JP2001505539A - エラスチン及び他の線維状タンパク質由来の自己整列ペプチド - Google Patents

エラスチン及び他の線維状タンパク質由来の自己整列ペプチド

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Abstract

(57)【要約】 2次構造を持ち、少なくとも3つのβシート/βターンを持ち、天然に存在する繊維状タンパク質でないことを特徴とするポリペプチドを提供する。エラスチンでモデルしたポリペプチドにより示されるそのようなポリペプチドは、補てつ物として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 エラスチン及び他の線維状タンパク質由来の自己整列ペプチド 発明の背景 本発明は、ヒトエラスチン及び他の繊維状タンパク質をモデルとした自己整列 ペプチドに関する。ペプチドは、例えばヒトへの移植用又は弾性材料用の生体適 合性材料として有用である。 現在利用可能な軟組織の補てつ(prosthesis)用合成移植材料は、最適な生体適 合性が達成されるに至っていない。理想的な材料は、適切な構造支持の役割を果 たすものであり、免疫原性及び血栓形成反応を引き起こさないという意味での生 体適合性があり、取替えられる組織の物理的特性を模擬するものであり、正常細 胞の浸潤及び増殖に対する優しい環境を提供するものである。 組織は時には皮膚移植や血管置換によるなど患者の身体の別の部分から借りる ことができるが、この方法は適切なドナー組織の入手可能性が限られていること などのいくつかの制約がある。ダクロン、テフロン(Gortex)及びポリウ レタンのような合成材料ならびに金属(ステンレススチール及びチタニウム)は、 しばしば軟組織の補てつに用いられる。これらの材料は、強度、耐久性及び柔軟 性の要件を満たすことができるが、異物として、長期の使用では最大限の生体適 合性はない。 この問題に対処する1つの方法は、非生物材料をタンパク質や他の天然物質で 被覆することであった。他の方法は動物組織調製物からの生物材料を使用するこ とであった。例えば、動物皮膚調製物は熱傷を被覆するのに用いられ、処理済み の動物血管はヒトにおける血管置換の可能性を提供するのに用いられている。 エラスチンは、天然の構造タンパク質であり、非生物補てつ物を被覆するため に可溶性の形態で、また生物学的に誘導された補てつ物を製造するために固体の 形態で補てつに使用できる可能性がかなり注目されている。エラスチンは、補て つにおける使用に適した構造特性を有し、細胞浸潤のための生体適合性の非血栓 形成性の表面を提供する。エラスチンは、耐久性があり、極めて安定で、高度に 不溶性の細胞外マトリックスタンパク質であり、大血管、弾性靭帯、肺実質及び 皮膚など、エラスチンが認められる組織に伸長性及び弾性反跳などの特性を与え る。 大動脈は、エラスチンの良好な供給源である。しかしながら、ヒト動脈は大量 に入手できないので、動物の動脈がエラスチンの主要な供給源となっていた。動 脈エラスチンは高度に不溶性のマトリックスであるので、可溶性のエラスチン由 来物質は、この不溶性タンパク質を酸又はアルカリで処理して、αエラスチン及 びκエラスチンのような加水分解産物を生成させることにより得られる。これら は、様々な大きさのペプチドの比較的不確定な混合物である。 生体適合性材料を開発する試みとして、可溶性の動物エラスチン材料が、通常 は化学架橋剤により固定して、非生物補てい材料の被覆に用いられた。例えば、 米国特許第4,960,423号(Smith)は、動物エラスチンから得られた水溶 性ペプチドで被覆した合成血管補てい物に関する。 米国特許第5,416,074号(Rabaud)は、エラスチン又は可溶化エラスチ ンペプチド、及びフィブンのような他の結合組織タンパク質を含む組成物に関す る。可溶化エラスチンペプチドは、10,000を超える分子量を有している。 米国特許第4,474,851号(Urry)は、ダクロンのような人工コア繊維及 びテトラペプチド又はペンタペプチド繰返し単位を有するポリペプチドを含むエ ラストマー複合材料をめざしている。この単位は、トロポエラスチン分子におい て繰り返されていることが認められる単位、すなわちVal−Pro−Gly− Val−Gly(VPGVG)及びVal−Pro−Gly−Gly(VPGG) に由来する。ポリペプチドは、一連のβターンを含み、βコイル構造を有すると 提唱されている。ポリペプチドは、複合材料にエラストマーの特性を与えるが、 構造的強度又は完全性を殆ど有していない。人工コア繊維は、複合材料に後者の 特性を与える。 米国特許第4,979,959号(Guire)は、固体状生物材料を生体適合性物 質で被覆し、その生体適合性物質を光化学反応によりその表面に化学的に結合さ せることにより固体状生物材料の生体適合性を改善する方法に関する。 エラスチン基材料も補てい物を製造することができる固体材料の製造に用いら れている。これらは、コラーゲン、フィブリン、フィブロネクチン及びラミニン と共同凝集体を形成してゲル様物質を生じる可溶性動物エラスチン及びヒトエラ スチンの(PGVGVAのような)短い疎水性配列から誘導される重合物質を含 む。