、アミノ酸組成分析の酸加水分解ステップの条件下でネイティブＬ−セリンの後ろを開裂しないと予想される。これにより、修飾蛋白質ポリマー中で観察されたＬ−セリンの絶対含量は観察されるように削減されよう。この組成データに基づいて、官能基化は９％〜58％のＬ−セリン残基上でおこる。絹フィブロインに対する抗体の反応性はGAGAGSエピトープの認識による。このエピトープ内の最も顕著な化学基、即ちＬ−セリン上のヒドロキシル側鎖において化学修飾がおこるなら、減少された抗体との反応性が予想される。定性的に、このように減少された抗体との反応性は HP−PnF 及びHP−SLP3.0の場合に観察される。 HP−PnF で被覆されたポリスチレン上のベロ細胞の付着界面活性剤活性及び細胞付着活性に関するHP−PnF の適格性を判断するため、 96ウェルのマルチウェルポリスチレン組織培養プレート上で細胞付着アッセイを行った。このアッセイにおいて、4.5モーラー過塩素酸リチウム中に 1.0mg／ml でProNectin F（PnF）を作り、最終的なコーティング濃度までリン酸緩衝塩類溶液で連続的に希釈した。脱イオン水中にHP−PnF を形成し、脱イオン水で連続的に希釈した。各々の希釈液をプレート上の８ウェルの１つのレーンに適用した。ブロッキング、細胞の接種、インキュベーション、固定化、及びアミドブルーブラック染料での染色は全て標準的プロトコルに従って行った。相対的な細胞数を 495nmにおいて分光光度で測定した。この細胞付着アッセイの結果を表６に示す。 SP−PnF で被覆されたポリスチレンへのVERO細胞の付着界面活性剤活性及び細胞付着活性に関するSP−PnF の適格性を判断するために、96ウェルのマルチウェルポリスチレン組織培養プレート上で細胞付着アッセイを行った。このアッセイにおいて、4.5モーラー過塩素酸リチウム中に1.0mg／ml でProNectin Fを作り、10μｇ／mlの最終コーティング濃度までリン酸緩衝塩類溶液で連続的に希釈し、次に８ウェルの最初のレーンに適用した。SP−PnF を１ mg／mlで脱イオン水中に溶かし、10μｇ／ml、1.0μｇ／ml、及び0.10μｇ／ml の最終コーティング濃度まで希釈した。各々の希釈液をプレート上の８ウェルの２つのレーンに適用した。ブロッキング、細胞の接種、インキュベーション、固定化、及びアミドブルーブラック染料での染色は全て標準的プロトコルに従って行った。相対的な細胞数を 495nmにおいて分光光度により測定した。このアッセイの結果を表７に示す。 DMA−PnF で被覆されたポリスチレンへのVERO細胞の付着界面活性剤活性及び細胞付着活性に関するDMA-PnF の適格性を判断するために、96ウェルのマルチウェルポリスチレン組織培養プレート上で細胞付着アッセイを行った。このアッセイにおいて、4.5モーラー過塩素酸リチウム中に 1.0mg／mlで ProNectin Fを作り、10μｇ／mlの最終コーティング濃度までリン酸緩衝塩類溶液で連続的に希釈し、８ウェルの最初のレーンに適用した。DMA−PnF を１mg／mlで脱イオン水中に溶かし、10μｇ／ml、1.0μ ｇ／ml及び0.10μｇ／mlの最終コーティング濃度に希釈した。各々の希釈液をプレート上の８ウェルの１つのレーンに適用した。ブロッキング、細胞の接種、インキュベーション、固定化、及びアミドブルーブラック染料での染色は全て標準的プロトコルに従って行った。相対的な細胞数を 495nmにおいて分光光度で測定した。このアッセイの結果を表８に示す。データは、HP-PnF が界面活性剤及び細胞付着表面調節剤の両方としてその活性を保持することを示す。更に、ヒドロキシプロピル化はいずれの急性の毒性も引きおこさない。ヒドロキシプロピル化ポリマーは哺乳動物細胞培養の目的のためにポリスチレンをコーティングするための利用性を示す。その改良はそれを他の目的、例えばポリプロピレン繊維上への析出に適したものとする。