JPH02145600A - ヒアルロン酸固定化蛋白質及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒアルロン酸固定化蛋白質及びその製造方法に
関し、特に保湿性、粘弾性、生体適合性及び生理活性を
具備するヒアルロン酸固定化蛋白質及びその製造方法に
関する。

本発明のヒアルロン酸固定化蛋白霊、皮膚保護剤、機能
性化粧品等に利用される。

〔従来技術〕

ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミンが交互に浩合した高分子量の多ｌ！類で
あり、動物の組ＶＩＡ牢に広く分布している。そして動
物の組織中ではこのヒアルロン酸は高い保水性により組
織水の重要な支持物質として作用し、また水和したヒア
ルロン酸は、高い粘弾性により潤滑物質としても作用し
、常に重要な役割をはたしている。

従来、ヒアルロン酸は上述の性質により例えば化粧品の
保湿剤として使用されているが、近年ではヒアルロン酸
に対する研究がさらに進み、その薬理作用が解明される
につれて、眼科用治療薬や関節炎治療薬等としての利用
が図られつつある。

さらにこのようなヒアルロン酸の性質を保ちつつ、これ
を化学的に変性してその安定性を向上させ、さらに付加
価値を与える研究も進められている。

例えば、特開昭６２−６４８０２号公報には、ヒアルロ
ン酸中のＣ０ＯＨ基に各種アルコールを反応させてエス
テルとしたものは薬理作用を有し、またフィルム状、糸
状、スポンジ状等に成形して利用し得ることが報告され
ており、特開昭６１−１３８６０１号公報にはヒアルロ
ン酸と他の水溶性ポリマー（コラーゲン、エラスチン、
アルブミン、グロブリン等の各種の蛋白質を含む。）を
ジビニルスルホンを用いて架橋してヒアルロン酸含有ゲ
ルを生成させ、これを医薬用剤、化粧品用剤などとして
利用し得ることが報告されている。

一方、「バイオテクノロジー事典」　（昭和６２年、シ
ーエムシー社刊行）中には、生体の保護材料（例えば人
工皮膚など）として乾燥豚皮、シリコーン−ナイロン−
コラーゲン複合体、コラーゲン不織布、セファデックス
（デキストランをエピクロルヒドリンで架橋させたポリ
マー）などが使用されることが記載されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これらを用いた皮膚欠損部の保護材料は
水分透過性の調節が難しく、これを実際に使用した場合
、過剰な水分の蒸散により皮膚に脱水症状が生じたり、
また水分の蒸散の不足により保護材料の下部に患部の浸
出液がたまるなど種々の問題を生起することがあった。

このように上記の保護材料は生体との親和性に劣り、新
生した皮膚と一体にならないばかりか、新生した皮膚を
傷めてしまうという問題があった。

さらに保護材料の形状としては、蛋白質系物質の膜状体
ばかりではなく、繊維を織った布状体としても使用する
と通気性が向上するが、いずれの場合も同様な問題があ
り、またこの蛋白質材料を化粧品に応用する場合も、皮
膚への親和性や保水性に関する問題があり、共にこの−
ような問題のない新規な材料の出現が期待されていた。

〔課題解決の手段〕

本発明は上記問題を解決することを目的とし、その構成
は、第１の発明は、蛋白質に、ヒアルロン酸がシアヌー
ル酸類の残基を介して固定化されていることを特徴とし
、第２の発明は、蛋白質にヒアルロン酸を反応させるヒ
アルロン酸固定化蛋白質の゛製造方法において、ｐＨ３
以上、温度４０℃以下の条件のもとに蛋白質及びヒアル
ロン酸と共にカルボジイミド類または塩化シアヌール或
いは塩化シアヌール誘導体類を共存、反応させることを
特徴とする。

以下、本発明の詳細な説明する。

まず、本発明に係る蛋白質としてはコラーゲン、水溶性
蛋白質、ゼラチン等の水溶性蛋白質や卵殻膜、羊膜、豚
等の皮膚など皮膜状の蛋白質を用いることができる。ま
たヒアルロン酸は前述した通り動物のｍ織中に広く分布
し、化学的にはＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンが交互に結合した高分子量の多＄、１）１
）１（である。その分子量は通常５０万以上であるが、
本発明の製造方法による製品の保水性を高めるためには
分子量約１００万以上のものが好ましい。