いくつかの例において、これらの合成ペプチドは、エラスチン様ペプチド間 又はコラーゲンのような他のタンパク質への架橋を可能とするリシン残基を含む アラニンに富む短い配列も含む。エラスチン及びコラーゲンは、リシンから誘導 される架橋を含む。例えば、米国特許第5,223,420号(Rabaud)は、フィ ブリンのような少なくとも1つの他のタンパク質とエラスチンとを含む付加物を 有するエラスチン基製品に関する。 米国特許第4,589,882号(Urry)は、テトラペプチド及びペンタペプチ ドの繰返し単位のエラストマー成分及びアミノ酸残基を含みうる架橋成分からな る人工エラストマー共重合体に関する。その繰返し単位はエラスチンに由来する 。米国特許第4,132,746号(Urry)は、架橋構造をもつ不溶性の合成ポリ ペンタペプチドに関する。ペンタペプチドは、トロポエラスチンに存在するVP GVGペプチドである。このペプチドから誘導される他の材料については、米国 特許第4,500,700号、米国特許第4,870,055及び米国特許第5 ,250,516号(全てRrry)も参照のこと。これらの特許に記載されている ポ リペプチドは、一連のβターンを含み、βコイル構造を有すると提唱されている 。 動物動脈も余分の物質を除去し、血管置換に用いることができる管状のエラス チン及びコラーゲンのマトリックスを主として残す処理が行われている。例えば 、米国特許第4,776,853号(Klement)は、適当なドナー組織から移植可 能な生物材料を調製する方法に関する。 上記の特許及び刊行物の個々の内容は、参照することによりそれら全体を本明 細書の一部とする。 上記で論じた材料は、ヒトへの移植に適した補てつ物の必要性を満たすために 開発された。しかしながら、これらの材料は完全に満足なものではなく、適切な 機械的特性を有し、血液、組織液及び細胞との接触に副作用を伴うことなく使用 できる補てつ物の必要性が残されている。 発明の概要 従って、ヒトに移植される補てつ物に使用できる材料を提供することが本発明 の1つの目的である。もう1つの目的はヒトへの移植に適した補てつ物を提供す ることである。 これら及び他の目的に従って、本発明は、少なくとも3つのβシート/βター ン構造を含み、天然に存在する繊維状タンパク質ではないポリペプチドを提供す る。1つの実施態様によれば、該ポリペプチドは、図1Bに示すアミノ酸配列の 部分から本質的になる。他の実施態様によれば、該ポリペプチドは、動物エラス チンのアミノ酸配列の部分から本質的になる。更に他の実施態様によれば、該ポ リペプチドは、ラムプリン(lamprin)のアミノ酸配列の部分から本質的になる。 他の実施態様によれば、該ポリペプチドは、クモのシルクタンパク質のアミノ酸 配列の部分から本質的になる。 本発明は、また、図1Bに示すアミノ酸配列の部分から本質的になるポリペプ チドから本質的になる、ヒトへの移植に適した材料も提供する。他の実施態様に よれば、本発明は、動物材料からなり、その動物材料の表面が図1Bに示すアミ ノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチドで被覆された補てつ物を提供する 。他の実施態様によれば、本発明は、合成材料からなり、該合成材料の表面が図 1Bに示すアミノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチドで被覆された補て つ物を提供する。更に他の実施態様によれば、本発明は、金属からなり、その金 属の表面が図1Bに示すアミノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチドで被 覆された補てつ物を提供する。 本発明はまた、図1Bに示すアミノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチ ドを含む化粧品材料も提供する。 本発明はまた、少なくとも3つのβシート/βターン構造を含み、天然に存在 する繊維状タンパク質ではないポリペプチドからなる弾性材料及び高い引張強度 を有する材料も提供する。 本発明はまた、(A)少なくとも3つのβシート/βターン構造を含み、図1 Bに示すアミノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチドと、(B)少なくと も3つのβシート/βターン構造を含む動物エラスチンのアミノ酸配列の部分か ら本質的になるポリペプチドと、(C)少なくとも3つのβシート/βターン構 造からなるラムプリンのアミノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチドと、 (D)少なくとも3つのβシート/βターン構造からなるクモのシルクタンパク 質のアミノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチドとからなる群から選択さ れる2つ又はそれ以上のポリペプチドからなり、2つ又はそれ以上のポリペプチ ドが同じか、又は異なっていてもよい材料も提供する。 