JPS6328891B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は止血剤、その製造方法及びその使用
法に関する。 公知の特許には、止血剤との関連で用いられる
血管系や血管物質の表面電荷の変更方法が論議さ
れている。一般的にいうと、血栓生成などを避け
るため表面電荷を、よりマイナスにする様に処理
することが提案されている。 アプージヨン社で造られ特許2465351に公開さ
れているゲルフオーム、アセコン社で造られ特
許3742955に記されているアビテン、そしてジ
ヨンソン・ジヨンソンで造られ特許3364200に記
されているサージセルの様な各種の止血剤が知
られている。 特許3742955でバツチスタ等はコラーゲンを
色々と処理して造られたものが外科で有用であ
り、傷治療に用いられることを報告している。ま
たエー・ピーコツク等はアン、サージ、（Ann、
Surg.）161号、238−47、1965年２月号でコラー
ゲンは傷手当に使うと、止血性を持つていること
を教えている。更にバツチスタ等は繊維性コラー
ゲンやコラーゲン製繊維は適切につくられ血液で
濡らされると止血性を示すだけでなく、温血動物
の裂けた皮膚表面に予期しない附着性を示すこと
を報告している。それ等は微細な繊維性コラーゲ
ンやコラーゲンからつくつた繊維製品であり、止
血剤として有用で、温血動物の切れた皮膚に、血
液で濡らされ、接触して附着性を示すものをつく
る方法を提案している。 アストン等は特許3364200で普通のガーゼハツ
ド等を止血剤例えば塩化鉄、トロンビン等に浸漬
したものからなる外科止血剤が出血を止めるため
多年に亘つて用いられてきたことを報告してい
る。しかし乍らこの公知の止血剤は局所組織反応
を起すので、そのまま閉じた傷の中に残すことが
できず、そのため出血部位から止血剤を取除かな
ければならないから、出来上つた凝血をこわし新
しい出血を起させるということはその重大な不利
であるとして批判されている。従つてアストン等
は閉じた傷の中にそのまま残しても何等の重大な
局所組織反応を起すことのない様な止血剤には大
きな必要性があることを認めている。そこにはま
た、酸化セルローズが止血性を示すだけでなく動
物組織に吸収されることが見出された旨報告され
ている。アストン等は保存中に変質を起さない改
善した安定性を有する酸化セルローズの吸収性止
血剤を提供している。酸化セルローズはパルプ、
綿、コトンリンター、ラミー、ジユート、紙等及
びビスコース法又はベンベルグ法によりつくられ
た再生セルローズやレーヨンからつくられる。 コツレル特許2465357は液浸透性で、水溶性で
あり、スポンジの一般的な物理的性質を持つが動
物体に吸収されるゼラチンスポンジに関する。こ
のスポンジはその明細書によると濡れると柔軟に
なり、多数の微細孔を有していて、多量の治療剤
を含み次いでそれを徐々に放出するか傷の中の液
体即ち血液や滲出物を有効に吸収する物として作
用するべき多孔物質である。コツレルはゼラチン
を含む水溶液をつくり少量のホルマリンを加え次
いで長時間かきまぜて元の溶液量より実質的に大
きい泡物質をつくる方法を公開している。 上述の発明は止血剤の領域で重要なものである
がどの特許も関連材料の表面電荷や静電負荷を制
御し、従つて本発明における様に止血問題の基本
にかかわつて来ていない。 上記に加えるに、コラーゲンスポンヂの論議は
「コラーゲンスポンジ；Madical Application、
J.Biomedical Materials Research（John Wiley
＆Sons、New York Vo1.11No.５、Sept、1977」
にも出ている。この文献では生体により分解され
うる（bio degradable）材料としてのコラーゲ
ンの利用が吸収率と抗体性との関連で総説されて
いる。 この発明の課題は改良止血剤を提供するにあ
