FI84362B - Foeraendring av dna-sekvensen mellan shine-dalgarno-sekvensen och startcodon av trp-operon foer foerbaettring av proteinproduktionen. - Google Patents

Description

1 84362

Trp-operonin Shine-Dalgarno -sekvenssin ja aloituskodonin välisen DNA-sekvenssin muuttaminen proteiinituotannon parantamiseksi 5 Trp-operonin säätelyjaksoja käytetään paljon euka- ryoottisten proteiinien tuottamiseen E. colissa. Trp-operonin promoottorin ja operaattorin sisältävä DNA-jakso on tällöin kaupallisesti saatavissa.

Trp-operonin säätelysekvenssien muuntamiset ovat 10 jo tunnettuja. Niinpä esimerkiksi DE-hakemusjulkaisussa 3 247 922 kuvataan, miten Serratia marcescensin trp-operonin säätelyosan nukleotidijaksoon voidaan muodostaa Hind III-pilkkoutumiskohta ribosomin sitoutumiskohdan ja aloituskodonin väliin. J.C. Edman et ai. [Nature 291 15 (1981) 503-506] kuvaavat Clal-pilkkoutumiskohdan lisää mistä E. colin vastaavaan sekvenssiin. Tämä muuttaminen muuttaa kuitenkin nukleotidien lukumäärää ribosomin sitoutumiskohdan ja aloituskodonin välissä luonnolliseen sekvenssiin verrattuna.

20 Nyt on havaittu, että vaihtamalla yksi nukleotidi, siis muuttamatta nukleotidien lukumäärää, voidaan DNA-sekvenssiin muodostaa pilkkoutumiskohta restriktioentsyy-miä varten ribosomin sitoutumiskohdan ja aloituskodonin väliin. Keksinnön mukaisesti korvataan välittömästi ennen 25 aloituskodonia oleva nukleosidi adenosiini sytidiinillä.

Keksintö koskee siten E. colin trp-operonin muutettua DNA-jaksoa, joka sijaitsee "Shine-Dalgarno"-sekvenssin ja ensimmäisen aloituskodonin välissä, ja joka DNA-sekvenssi I on 30 5' GTATCGACC 3' 3' CATAGCTGG 5' Tämä sekvenssi I liittyy ylemmän säikeen 5’-päästä trp-operonin "Shine-Dalgarno"-sekvenssiin 5' AAGG 3' 35 3' TTCC 5’ 2 84362 (joka vastaa varsinaistaribosomisitoutumiskohtaa RNA-ta-solla) ja ylemmän säikeen 3'-päästä aloituskodoniin ATG.

Seuraavassa verrataan keksinnön mukaista sekvenssiä I luonnolliseen E. colin sekvenssiin ja Edmanin 5 et ai. [siteerattu yllä] mukaiseen sekvenssiin esittämällä - tarkastelun helpottamiseksi - vain ylempi säie, josta jatkossa käytetään nimitystä "koodaava säie":

E. coli GTA TCG ACA

Edman et ai. GTA TCG AT 10 Sekvenssi I GTA TCG ACC

(Muutokset E. colin jaksoon nähden on alleviivattu ).

Tämä keksinnön mukainen luonnollisen sekvenssin A:n vaihtaminen C:ksi tuo mukanaan seuraavia etuja: 15 Jos aloituskodonia ATG seuraava nukleosidi on gua- nosiini, muodostuu tällöin tunnistus jakso C4-CATGG restriktioentsyymiä Ncol varten. Tämä pilkkoutumiskohta tekee mahdolliseksi DNA:n sijoittamisen välittömästi aloituskodonin viereen esimerkiksi kaavan II 20 5' CATGX...3' (II) 3' Y...5' jossa X ja Y ovat ensimmäinen komplementaarinen nukleo-tidiparin rakennegeenin aloituskodonin jälkeen, mukaisen synteettisen oligonukleotidin avulla. Jos X on tällöin G 25 ja Y on C, säilyy Ncol-pilkkoutumiskohta ligaatiotuot-teessa. Jos sen sijaan käytetään esimerkiksi synteettistä liittäjäjaksoa, jonka ylempi sekvenssi 5' CATG 3' liittyy toiseen nukleotidiin, säilyy Ncol-pilkkoutumis-kohta ja saadaan aikaan samalla täysi vapaus vaihdella 30 aloituskodonin jälkeistä ensimmäistä aminohappoa.