本発明はまた、天然に存在する繊維状タンパク質の部分の一次構造と、少なく とも3つのβシート/βターン構造を含む二次構造を有し、(A)βシート/β ターン構造の各々が3個から約7個のアミノ酸残基を含み、(B)該ポリペプチ ドが天然に存在する繊維状タンパク質でないポリペプチドも提供する。 本発明の別の目的と優位性は、以下の記述において一部示されており、また一 部はその記述から明らかになるか、あるいは、本発明の実施により知ることがで きる。目的と優位性は、末尾に記載した特許請求の範囲において再度引用する本 発明の手段により認識し、達成することができる。 図面の簡単な説明 図1Aは、ヒトエラスチンのドメイン構造を示す。例2に記載の発現構造に使 用されるドメインの位置は括弧で括った領域により示される。 図1Bは、シグナルペプチドを含まないヒトエラスチンのアミノ酸配列を示す 。下線を引いたアミノ酸残基は、MFU−1と称する本発明のポリペプチドを含 む。 図1Cは、MFU−1を発現させるのに用いられるGST融合構造物を示す。 図1Dは、例1に記載の発現されたエクソンに対応する疎水性及び架橋ドメイ ンの絵表示である。 図1Eはβシート/βターン構造を有するペプチドの概略図である。 図2に、例2に記載のように、GST融合タンパク質からMFU−1を遊離さ せるための臭化シアン処理の後の分解産物の0.05M酢酸を用いたBioGe l P−30上のクロマトグラフィーを示す。MFU−1は画分1に含まれてい る。 図3は、MFU−1のコアセルベーション(coacercation)(自己凝集)を示す 。 図4Aは、MFU−2と称する本発明のポリペプチドを発現するのに用いられ るGST融合構造物を示す。 図4Bは、MFU−2の疎水性及び架橋ドメインの絵表示である。 図4Cは、MFU−2のアミノ酸配列を示す。 好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、ヒトエラスチン及び他の天然に存在する繊維状タンパク質をモデル とした独特のポリペプチドに関する。以下の議論でしばしば具体例としての親タ ンパク質としてヒトエラスチンに言及するが、他の天然に存在する繊維状タンパ ク質をモデルとしたポリペプチドが本発明により意図されており、ヒトエラスチ ンをモデルとしたポリペプチドについて記述されているものと類似の方法で製造 し、使用することができる。 「親タンパク質」なる語句は、ここでは本発明のポリペプチドのモデルとなっ ているタンパク質を意味する。例えば、ヒトのエラスチンをモデルとしたポリペ プチドは、ヒトのトロポエラスチンのアミノ酸配列の部分を含む。「天然に存在 する繊維状タンパク質」は、天然に見いだされるあらゆる繊維状タンパク質であ り、「繊維状タンパク質」は、当該技術分野における通常の意味をもつ。従って 、繊維状タンパク質は、長繊維又はシートを形成するようにマトリックス中で配 列したポリペプチド鎖からなる。Lehninger,BIOCHEMISTRY 60(19 75年)参照。繊維状タンパク質の例として、エラスチン、ラムプリン及びクモ のシルクタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。Robsonら, J.Biol.Chem.268:1440−47(1993年)は、本発明のポリペプ チドのモデルとすることができる別のタンパク質を開示している。本文献は参照 することにより本明細書の一部とする。 エラスチンならびにクモのシルク及びラムプリンのような他の繊維状細胞外マ トリックスに関するアミノ酸配列の情報は、入手可能である。二次及び三次構造 の解析とともに、この情報は、それらの機械的特性及び、特にそれらの不溶性繊 維への集成の機構に関する一般的理論をもたらしている。 エラスチンは、生体内でトロポエラスチンと呼ばれる単量体として合成され、 細胞からの分泌時にデスモシン(desmosine)と呼ばれる共有架橋結合の形成によ り分枝状重合体ネットワークに集成する(Mechamら,CELL BIOLOGY OF EXT RACELLURAR MATRIX,第2版(New York,1991年))。デスモシン架橋結合は、 リシルオキシダーゼ(lysyl oxdase)の作用により酵素的に生成される。各 デスモシンは、4つのリシン残基(2つは関係するポリペプチド鎖の各々からの もの)の側鎖を取り込む。エラスチンのエラストマー特性の基礎をなす原理は、 議論の余地があるが、この並外れた特性は該タンパク質の強い疎水性に依存して いるという意見の一致がある。 トロポエラスチンは、主として交互に存在する疎水性ドメインと架橋ドメイン からなる(Indikら,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 84:(1986年) )。架橋ドメインはアラニン(A)に富み、リシン(K)はKAAK及びKAA AK間隔に存在する架橋の形成に関与することが運命づけられている。