る。 この発明の他の課題は止血剤をつくる改良方法
を提供するにある。 この発明の更に別の課題は止血剤利用の改良方
法を提供するにある。 この発明の上記の課題を達成するために、コラ
ーゲン物質又はコラーゲン様物質からなる一つを
その表面電荷が有効に、更にプラスになる様に修
飾すること、そしてこうして修飾した物質を出血
制御に適用する方法を提供することである。 この発明の特別の実施態様によるとこの物質は
非共有結合的修飾によつて行われる。更にこのも
のが凍結乾燥に付される。 この発明の他の実施態様によると物質が共有結
合的修飾法により処理されてよい。この物質はま
た適当に修飾せられて凍結乾燥に付される。 この発明によると上述の様につくつた止血剤が
提供される。使用されるコラーゲン又はコラーゲ
ン様物質が塩酸で処理したゼラチンであるのがよ
い。 この発明の態様によるとゼラチンはエチレンジ
アミンで処理できる。 この発明の上述の課題及びその他目的、態様及
び利点は以下の説明から明かである。 この発明の目的は化学的に修飾したコラーゲン
又はコラーゲン様物質を一般市販の製品と比肩し
うるがある点ではより優れた止血剤として提供す
るにある。 この発明の物質はプラスの部分構造
（moieties）で修飾したコラーゲン又はコラーゲ
ン化合物であつて、殊に非縫合患部の出血を臨床
的に制御するのに用いることができる。それは普
通の外科的処置への補助手段であることを意味す
るものでそれに代わるものではない。 多くの要因が止血剤の凝血機構に寄与してい
る。それら要因には(1)表面化学（生化学的反応を
含む）(2)電荷、又は静電荷性そして(3)微細構造が
ある。止血剤を合成し且つ評価する初期段階では
上述の要因それぞれの重要性を理解する試みがな
されて来た。 この発明により提供された各種形態の止血剤は
コラーゲン又はコラーゲン様化合物の修飾物であ
る。コラーゲンそのものは止血性を示す。試みら
れて来た修飾は表面電荷や微細構造を操作するこ
とによりそれらの増大を求めるものである。 化合物の電荷濃度の変更は２つの方法即ちHCl
により提供される様なプラスの基を用いる溶解骨
ゼラチン（ベーカーU.S.P.）の非共有結合による
修飾(2)ゼラチンのペプチツド鎖への各種リガンド
（ligand）の共有結合的適用によつて達成できる。
プラスに荷電した多くの形態の止血剤の製造は下
記の様に例えばコラーゲン又はコラーゲン様物質
又は化合物の以下の様な初期製造法によつて行わ
れる。 例えばゼラチンの１％（又は0.1〜15％）の原
溶液の１を絶えずかきまぜ乍ら室温で蒸溜水又
は脱イオン水に溶かす。この原液から各200ml、
の部分試料（aliquot）を取り出し、下記の各種
操作に使用する。 Ａ 非共有結合的修飾法 プロテイン溶液の200mlの部分試料を１％ゲ
ル（低密度）HCl（LDHCl）で所望のPH（PH＝
2.5）に調整する。PH＝3.0の場合５％ゲル（高
密度）HCl（HDHCl）を用いる。この溶液に濃
HCl（フイツシヤー試薬純度）を稀釈した1N
HClを加える。その間絶えずかきまぜて均質性
を確保し何等かの変質が極力起らない様にす
る。 ゼラチン−HCl溶液を次いで２時間室温でか
きまぜワツトマンNo.４フイルターで600mlビル
タス（Virtus）フラスコ中にろ取する。このフ
ラスコをドライアイス浴（−40℃）中に漬け、
フラスコを絶えず電磁的に撹拌して、プロテイ
ン液を凍らせる。次いでこの材料をビルタス凍
結乾燥機（Research Equipment、N.Y.）上に
置き溶液が泡状になるまで乾燥する。次いで材
料をビルタスフラスコから取出しデシケーター
ガラス又はプラスチツク瓶中におく代りにシエ
ルフ−凍結法が用いられた。 第２の修飾法は精製ゼラチンに0.001M、
0.01M、0.10M又は0.25M（表１）の最終Ca⁺⁺