Ncol:llä pilkotun DNA:n yksisäikeiset päät voidaan luonnollisesti täydentää entsymaattisesti, esimerkiksi Klenow-polymeraasin avulla, ja liittää siten saatu tylppäpäinen DNA, jonka sekvenssi on III, 3 84362 5’ GTA TCG ACC ATG 3' 3’ CAT AGC TGG TAC 5' (III) tylppäpäiseen sekvenssiin IV 5' X...3' 5 3’ Y...5' (IV) DNA-sekvenssiksi V, 5’ GTA TCG ACC ATG X...3' 3' CAT AGC TGG TAC Y...5' (V) jolloin X ja Y ovat edellä määritellyt. Tällöin ei tarvi-10 ta muuta aloituskodonia tietylle ilmennettävälle rakenne- geenille. Tämä on edullista esimerkiksi N-terminaalisesta päästä lyhennettyjen proteiinien valmistuksen kannalta.

On myös mahdollista poistaa yksisäikeiset päät entsymaattisesti, jolloin muodostuu samoin tylppäpäinen 15 DNA-sekvenssi VI

5' GTA TCG AC 3' 3' CAT AGC TG 5' (VI) joka voidaan liittää tylppäpäiseen sekvenssiin VII 5' Z ATG X... 3' 20 3' Z'TAC Y...5' (VII) DNA-sekvenssiksi (VIII) 5’ GTA TCG ACZ ATG X...3’ 3' CAT AGC TGZ'TAC Y...5' (VIII) jolloin Z ja Z' ovat haluttu nukleotidipari, joka voi 25 myös jäädä pois. Kun Z ja Z' ovat A ja T, muodostuu luonnollinen E. coli -sekvenssi.

Näiden monien kloonausmahdollisuuksien lisäksi tarjoaa tämä keksintö sen edun, että rakennegeenin ilmentyminen tehostuu yllättävässä määrin.

30 Keksintö koskee toisena puolenaan menetelmää E.

colin trp-ilmentymis-järjestelmän sisältävän vektorin valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että E. coli -vektori, joka sisältää DNA-sekvenssin I (koodaava säie) ja sen jälkeen 5' ATGG 3' -jakson, pilko-35 taan restriktioentsyymillä Ncol ja 4 84362 a) ligatoidaan pilkkoutumiskohtaan DNA-sekvenssin II geenirakene tai b) täytetään pilkkomiskohta entsymaattisesti ja ligatoidaan DNA-sekvenssi III DNA-sekvenssin IV kanssa 5 tai c) poistetaan pilkkomiskohdan yksisäikeinen jakso entsymaattisesti ja ligatoidaan DNA-sekvenssi VI DNA-sek-venssin VII kanssa.

Keksintö koskee lisäksi E. coli -isäntäorganisme-10 ja, joille on tunnusmerkillistä se, että ne sisältävät keksinnön mukaisesti saadun vektorin, jolloin Z on C ja Z' on G. Keksintö koskee myös menetelmää popypeptidien valmistamiseksi geneettisesti koodattavissa olevista aminohapoista, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että * 15 saatetaan ilmentyminen tapahtumaan keksinnön mukaisella vektorilla transformoiduissa E. coli -soluissa tunnetulla tavalla.

Keksinnön muita puolia ja sen edullisia suoritusmuotoja valaistaan tarkemmin seuraavassa, ja ne määritel-20 lään patenttivaatimuksissa.

Kuviot 1-3 valaisevat tarkemmin suoritusmuotoesi-merkkejä. Niinpä kuvio 1 esittää plasmidin pH 131/5 valmistamista tunnetusta plasmidista ptrpLl. Kuvio 2 esittää interleukiini 2 koodaavan plasmidin pH 185/11 valmis-25 tamista tunnetusta plasmidista pH 159/6 ja plasmidista pH 131/5 (kuvio 1). Viimeisenä oleva kuvio 3 esittää fl-in-terferonia koodaavaa plasmidia pH 192/5.

