JP3755640B2 - 創傷被覆材 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、創傷被覆材に関する。さらに詳しくは、創傷、褥瘡、熱傷、皮膚潰瘍等による皮膚欠損部位に適用され、かかる部位を保護し、肉芽形成・表皮再生や治癒を促進することのできる創傷被覆材に関する。
【0002】
【従来の技術】
創傷治癒促進効果の向上のために、細胞増殖因子として知られている特定のポリペプチドを従来の創傷被覆材に固定化したものが提案されている(特開平10−316581号公報)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
細胞増殖因子は細胞の増殖には効果があり、基材上では細胞増殖が認められるものの、創傷被覆材として使用した場合は、創傷の治癒促進作用が十分ではない。
本発明の目的は、上記現状に鑑み、創傷の治癒において、細胞の増殖や分化が制御良く行われ、その結果、治癒が十分に促進される創傷被覆材を提供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成すべく本発明者らは鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち、本発明の創傷被覆材の特徴は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を1分子中に3〜50個有し、さらにGAGAGSのアミノ酸配列を少なくとも2つ有するポリペプチド(A)と、基材(B)とからなる点である。
【0005】
本発明において、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列としては、接着シグナルとして働くものであればいずれも使用でき、例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Vol.9 ,No.7 ,1990,527頁に記載されているものが挙げられる。
その中で好ましいものは、接着する細胞が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされるRGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列及びHAV配列であり、さらに好ましいものはRGD配列、YIGSR配列、PDSGR配列、LGTIPG配列、IKVAV配列及びHAV配列であり、特に好ましいものはRGD配列、IKVAV配列及びHAV配列である。
【0006】
ポリペプチド(A)中に有する前記最小アミノ酸配列の数は、細胞接着性の観点から、1分子中に少なくとも1個必要であり、好ましくは3〜50個であり、さらに好ましくは5〜40、特に好ましくは10〜30である。
【0007】
(A)の数平均分子量は、細胞に対する毒性及び接着性の観点から、通常5,000〜5,000,000であり、好ましくは10,000〜1,000,000、さらに好ましくは50,000〜500,000である。
【0008】
なお、(A)の数平均分子量は、SDS−PAGE法(Naドデシルスルフェイト−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法)で、(A)を水中で分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる。
【0009】
(A)の製造方法は特に制限されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にして製造することができ、例えば有機合成法(固相合成法、液相合成法など)、生化学的合成法{遺伝子組換微生物(酵母、細菌、大腸菌等)}等によって合成することができる。
【0010】
有機合成法に関しては、例えば、日本生化学学会編「続生化学実験講座2 タンパク質の化学(下)」641〜694頁(昭和62年5月20日;株式会社東京化学同人発行)等に記載されている。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平7−501443号公報中で例示されている。
【0011】
高分子量の(A)を容易に合成できる点で、遺伝子組換微生物による生化学的合成法が好ましく、特に遺伝子組換大腸菌を用いて合成する方法が好ましい。
【0012】
(A)の25℃の水に対する溶解度は、通常0又は10-6〜1,000mg/lであり、好ましくは0又は10-6〜10mg/lである。この範囲であると、基材(B)と結合していなくても体液中に溶出せず、細胞接着因子としての効能が創傷被覆材上あるいは被覆材中で持続する結果、創傷の治癒期間がさらに短縮されるため好ましい。
【0013】
(A)は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列以外のアミノ酸をさらに含有してもよい。
これらのアミノ酸としては、疎水性を示すアミノ酸(G,A,V,L,P,I,M,W,F)等が使用できる。これらのアミノ酸を使用することにより、(A)が水に対して不溶性となりさらに好ましくなる。
これらのアミノ酸のうち、GAGAGSのアミノ酸配列を2つ以上有する場合がさらに好ましい。
【0014】
