JPH0665317B2 - ｔｒｐオペロンのシヤイン‐ダルガーノ配列と開始コードンとの間のＤＮＡ配列におけるタンパク質発現を増大させるための改変 - Google Patents
ｔｒｐオペロンのシヤイン‐ダルガーノ配列と開始コードンとの間のＤＮＡ配列におけるタンパク質発現を増大させるための改変Info
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- JPH0665317B2 JPH0665317B2 JP61089832A JP8983286A JPH0665317B2 JP H0665317 B2 JPH0665317 B2 JP H0665317B2 JP 61089832 A JP61089832 A JP 61089832A JP 8983286 A JP8983286 A JP 8983286A JP H0665317 B2 JPH0665317 B2 JP H0665317B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、大腸菌由来のｔｒｐ発現系を含むベクターを
用いた、一般にコード可能なアミノ酸から構成されるポ
リペプチドの製造技術に関する。
用いた、一般にコード可能なアミノ酸から構成されるポ
リペプチドの製造技術に関する。
ｔｒｐオペロンの調節配列は、大腸菌における真核生物
のタンパク質の発現のためにしばしば使用される。ｔｒ
ｐオペロンのプロモーター及びオペレーターを含むＤＮ
Ａ断片は、現在商業的に入手可能である。
のタンパク質の発現のためにしばしば使用される。ｔｒ
ｐオペロンのプロモーター及びオペレーターを含むＤＮ
Ａ断片は、現在商業的に入手可能である。
ｔｒｐオペロンの調節配列の改変については既に開示さ
れていた。例えば、セラチア・マルセセンス（Serratia
marcescens）由来ｔｒｐオペロンの調節因子であるヌ
クレオチド配列において、リボソーム結合部位と開始コ
ードンとの間にＨｉｎｄIII切断部位を組込みうる可能
性のあることが、たとえば西独公開第３，２４７，９２
２号明細書（南アフリカ特許第８３／９５１９号及び公
開オーストラリア特許出願第１８３／２２８３２号に対
応する）に記載されている。ＣｌａＩ切断部位を大腸菌
の対応配列に挿入することは、ジェイ・シー・エドマン
ら、ネーチャー、第２９１巻、１９８１年、第５０３−
５０６頁〔J.C.Edman etal.,Nature 291(1981)503-50
6〕に開示されている。しかしながら、この改変によっ
て、自然配列と比較してリボソーム結合部位と開始コー
ドンとの間のヌクレオチド数が変わることになる。
れていた。例えば、セラチア・マルセセンス（Serratia
marcescens）由来ｔｒｐオペロンの調節因子であるヌ
クレオチド配列において、リボソーム結合部位と開始コ
ードンとの間にＨｉｎｄIII切断部位を組込みうる可能
性のあることが、たとえば西独公開第３，２４７，９２
２号明細書（南アフリカ特許第８３／９５１９号及び公
開オーストラリア特許出願第１８３／２２８３２号に対
応する）に記載されている。ＣｌａＩ切断部位を大腸菌
の対応配列に挿入することは、ジェイ・シー・エドマン
ら、ネーチャー、第２９１巻、１９８１年、第５０３−
５０６頁〔J.C.Edman etal.,Nature 291(1981)503-50
6〕に開示されている。しかしながら、この改変によっ
て、自然配列と比較してリボソーム結合部位と開始コー
ドンとの間のヌクレオチド数が変わることになる。
本発明の概要 制限酵素の切断部位を、ヌクレオチド数を変えずに一つ
のヌクレオチドを置換することによって、リボソーム結
合部位と開始コードンとの間のＤＮＡ配列に挿入するこ
とが可能であることが見出された。本発明では、開始コ
ードンのすぐ上流に位置するヌクレオシドアデノシンが
シチジンに置換されている。
のヌクレオチドを置換することによって、リボソーム結
合部位と開始コードンとの間のＤＮＡ配列に挿入するこ
とが可能であることが見出された。本発明では、開始コ
ードンのすぐ上流に位置するヌクレオシドアデノシンが
シチジンに置換されている。
このように、本発明は大腸菌ｔｒｐオペロンの改変ＤＮ
Ａ断片に関連しており、この断片はシャイン−ダルガー
ノ（Shine-Dalgarno）配列と第一開始コードンとの間に
位置するものであって、下記のＤＮＡ配列Ｉを有するも
のである。
Ａ断片に関連しており、この断片はシャイン−ダルガー
ノ（Shine-Dalgarno）配列と第一開始コードンとの間に
位置するものであって、下記のＤＮＡ配列Ｉを有するも
のである。
５′ＧＴＡＴＣＧＡＣＣ ３′ （Ｉ） ３′ＣＡＴＡＧＣＴＧＧ ５′ この配列Ｉは、上部鎖の５′末端で下記のｔｒｐオペロ
ンのシャイン−ダルガーノ配列（ＲＮＡの段階では、現
実のリボソーム結合部位に対応）と結合し、上部鎖の
３′末端で開始コードンＡＴＧと結合している。
ンのシャイン−ダルガーノ配列（ＲＮＡの段階では、現
実のリボソーム結合部位に対応）と結合し、上部鎖の
３′末端で開始コードンＡＴＧと結合している。
５′ＡＡＧＧ ３′ ３′ＴＴＣＣ ５′ 本発明における配列Ｉは、「コーディング鎖」と称され
る上部鎖のみについて、下記のように明確化を期して示
されるように、天然大腸菌配列及び前記エドマンらによ
り開示された配列と比較される。
る上部鎖のみについて、下記のように明確化を期して示
されるように、天然大腸菌配列及び前記エドマンらによ
り開示された配列と比較される。
大腸菌 ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＡ エドマンら ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＴ 配列Ｉ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＣ （大腸菌配列との違いは下線部分である。） 天然配列におけるＡをＣとする本発明による置換によれ
ば、下記の利点が得られる。
ば、下記の利点が得られる。
ヌクレオシドグアノシンを開始コードンＡＴＧの下流に
結合させれば、制限酵素ＮｃｏＩについての認識配列が
形成される。
結合させれば、制限酵素ＮｃｏＩについての認識配列が
形成される。
Ｃ↓ＣＡＴＧＧ この切断部位のおかげで、例えば下式IIの合成オリゴヌ
クレオチドを用いることにより、開始コードンのすぐ隣
にＤＮＡを挿入することが可能になる。
クレオチドを用いることにより、開始コードンのすぐ隣
にＤＮＡを挿入することが可能になる。