これらの 架橋領域を分けているドメインは、強い疎水性であり、多くの縦一列に繰り返さ れるペンタペプチド及びヘキサペプチド配列を含む。ヒトエラスチンでは、これ らのうちの最も顕著なものは、エクソン24において7回繰り返される配列PG VGVAである(Indikら,前出)。 繰り返し疎水性配列に関する構造研究から、専らβシート/βターン構造が示 されている。すなわち、それらはβシートを含み、βターンが介在している。類 似のβシート/βターン構造が、すべてが高い引張強度を有する安定な繊維又は マトリックスを形成するシパイダーシルク、ラムピリン及びカイコガのコリオン を含めた他の自己凝集性の重合したマトリックスタンパク質にも寄与している。 これらの構造は、これらのタンパク質が自己凝集する能力に非常に重要なもので あると提唱された(Robsonら,前出)。 間隔をおいて繰り返し配置されている疎水性ドメインがトロポエラスチンの高 次構造への集合を支配しているという証拠が存在する。トロポエラスチンならび にエラスチンの可溶化断片(すなわちκエラスチン及びαエラスチン)及び疎水 性の繰返し配列に対応する合成ペプチドはすべて、ポリペプチド鎖間の疎水的相 互作用が低重合性の原繊維構造の形成を引き起こす過程であるコアセルベーショ ンを受ける。この自己凝集は無作為でなく、疎水性ドメインは、架橋して原繊維 弾性マトリックスになるためのトロポエラスチン単量体の配列を促進する(Ro bsonら,前出;Bressanら,J.Ultrastr.Res.94:209−1 6(1986年))。 図1Aに示すように、ヒトエラスチンは、その大部分の長さにわたって交互に 存在する架橋ドメインと疎水性ドメインからなる。架橋ドメインは、主としてK AAK及びKAAAK配列におけるリシン(K)及びアラニン(A)からなり、 リシン残基は、リシルオキシダーゼによる酸化的脱アミノ化及びそれに続く共有 デスモシン架橋の形成に適した立体配座に存在する(Indikら,前出)。疎水 性ドメインは、βシート/βターン構造に存在すると考えられている疎水性のペ ンタペプチド及びヘキサペプチド配列に富んでいる(Tamburroら,ADVAN CES IN LIFE SCIENCES 115-27(1990年))。これらの疎水性領域は、伸長性及 び弾性反跳というエラスチンの物理的特性にとって、また、トロポエラスチン( エラスチンの単量前駆体)の原繊維構造への自己凝集の能力にとって重要である と考えられているRobsonら,前出;Tamburroら,前出)。昆虫の 卵殻コリオンタンパク質、クモのドラグライン(dragline)シルク及びヤツメウナ ギの軟骨のラムプリンを含めた安定な原繊維マトリックスへの自己凝集及び自己 整列が可能な他のタンパク質はすべて、βシート/βターン構造を有する疎水性 の繰返しペプチドの同様な領域を有する(Hamodrakasら,Int.J.Biol .Macromol.11:307−13(1989年);Simmonsら,Science2 71:84−87(1996年);Robsonら,,前出)。 本発明のポリペプチドは、エラスチンならびにクモのシルク及びラムプリンの ような他の繊維状タンパク質をモデルとしたものであり、繊維形成の最初の段階 である自己整列に必要な数及び種類のアミノ酸を含む。便宜上、本発明の各ポリ ペプチドを最小機能単位又はMFUと称する。本発明によるMFUの二次構造は 、少なくとも3つのβシート/βターン構造を含む。 上述したように、βシート/βターン構造は当該技術分野においてよく知られ ている。本発明によるβシート構造は、典型的にはいくつかのアミノ酸残基、例 えば、3個から約7個のアミノ酸残基、許容し得る数として約5個から約7個の アミノ酸残基、特に5個から7個のアミノ酸残基を含む。βシート構造のアミノ 酸残基は疎水性側鎖を有することもできる。本発明によるβシート構造は、典型 的には2つのアミノ酸残基、しばしばGG又はPGで始まり、別のアミノ酸残基 。を含むこともできる。例えば、本発明によるβターン構造は、約2個から約4 個のアミノ酸残基、許容し得る数として2個から4個のアミノ酸残基、特に4個 のアミノ酸残基を含むことができる。 図1Eは、βシート/βターン構造を有するペプチドの概略図である。陰影を つけたリボンはペプチドを表わす。リボンの6つの直線部分はβシート構造を表 わし、5つの曲線部分はβターン構造を表わす。中抜きの円はβシートの下の方 向を向いている疎水性側鎖を表わし、陰影をつけた円はβシートの上の方向を向 いている疎水性側鎖を表わす。これらの疎水性側鎖は、アラニン、バリン、イソ 、ロイシン、ロイシン、チロシン及びフェニルアラニンのようなアミノ酸残基上 にある。矩形はβターン構造を安定化している水素結合を示す。Robinso nら,前出;Lehninger,前出の133−35頁も参照のこと。 本発明のMFUは、可溶性であり、親タンパク質と同じ仕方で自ら整列するコ アセルベーションの特性を示す。例えば、MFUの疎水性配列は、親タンパク質 の疎水性配列と同じ方法で自ら整列する。MFUの二次構造を考えるとき、これ はMFUのβシートが互いに整列させられていることを意味する。