(A)の好ましい具体例としては、三洋化成工業(株)製プロネクチンF{細胞接着シグナルRGD配列と(GAGAGS)9配列とを1分子中に各々約13個づつ有する分子量約11万であるポリペプチド(遺伝子組み換え大腸菌により製造)}、同プロネクチンL{細胞接着シグナルIKVAV配列と(GAGAGS)9配列とを1分子中に各々約13個づつ有する分子量約11万であるポリペプチド(遺伝子組み換え大腸菌により製造)}等が挙げられる。
【0015】
本発明の創傷被覆材において、基材(B)としては特に制限はなく、従来から用いられる各種含水(性)ゲル、ハイドロコロイド、固形物(粉末、フィルム、不織布及びスポンジ)等を用いることができる。
(B)としては、細胞若しくは体液と直接に接していても変化が起こらない生物学的非分解性材料及び細胞若しくは体液と直接に接しているうちに分解吸収されてしまう生物学的分解性材料が使用できる。
【0016】
生物学的非分解性材料としては、セルロース、ポリウレタン、シリコーン樹脂、ポリジエン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びポリアクリル酸塩等が挙げられる。
【0017】
生物学的分解性材料としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグルタミン酸、コラーゲン、ゼラチン、クルコサミノクリカン、ヒアルロン酸、フィブリン、アルギン酸、キチン、キトサン、フィブロイン及びこれらの塩等が挙げられる。
【0018】
角質層から真皮の途中に至る浅い創に対しては、創傷の被覆が重要な機能であるため、創傷被覆材の基材としては、生物学的非分解性材料が好ましい。
一方、真皮から皮下組織に到達するような深い創に対しては、細胞組織の増殖の足場を提供するのが重要な機能であるため、創傷被覆材の基材としては、生物学的分解性材料が好ましい。
【0019】
本発明の創傷被覆材において、基材(B)100重量部に対するポリペプチド(A)の好ましい量としては、0.0001〜50重量部であり、さらに好ましい量としては0.01〜1重量部である。(A)の量がこの範囲であると、創傷促進効果がさらに発揮できる。
【0020】
本発明の創傷被覆材は、(A)と(B)を組合せることによって得られるが、その方法については特に制限はなく、物理的に接触させる方法あるいは化学的に結合させる方法等が挙げられる。
物理的に接触させる方法による場合、例えば、(A)の水または溶剤等の溶液を(B)に塗工あるいは含浸させた後、乾燥させることによって得られる。 化学的に結合させる場合、例えば、(A)と(B)をN−ヒドロキシコハク酸イミドあるいは水溶性カルボジイミド存在下にエステル化あるいはアミド化した後、洗浄乾燥させることによって得られる。
【0021】
本発明の創傷被覆材の形状については特に制限はなく、フィルム状、シート状、塊状、粉末状、ペレット状、管状、紐状、繊維状、布帛状及び網状等の形態が可能である。
【0022】
本発明の創傷被覆材は、擦過創、切創、挫創等の一般外傷;採皮創、削皮創等の手術創;熱傷;潰瘍;褥瘡;前記以外の各種創傷等からなる患部に当てて用いて患部からの滲出液の吸収、該滲出液の保持、患部への菌類の感染や増殖の防止して、患部の治癒促進させるための創傷被覆材として好適である。
さらに、骨等の生体組織の接着促進、骨の補強、軟骨の再生促進、神経の再生促進等の用途にも有効に使用することができる。
【0023】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【0024】
実施例1,2、比較例1,2
(1)アルギン酸共有結合架橋体の製造:
(i) 2.3g(20mmol)のN−ヒドロキシコハク酸イミド(HOSu、株式会社ペプチド研究所製)を酢酸エチル150mlに溶解し、撹拌しながら10mlの酢酸エチルに溶解した0.6g(10mmol)のエチレンジアミン(EDA、和光純薬株式会社製)を室温下に滴下した。
滴下終了後、さらに1時間撹拌を続け、析出した結晶を濾取し、減圧下に乾燥してエチレンジアミン2N−ヒドロキシコハク酸イミド塩(EDA・2HOSu)2.9g(収率約100%)を得た。
【0025】
(ii)アルギン酸ナトリウム(和光純薬株式会社製;粘度500〜600cp)の1重量%水溶液550ml(カルボキシル基:275mmol)に、2.42g(8.5mmol)の上記(i)で得られたEDA・2HOSuと、17.6g(92mmol)の1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl、株式会社ペプチド研究所製)とを溶解して、15cm×25cmのテフロン被覆アルミ製トレイ4枚に流延し、室温で約51時間静置し、含水ゲルを得た。
得られた含水ゲルを、細胞間質液と同じ濃度(Caイオン5meq.、Naイオン143meq.)になるように、CaCl2とNaClを溶解した水溶液(ECF)で十分に洗浄した後、純水で十分に洗浄し、次いで凍結乾燥してスポンジ状のアルギン酸共有結合架橋体約5gを得た。
【0026】
(2)細胞接着シグナル含有ポリペプチドとアルギン酸共有結合架橋体の組合せ:
(i) ポリペプチドとして、三洋化成工業(株)製プロネクチンFを使用;
プロネクチンF0.5mgをプロネクチンF溶解液(過塩素酸リチウム飽和溶液)0.5mlに溶解し、さらに水で10倍に希釈した溶液に、上記(1)で得られたアルギン酸共有結合架橋体の1g加え、さらに水を加えて架橋体全体を湿潤させた後、凍結乾燥させて、加熱滅菌(120℃、5分間)を施して、実施例1の創傷被覆材1を得た。