本方法が蛋白質の接着特性を減少させることなく高度に繰返しのある整列した蛋白質の水溶性を増加させることは供されるデータから明らかである。修飾後、蛋白質は水に可溶化され得、毒性溶液中に溶かす必要なしに生物学的目的のためにプラスチック表面を被覆するのに用いられ得る。本明細書に言及される全ての出版物及び特許出願は、各々の個々の出版物又は特許出願が詳細かつ個々に引用により組み込まれて示されるのと同じ程度まで本明細書に引用により組み込まれる。本発明は十分に記載されているが、添付の請求の範囲の要旨及び範囲から離れることなく多くの変換及び改良がそれに行われ得ることは当業者に明らかであろう。

【手続補正書】【提出日】１９９７年６月２０日【補正内容】請求の範囲１．官能性を含む反応性ヘテロ原子を有する天然のアミノ酸を含む水不溶性の少くとも部分的に結晶性の繰返し単位前駆蛋白質から水溶性蛋白質を調製する方法であって、該方法が、前記前駆蛋白質を有機溶媒、高塩濃度水溶液、又はそれらの組合せ中に溶かして反応溶液を供するステップと、前記反応溶液に、有機反応物を、該有機反応物の、前記ヘテロ原子を保持する前記官能性との反応のための条件下で加えて、少くとも１の極性の更なるヘテロ原子を供し、それにより前記アミノ酸の少くとも１％が官能基化されるステップと、それにより前記水溶性蛋白質が作られるステップと、を含むことを特徴とする方法。２．前記溶液が高イオン強度水溶液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記溶液がリチウム塩中少くとも２Ｍであり、前記条件が少くとも９のpH であることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記有機反応物が２〜５炭素原子のエポキシドであることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記繰返し単位がフィブロイン繰返し単位であることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．繰返し単位のメンバーとしてセリン又はトレオニンを含む水不溶性の少くとも部分的に結晶性のフィブロイン繰返し単位前駆蛋白質から水溶性蛋白質を調製する方法であって、該方法が、前記前駆蛋白質を高塩濃度塩基性水溶液中に溶かして反応溶液を供するステップと、前記反応溶液に２〜５炭素原子のエポキシドを加え、それにより前記アミノ酸の少くとも１％を官能基化して前記水溶性蛋白質を供するステップと、を含むことを特徴とする方法。７．前記水溶液がリチウム塩中少くとも２Ｍであり、少くとも約10mMのヒドロキシド濃度を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。８．前記前駆蛋白質が、細胞結合性配列を含む介在基を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。９．繰返し単位中にセリン又はトレオニンを含む水溶性の少くとも部分的に結晶性の繰返し単位前駆蛋白質から水溶性蛋白質を調製する方法であって、該方法が、前記前駆蛋白質を塩基性高塩濃度水溶液中に溶かして反応溶液を供するステップと、前記反応溶液に、有機反応物を、該有機反応物の、ヘテロ原子を保持する官能性との反応のための条件下で加えて、ヒドロキシル、スルホネート、及びアンモニオからなる群から選択される少くとも１の極性の更なるヘテロ原子官能性を供し、それにより前記アミノ酸の少くとも１％が官能基化されるステップと、それにより前記水溶性蛋白質が作られるステップと、を含むことを特徴とする方法。 10．前記更なるヘテロ原子官能性がヒドロキシルであり、前記反応物が２〜４炭素原子のエポキシドであることを特徴とする請求項９に記載の方法。 11．前記更なるヘテロ原子官能性がスルホネートであり、前記反応物が３〜８炭素原子のスルトンであることを特徴とする請求項９に記載の方法。 