本発明はこれら蛋白質とヒアルロン酸とを反応させるに
際して、この両者と共に架橋剤としてのカルボジイミド
類または塩化シアヌール類を共存、反応（固定化化反応
）させることを特徴とするものである。このカルボジイ
ミド類の好ましい代表例としては　水溶性の１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩や１−シクロへキシル−３−（２−モルホリニル
−４−エチル）−カルボジイミド−ｐ−トルエンスルホ
ナート等がある。また塩化シアヌール類としては塩化シ
アヌール、及び塩化シアヌールのｃ７！基をＮＨＣＨ，
Ｃ０ＯＨ基、ＯＣＨｚ　ＣＯＯＨ基、ＮＨ２基などで置
換した化合物がある。

蛋白質、ヒアルロン酸及び架橋剤との固定化反応はｐＨ
３以上、温度４０℃以下の条件下で行われる。実際には
ヒアルロン酸水溶液と蛍白質の水溶液或いは懸濁液の混
合液中にカルボジイミド類または塩化シアヌール類を添
加して反応させたり（１段法）、まずヒアルロン酸水溶
液あるいは蛋白質の水溶液或いは懸濁液の一方に架橋剤
を添加して反応させた後に他方を添加し、反応させる（
２段法）ことができる。

この固定化反応に使用されるヒアルロン酸水溶液の濃度
は好ましくは２重量％以下である。２重量％以上の濃度
であると水溶液の粘度が高すぎ、反応液系の撹拌効率、
反応の進行及び反応の均一性などが低下する。また蛋白
質の水溶液或いは懸濁液の濃度は好ましくはおよそ２重
量％以下である。濃度が２重量％以上になると、反応液
系の粘度が高すぎ、反応液系の撹拌効率、反応の進行及
び反応の均一性などが低下する。さらに蛋白質が水不溶
性の場合、これを水に浸漬して水溶液や懸濁液の場合と
同様に反応を進めることができる。

この場合には反応率を高めるため、あらかじめ蛍白質を
ドデシル硫酸ナトリウムなどのような膨潤剤で膨潤させ
た後、これを固定化反応に付することが好ましい。

蛍白質へのヒアルロン酸の固定化反応は固定化剤として
カルボジイミド類を用いる場合、蛋白質のＮＨ，ｉに対
してヒアルロン酸中のＣ０ＯＨ基をカルボジイミド類固
定化剤を介してカップリングしアミド結合することに基
づいている。固定化剤として塩化シアヌールや塩化シア
ヌール誘導体を用いる場合、蛋白質のＮ　Ｈを基、ＯＨ
基、ＳＨ基等の置換基に対してヒアルロン酸中のＯＨ基
を塩化シアヌールや塩化シアヌール誘導体の残基を介し
て結合することに基づいている。そしてこれらの固定化
反応に適した条件は、ｐＨ３以上、温度４０℃以下であ
る。架橋剤として塩化シアヌール類を用いた場合には、
反応の進行と共に脱塩酸反応が生じ反応系のｐＨが低下
するのでＮａＯＨ１ＫＯＨ，Ｎａ、Ｃｏ、等のアルカリ
剤でｐＨ３以上になるよう調整しながら反応を進めるこ
とが望ましい。また大量のバッファー液中で反応させる
こともできる。他方、反応温度が４０℃以上になると、
ヒアルロン酸の分解に伴う分子量の低下が起こるので好
ましくない。以上の条件以外では反応効率が低く、実質
的に固定化反応が進行しない。

本発明の製造方法を実施する場合、塩化シアヌール類は
水に対する溶解度が小さく、かつ加水分解され易いので
、反応を均一にかつ効率的に進行させるために反応液中
にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチ
ルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の反応に対し
不活性な親木性有機溶剤を、共存させることが望ましい
。

本発明により製造されたヒアルロン酸固定化蛋白質は次
の方法により精製することができる。すなわち、蛋白質
として水不溶性蛋白質を用いた場合には、反応液を塩酸
、硝酸、硫酸等の鉱酸で中和した後純水で洗浄し、その
まま湿潤状態で保存するか、または凍結状態、真空乾燥
等により乾燥した精製物として保存することができる。

この過程において膜状物、糸状体、粒状体など適宜成形
した状態のものとすることができる。また蛋白質として
水溶性蛋白質を用いた場合には、前記と同様に中和した
後、反応液を適当な方法で製膜、紡糸、微粒子化し、水
洗してヒアルロン酸固定化蛋白質の精製物とすることが
できる。例えば、上記反応液をドクターブレード法等の
方法で製膜後、メタノール等で不溶化させて膜状のヒア
ルロン酸固定化蛋白質を製造することができ、また例え
ば上記反応液をメタノール、アセトン等の不溶化溶媒中
で紡糸して繊維状のヒアルロン酸固定化蛋白質を製造す
ることができ、さらに例えば反応液を撹拌したメタノー
ル、アセトン等の不溶化溶媒中に添加して粒子状のヒア
ルロン酸固定化蛋白質を製造することができる。