この整列は、 親タンパク質におけるものと同様に起こり、βシートが「レゴ」型モチーフに積 み重ねられる(Robsonら,前出を参照)。エラスチン由来のMFUにおいて 、この整列もMFUの架橋を可能にするようにリシン残基の整列を引き起こす。 本発明の1つの実施態様は、天然に存在する繊維状タンパク質の部分の一次構 造(すなわち、アミノ酸配列)及び少なくとも3つのβシート/βターン構造を 含む二次構造を有し、天然に存在する繊維状タンパク質ではないポリペプチドを 提供する。好ましくは、βシート/βターン構造の各々が3個から約7個のアミ ノ酸残基を含む。ポリペプチドは、それが対応する親タンパク質を特定するのに 十分な長さをもつ。少なくとも約10個のアミノ酸残基はこの点に関して十分で あると考えられている。このポリペプチドより長いものであってもよく、例えば 親タンパク質全体の長さまでとすることができる。 また、一次構造が1個又はそれ以上のアミノ酸残基の付加、置換及び/又は欠 失により修飾されている天然に存在する繊維状タンパク質の一次構造を含むポリ ペプチドも本発明の一部として意図されている。該ポリペプチドは、少なくとも 3つのβシート/βターン構造を含む二次構造を有し、本明細書に記載の自己整 列の特性を示す。行い得る修飾の数に関する制限はないが、1個から約20個、 特に1個から約10個、明確に限定して1個から5個のアミノ酸残基の付加、置 換及び/又は欠失がポリペプチドの上述の特性を維持しつつ実施することができ る。 好ましくは、保存的なアミノ酸の変更のみを行う。例示的なアミノ酸置換とし ては、アラニンからセリン、アルギニンからリシン、アスパラギンからグルタミ ン又はヒスチジン、アスパラギン酸からグルタミン酸、システインからセリン、 グルタミンからアスパラギン、グルタミン酸からアスパラギン酸、グリシンから プロリン、ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミン、イソロイシンからロイ シン又はバリン、ロイシンからバリン又はイソロイシン、リシンからアルギニン 又はグルタミン又はグルタミン酸、メチオニンからロイシン又はイソロイシン、 フェニルアラニンからチロシン又はロイシン又はメチオニン、セリンからトレオ ニン、トレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリ プトファン又はフェニルアラニン、バリンからイソロイシン又はロイシンへの変 更が挙げられる。 例えば、ポリペプチドの疎水性領域の修飾は、βターンにおける1つ又はそれ 以上のアミノ酸残基をβターンを開始する他のアミノ酸と置換することを含んで も良い。例えば、1つ又はそれ以上のP又はG残基をそれぞれG又はP残基で置 換するか、あるいはセリン残基で置換することができる。更に、又は、そのかわ りとして、1つ又はそれ以上のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換のような修飾 をβシート構造におけるアミノ酸残基に対して行うことができる。例えば、疎水 性側鎖を有するアミノ酸残基を疎水性側鎖を有する又は類似の特性を有する側鎖 を有する異なるアミノ酸残基で置換することができる。例示的な置換としては、 アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン及びフェニルアラニンの 相互置換が挙げられる。 架橋ドメインを含むポリペプチドについては、付加、欠失及び上述のような保 存的なアミノ酸置換のような架橋ドメインのαらせん構造に干渉しないあらゆる 数の付加、置換及び欠失を行うことができる。また、リシン残基も、アルギニン 、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む酸性又は塩基性残基のような架橋に関 与する他のあらゆるアミノ酸残基で置換することができる。 本発明の1つの実施態様によれば、そのアミノ酸配列が図1Bに示すアミノ酸 配列の部分の変異型であるポリペプチドが提供される。そのようなポリペプチド のアミノ酸配列は、図1Bに示すアミノ酸配列の一部に対応し、図に示すアミノ 酸配列が1個から約10個のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換により修飾され ている。そのようなポリペプチドは、少なくとも3つのβシート/βターン構造 を含む二次構造を有し、本明細書に記載の自己整列の特性を示す。本発明の他の 実施態様によれば、そのアミノ酸配列が図4Cに示すアミノ酸配列の一部の変異 型であるポリペプチドが提供される。そのようなポリペプチドのアミノ酸配列は 、図4Cに示すアミノ酸配列の一部に対応し、図に示すアミノ酸配列が1個から 約 10個のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換により修飾されている。そのような ポリペプチドは、少なくとも3つのβシート/βターン構造を含む二次構造を有 し、本明細書に記載の自己整列の特性を示す。 