12．前記更なるヘテロ原子官能性が４〜８炭素原子のアンモニオであることを特徴とする請求項９に記載の方法。 13．少くとも６kDの水溶性繰返し単位蛋白質化合物であって、前記繰返し単位が３〜30アミノ酸であり、極性基で置換された２〜８炭素原子のアルキル基にその少くとも１％が結合した官能性を含む化学反応性ヘテロ原子を含む少くとも１のアミノ酸を含むことを特徴とする水溶性繰返し単位蛋白質化合物。 14．前記繰返し単位が約４〜10アミノ酸であり、セリン又はトレオニンを含み、前記極性基がヒドロキシルであることを特徴とする請求項13に記載の蛋白質化合物。 15．前記極性基がアンモニオであることを特徴とする請求項13に記載の蛋白質化合物。 16．前記極性基が酸性であることを特徴とする請求項13に記載の蛋白質化合物。 17．少くとも６kDの水溶性フィブロイン繰返し単位蛋白質であって、該繰返し単位が、その少くとも約１％が極性基で置換された２〜８炭素原子のアルキル基に結合したセリンを含むことを特徴とする水溶性フィブロイン繰返し単位蛋白質化合物。 18．前記極性基がヒドロキシル、スルホネート及びアンモニオからなる群から選択されることを特徴とする請求項17に記載の蛋白質化合物。 19．前記繰返し単位が生理的に活性な配列を含む介在配列を有することを特徴とする請求項17に記載の蛋白質化合物。 20．前記生理的に活性な配列がRGDSを含むことを特徴とする請求項19に記載の蛋白質化合物。 21．配列GAGAGSの繰返し単位を含み、RGDSを含む介在配列を有し、極性基で置換された２〜８炭素原子のアルキル基でアルキル化された少くとも約１％のセリン基を有する少くとも約10kDの水溶性蛋白質化合物であって、前記極性基がヒドロキシ、スルホネート、及びアンモニオからなる群から選択されることを特徴とする水溶性蛋白質化合物。 22．請求項13に記載の蛋白質化合物の被覆を含む固状基体。 23．請求項17に記載の蛋白質化合物の被覆を含む固状基体。 24．請求項21に記載の蛋白質化合物の被覆を含む固状基体。 25．前記極性基がヒドロキシルであることを特徴とする請求項24に記載の蛋白質化合物の被覆を含む固状基体。 26．約１Ｍ未満の塩濃度を有し、少くとも0.01重量％の請求項13に記載の蛋白質化合物を有する水溶液。

Claims

【特許請求の範囲】１．官能性を含む反応性ヘテロ原子を有する天然のアミノ酸を含む水不溶性の少くとも部分的に結晶性の繰返し単位前駆蛋白質から水溶性蛋白質を調製する方法であって、該方法が、前記前駆蛋白質を有機溶媒、高塩濃度水溶液、又はそれらの組合せ中に溶かして反応溶液を供するステップと、前記反応溶液に、有機反応物を、該有機反応物の、前記ヘテロ原子を保持する前記官能性との反応のための条件下で加えて少くとも１の極性の更なるヘテロ原子を供し、それにより前記アミノ酸の少くとも１％が官能基化されるステップと、それにより前記水溶性蛋白質が作られるステップと、を含むことを特徴とする方法。２．前記溶液が高イオン強度水溶液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記溶液がリチウム塩中少くとも２Ｍであり、前記条件が少くとも９のpH であることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記有機反応物が２〜５炭素原子のエポキシドであることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記繰返し単位がフィブロイン繰返し単位であることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．