濃度になるようにCaCl₂・2H₂O（フイツシヤー
試薬純度）を加えることである。 Ｂ 共有結合的修飾 共有結合は支持体としてのコラーゲン又はゼ
ラチンの構造を利用し、ゼラチンの末端
COOH−基と各種リガンドの遊離アミノ基の
間に出来たペプチツド結合により、その母体に
リガンドを結合させることによつてえられる、
（その際支持体が例えば遊離のカルボン酸末端
基を有するセフローゼマトリツクスに似てい
ることを考慮している）。 このペプチツド結合の形成は結合剤１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド−HCl（シグマ社より売られている
E.D.C）を用いてPH4.75で容易に行われる。 その様な結合形成が説明されるのは使用され
た骨ゼラチンがアミノ酸構成において牛の骨の
コラーゲンと似ていると推定されているからで
ある。牛の骨コラーゲンは44のアスパラギン酸
残基77のグルタミン酸残基を有している。別言
すると1000の残基当り121のCOOHを有してい
る。上述の分析によりこの実験でゼラチンは
100／1000遊離カルボン酸基を含んでいると推
定出来る。こうして100mg／１ｇゼラチンは修
飾するリガンドが大過剰のときは修飾される筈
である。他の修飾もすべて同様に行われる。 例 プロテイン溶液の200ml部分試料に可能な結合
部位の５倍過剰であるために充分な量のリガンド
（１モル）を加えた。この溶液を適当な酸（HCl）
か或は塩基（NaOH）を用いてPHを4.75に調整す
る。この撹拌溶液に５ｇの固形のEDC（1Mの最
終濃度にするに必要な最小のカルボジイミド）を
加える。次いでこの溶液を２時間かきまぜた。こ
の反応をリード−１−スロツプPHメーターで測定
して追跡した。PHは例えばPH＝３に変化したが塩
基を加えて補正した。この資料を24時間更にかき
まぜ可能な結合部位すべての完全反応が確保され
た。 次いでプロテインを６時間流水を用い、更に２
時間蒸溜水及び脱イオン水の４で４回繰返し透
析した。そうして未反応のリガンドや縮合試薬を
すべて除去する。次いでこの材料をろ過し、非共
有結合的修飾剤と同じ様に処理した（シエル凍結
又は凍結乾燥する）。

【表】 どの様なコラーゲンの化学的修飾が実際に起つ
ているかを決めるためには下記の分析方法が用い
られた。 (1) ポリアクリルアミドヂスク電気泳動法（P.
A.G.E） (2) 結合状態の検討 (3) 円２色性（dichromism）の検討 P.A.G.Eはプロテインの純度、質量及び荷電を
明かにするために広く用いられる手法である。プ
ロテインは電荷／質量（ｅ／ｍ）割合に基き媒体
を経て移動する。プロテインの移動はその割合に
よつて決るから要因を評価するためにこの手法を
用いることが出来る。 更に有利には、この要因は少しく変更したマス
（S.D.S変質ゲル電気泳動法）である。プロテイ
ンの結合状態は理想的なマスプロテインと修飾し
た荷電性との間の識別をするために利用すること
ができる。このテクニツクはコラーゲンの修飾に
よる何等かの荷電の変化量を測定することができ
るのでより困難で、金がかかるが普通の等電点に
近接させる方法（isoelectric focusing）を用い
る必要がない。 結合状態の検討については、修飾の形式と量を
決めるのに使用されることは明かである。この方
法で用いられる共有結合的修飾は本質においてプ
ソイド型リジン残基をつくる。そのままのプロテ
イン（intact protain）上の遊離NH₂基を識別で
きる方法は何れも処理の前後のNH₂基の数を比
較することにより結合量を決定するのに使用出来
る。その様な方法はニンヒドリン検定及び≠又は
フルオレスカミン検等（Purcell etal）を含んで
いる。 最後にプロテインの構造は或程度その化学的性
質を左右する。従つて修飾による化学的構造の何
等かの変更を処理の前後の円２色性の検討で監視