Keksinnön eräänä erityispiirteenä on se, että am-pisilliiniresistenssigeeni, jossa on B-laktamaasipromoot-30 tori, on vektorissa samassa orientaatiossa kuin trp-pro- moottori. On nimittäin yllättävästi käynyt ilmi, että keksinnön mukaisesti muunnetun trp-operonin seurauksena ei ole ainoastaan aloituskodonia seuraavan geenin sangen voimakas ilmentyminen vaan myös fl-laktamaasituotannon in-35 dusoituminen. Suurentunut β-laktamaasipitoisuus antaa re- s 84362 sistenssin suurehkoja ampisilliinipitoisuuksia vastaan, jolloin valikointimahdollisuudet lisääntyvät. Täten käy mahdolliseksi testata nopeasti erityisen suotuisat pro-moottorimutaatiot ja myös nukleotidimuunnokset ribosomi-5 sitoutumiskohdan alueella kunkin ilmentymisen tuloksena olevan proteiinin yhteydessä.

Kun samanaikainen β-laktamaasin muodostuminen on epätoivottavaa, mutta tulisi käyttää ampisilliiniresis- tenssigeenin sisältäviä vektoreita, voidaan tämän muodos- 10 tuminen estää sijoittamalla terminaattori haluttua poly- peptidiä vastaavan rakennegeenin ja β-laktamaasiraken- negeenin väliin. Keksinnön tämän puolen lisäpiirteenä on siten soveltuvan terminaattorin, edullisesti bakteeriter- minaattorin lisääminen mainittujen geenien väliin. Eri- 15 tyisen soveltuva on trp-operonin terminaattori, joka sijoitetaan soveltuvaan kohtaan, esimerkiksi 10-20 nukleotidia rakennegeenin lopetuskodonin (tai lopetuskodonien) jälkeen tai välittömästi β-laktamaasioperonin eteen.

Keksinnön mukainen geenirakenne, jossa on trp-20 proottori/operaattori voidaan muodostaa kaikkiin E. co-lissa replikoituviin plasmideihin. Edullisesti käytetään tavanomaisia E. coli -vektoreita, kuten pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8 ja niiden johdoksia. Johdoksina tulevat kyseeseen esimerkiksi sellaiset plasmidit, joista 25 on poistettu tarpeettomia alueita tai joihin on tuotu pilkkoutumiskohtia tai markkereita tai joissa näitä kohtia on muutettu.

Geenisekvenssit II, IV, V, VII ja VIII sisältävät nukleotidiparissa XY alun halutulle rakennegeenille, esi-30 merkiksi lähinnä isännän omalle geenille, joka koodaa proteiinia, joka saa aikaan kuljetuksen periplasma-alueelle tai solukalvoon. Tällä tavalla voidaan valmistaa myös fuusioproteiineja, jotka poistuvat plasmasta ja ovat siten helpommin eristettäviä ja/tai suojattuja solun omi-35 en entsyymien aiheuttamaa pilkkoutumista vastaan. Voidaan 6 84362 valmistaa myös fuusioproteiineja, joita on helppo erottaa solun omista proteiineista liukenemattomuutensa perusteella. Lisäksi on mahdollista saada aikaan suora ilmentyminen haluttuina proteiineina sijoittamalla rakennegee-5 ni välittömästi aloituskodonin ATG jälkeen.

Esimerkkejä polypeptideistä, joita voidaan valmistaa keksinnön mukaisesti, ovat insuliini, interferonit, interleukiinit, kuten interleukiini 2, hirudiini ja soma-tostatiini.

10 Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavissa esimer keissä. Yksittäisten menetelmävaiheiden suhteen viitataan Maniatisin et ai. oppikirjaan Molecular Cloning, Gold Spring Harbor, 1982.

Esimerkki 1 t 15 Kromosomaalinen E. coli -DNA pilkotaan Hinfl:llä, ja eristetään 492 emäsparin fragmentti, joka sisältää trp-operonin lisäksi promoottorin, operaattorin, L-pep-tidin rakennegeenin, vaimentimen ja trp-E-rakennegeenin kuutta ensimmäistä aminohappoa vastaavat kadonit. Tämä 20 fragmentti täydennetään Klenow-polymeraasin avulla deok-sinukleotiditrifosfaateilla, liitetään molemmista päistään oligonukleotidiin, joka sisältää Hindlll-tunnistus-jakson, ja pilkotaan sitten HindIII:lla. Siten saatu ' Hindlll-fragmentti ligatoidaan pBR322:n Hindlll-kohtiin.

25 Siten saadaan plasmidi ptrpE2-l [J.C. Edman, et ai., siteerattu yllä]. Tämä muutetaan kuvatulla tavalla plasmi-diksi ptrpLl.