５′ＣＡＴＧＸ……３′ （II） ３′ Ｙ……５′ （上記式中、Ｘ及びＹは構造遺伝子の開始コードン下流
における最初の相補的ヌクレオチド対を表わす） この式においてＸがＧを表わし、ＹがＣを表わす場合
は、ＮｃｏＩ切断部位は結合生成物中に残存する。逆
に、例えば合成リンカーが挿入され、その突出配列５′
ＣＡＴＧ３′が別のヌクレオチドと結合することになる
ならば、ＮｃｏＩ切断部位は消失するものの、一方では
開始コードンの下流の最初のアミノ酸は各種多様のもの
に変えることができる。
における最初の相補的ヌクレオチド対を表わす） この式においてＸがＧを表わし、ＹがＣを表わす場合
は、ＮｃｏＩ切断部位は結合生成物中に残存する。逆
に、例えば合成リンカーが挿入され、その突出配列５′
ＣＡＴＧ３′が別のヌクレオチドと結合することになる
ならば、ＮｃｏＩ切断部位は消失するものの、一方では
開始コードンの下流の最初のアミノ酸は各種多様のもの
に変えることができる。
勿論、ＮｃｏＩで切断されたＤＮＡの突出末端を、例え
ばクレノウポリメラーゼを用いて酵素的に埋填し、更に
このようにして得られた配列III： ５′ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ３′ （II
I） ３′ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ５′ の平滑（ブラント）末端ＤＮＡを、平滑末端配列IV： ５′ Ｘ……３′ （IV） ３′ Ｙ……５′ と結合させて、ＤＮＡ配列Ｖ： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＴＧ Ｘ……３′
（Ｖ） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＡＣ Ｙ……５′ （Ｘ及びＹは前記の意味を有する） を得ることも可能である。発現すべき特定の構造遺伝子
のための開始コードンは、この場合では更に必要とはさ
れない。これは、例えば、Ｎ末端が短くなったタンパク
質を製造するためには好ましいものである。
ばクレノウポリメラーゼを用いて酵素的に埋填し、更に
このようにして得られた配列III： ５′ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ３′ （II
I） ３′ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ５′ の平滑（ブラント）末端ＤＮＡを、平滑末端配列IV： ５′ Ｘ……３′ （IV） ３′ Ｙ……５′ と結合させて、ＤＮＡ配列Ｖ： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＴＧ Ｘ……３′
（Ｖ） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＡＣ Ｙ……５′ （Ｘ及びＹは前記の意味を有する） を得ることも可能である。発現すべき特定の構造遺伝子
のための開始コードンは、この場合では更に必要とはさ
れない。これは、例えば、Ｎ末端が短くなったタンパク
質を製造するためには好ましいものである。
他の可能性は突出末端を酵素的に分解することであっ
て、それによって同様に平滑末端ＤＮＡ配列VI： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣ ３′ （VI） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧ ５′ を得て、これを平滑末端配列VII： ５′ Ｚ ＡＴＧ Ｘ……３′ （VII） ３′ Ｚ′ ＴＡＣ Ｙ……５′ と結合して、ＤＮＡ配列VIII： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＺ ＡＴＧ Ｘ……３′
（VIII） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧＺ′ ＴＡＣ Ｙ……５′ （Ｚ及びＺ′は所望のヌクレオチド対を表わすが、これ
らは省略することもできる） とすることができる。天然大腸菌配列は、Ｚ及びＺ′が
それぞれＡ及びＴを表わす場合に形成される。
て、それによって同様に平滑末端ＤＮＡ配列VI： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣ ３′ （VI） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧ ５′ を得て、これを平滑末端配列VII： ５′ Ｚ ＡＴＧ Ｘ……３′ （VII） ３′ Ｚ′ ＴＡＣ Ｙ……５′ と結合して、ＤＮＡ配列VIII： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＺ ＡＴＧ Ｘ……３′
（VIII） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧＺ′ ＴＡＣ Ｙ……５′ （Ｚ及びＺ′は所望のヌクレオチド対を表わすが、これ
らは省略することもできる） とすることができる。天然大腸菌配列は、Ｚ及びＺ′が
それぞれＡ及びＴを表わす場合に形成される。
これらが様々なクローニングの可能性を有していること
の他に、本発明では構造遺伝子の発現量が著しい程にま
で改善されるという利点を生じる本発明においては、大
腸菌由来のｔｒｐオ発現系を含むベクターの製造法が関
連する。その方法は、ＤＮＡ配列Ｉ（コーディング鎖）
とそれに続く５′ＡＴＧＧ３′を含む大腸菌ベクターを
制限酵素ＮｃｏＩで切断し、更に、 a)ＤＮＡ配列IIの構造遺伝子をこの切断部位に結合させ
るか、あるいは b)この切断部位を酵素的に埋填して、配列IIIのＤＮＡ
を配列IVのＤＮＡと結合させるか、あるいはｃ）この切
断部位の突出配列を酵素的に分解し、配列VIのＤＮＡを
配列VIIのＤＮＡと結合させる、ことからなる。
の他に、本発明では構造遺伝子の発現量が著しい程にま
で改善されるという利点を生じる本発明においては、大
腸菌由来のｔｒｐオ発現系を含むベクターの製造法が関
連する。その方法は、ＤＮＡ配列Ｉ（コーディング鎖）
とそれに続く５′ＡＴＧＧ３′を含む大腸菌ベクターを
制限酵素ＮｃｏＩで切断し、更に、 a)ＤＮＡ配列IIの構造遺伝子をこの切断部位に結合させ
るか、あるいは b)この切断部位を酵素的に埋填して、配列IIIのＤＮＡ
を配列IVのＤＮＡと結合させるか、あるいはｃ）この切
断部位の突出配列を酵素的に分解し、配列VIのＤＮＡを