することは有用である。結局のところ相互関係は
構造の変更と凝血性との間に定められるべきであ
る。 合成された材料を評価するため、生体での急性
動物実験（犬）及び試験官内でのTRT（トロンビ
ン、再石炭化時間（thrombin recalcification
time））分析が用いられてきた。 この発明の止血剤の評価とその比較は以下の方
法によつた。 (1) 各種試料を２日、７日及び２週間動物に皮下
埋設すること (2) ２つの別々の解剖的局所（皮膚と脾臓）にお
ける出血時間及び失血量の半定量的分析それら
のテストから、各試料の相対的凝血性（効
能）、血液との接触前後におけるそれら材料
の物理的構造的完全性（完壁性）についての情
報毒性及び組縮系のあらましの徴候異る部
位からの血液に曝らされたとき形成された繊維
素の異る形状（試料の性質及び血液の性質によ
つて決まる）手術室の条件下での各試料の処
理時の性質及び処理、凝血及び周辺組織との
接触に関連しての各試料についての臨床医師の
主観埋設試験は胸（犬）の筋肉にポケツトを造
り各試料を各ポケツト中においてその近くで絹
糸で縫合することにより行われた。各試料は動
物を殺す前に切り出され、ホルマリン−グルタ
ールアルデヒド中で固定され組織学的及び顕微
鏡的検査に付された。得られた試料は次のとお
りであつた。

【表】 加えるに写真による評価が１、２及び７日間隔
で各結合位置（sites）について行われた。 それら埋設試験及び構造検討の結果は表１と表
２にまとめられている。 皮膚切開治癒時間 犬の左右胴を３cm切開した。そしてその切面は
筋肉を貫通していた。次いで止血剤を加え切開を
凝血するままにした。どの試料（止血剤）にも圧
力は全く加えなかつた。凝血時間はストツプウオ
ツチで得られた。 それぞれ切開をした一連の実験において予め重
量を秤つた４×４繃帯又はスポンヂが置かれ血液
が集められ且つ秤量せられた。血液量は血液を吸
つた４×４繃帯又はスポンヂの重量から新しい乾
燥した４×４スポンヂの重量を差し引くことによ
つて算出された。結果は表３に記されている。 器官の出血時間 脾臓や肝臓の様な非縫合器官における各試料
（止血剤）の相対的な止血能についての情報をう
るために脾臓を切開し、出血時間を算出した。そ
の手続きは上記皮膚テストに本質的に類似してい
る。３cmの切開は脾臓の側面で行われ、止血剤が
傷の上に置かれ出血時間と血液量とが算出され
た。このデータの評価には幾分の困難が伴つた。
何故なら傷の程度の相違（即ち切断した動脈等）
により出血量が相違するからである。この点は必
要により結果の表中に示されている。次いで脾臓
を摘出し、固定し組織学的な評価を行つた。 試験管中の分析 試験管中での分析が行われたがそれは普通の生
理的食塩水の濃度と同じ濃度の溶解止血剤での規
格のTRT（トロンビン再石灰化時間）によるもの
である。 結 果 試験結果はこの発明の止血剤の幾つかのものが
その止血剤及び組織学的な評価において市販で入
手出来る止血剤（アビテン、サーゲセル及びゲル
フオーム）と十分に比肩しうるものであることを
示すものである。それはH.D.HCl（高濃度５％
HClで処理したもの、Ｌ、D.HCl（低濃度１％
HClで処理したもの）LD゜（低濃度の１％ゼラチ
ン）である。その上この予備的な調査に関与した
調査官や臨床医は止血剤の効力の順位をH.D
HCl、L.D HClアビテン、L.D.Oサーギセル及び
ゲルフオームであるとしている。 上述の結果は次記表１及び２に表示されてい
る。

【表】

【表】 図表１−３はこの発明の各種製品の紫外線吸収
スペクトルを示すものである。基本化合物単独又
はCaCl₂を有する基本化合物は280ｍμでは吸収
を示さない。そのことはプロテインによる汚染が
全くないことを示すものである。しかし牛血清ア
ルブミン（BSA）を加へると、280ｍμに吸着の