Tämän lähtötuotteen muuttamiseksi keksinnön mukaiseksi vektoriksi, pilkotaan ensin mainittu Clalrllä val- 30 mistäjän (New England Biolobs) ohjeiden mukaisesti. Kun inkubointl on saatettu loppuun, uutetaan inkubointiseos fenolilla, erotetaan orgaaninen kerros, ja saostetaan DNA lisäämällä 2,5-kertainen tilavuus etanolia ja inkuboimal-la -20* C:ssa.

35 Kun DNA on erotettu sentrifugoimalla, se käsitel- 7 84362 lään alkalisella fosfataasilla (Boehringer Mannheim) 5'-fosfaattriryhmien poistamiseksi.

Synteettisesti valmistettu oligonukleotidi IX

5' CGACCATGGT 3' (IX) 5 fosforyloidaan 5'-päästään polynukleotidikinaasientsyymin ja ATP:n avulla. Tämä tehdään pitämällä synteettistä oli-gonukleotidia 5 min. 70° C:ssa ja jäähdyttämällä se sitten heti jäähauteessa. Fosforylointi tehdään pitämällä oligonukleotidia 25 piissä puskuria [50 mmol/1 Tris-HCl, 10 pH 7,6; 10 mmol/1 MgCl2, 5 nunol/1 ditiotreitolia (DTT) ], johon on lisätty 100 pmol/l ATP:tä ja noin 10 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia, 37° C:ssa 30 min. Reaktio päätetään lisäämällä etyleenidiamiinitetraetikkahapon (EDTA) natriumsuolaa loppupitoisuudeksi 50 pmol/l. Ylimääräinen 15 ATP voidaan poistaa esimerkiksi tekemällä geenisuodatus Sepharoosilla ((R)SEPHADEX G 50, hienojakoinen).

Oligonukleotidi IX on itsekomplementaarinen ja voi muodostaa kaksisäikeisen rakenteen X.

51 CGACCATGGT 3' 20 TGGTACCAGC (X) Tässä kaksisäikeisessä oligonukleotidissa X on yk-sisäikeiset päät, jotka tekevät mahdolliseksi sijoittamisen avatun plasmidin ptrpLl Clal-kohtiin.

Noin 50 ng oligonukleotidia inkuboidaan noin 1 25 pg:n kanssa reagoinutta, fosfataasilla käsiteltyä plas-midia 30 pl;ssa puskuria (50 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,4; 10 mmol/1 MgCl2, 10 mmol/1 DTT), johon on lisätty pitoisuudeksi 1 mmol/1 ATP:ta ja 0,1 ng/ml naudan seerumialbumiinia (BSA), 12° C:ssa 20 tuntia. Saadaan plasmidi pH 131/5 30 (kuvio 1).

Tämä reaktioseos voidaan käyttää välittömästi kompetenttien E. coli-solujen transformointiin. Valikointi tehdään agarmaljoilla, jotka sisältävät L-ravintoalustaa ja 50 pg/ml ampisilliinia [H.J. Miller, Experiments in 35 Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972].

8 84362

Koska plasmidiin pH 131/5 oli tuotu Ncol-pilkkou-tumiskohta, tutkittiin ampisilliiniresistenteistä pesäkkeistä se, sisältääkö saatu plasmidi-DNA noin 300 emäspa-rin kokoisen HindiII-NcoI -fragmentin. Yli 80 % pesäk-5 keistä sisälsi tämän fragmentin. Maxam-Gilbertin mukaisesti tehty sekvenointi vahvisti synteettisen fragmentin mukanaolon ja kuvan I mukaisen plasmidin pH 131/5 esitetyn sekvenssin.

Esimerkki 2 10 DE-hakemusjulkaisun 3 419 995 kuvion 5 mukaista plasmidia pl59/6 inkuboidaan EcoRI- ja Sali-entsyymien kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti, ja erotetaan gee-lielektroforeesilla 420 emäsparin DNA-fragmentti, joka sisältää ihmisen interleukiini 2 vastaavan geneettisen t 15 informaation. Yksisäikeiset päät poistetaan mungpapunuk-leaasilla (Pharmacia P-L Biochemicals) valmistajan suosittelemissa olosuhteissa.