以下の記述では例示的MFUとしてエラスチンをモデルとしたMFUを用いる が、他のタンパク質由来のペプチドも本発明に含まれる。例えば、クモのシルク 及びラムプリンを含めた他のあらゆる繊維形成タンパク質由来のペプチドは、本 発明の一部として意図されている。これらのMFUは、エラスチンをモデルとし たMFUについて本明細書に記載したと同様に得ることができる。更に、異なる 親タンパク質由来のMFUの混合物(例えば、ラムプリン及びエラスチンをモデ ルとしたMFU)を様々な材料を製造するためにともに用いることができる。 ヒトエラスチンのドメイン構造を図1Aに示す。図に示すように、多くの交互 に配列している架橋ドメインと疎水性ドメインが存在する。疎水性ドメインは各 々多数のβシート/βターン構造形成配列を含むと考えられている。これらのド メインは、おそらく、エラスチンのMFUである。更なる実験に用いたこれらの うちの1つは、括弧で示されており、MFU−1と称する(以下の例1参照)。図 1Bにヒトエラスチンのアミノ酸配列を示す。下線を付けたアミノ酸残基、すな わち残基374〜499はMFU−1を構成する。ヒトエラスチンをモデルとし た他のMFUは、それぞれ残基19〜160、188〜367及び607〜71 7を含む。 ヒトエラスチンをモデルとしたMFUは、トロポエラスチン分子(図1B)の アミノ酸配列の一部を含み、それらの二次構造において少なくとも3つのβシー ト/βターン構造を有する。それらはまた、リシン残基のような架橋に関与する ことができるアミノ酸残基も含む。 本発明の1つの実施態様において、MFUは、デスモシン型結合を形成するよ うな方法で架橋に関与することができる2つのアミノ酸残基を含む。例えば、M FUは、KAAK又はKAAAKアミノ酸配列を含んでいてよい。 好ましい実施態様において、ヒトエラスチンをモデルとしたポリペプチドは図 1Bに示すアミノ酸配列の一部から本質的になる。本明細書における「AはBか ら本質的になる」とは、AはBを含み、また、A−B材料の特性に実質的に影響 を与えない他の成分を含む可能性もあることを意味する。例えば、図1Bに示す アミノ酸配列の一部から本質的になるポリペプチドは、図1Bに示すアミノ酸配 列の一部を含み、また、該ポリペプチドの特性を実質的に変化させない他のアミ ノ酸残基を含むこともあるポリペプチドを意味する。すなわち、該ポリペプチド は、トロポエラスチンペプチドと同じ方法で少なくとも3つのβシート/βター ン構造を有し、自己整列するという特性を維持している。 上述のように、MFUの二次構造(βシート/βターン)は、MFUが親タン パク質の凝集体の構造を模擬する方法で、自ら整列するというようなMFUの自 己凝集及び自己整列を誘導すると考えられている。例えば、トロポエラスチン単 量体がエラスチンタンパク質を形成する仕方を模擬して、酵素的又は化学的架橋 して安定な重合体構造になるために、MFUのβシートが整列し、ヒトエラスチ ンをモデルとしたMFUのリシン残基が整列する。 MFUは、ペプチドの直接合成あるいは組換えによる生成を含むあらゆる方法 で得ることができる。例えば、ヒトエラスチンをモデルとしたMFUのDNAは 、DNAの分解と適切なセグメントの選択により、あるいは、様々なよく知られ た方法によるDNAの合成により、ヒトエラスチンのDNAコードから直接得る ことができる。 利用可能な技術により、あらゆるヒトエラスチンMFUの縦列反復(tandemrep eat)、又はトロポエラスチン分子全体まで及び含むヒトエラスチンのより大きい ドメインを含むMFUをコードするDNAを構築することができる。これらのよ り大きいエラスチン配列は、それらの集成の動力学又はそれらの機械学的特性 の観点から利点を有する。例えば、ヒトエラスチンのエクソン20、21、23 、24、21、23及び24からなるMFU−2を発現させ、精製した。このア ミノ酸配列を図4Cに示す。MFU−2は、コアセルベーション温度がより低い ことから明らかなように、MFU−1より高い自発的自己凝集の傾向を示した。 以下の例6を参照のこと。 本発明のMFUは通常溶液に可溶であるが、これらの溶液のpH、塩含量及び 温度の簡単な操作によりポリペプチドのコアセルベーション及び自己整列が開始 し、エラスチン様繊維の凝集が起こる。MFUのコアセルベーション及び自己整 列をもたらす正確な条件は、MFUポリペプチドと操作するMFU溶液によって 異なる。コアセルベーションをもたらす条件は当業者において周知であり、当業 者は次の通常の実験手順によりMFUのコアセルベーション及び自己整列を誘発 することができる。 図3に本発明のMFUsがコアセルベートする能力を示す。特に、図3にヒト エラスチンのMFU−1のコアセルベーション(自己凝集)を示す。該ペプチド を1.5MのNaCl及び0.3mMのCaCl2を含むリン酸緩衝塩類溶液( pH7.4)に0.25mg/mlの濃度で溶解し、温度を一様な割合で上昇さ せた。コアセルベーションの開始は、53℃で起こり、溶液の濁度の増加により 示される。以下の実施例4に示すデータは、MFUがヒト以外のエラスチンとと もに集合する能力を示している。 