このようにして得られたヒアルロン酸固定化蛋白質は水
で湿潤させ、トルイジンブルーで染色するとメタクロマ
ジー現象で赤紫、ないし青色に変色することによりヒア
ルロン酸の蛋白質への固定化が確認される。また、臭化
カリウムを用いた赤外線吸収スペクトルの測定では、蛋
白質のＮ−Ｈ基及びヒアルロン酸のＣ−ＯＨ基に基づく
吸収（１５２０ｃ　ｍ　−’及び１０６０　ｃ　ｍ−〇
が変化していることによっても確認される。さらに固定
化されたヒアルロン酸量は臭化カリウムを用いたＦＴ−
Ｉ　Ｒのチャートで検量線から定量することができる。

〔「機器分析の手引き」　（小川雅彌監修、１９７９年
、化学同人社発行）第１０真に記載の方法による〕本発
明によって製造されたヒアルロン酸固定化蛍白質は保水
性及び粘弾性に優れている上、ヒアルロン酸及び蛋白質
の性質上、生体適合性にも優れている。

〔作用〕

本発明は、水溶性カルボジイミド類のようなアミド化試
薬や塩化シアヌール類等の固定化剤を用いることにより
ヒアルロン酸が蛋白質にきわめて強固に固定化されるこ
とを見出して完成したものである。固定化剤としてカル
ボジイミド類を用いた場合にはヒアルロン酸はアミド結
合によって蛋白質に強固に結合し、固定化剤として塩化
シアヌール誘導体を用いた場合は、ヒアルロン酸はシア
ヌール酸類の残基を介して強固に固定化される。

〔実施例〕

以下、本発明をその実施例に基づいて詳細かつ具体的に
説明する。なお、実施例において使用されたヒアルロン
酸は醗酵法により製造されたもので、分子量は約１５０
万である。また濃度比における「％」は「重量％」を示
す。

１）ｆｉ上（ヒアルロン酸固定化卵殻膜の製造）０．２
％ヒアルロン酸水溶液Ｉ　Ｑｍｊ！に、０．２モルの１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩水溶液１０ｍβ（ｐＨ４）を加え、液温
４０℃で１０分間処理した後、鶏卵から取り出した卵殻
膜１００ｍｇを加え、液温４０℃で１０分間反応させた
。

反応後、試料をよく水洗し、トルイジンブルーで染色し
、顕微鏡でよく観察したところ、斑点状にヒアルロン酸
が固定していることが確認された。

試料の表面をＦＴ−ＩＲ反射法により測定し、紐帯白質
で作成した検量線を用いてヒアルロン酸の含有量を見積
もったところ、約１９％であった。

尖立五ｌ＜ヒアルロン酸固定化絹蛋白質膜の製造）精選
した家蚕面を９モルの臭化リチウムに溶解させ、蒸留水
で透析して得られた液状絹蛋白質をポリエステルフィル
ム上に流延し、紐帯白質膜を成形させた。この膜を８０
％メタノールで処理して不溶化した後、臭化リチウムの
希薄溶液に浸けた。

０．２５％ヒアルロン酸溶液３９ｍｊ２に０．０２モル
の塩化シアヌール／ジオキサン溶液１５ｍｊ！を加え、
水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整した後、紐帯白質膜
を入れ液温３７℃で１０時間反応させた。

反応後膜を水洗し、トルイジンブルーで染色したところ
、斑点状に赤紫色に染色し、紐帯白質膜には斑点状にヒ
アルロン酸が固定化されていることが認められた。

災施拠主（ヒアルロン酸固定化絹蛋白質微粒子の製造） 家蚕面０．５ｇを臭化リチウムに溶解させ、透析中に沈
澱してきた紐帯白質を含む懸濁液５０ｍ１を、０．０２
モルの塩化シアヌール／ジオキサン溶？＆２５ｍ＊を用
いて０．２５％のヒアルロン酸溶液１００ｍｆｆと液温
Ｏ℃で反応させたところ、反応中に紐帯白質が溶解し均
質な溶液となった。１２時間反応させた後反応液を激し
く撹拌したアセトン中に入れると、微粒子状のヒアルロ
ン酸固定化絹蛋白質が得られた。このような微粒子状の
ヒアルロン酸固定化蛋白質は化粧品基材として優れた皮
膚親和性を有すると共に、無水の状態で取扱うことがで
き、流通上にも利点を有する。