Plasmidin pH131/5 annetaan reagoida Ncolrn kanssa, ja poistetaan yksisäikeiset päät samoin mungpapunukleaa-20 silla. Sitten liitetään nyt tylppäpäinen interleukiini 2 vastaava rakennegeeni tylppäpäiseksi tehtyyn avattuun plasmidiin DNA-ligaasin avulla "blunt end"-olosuhteissa. Tällöin muodostuu uudelleen Ncol-pilkkoutumiskohta. Κύη on transformoitu E. coli 294, tehdään ampisilliiniresis-25 tenttien kloonien, joissa on sopivat restriktiofragmen-tit, esimerkiksi noin 260 emäsparin EcoRI-Xbal -fragmentti tai noin 150 emäsparin EcoRI-SacI -fragmentti, valikointi .

Plasmidista pH185/ll (kuvio 2) vahvistettiin nuk-30 leotidisekvenssi sekvenssianalyysillä. Tässä rakenteessa on säilynyt Ncol-restriktiokohta.

Interleukiini 2:n ilmentämiseksi inkuboidaan E. coli -294 -bakteereja, jotka sisältävät plasmidin pH 185/11, LB-alustassa [H.J. Miller, loc cit.], joka sisäl-35 tää 50 pg/ml ampisilliinia, yön yli ilmastaen. Sitten 9 84362 tehdään laimennus suhteessa 1:100 M9-alustaan [H.J. Miller, siteerattu yllä], joka sisältää 1 pg/ml tiamiinia ja 500 pg/ml kasaminohappoja. Optisen tiheyden (OD) ollessa 0,5 voidaan tehdä indusointi indolyyli-3-akryylihapolla 5 loppupitoisuuteen 15 pg/ml asti. Kun on inkuboitu vielä 2-3 tuntia, erotetaan bakteerit sentrifugoimalla. SDS-geelielektroforeesilla voidaan todeta indusoitujen bakteerien ollessa kyseessä voimakas proteiinivyöhyke, joka reagoi DE-hakemusjulkaisun 3 419 995 mukaisesti valmiste-10 tun interleukiini 2:n vasta-aineiden kanssa. Vyöhyke vastaa interleukiini 2:n odotettua molekyylipainoa, eikä sitä esiinny indusoimattomien bakteerien yhteydessä. Interleukiini 2 -aktiivisuus voidaan todeta pitoisuuden ollessa suuri indusoiduissa bakteereissa.

15 Edellä mainitut bakteeriviljelyolosuhteet pätevät ravistuspullojen ollessa kyseessä. Fermentoitaessa suurempiin OD-arvoihin (yli 3) tulee kasaminohappoja ja/tai L-tryptofaania lisätä suuremmiksi pitoisuuksiksi. Esimerkki 3 20 Ihmisen β-interferonia vastaava rakennegeeni saa tiin cDNA-pankista. Kloonit sisältävät insertin plasmidin pBR322 PstI-kohdassa. Restriktioentsyymien Hinfl ja PstI avulla eristettiin β-interferonirakennegeenistä 120 emäs-parin pala. Hinfl-tunnistusjakso alkaa siinä 16 nukleoti-25 dia biologisesti aktiivisen β-interferonin N-terminaalis-ta metioniinia vastaavan kadonin jälkeen.

Synteettisesti valmistettu oligonukleotidi XI 5' CATGAGCTACAATCTTCTTGG 3' 3' TCGATGTTAGAAGAACCTAA 5' (XI) 30 Ncol Hinfl liitetään DNA-ligaasin avulla fragmentin HinfI-päähän. Saadaan DNA-jakso XII.

β-interferonirakennegeenistä eristettiin Pstlillä ja BglII:lla 365 emäsparin mittainen DNA-jakso. Tämä jak-35 so kloonattiin tavanomaiseen plasmidiin pUC12, jonka oli 10 84362 ennalta annettu reagoida Pstl:n ja BamHIrn kanssa. Saadaan plasmidi pH188. Ampilifioinnin ja uudelleeneristämi-sen jälkeen inkuboidaan plasmidia pH188 Pstlrn ja EcoRI:n kanssa, ja eristetään β-interferonigeenifragmentti (DNA-5 jakso XIII).

Plasmidin pH131/5 annetaan reagoida restriktio-entsyymien Ncol ja EcoRI kanssa. Sen jälkeen DNA-jaksoja XII ja XIII inkuboidaan avatun plasmidin kanssa DNA-li-gaasientsyymin läsnä ollessa olosuhteissa, jotka johtavat 10 kovalenttiseen sitoutumiseen. Restriktio- ja sekvenssi- analyysillä vahvistettiin plasmidin pH192/5 odotettu sekvenssi (kuvio 3).