本発明のMFUの特徴的な特性は、ヒトエラスチンのトロポエラスチン単量体 と同じ方法、つまり秩序だった方法で自己集合するそれらの能力である。例えば 、MFUは、ポリペプチドがヒトエラスチンをモデルとしているときは、それら のβシート構造を整列させ、個々のMFUペプチド間の架橋を起こさせるという 順序で自己整列する。この自己整列及び自己凝集の過程は、繊維形成における最 初の段階であると考えられる。酵素的架橋の後に、繊維を天然エラスチン重合体 と 類似の化学的及び構造的特性を有する材料にすることができる。このMFU材料 は、血管置換用のチューブ及び創傷や熱傷の治療のような他の用途のためのシー トのようなヒトエラスチン様補てつ物を作るのに用いることができる。あるいは 、MFUは、身体の天然構造材料に類似した補てつ材料を提供するために、他の タンパク質、例えばコラーゲンと共同凝集させることができる。 MFU基材料は、患者において増殖している細胞の浸潤を受け、補てつ物は恒 久的な生組織置換体となることができる。このヒト様MFU材料は、Urry特 許に記載の化学的に合成されたエラスチンの配列から製造された重合体及び上述 の他のタンパク質と共同凝集させたヒト以外のエラスチンの加水分解により製造 された重合体を含めた、これまでに補てつ用に提案された他のエラスチン含有材 料より生体適合性が高い。 本発明によってヒトエラスチンをモデルとしたMFUは、他のエラスチン調製 物と比べて明確な利点がある。例えば、以前に用いられたエラスチンの可溶化断 片と異なり、MFUは明確な組成の単一ペプチドである。MFUは親タンパク質 よりかなり小さく、構造が単純であり、従って、大量に製造又は発現させること 、溶液中の扱い、実験上及び実際上の目的のために操作することが容易である。 他のエラスチン調合物と同様に、MFUは非血栓形成性であり、細胞浸潤に対す る優しい環境を提供する。更に、完全にヒトエラスチン配列により構成されてお り、MFUは非免疫原性であり、従って真に生体適合性材料となる。 本発明に従ってヒトエラスチンをモデルとしたMFUは、ヒト又は動物エラス チンを用いるあらゆる仕方で用いることができる。例えば、本発明のヒトエラス チンの可溶性MFUは、動物αエラスチン及びκエラスチンのような可溶化した (すなわち加水分解)ヒト以外のエラスチン調製物が用いられたのと同じ方法で 補てい物などの非生物材料の表面を被覆するのに用いることができる。MFUは 、合成材料、動物材料及び/又は金属からなる補てつ物を含むあらゆる補てつ物 の 被覆に用いることができる。補てつ物は、多層のMFUで被覆することができる 。例えば、1層から500層以上のMFUを補てつ物に被覆することができる。 MFUは、被覆物の耐久性を改善するために、補てつ物に被覆した後に結合させ ることができる。本明細書において用いるように、補てつ物なる用語は、血管置 換用材料、心臓弁置換用材料、布様材料、ステント及び熱傷又は創傷の治癒を促 進するための被覆材として用いる材料を含めた身体に移植するあらゆる材料を含 むことを意味する。 本発明のMFUは、非血栓形成性であり、内皮及び他の細胞が付着し、増殖す る表面を提供するので、MFUで被覆した補てつ物は被覆しない補てつ物より生 体適合性である。更に、MFUで被覆した補てつ物は、ヒト配列を含む動物由来 のエラスチンで被覆した補てつ物と比べて利点を有し、非免疫原性である。また 、MFUは、以前に述べた動物由来の製品のように様々な大きさのペプチドの不 明確な混合物ではなく、明確で均一なペプチドを含む。 本発明のヒトエラスチンのMFUは、例えば加水分解した動物エラスチンを用 いる方法で化粧品にも用いることができる。米国特許第4,179,333号( Braeumer)、第4,659,740号(Usher)、第4,474,7 63号(Lubowe)、第4,419,288号(Cioca)、第4,327, 078号(Charlet)及び第4,963,656(Mitani)参照の こと。その各内容は、本明細書に参考することによりそのまま本明細書の一部と する。 本発明のMFUは、動物エラスチン及びコラーゲンフレームワークとともにヒ ト血管置換として用いることができる。動物エラスチン/コラーゲン材料は、動 物エラスチン及びコラーゲンから本質的になるチューブを残して、動物血管から 他のすべてのタンパク質、細胞及び可溶性成分を抽出することにより得られる。 例えば、上記の米国特許第4,776,853号(Klement)参照のこと 。 MFUは、自己集合及び自己整列という固有の特性を有するため、動物血管調製 物の動物エラスチンマトリックスと自発的に結合する。従って、動物エラスチン 血管の全表面は、多層のヒトエラスチンMFUで被覆し、酵素的又は化学的結合 により永久的結合を達成することができる。ヒトMFU表面を有する動物血管は 、被覆されていない動物エラスチン補てつ物と比べて実質的に免疫原性が低減し 、生体適合性が改善している。 上記のように、可溶化した(加水分解した)動物エラスチンはフィブリンのよ うな他のタンパク質と共同凝集し、短い繰返し疎水性エラスチン配列は高分子量 材料に重合した。