配列VIIのＤＮＡと結合させる、ことからなる。
本発明においては、上記の方法により得られたベクター
を含む大腸菌宿主生物が関連する。本発明は、一般にコ
ード可能なアミノ酸からなるポリプチドの製造法に関す
るものであって、この方法は上記のベクターで形質転換
された大腸菌細胞による発現を公知の方法で誘発させる
ことからなるものである。
を含む大腸菌宿主生物が関連する。本発明は、一般にコ
ード可能なアミノ酸からなるポリプチドの製造法に関す
るものであって、この方法は上記のベクターで形質転換
された大腸菌細胞による発現を公知の方法で誘発させる
ことからなるものである。
すなわち、本発明による上記ポリペプチドの製造は、下
記の工程（ｉ）および（ii）からなるものである。
記の工程（ｉ）および（ii）からなるものである。
（ｉ）下記のコーディング鎖ＤＮＡ配列Ｉ： ５′ＧＴＡＴＣＧＡＣＣ ３′ （Ｉ） とそれに続く５′ＡＴＧＧ３′とを含む大腸菌のベクタ
ーを制限酵素ＮｃｏＩで切断し、更に、 a)この切断部位において、下記のＤＮＡ配列ＩＩ： ５′ＣＡＴＧＸ…３′ （II） ３′ Ｙ…５′ （上記式中、ＸおよびＹは構造遺伝子の開始コードンの
下流における最初の相補的ヌクレオチド対を表わす） の遺伝子構造物を結合させるか、あるいは b)この切断部位を酵素的に埋填し、下記の配列IIIのＤ
ＮＡ： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ３′ （II
I） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ５′ を下記の配列ＩＶのＤＮＡ： ５′Ｘ…３′ （IV） ３′Ｙ…５′ （上記式中、ＸおよびＹは上記の意味を有する） と結合させるか、あるいは c)この切断部位における突出配列を酵素的に分解し、下
記の配列ＶＩのＤＮＡ： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣ ３′ （VI） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧ ５′ を下記の配列VIIのＤＮＡ： ５′ Ｚ ＡＴＧ Ｘ…３′ （VII） ３′ Ｚ′ ＴＡＣ Ｙ…５′ （ＺおよびＺ′は所望のヌクレオチド対を表わすが、こ
れらは省略することもできる） と結合させる、ことによって作製した大腸菌のｔｒｐ発
現系を有するベクターで大腸菌細胞を形質転換するこ
と。
ーを制限酵素ＮｃｏＩで切断し、更に、 a)この切断部位において、下記のＤＮＡ配列ＩＩ： ５′ＣＡＴＧＸ…３′ （II） ３′ Ｙ…５′ （上記式中、ＸおよびＹは構造遺伝子の開始コードンの
下流における最初の相補的ヌクレオチド対を表わす） の遺伝子構造物を結合させるか、あるいは b)この切断部位を酵素的に埋填し、下記の配列IIIのＤ
ＮＡ： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ３′ （II
I） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ５′ を下記の配列ＩＶのＤＮＡ： ５′Ｘ…３′ （IV） ３′Ｙ…５′ （上記式中、ＸおよびＹは上記の意味を有する） と結合させるか、あるいは c)この切断部位における突出配列を酵素的に分解し、下
記の配列ＶＩのＤＮＡ： ５′ ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣ ３′ （VI） ３′ ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧ ５′ を下記の配列VIIのＤＮＡ： ５′ Ｚ ＡＴＧ Ｘ…３′ （VII） ３′ Ｚ′ ＴＡＣ Ｙ…５′ （ＺおよびＺ′は所望のヌクレオチド対を表わすが、こ
れらは省略することもできる） と結合させる、ことによって作製した大腸菌のｔｒｐ発
現系を有するベクターで大腸菌細胞を形質転換するこ
と。
（ii）この大腸菌細胞における発現を誘発させること。
本発明の他の面及びそれらの好ましい態様は、以下で詳
細に説明されており、しかも特許請求の範囲において掲
げられている。
細に説明されており、しかも特許請求の範囲において掲
げられている。
発明の具体的説明 本発明の具体的態様は、ｔｒｐプロモーターと同じよう
に配向するβ−ラクタマーゼプロモーターを有し、アン
ピシリン耐性をもつベクターからなる。即ち、このベク
ターは、本発明に従って改変されたｔｒｐオペロンであ
るため、開始コードン下流の遺伝子の極めて顕著な発現
とβ−ラクタマーゼ誘導の可能性とが以外なことに生じ
ているのである。β−ラクタマーゼ濃度が高まると比較
的高濃度のアンピシリンに対しても耐性を示すため、そ
れを利用して選別するもう一つの可能性が開けてくる。
これにより、発現すべき各タンパク質についてリボソー
ム結合部位領域におけるヌクレオチドが特に好ましいプ
ロモーター変異ないし改変を起こしたか否かを調べるこ
とが迅速になるのである。
に配向するβ−ラクタマーゼプロモーターを有し、アン
ピシリン耐性をもつベクターからなる。即ち、このベク
ターは、本発明に従って改変されたｔｒｐオペロンであ
るため、開始コードン下流の遺伝子の極めて顕著な発現
とβ−ラクタマーゼ誘導の可能性とが以外なことに生じ
ているのである。β−ラクタマーゼ濃度が高まると比較
的高濃度のアンピシリンに対しても耐性を示すため、そ
れを利用して選別するもう一つの可能性が開けてくる。
これにより、発現すべき各タンパク質についてリボソー
ム結合部位領域におけるヌクレオチドが特に好ましいプ
ロモーター変異ないし改変を起こしたか否かを調べるこ
とが迅速になるのである。
β−ラクタマーゼの同時的形成は望まれないがアンピシ
リン耐性をもつベクターを利用しようとする場合は、所
望のポリペプチドについての構造遺伝子とβ−ラクタマ
ーゼについての構造遺伝子との間にターミネーターを挿
入することによって、その同時的形成を抑制することが
できる。したがって、本発明のこの点におけるもう一つ
の態様は、上記遺伝子間に適切なターミネーター、好ま
しくは細菌性ターミネーター、を挿入することからな
る。ｔｒｐオペロンのターミネーターが特に適切であ
り、例えば構造遺伝子における停止コードン（２種以上
の停止コードン）の下流か、又はβ−ラクタマーゼオペ
ロンのすぐ上流に存在する１０〜２０個のヌクレオチド
のような適切な部位に組込まれる。
リン耐性をもつベクターを利用しようとする場合は、所
望のポリペプチドについての構造遺伝子とβ−ラクタマ
ーゼについての構造遺伝子との間にターミネーターを挿