β-interferonin tuottamiseksi menetellään esimerkin 2 mukaisesti. Myös tässä yhteydessä havaitaan induktion 15 jälkeen elektroforeesigeelillä selvä vyöhyke, jota ei esiiny indusoimattomien bakteerien yhteydessä. Bakteeri-uutteissa on havaittavissa β-interferonin biologinen aktiivisuus.

Plasmidin pH131/5 Ncol-kohtaan sijoitettiin esi-20 merkin 2 mukaisesti interleukiini 2 vastaava rakennegee-ni. Kun plasmidin oli annettu reagoida EcoRI:n kanssa, tehtiin yksisäikeisistä päistä tylppäpäiset inkuboimalla Klenow-polymeraasin kanssa.

Kaupallisesti saatavissa olevan trp-operonin ter-25 minaattori (Pharmacia P-L Biochemicals) lisätään tähän avattuun, tylppäpäiseen plasmidiin "blunt end"-olosuhteissa tehden samalla renkaan sulkeminen.

Kun bakteereita on viljelty ja on tehty indusointi esimerkissä 2 ja edellä kuvatulla tavalla, tehdään bak-30 teerien erotus ja hajotus. SDS-geelielektroforeesissa näkyy muuttumattomana interleukiini 2 -proteiinin vyöhyke, jonka intensiteetti on samanlainen kuin esimerkissä 2. β-laktaasia vastaavan vyöhykkeen intensiteetti on kuitenkin selvästi pienempi.

35

Claims (8)

11 84362

1. E. colin trp-operonin DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että sen (koodavan säikeen) sekvenssi 5 on I 5' GTATCGACC 3' (I) joka liittyy 5'-päästään Shine-Dalgarno -sekvenssiin AAGG ja 3'-päästään aloituskodoniin ATG.

2. Patenttivatimuksen 1 mukainen DNA, tunnet-10 t u siitä, että sen (koodaavan säikeen) sekvenssi on Ia 5' GTATCGACCATGG 3' (Ia) joka liittyy 5'-päästään Shine-Dalgarno -sekvenssiin AAGG ja jossa 3'-päässä oleva G on rakennegeenin aloituskodo-nin jälkeinen ensimmäinen nukleotidi.

3. Menetelmä E. colin trp-ilmentymisjärjestelmän sisältävän vektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että E. coli -vektori, joka sisältää DNA-sekvenssin I (koodaava säie), jota seuraa 5' ATGG 3', pilkotaan rest-riktioentsyymillä Ncol ja 20 a) ligatoidaan pilkkoutumiskohtaan geenirakenne, jonka DNA-sekvenssi on II 5' CATGX...3' 3' Y...5' (II) jossa X ja Y ovat rakennegeenin aloituskodonin jälkeinen 25 ensimmäinen komplementaarinen nukleotidipari, tai b) täydennetään pilkkoutumiskohta entsymaattisesti ja ligatoidaan yhteen DNA, jonka sekvenssi on III 5' GTA TCG ACC ATG 3' 3' CAT AGC TGG TAC 5' (III) 30 ja DNA, jonka sekvenssi on IV 5' X...3' 3' Y...5' (IV) jossa X ja Y ovat edellä määritellyt, tai c) poistetaan pilkkoutumiskohdan yksisäikeinen pää 35 entsymaattisesti ja ligatoidaan DNA, jonka sekvenssi on VI i2 84 362 5’ GTA TCG AC 3' 3' CAT AGC TG 5’ (VI) ja DNA, jonka sekvenssi on VII

4. E. coli, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaisesti saadun vektorin, 10 jolloin Z on C ja Z' on G.

5. Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi geneettisesti koodattavissa olevista aminohapoista, tunnettu siitä, että saatetaan ilmentyminen tapahtumaan patenttivaatimuksen 4 mukaisissa E. coli -soluissa.

5. Z ATG X...3' 5 3’ Z'TAC Y...5' (VII) jossa Z ja Z' ovat haluttu nukleotidipari, joka voi myös puuttua.

6. Plasmidi pH131/5, tunnettu siitä, että se on kuvion 1 mukainen.

7. Plasmidi pHl85/ll, tunnettu siitä, että se on kuvion 2 mukainen.

8. Plasmidi pH192/5, tunnettu siitä, että 20 se on kuvion 3 mukainen. i3 84362