【0027】
(ii)ポリペプチドとして三洋化成工業(株)製プロネクチンLを使用;
プロネクチンFの代わりにプロネクチンLを用いた以外は上記(i)と全く同様にして実施例2の創傷被覆材2を得た。
【0028】
(iii)細胞接着シグナル含有ポリペプチドの代わりに、増殖因子KSIRVAVAPGを基材に固定化:
プロネクチンFをアルギン酸共有結合架橋体に組み合わせる代わりに、特開平10−316581号公報実施例8と同様の方法で、KSIRVAVAPGポリペプチドを固定化させたアルギン酸共有結合架橋体を合成し、比較例1の創傷被覆材3を得た。
(iv)ポリペプチドを用いず、(1)で得られたアルギン酸共有結合架橋体をそのまま用いて比較例2の創傷被覆材4とした。
【0029】
実施例3,4、比較例2
(3)細胞接着シグナル含有ポリペプチドとコラーゲンの組合せ:
(v) ポリペプチドとして、三洋化成工業(株)製プロネクチンFを使用;
プロネクチンF0.5mgをプロネクチンF溶解液(過塩素酸リチウム飽和溶液)0.5mlに溶解し、さらに水で10倍に希釈した溶液に、(株)高研製中性コラーゲン溶液の1gを加えて均一にした後、凍結乾燥させて、γ線滅菌(25kGy)を施して、実施例3の創傷被覆材5を得た。
【0030】
(vi)ポリペプチドとして三洋化成工業(株)製プロネクチンLを使用;
プロネクチンFの代わりにプロネクチンLを用いた以外は上記(v)と全く同様にして実施例4の創傷被覆材6を得た。
【0031】
(vii)ポリペプチドを用いず、(3)で用いた(株)高研製中性コラーゲン溶液をそのまま凍結乾燥させて、γ線滅菌(25kGy)を施して、比較例3の創傷被覆材7を得た。
【0032】
試験例1〜7
実施例1〜4及び比較例1〜3で得られた創傷被覆材1〜7から1cm×1cmの試験片をそれぞれ採取し、その各々を24穴(24ウェル)プレートの各ウェルに入れ、正常ヒト皮膚線維芽細胞を103個/ウェルの割合で投入し、各ウェルに10%FCS Eagle’s MEM培地1mlを加えて、5容量%の二酸化炭素を含む空気の存在下で37℃で14日間培養した。
各ウェルの細胞の状態を光学顕微鏡を用いて観察することによって、各創傷被覆材の細胞増殖活性を以下の基準で判定した。その結果を表1に示す。
【0033】
<細胞増殖性の判定基準>
◎;well全体にびっしりと細胞が広がっており、非常に良好。
○;wellのほぼ全体に広がっており、良好。
△;細胞の増殖は認められるがwellの一部に留まっており、不良。
×;細胞の増殖は認められず、全く不良。
【0034】
【表1】
【0035】
本発明の創傷被覆材を用いた場合、正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖が促進されていることが判り、創傷被覆材として、創傷の治癒促進効果が非常に高いことが判る。
【0036】
【発明の効果】
本発明の創傷被覆材は、創傷の治癒促進のために有効に使用することができる。また、生体組織を修復するための創傷被覆材、生体組織の接着促進材料、骨補強材、軟骨再生材、神経再生材などとして有効に使用することができ、難治性潰瘍などの難治性創傷の治療にも非常に有用である。
Claims (8)
- 細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を1分子中に3〜50個有し、さらにGAGAGSのアミノ酸配列を少なくとも2つ有するポリペプチド(A)と、基材(B)とからなることを特徴とする創傷被覆材。
- 基材(B)100重量部に対するポリペプチド(A)の量が0.0001〜50重量部である請求項1記載の創傷被覆材。
- 細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列が、アミノ酸一文字表記で現わされるRGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列及びHAV配列からなる群から選ばれる1種以上の配列である請求項1又は2記載の創傷被覆材。
- (A)の数平均分子量が、5,000〜5,000,000である請求項1〜3のいずれか記載の創傷被覆材。
- (A)が、遺伝子組換微生物によって合成される請求項1〜4のいずれか記載の創傷被覆材。
- (A)の25℃の水に対する溶解度が、0又は10-6〜1,000mg/lである請求項1〜5のいずれか記載の創傷被覆材。
- (B)が、セルロース、ポリウレタン、シリコーン樹脂、ポリジエン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びポリアクリル酸塩からなる群から選ばれる少なくとも1種の生物学的非分解性材料(B1)である請求項1〜6のいずれか記載の創傷被覆材。
- (B)が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグルタミン酸、コラーゲン、ゼラチン、クルコサミノクリカン、ヒアルロン酸、フィブリン、アルギン酸、キチン、キトサン、フィブロイン及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも1種の生物学的分解性材料(B2)である請求項1〜6のいずれか記載の創傷被覆材。
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