入することによって、その同時的形成を抑制することが
できる。したがって、本発明のこの点におけるもう一つ
の態様は、上記遺伝子間に適切なターミネーター、好ま
しくは細菌性ターミネーター、を挿入することからな
る。ｔｒｐオペロンのターミネーターが特に適切であ
り、例えば構造遺伝子における停止コードン（２種以上
の停止コードン）の下流か、又はβ−ラクタマーゼオペ
ロンのすぐ上流に存在する１０〜２０個のヌクレオチド
のような適切な部位に組込まれる。
本発明におけるｔｒｐプロモーター／オペレーターをも
つ遺伝子構成体は、大腸菌内で複製されるすべてのプラ
スミドの中に組込むことができる。商業的に利用可能な
大腸菌ベクター、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８及びそ
れらの誘導体を使用することが有利である。適切な誘導
体の例は、非本質的領域が除去され、切断部位もしくは
マーカーが組込まれるか又は修正されたそれらのプラス
ミドである。
つ遺伝子構成体は、大腸菌内で複製されるすべてのプラ
スミドの中に組込むことができる。商業的に利用可能な
大腸菌ベクター、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８及びそ
れらの誘導体を使用することが有利である。適切な誘導
体の例は、非本質的領域が除去され、切断部位もしくは
マーカーが組込まれるか又は修正されたそれらのプラス
ミドである。
遺伝子配列II、IV、Ｖ、VII及びVIIIは、ヌクレオチド
対ＸＹとともに、所望の構造遺伝子、例えば第一には、
宿主に内在しかつペリプラズム腔又は細胞膜に輸送され
るタンパク質をコードする遺伝子の最初の部分を含む。
この場合には、細胞質からの分離が可能であるために容
易に単離され、あるいは（また）細胞に内在する酵素に
よる分解から保護される融合タンパク質を製造すること
ができる。しかしながら、不溶性であるために細胞内在
タンパク質から容易に分離することができる融合タンパ
ク質を生成することも可能である。更には、開始コード
ンＡＴＧのすぐ下流に構造遺伝子を組込むことによっ
て、直接に所望のタンパク質を発現させることもでき
る。
対ＸＹとともに、所望の構造遺伝子、例えば第一には、
宿主に内在しかつペリプラズム腔又は細胞膜に輸送され
るタンパク質をコードする遺伝子の最初の部分を含む。
この場合には、細胞質からの分離が可能であるために容
易に単離され、あるいは（また）細胞に内在する酵素に
よる分解から保護される融合タンパク質を製造すること
ができる。しかしながら、不溶性であるために細胞内在
タンパク質から容易に分離することができる融合タンパ
ク質を生成することも可能である。更には、開始コード
ンＡＴＧのすぐ下流に構造遺伝子を組込むことによっ
て、直接に所望のタンパク質を発現させることもでき
る。
本発明によって得ることができるポリペプチドの例とし
ては、インシュリン、インターフェロン類、インターロ
イキン−２のようなインターロイキン類、ヒルジン又は
ソマトスタチンがある。
ては、インシュリン、インターフェロン類、インターロ
イキン−２のようなインターロイキン類、ヒルジン又は
ソマトスタチンがある。
本発明は下記の諸例により詳細に説明される。各プロセ
ス段階については、マニアティス（Maniatis）ら、コー
ルド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）
（１９８２年）の“モレキュラー・クローニング（Mole
cular Cloning）”を参考にすることができる。
ス段階については、マニアティス（Maniatis）ら、コー
ルド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）
（１９８２年）の“モレキュラー・クローニング（Mole
cular Cloning）”を参考にすることができる。
例１ 大腸菌染色体ＤＮＡをＨｉｎｆＩで切断して、プロモー
ター、オペレーター、Ｌ−ペプチドの構造遺伝子アテニ
ュエーター及び最初の６個のアミノ酸についてのトリプ
トファンＥ構造遺伝子のコードンを含むｔｒｐオペロン
の４９２塩基対断片を単離する。この断片をクレノウポ
リメラーゼによってデオキシヌクレオチド三リン酸で埋
填し、その両端部をＨｉｎｄIII認識配列をもつオリゴ
ヌクレオチドと結合させ、それからＨｉｎｄIIIで切断
する。このようにして得たＨｉｎｄIII断片をｐＢＲ３
２２のＨｉｎｄIII切断部位と結合させる。こうして得
られるプラスミドがｐｔｒｐＥ２−１である（前記ジェ
イ・シー・エドマンらの文献参照）。このプラスミド
は、記述のようにしてプラスミドｐｔｒｐＬ１に転換さ
れる。
ター、オペレーター、Ｌ−ペプチドの構造遺伝子アテニ
ュエーター及び最初の６個のアミノ酸についてのトリプ
トファンＥ構造遺伝子のコードンを含むｔｒｐオペロン
の４９２塩基対断片を単離する。この断片をクレノウポ
リメラーゼによってデオキシヌクレオチド三リン酸で埋
填し、その両端部をＨｉｎｄIII認識配列をもつオリゴ
ヌクレオチドと結合させ、それからＨｉｎｄIIIで切断
する。このようにして得たＨｉｎｄIII断片をｐＢＲ３
２２のＨｉｎｄIII切断部位と結合させる。こうして得
られるプラスミドがｐｔｒｐＥ２−１である（前記ジェ
イ・シー・エドマンらの文献参照）。このプラスミド
は、記述のようにしてプラスミドｐｔｒｐＬ１に転換さ
れる。
この出発物質を本発明のベクターに変えるために、これ
をＣｌａＩと反応させる〔製造者〔ニューイングランド
バイオラブス（New England Biolabs）〕の勧めに従
う〕。インキュベート終了後、インキュベート混合物を
フェノールで抽出し、有機相を分離し、続いて２．５倍
容量のエタノールを加え、−２０℃でインキュベートす
ることにより、ＤＮＡを沈澱させる。
をＣｌａＩと反応させる〔製造者〔ニューイングランド
バイオラブス（New England Biolabs）〕の勧めに従
う〕。インキュベート終了後、インキュベート混合物を
フェノールで抽出し、有機相を分離し、続いて２．５倍
容量のエタノールを加え、−２０℃でインキュベートす
ることにより、ＤＮＡを沈澱させる。
ＤＮＡを遠心除去し、しかる後５′−リン酸残基を除く
ためにアルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社）で処理する。
ためにアルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社）で処理する。