ピークを示す様になる。プロテインに比して
CaCl₂の割合が増大すると共に吸収が減少するの
はおそらくプロテイン稀釈の結果であるがその減
少状況は図３に示されている。試料はすべて１％
溶液として造られ、次いで測定に先立つて10倍稀
釈せられた。図１−３に示された百分率は凍結乾
燥の前の濃度である。 第４図は0.01N NaOH又は0.01N HClの100μ
を加へたスーパースタツト（Super Stat）0.1溶
液10mlのPHを示す。殆ど緩衝能力を有たない蒸溜
水のPH曲線も示されている。プロテインに比して
CaCl₂の割合が増大すると共に、おそらくプロテ
インの稀釈の結果として緩衝能力が低下する。塩
基の添加の結果も酸の添加の際よりもPHの大きな
変化が起る。この相違は下記理由で予期されるも
のである。即ち(1)蒸溜水（PH＝５・５）中の新規
化合物のPHは酸性凡そ5.9であり、また(2)ゲル分
子上の真正マイナス荷電はOHよりもより有効に
H⁺中和作用をする。 第５図及び第６図は新規化合物の赤外線スペク
トルを示すものである。Ｎ−ＨとＣ＝Ｏの吸収ピ
ークが示されている。プロテインに比しCaCl₂の
割合を増大すると期待される様に２つの吸収ピー
クの低下を結果する。しかしピークの形状に影響
を与えない。 以上のことから、この発明は改良された止血剤
を提供しまた、それを製造する方法を提供するも
のであることが判るであろう。この発明はまた止
血を制御する改良された方法を提供するものであ
る。 凍結乾燥技術は公知であるけれども次記ステツ
プは上記説明に関連して用いることができる。 １ プラスチツク製100mmペトリ皿の中に50ml量
を分与する。 ２ 凍結乾燥器（例えばヴイルタスモデル
100SRC−７）の中で30分間−50℃に３〜５時
間か又は共融点までのシエルフー冷凍が予定さ
れた。 ３ 1/2時間凝縮器を付し、３時間加熱せずに真
空にし始める。 ４ ＋30℃にシエルフー熱を加へ、48時間継続す
る。 以下の操作を滅菌のために使用できる。 １ ガス滅菌管中に入れのち指示書と共に封入す
る ２ エチレンオキサイドにより普通の循環法でガ
ス滅菌する ３ エチレンオキシドに曝したのち用心深く空気
で置き換へる。 上記の実施態様の多くの変形は当業者にとつて
は極めて明白であるが、それら変形は特許請求の
範囲の項に定義された発明の範囲から逸脱するこ
とがない。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図はこの発明の各種の実施態様の紫外
線吸収スペクトルを示すチヤートであり、第４図
はこの発明の化合物の溶液のPHを示すチヤートで
あり、第５〜６図はこの発明の実施態様の赤外線
スペクトルを示すチヤートである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コラーゲン又はコラーゲン様物質を、その表
   面電荷をよりプラスにするように処理することを
   特徴とする止血剤の製造方法。 ２ コラーゲン又はコラーゲン様物質を水に溶解
   し、ついで共有結合又は非共有結合的修飾法によ
   つて修飾する特許請求の範囲第１項記載の止血剤
   の製造方法。 ３ コラーゲン又はコラーゲン様物質はゼラチン
   である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の止
   血剤の製造方法。 ４ 修飾物質は凍結乾燥されている特許請求の範
   囲第１、第２又は第３項記載の止血剤の製造方
   法。 ５ 塩酸、エチレンジアミン、塩化カルシユウム
   又は塩化アンモニユームが表面電荷を修飾するた
   めに用いられる特許請求の範囲第１、第２、第３
   又は第４項の何れか１つに記載の止血剤の製造方
   法。 ６ 特許請求の範囲第１乃至第５項記載の何れか
   １つによつて製造される止血剤。