なお、この条件ではヒアルロン酸並びに紐帯白質は各々
単独ではアセトンに溶解して沈澱しない。

この試料についてＦＴ−ＩＨにより測定すると、微粒子
中のヒアルロン酸含有量はおよそ２９％であった・ 大１）土（ヒアルロン酸固定化絹蛋白質膜の製造）０．
５％のヒアルロン酸水溶液３０ｍ１に０．０２モルの塩
化シアヌール／アセトン溶液１５ｍｊ２を加え、水酸化
ナトリウムでｐＨ１０に調整した後、実施例２における
場合と同様にして得られた液状の紐帯白質３０ｍｊ！を
加え、緩やかに撹拌しながら温度θ℃で１６時間反応さ
せた。

反応後、得られた粘稠な溶液をポリプロピレンフィルム
上に流延し、ヒアルロン酸固定化絹蛋白質の膜状物を形
成した。この水溶性膜を８０％メタノールに入れて処理
し水不溶化させた。水不溶化処理した膜をトルイジンブ
ルーで染色したところ、赤紫色に染色し、綱膜にヒアル
ロン酸が固定化されていることが認められた。

尖マ拠玉（ヒアルロン酸固定化絹蛋白繊維の製造）実施
例４と同様にして得られたヒアルロン酸固定化絹蛋白質
の粘稠な溶液を注射器によってアセトン中に押し出した
ところ、糸状の成形物が得られた。これをトルイジンブ
ルーで染色したところ、赤紫色に染色し、絹繊維にヒア
ルロン酸が固定化されていることが認められた。

この糸状物は更に延伸し、撚糸し、織布や不織布とする
ことができ、皮膚被覆材としての用途が拡大した。

大施炭工（ヒアルロン酸固定化コラーゲン繊維の製造） ０．５％のヒアルロン酸水溶液３０ｍｎに０．０２モル
の塩化シアヌール／アセトン溶液１５ｍ１を加え、水酸
化カリウムでｐＨ１０に調整した後、０．５％コラーゲ
ン水溶液２０　ｍ　ｌを加え、温度１０℃で緩やかに撹
拌しながら１５時間反応させた。

反応液に食塩０．５ｇを添加して均一にし、これを注射
器によってアセトン中に押し出したところ、糸状の成形
物が得られた。これをトルイジンブルーで染色したとこ
ろ、赤紫色に染色し、コラーゲン繊維にヒアルロン酸が
固定化されていることが認められた。

ａ（ヒアルロン酸固定化羊膜の製造） ０．２％のヒアルロン酸水溶液３０ｍｌ！に０．０２モ
ルの塩化シアヌール／ジオキサン溶液１５ｍＩ！を加え
、水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整した後、３０ｍｇ
の羊膜を入れ、温度３７℃で１０時間反応させた。

反応後羊膜を水洗し、これをトルイジンブルーで染色し
たところ、斑点状に赤紫色に染色し羊膜にヒアルロン酸
が固定化されていることが認められた。

ＩＬＬＬ（ヒアルロン酸固定化ゼラチンの製造）ゼラチ
ン３０　ｍ　ｇを熱水３９ｍｌに溶解した後室＞＝に冷
却し、塩化シアヌールの０．２５％ヒアルロン酸溶液１
５ｍ１を加え、反応液を温度Ｏ℃に冷却し、かつ水酸化
ナトリウムでｐＨ１０に調整し、３０分間反応させた。

反応が進行するに伴い、反応液中にゲル状物が生成し沈
澱した。このゲル状物をアセトン中に入れて洗浄すると
微粒子状の反応物が得られた。これをトルイジンブルー
で染色したところ赤紫色に略均−に染色し、ゼラチンに
ヒアルロン酸が固定化されていることが認められた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、保湿性、生体適合性に優れたヒアルロ
ン酸をきわめて強固に固定化した蛋白質を膜状体、繊維
状体あるいは粒状体として容易に製造することができ、
そのために優れた医療用材料或いは優れた化粧品用剤な
どの素材を容易にしかも安価に提供することができるの
で、本発明は当業界においてきわめて優れた発明である
。

特許出願人　電気化学工業株式会社 代理人　弁理士　　鈴　木　定　子

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛋白質に、ヒアルロン酸がシアヌール酸類の残基
   を介して固定化されていることを特徴とするヒアルロン
   酸固定化蛋白質。
2. （２）蛋白質にヒアルロン酸を反応させるヒアルロン酸
   固定化蛋白質の製造方法において、ｐＨ３以上、温度４
   ０℃以下の条件のもとに蛋白質及びヒアルロン酸と共に
   カルボジイミド類または塩化シアヌール或いは塩化シア
   ヌール誘導体類を共存、反応させることを特徴とするヒ
   アルロン酸固定化蛋白質の製造方法。