合成的に得られるオリゴヌクレオチドIX： ５′ ＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴ ３′ （IX） をポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰにより５′末端
でリン酸化する。このためには、この合成オリゴヌクレ
オチドを７０℃で５分間加熱し、しかる後直ちに氷浴中
で冷却する。リン酸化は、１００μＭ ＡＴＰ及びＴ４
−ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位が添加された緩衝
液２５μｌ（５０ｍＭトリスＨＣｌ、pH７．６０、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ））中、３７℃で３０分間にわたり処理する。反応
を、最終濃度５０μＭとなるまでエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩を加えることによって停
止させる。過剰のＡＴＰは、例えばセファロース（商標
名ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ５０、細粒）のゲル過によっ
て除去することができる。
でリン酸化する。このためには、この合成オリゴヌクレ
オチドを７０℃で５分間加熱し、しかる後直ちに氷浴中
で冷却する。リン酸化は、１００μＭ ＡＴＰ及びＴ４
−ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位が添加された緩衝
液２５μｌ（５０ｍＭトリスＨＣｌ、pH７．６０、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ））中、３７℃で３０分間にわたり処理する。反応
を、最終濃度５０μＭとなるまでエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩を加えることによって停
止させる。過剰のＡＴＰは、例えばセファロース（商標
名ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ５０、細粒）のゲル過によっ
て除去することができる。
オリゴヌクレオチドIXは自己相補的であって、自ら会合
して二重鎖構造Ｘを形成することができる。
して二重鎖構造Ｘを形成することができる。
５′ ＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴ ３′ ＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣ この二重鎖オリゴヌクレオチドＸは突出末端を有してい
るので、これを開環状プラスミドｐｔｒｐＬ１のＣｌａ
Ｉ部位に挿入することができる。
るので、これを開環状プラスミドｐｔｒｐＬ１のＣｌａ
Ｉ部位に挿入することができる。
このオリゴヌクレオチド約５０ｎｇをプラスミド約１μ
ｇと一緒にインキュベートするが、このプラスミドは１
ｍＭ ＡＴＰ及び０．１ｎｇ／ml牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）が添加された緩衝液３０μｌ（５０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ、pH７．４０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤ
ＴＴ）中１２℃で２０時間ホスファターゼで処理された
ものである。プラスミドpH１３１／５が得られる（図
１）。
ｇと一緒にインキュベートするが、このプラスミドは１
ｍＭ ＡＴＰ及び０．１ｎｇ／ml牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）が添加された緩衝液３０μｌ（５０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ、pH７．４０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤ
ＴＴ）中１２℃で２０時間ホスファターゼで処理された
ものである。プラスミドpH１３１／５が得られる（図
１）。
この反応混合物は、コンピテント大腸菌細胞の形質転換
のために直ちに使用することができる。選別は、Ｌブイ
ヨン〔エッチ・ジェイ・ミラー（H.J.Miller）「分子遺
伝学の実験」（Experiments in Molecular Genetic
s）、コールド・スプリング・ハーバー、１９７２年〕
及び５０μｇ／mlアンピシリンを用いて寒天プレート上
で行なわれる。
のために直ちに使用することができる。選別は、Ｌブイ
ヨン〔エッチ・ジェイ・ミラー（H.J.Miller）「分子遺
伝学の実験」（Experiments in Molecular Genetic
s）、コールド・スプリング・ハーバー、１９７２年〕
及び５０μｇ／mlアンピシリンを用いて寒天プレート上
で行なわれる。
ＮｃｏＩ切断部位がプラスミドpH１３１／５に挿入され
ているため、アンピシリン耐性コロニーを試験して、プ
ラスミドＤＮＡが約３００塩基対のＨｉｎｄIII−Ｎｃ
ｏＩ断片を有しているか否かについて調べた。８０％以
上のコロニーがこの断片を有していた。マキサム−ギル
バート法での配列決定により。合成ＤＮＡ断片の組込み
と図１に示したプラスミドpH１３１／５の配列とが確認
された。
ているため、アンピシリン耐性コロニーを試験して、プ
ラスミドＤＮＡが約３００塩基対のＨｉｎｄIII−Ｎｃ
ｏＩ断片を有しているか否かについて調べた。８０％以
上のコロニーがこの断片を有していた。マキサム−ギル
バート法での配列決定により。合成ＤＮＡ断片の組込み
と図１に示したプラスミドpH１３１／５の配列とが確認
された。
例２ 西独公開第３，４１９，９９５号明細書の図５に示され
たプラスミドｐ１５９／６を製造者が勧めるように酵素
ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩと一緒にインキュベートし、ヒ
トインターロイキン−２についての遺伝情報をもつ４２
０塩基対のＤＮＡ断片をゲル電気泳動により分離する。
一重鎖突出末端を、製造者が勧める条件下でヤエナリ
（mungbean）ヌクレアーゼ（ファルマシアＰ−Ｌバイオ
ケミカルズ社、Pharmacia P-L Biochemicals）で分解す
る。
たプラスミドｐ１５９／６を製造者が勧めるように酵素
ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩと一緒にインキュベートし、ヒ
トインターロイキン−２についての遺伝情報をもつ４２
０塩基対のＤＮＡ断片をゲル電気泳動により分離する。
一重鎖突出末端を、製造者が勧める条件下でヤエナリ
（mungbean）ヌクレアーゼ（ファルマシアＰ−Ｌバイオ
ケミカルズ社、Pharmacia P-L Biochemicals）で分解す
る。
このプラスミドpH１３１／５をＮａｃＩと反応させ、突
出一重鎖末端を同様にヤエナリヌクレアーゼで分解す
る。次いで、平滑末端となっているインターロイキン−
２についての構造遺伝子を、「平滑末端」条件下でＤＮ
Ａリガーゼを用いて、開環させかつ平滑末端としてある
プラスミドに組込む。これにより、ＮｃｏＩ切断部位を
再形成させる。大腸菌２９４への形質転換を行ない、適
切な制限断片、例えば約２６０塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｘ
ｂａＩ断片又は約１５０塩基対のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ
断片、をもつアンピシリン耐性クローンを選別する。
出一重鎖末端を同様にヤエナリヌクレアーゼで分解す
る。次いで、平滑末端となっているインターロイキン−
２についての構造遺伝子を、「平滑末端」条件下でＤＮ
Ａリガーゼを用いて、開環させかつ平滑末端としてある
プラスミドに組込む。これにより、ＮｃｏＩ切断部位を
再形成させる。大腸菌２９４への形質転換を行ない、適
切な制限断片、例えば約２６０塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｘ
ｂａＩ断片又は約１５０塩基対のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ
断片、をもつアンピシリン耐性クローンを選別する。
配列決定により、プラスミドpH１８５／１１（図２）の
ヌクレオチド配列を確認した。ＮｃｏＩ制限部位はこの
構造中に残存している。
ヌクレオチド配列を確認した。ＮｃｏＩ制限部位はこの
構造中に残存している。
インターロイキン−２の発現のために、プラスミドpH１
８５／１１含有大腸菌２９４を５０μｇ／mlアンピシリ
ン含有ＬＢ培地（エッチ・ジェイ・ミラーの前記文献参
照）中で通気しながら一夜インキュベートする。次い
で、１μｇ／mlチアミン及び５００μｇ／mlカザミノ酸
含有Ｍ９培地（エッチ・ジェイ・ミラーの前記文献参
照）により１：１００希釈物を調製する。ＯＤ０．５の
状態で、最終濃度１５μｇ／mlとなるまでインドリル−
３−アクリル酸を加えて誘発を行なうことができる。更
に２〜３時間後、遠心分離して細菌を除去する。ＳＤＳ
ゲル電気泳動により、誘発細菌から、西独公開第３，４
１９，９９５号明細書で製造されたインターロイキン−
２に対する抗体と反応する強タンパク質バンドを検出す
ることができる。このバンドは予想される分子量をもつ
インターロイキン−２と一致し、非誘発細菌からは得ら
れない。生物学的活性をもつインターロイキン−２は誘
発細菌において高濃度で検出することができる。
８５／１１含有大腸菌２９４を５０μｇ／mlアンピシリ
ン含有ＬＢ培地（エッチ・ジェイ・ミラーの前記文献参
照）中で通気しながら一夜インキュベートする。次い
で、１μｇ／mlチアミン及び５００μｇ／mlカザミノ酸
含有Ｍ９培地（エッチ・ジェイ・ミラーの前記文献参
照）により１：１００希釈物を調製する。ＯＤ０．５の
状態で、最終濃度１５μｇ／mlとなるまでインドリル−
３−アクリル酸を加えて誘発を行なうことができる。更
に２〜３時間後、遠心分離して細菌を除去する。ＳＤＳ
ゲル電気泳動により、誘発細菌から、西独公開第３，４
１９，９９５号明細書で製造されたインターロイキン−
２に対する抗体と反応する強タンパク質バンドを検出す
ることができる。このバンドは予想される分子量をもつ
インターロイキン−２と一致し、非誘発細菌からは得ら
れない。生物学的活性をもつインターロイキン−２は誘
発細菌において高濃度で検出することができる。
上記細菌培養条件は、振盪フラスコ法でも適用される。
この場合は、更に高濃度のカザミノ酸及び（又は）Ｌ−
トリプトファンをより高いＯＤ値（３以上）で醗酵する
まで添加するようにする。
この場合は、更に高濃度のカザミノ酸及び（又は）Ｌ−
トリプトファンをより高いＯＤ値（３以上）で醗酵する
まで添加するようにする。
例３ ヒトβ−インターフェロンについての構造遺伝子をｃＤ
ＮＡバンクから入手した。このクローンは、プラスミド
ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位にその挿入断片を有してい
る。β−インターフェロンの構造遺伝子由来の１２０塩
基対の断片を、制限酵素ＨｉｎｆＩ及びＰｓｔＩと接触
させることにより単離した。ＨｉｎｆＩ部位の認識配列
は、この生物学的に活性なβ−インターフェロンのＮ末
端メチオニンについてのコードンのヌクレオチド１６個
下流から始まる。
ＮＡバンクから入手した。このクローンは、プラスミド
ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位にその挿入断片を有してい
る。β−インターフェロンの構造遺伝子由来の１２０塩
基対の断片を、制限酵素ＨｉｎｆＩ及びＰｓｔＩと接触
させることにより単離した。ＨｉｎｆＩ部位の認識配列
は、この生物学的に活性なβ−インターフェロンのＮ末
端メチオニンについてのコードンのヌクレオチド１６個
下流から始まる。
合成により得られるオリゴヌクレオチドＸＩ： ５′ ＣＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＴＧＧ
３′（XI） ３′ ＴＣＧＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＡＡ
５′ Ｎｃｏ Ｉ Ｈｉｎｆ
Ｉ をＤＮＡリガーゼによって断片のＨｉｎｆＩ末端に付着
させる。ＤＮＡ断片ＸIIが得られる。
３′（XI） ３′ ＴＣＧＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＡＡ
５′ Ｎｃｏ Ｉ Ｈｉｎｆ
Ｉ をＤＮＡリガーゼによって断片のＨｉｎｆＩ末端に付着
させる。ＤＮＡ断片ＸIIが得られる。
更に、３６５塩基対のＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ及びＢｇ