繰返し単位のメンバーとしてセリン又はトレオニンを含む水不溶性の少くとも部分的に結晶性のフィブロイン繰返し単位前駆蛋白質から水溶性蛋白質を調製する方法であって、該方法が、前記前駆蛋白質を高塩濃度塩基性水溶液中に溶かして反応溶液を供するステップと、前記反応溶液に２〜５炭素原子のエポキシドを加え、それにより前記アミノ酸の少くとも１％を官能基化して前記水溶性蛋白質を供するステップと、を含むことを特徴とする方法。７．前記水溶液がリチウム塩中少くとも２Ｍであり、少くとも約10mMのヒドロキシド濃度を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。８．前記前駆蛋白質が、細胞結合性配列を含む介在基を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。９．繰返し単位中にセリン又はトレオニンを含む水溶性の少くとも部分的に結晶性の繰返し単位前駆蛋白質から水溶性蛋白質を調製する方法であって、該方法が、前記前駆蛋白質を塩基性高塩濃度水溶液中に溶かして反応溶液を供するステップと、前記反応溶液に、有機反応物を、該有機反応物の、ヘテロ原子を保持する官能性との反応のための条件下で加えて、ヒドロキシル、スルホネート、及びアンモニオからなる群から選択される少くとも１の極性の更なるヘテロ原子官能性を供し、それにより前記アミノ酸の少くとも１％が官能基化されるステップと、それにより前記水溶性蛋白質が作られるステップと、を含むことを特徴とする方法。 10．前記更なるヘテロ原子官能性がヒドロキシルであり、前記反応物が２〜４炭素原子のエポキシドであることを特徴とする請求項９に記載の方法。 11．前記更なるヘテロ原子官能性がスルホネートであり、前記反応物が３〜８炭素原子のスルトンであることを特徴とする請求項９に記載の方法。 12．前記更なるヘテロ原子官能性が４〜８炭素原子のアンモニオであることを特徴とする請求項９に記載の方法。 13．少くとも６kDの水溶性繰返し単位蛋白質化合物であって、前記繰返し単位が３〜30アミノ酸であり、極性基で置換された２〜８炭素原子のアルキル基にその少くとも１％が結合した官能性を含む化学反応性ヘテロ原子を含む少くとも１のアミノ酸を含むことを特徴とする水溶性繰返し単位蛋白質化合物。 14．前記繰返し単位が約４〜10アミノ酸であり、セリン又はトレオニンを含み、前記極性基がヒドロキシであることを特徴とする請求項13に記載の蛋白質化合物。 15．前記極性基がアンモニオであることを特徴とする請求項13に記載の蛋白質化合物。 16．前記極性基が酸性であることを特徴とする請求項13に記載の蛋白質化合物。 17．少くとも６kDの水溶性フィブロイン繰返し単位蛋白質であって、該繰返し単位が、その少くとも約１％が極性基で置換された２〜８炭素原子のアルキル基に結合したセリンを含むことを特徴とする水溶性フィブロイン繰返し単位蛋白質化合物。 18．前記極性基がヒドロキシル、スルホネート及びアンモニオからなる群から選択されることを特徴とする請求項17に記載の蛋白質化合物。 19．前記繰返し単位が生理的に活性な配列を含む介在配列を有することを特徴とする請求項17に記載の蛋白質化合物。 20．前記生理的に活性な配列がRGDSを含むことを特徴とする請求項19に記載の蛋白質化合物。 21．配列GAGAGSの繰返し単位を含み、RGDSを含む介在配列を有し、極性基で置換された２〜８炭素原子のアルキル基でアルキル化された少くとも約１％のセリン基を有する少くとも10kDの水溶性蛋白質化合物であって、前記極性基がヒドロキシ、スルホネート、及びアンモニオからなる群から選択されることを特徴とする水溶性蛋白質化合物。 22．請求項13に記載の蛋白質化合物の被覆を含む固状基体。 23．請求項13に記載の蛋白質化合物の被覆を含む固状基体。 24．請求項21に記載の蛋白質化合物の被覆を含む固状基体。 25．前記極性基がヒドロキシルであることを特徴とする請求項24に記載の蛋白質化合物の被覆を含む固状基体。 26．約１Ｍ未満の塩濃度を有し、少くとも0.01重量％の請求項13に記載の蛋白質化合物を有する水溶液。