ｌIIを用いてβ−インターフェロンの構造遺伝子から単
離した。この断片を、予めＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩと反
応させてある商業的に入手可能なプラスミドｐＵＣ１２
を用いてクローン化した。プラスミドpH１８８が得られ
る。増殖・再単離後、プラスミドpH１８８をＰｓｔＩ及
びＥｃｏＲＩと一緒にインキュベートし、β−インター
フェロン遺伝子断片を単離する（ＤＮＡ断片ＸIII）。
ｌIIを用いてβ−インターフェロンの構造遺伝子から単
離した。この断片を、予めＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩと反
応させてある商業的に入手可能なプラスミドｐＵＣ１２
を用いてクローン化した。プラスミドpH１８８が得られ
る。増殖・再単離後、プラスミドpH１８８をＰｓｔＩ及
びＥｃｏＲＩと一緒にインキュベートし、β−インター
フェロン遺伝子断片を単離する（ＤＮＡ断片ＸIII）。
プラスミドpH１３１／５を制限酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏ
ＲＩと反応させる。次いで、ＤＮＡリガーゼ酵素の存在
下、共有結合を生じる条件にて、ＤＮＡ断片ＸII及びＸ
IIIをこの開環状プラスミドと一緒にインキュベートす
る。プラスミドpH１９２／５の予想される配列を制限分
析法及び配列決定法により確認する（図３）。
ＲＩと反応させる。次いで、ＤＮＡリガーゼ酵素の存在
下、共有結合を生じる条件にて、ＤＮＡ断片ＸII及びＸ
IIIをこの開環状プラスミドと一緒にインキュベートす
る。プラスミドpH１９２／５の予想される配列を制限分
析法及び配列決定法により確認する（図３）。
β−インターフェロンの発現プロセスは例と同様であ
る。この場合にも、誘発後に電気泳動ゲルによって顕著
なバンドが検出されるが、このバンドは非誘発細菌では
存在しない。生物学的活性をもつβ−インターフェロン
は、細菌からの抽出物中に検出することができる。
る。この場合にも、誘発後に電気泳動ゲルによって顕著
なバンドが検出されるが、このバンドは非誘発細菌では
存在しない。生物学的活性をもつβ−インターフェロン
は、細菌からの抽出物中に検出することができる。
インターロイキン−２についての構造遺伝子を例２に従
いプラスミドpH１３１／５のＮｃｏＩ部位に挿入した。
プラスミドとＥｃｏＲＩとの反応後、デオキシアデノシ
ン三リン酸及びデオキシチミジン三リン酸の存在下にク
レノウポリメラーゼと共にインキュベートすることによ
り、突出末端を平滑末端とした。
いプラスミドpH１３１／５のＮｃｏＩ部位に挿入した。
プラスミドとＥｃｏＲＩとの反応後、デオキシアデノシ
ン三リン酸及びデオキシチミジン三リン酸の存在下にク
レノウポリメラーゼと共にインキュベートすることによ
り、突出末端を平滑末端とした。
開環させかつ平滑末端としたプラスミドに、「平滑末
端」条件下で、商業的に入手可能なｔｒｐオペロンのタ
ーミネーター（ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ
社）を組込み、同時に閉環させる。
端」条件下で、商業的に入手可能なｔｒｐオペロンのタ
ーミネーター（ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ
社）を組込み、同時に閉環させる。
例２で予め述べたように細菌を増殖させかつ誘発させた
後、細菌を分離し、溶菌させる。ＳＤＳゲル電気泳動で
はインターロイキン−２タンパク質のバンドに変化が見
られず、例２と同じ強度を有している。しかしながら、
β−ラクタマーゼに相当するバンドは著しく低い強度を
示す。
後、細菌を分離し、溶菌させる。ＳＤＳゲル電気泳動で
はインターロイキン−２タンパク質のバンドに変化が見
られず、例２と同じ強度を有している。しかしながら、
β−ラクタマーゼに相当するバンドは著しく低い強度を
示す。
図１〜３は、本発明の具体例を詳細に説明するものであ
って、図１は公知のプラスミドｐｔｒｐＬ１からのプラ
スミドpH１３１／５の製造法を示す説明図、図２は公知
のプラスミドｐ１５９／６及びプラスミドpH１３１／５
（図１）からの、インターロイキン−２をコードするプ
ラスミドpH１８５／１１の製造法を示す説明図、および
図３はβ−インターフェロンをコードするプラスミドpH
１９２／５を示す説明図、である。
って、図１は公知のプラスミドｐｔｒｐＬ１からのプラ
スミドpH１３１／５の製造法を示す説明図、図２は公知
のプラスミドｐ１５９／６及びプラスミドpH１３１／５
（図１）からの、インターロイキン−２をコードするプ
ラスミドpH１８５／１１の製造法を示す説明図、および
図３はβ−インターフェロンをコードするプラスミドpH
１９２／５を示す説明図、である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オイゲン、ウールマン ドイツ連邦共和国デー‐6246、グラースヒ ユツテン／タウヌス、ツム、タールブリツ ク、31 (72)発明者 フリードリツヒ、ベンゲンマイヤー ドイツ連邦共和国デー‐6238、ホーフハイ ム、アム、タウヌス、アム、ザイエンバツ ハ、38
Claims (3)
- 【請求項１】下記の工程（ａ）および（ｂ）からなる、
一般にコード可能なアミノ酸から構成されるポリペプチ
ドの製造法。 （ａ）（ｉ）下記のコーディング鎖ＤＮＡ配列Ｉ： ５′ＧＴＡＴＣＧＡＣＣ３′ （Ｉ） とそれに続く５′ＡＴＧＧ３′とを含む大腸菌のベクタ
ーを制限酵素ＮｃｏＩで切断し、 （ii）この切断部位において、下記のＤＮＡ配列II： ５′ＣＡＴＧＸ…３′ （II） ３′ Ｙ…５′ （上記式中、ＸおよびＹは、構造遺伝子の開始コードン
の下流における最初の相補的ヌクレオチド対を表わす） の遺伝子構造物を結合させる、 ことによって作製した大腸菌のｔｒｐ発現系を有するベ
クターで大腸菌細胞を形質転換すること。 （ｂ）この大腸菌細胞における発現を誘発させること。 - 【請求項２】下記の工程（ａ）および（ｂ）からなる、
一般にコード可能なアミノ酸から構成されるポリペプチ
ドの製造法。 （ａ）（ｉ）下記のコーディング鎖ＤＮＡ配列Ｉ： ５′ＧＴＡＴＣＧＡＣＣ３′ （Ｉ） とそれに続く５′ＡＴＧＧ３′とを含む大腸菌のベクタ
ーを制限酵素ＮｃｏＩで切断し、 （ii）この切断部位を酵素的に埋填し、下記の配列III
のＤＮＡ： ５′ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ３′ （II
I） ３′ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ５′ を下記の配列ＩＶのＤＮＡ： ５′Ｘ…３′ （IV） ３′Ｙ…５′ （上記式中、ＸおよびＹは、構造遺伝子の開始コードン
の下流における最初の相補的ヌクレオチド対を表わす） と結合させる、 ことによって作製した大腸菌のｔｒｐ発現系を有するベ
クターで大腸菌細胞を形質転換すること。 （ｂ）この大腸菌細胞における発現を誘発させること。 - 【請求項３】下記の工程（ａ）および（ｂ）からなる、
一般にコード可能なアミノ酸から構成されるポリペプチ
ドの製造法。 （ａ）（ｉ）下記のコーディング鎖ＤＮＡ配列Ｉ： ５′ＧＴＡＴＣＧＡＣＣ３′ （Ｉ） とそれに続く５′ＡＴＧＧ３′とを含む大腸菌のベクタ
ーを制限酵素ＮｃｏＩで切断し、 （ii）この切断部位における突出配列を酵素的に分解
し、下記の配列VIのＤＮＡ： ５′ＧＴＡ ＴＣＧ ＡＣ ３′ （VI） ３′ＣＡＴ ＡＧＣ ＴＧ ５′ を下記の配列VIIのＤＮＡ： ５′−Ｚ ＡＴＧ Ｘ…３′ （VII） ３′ Ｚ′ＴＡＣ Ｙ…５′ （ＺおよびＺ′は所望のヌクレオチド対を表わすが、こ
れらは省略することもでき、ＸおよびＹは構造遺伝子の
開始コードンの下流における最初の相補的ヌクレオチド
対を表わす） と結合させる、 ことによって作製した大腸菌のｔｒｐ発現系を有するベ
クターで大腸菌細胞を形質転換すること。 （ｂ）この大腸菌細胞における発現を誘発させること。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853514113 DE3514113A1 (de) | 1985-04-19 | 1985-04-19 | Veraenderung der dna-sequenz zwischen shine-dalgarno-sequenz und startcodon des trp-operons zur steigerung der proteinexpression |
| DE3514113.1 | 1985-04-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61242583A JPS61242583A (ja) | 1986-10-28 |
| JPH0665317B2 true JPH0665317B2 (ja) | 1994-08-24 |
Family
ID=6268543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61089832A Expired - Lifetime JPH0665317B2 (ja) | 1985-04-19 | 1986-04-18 | ｔｒｐオペロンのシヤイン‐ダルガーノ配列と開始コードンとの間のＤＮＡ配列におけるタンパク質発現を増大させるための改変 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0198415B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0665317B2 (ja) |
| KR (1) | KR940004543B1 (ja) |
| AT (1) | ATE44046T1 (ja) |
| AU (1) | AU600229B2 (ja) |
| CA (1) | CA1321963C (ja) |
| DE (2) | DE3514113A1 (ja) |
| DK (1) | DK172695B1 (ja) |
| ES (2) | ES8704541A1 (ja) |
| FI (1) | FI84362C (ja) |
| GR (1) | GR861022B (ja) |
| HU (1) | HU196458B (ja) |
| IE (1) | IE58994B1 (ja) |
| IL (1) | IL78529A (ja) |
| NO (1) | NO175646C (ja) |
| NZ (1) | NZ215858A (ja) |
| PH (1) | PH26596A (ja) |
| PT (1) | PT82417B (ja) |
| ZA (1) | ZA862925B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4966849A (en) * | 1985-09-20 | 1990-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
| AU8379991A (en) * | 1990-09-14 | 1992-03-26 | Astra Aktiebolag | A novel method of generating clones for the expression of unfused proteins |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
| JPS60188077A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Teruhiko Beppu | 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド |
| DE3430683A1 (de) * | 1984-08-21 | 1986-03-06 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Synthetische regulationsregion |
-
1985
- 1985-04-19 DE DE19853514113 patent/DE3514113A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-04-09 DE DE8686104879T patent/DE3663956D1/de not_active Expired
- 1986-04-09 EP EP86104879A patent/EP0198415B1/de not_active Expired
- 1986-04-09 AT AT86104879T patent/ATE44046T1/de not_active IP Right Cessation
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