本発明のMFUは、MFUから本質的になる補てつ物の製造に 用いる繊維を作るために同様な方法で用いることができる。例えば、MFUをフ ィブリン及び他の短い疎水性エラスチン配列と共同凝集させ、より高分子量の材 料に重合させることができる。 本発明はまた、動物エラスチンをモデルとしたMFUも提供する。そのような MFUは、例えば弾性材料において有用である。マウス、ラット、ニワトリ、ウ シ及びブタを含めたいくつかの動物エラスチンのアミノ酸配列が知られている。 本発明はまた、ラムプリン及びクモのシルクを含むが、これらに限定されない 他の繊維状の自己集合性タンパク質をモデルとしたMFUに関する。これらのタ ンパク質のMFUは、それらの原繊維重合構造への整列を導くための十分な情報 (すなわち十分なβシート/βターン構造)を含んでいる。例えば、ラムプリン のアミノ酸配列は既知であり、このタンパク質の二次構造は多くのβシート/β ターン構造を含むと考えられている(Robsonら,前出)。本発明によるラム プリンをモデルとしたMFUは、少なくとも3つのβシート/βターン構造を有 するラムプリンのアミノ酸配列の一部を含み、天然に存在するラムプリンタンパ ク質でない。好ましい実施態様において、ラムプリンをモデルとしたMFUは、 本質的にラムプリンのアミノ酸配列の一部からなる。あるいは、ラムプリンをモ デルとしたMFUは、ラムプリンのアミノ酸配列の一部を含み、そのアミノ酸配 列が上述のように1つ又はそれ以上の付加、置換及び/欠失により修飾されてい る。 ラムプリン及び他の繊維状タンパク質をモデルとしたMFUは、様々な材料を 製造するのに用いることができる。該材料は、それらの親タンパク質の高い引張 り強度、弾性及び可塑性という特殊な特性を有し、従って、多くの異なる用途、 例えば、高い引張り強度を必要とするパラシュートに用いるコード及びロープに 適している。 本発明はまた、単一の親タンパク質に由来する2つ又はそれ以上のMFUを含 み、MFUが同じものであっても又は異なっていてよい材料及び異なる親タンパ ク質に由来する2つ又はそれ以上のMFUを含む材料も含む。同じ又は異なる親 タンパク質に由来するMFUのそのような組合せは、所望の物理的特性を有する 製品を製造するために選択することができる。例えば、エラスチン由来のMFU とクモのシルクタンパク質由来のMFUの組合せにより、エラスチンの高伸長性 とクモのシルクタンパク質の高引張り強度が得られるであろう。MFUとそれら の相対的な量を適切に選択することにより、指定の特性を有する材料の生産が可 能である。 組合せは、MFUの混合物、2つ又はそれ以上のMFUを含む融合タンパク質 、あるいは互いに化学的に結合した2つ又はそれ以上のMFUのようなあらゆる 形態でよい。例えば、本発明の1つの実施態様は、動物又はヒトエラスチンのよ うなエラスチンをモデルとしたMFU及びラムプリン又はクモのシルクタンパク 質のような他のタンパク質をモデルとしたMFUを含むポリペプチドを提供する 。そのようなポリペプチドは、当業者に既知の方法、例えば融合タンパク質を製 造するのに用いる方法により製造することができる。ラムプリンの縦列繰返し配 列により両側でフランクされたヒトエラスチンのエクソン21及び22を含むM F Uは、融合タンパク質として発現した。以下の実施例7を参照のこと。別の実施 態様において、ラムプリン又はクモのシルクタンパク質をモデルとしたMFUに 化学的に結合した動物又はヒトエラスチンをモデルとしたMFUからなる材料が 提供されている。そのような化学的に結合したポリペプチドは、同業者既知の方 法により製造することができる。本発明は同じ又は異なる親タンパク質をモデル としたMFUの他の組合せも含む。 本発明は次の実施例において言及することにより以下に更に例示する。実施例 は例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。例1. ヒトエラスチンの最小機能単位−1(MFU−1)の選択 上記のように、エラスチンのような繊維状タンパク質の疎水性ドメインのβシー ト/βターン構造は、タンパク質の自己整列及び自己集合に重要な役割を果たし ていると考えられている。MFUの選択のためにこれらの構造に焦点を絞る。 ヒトエラスチンの特異的MFU(MFU−1と称する)を発現のために選択し た。このMFUは、ヒトエラスチン遺伝子の4つのエクソン領域、すなわちエク ソン20(35アミノ酸)、21(14アミノ酸)、23(19アミノ酸)及び24 (53アミノ酸)によりコードされている。図1C参照。このペプチドのアミノ 酸残基は図1Bにおいて下線が付されているものである。該MFUは、疎水性ド メインにより各側で隣接した2つの隣接中央架橋ドメインを含む。図1DはMF U−1に対応する架橋ドメインの絵表示である。αらせん配座にあると考えられ ているリシン残基を含む架橋ドメインは円柱で表されている。隣接している疎水 性ドメインは、疎水性の側鎖が突き出した矩形の板として表されている。これら の疎水性ドメインは各々いくつかのβシート/βターン構造を含んでいる。この MFUは、エラスチンの総質量の約1/6を構成しているに過ぎず、約10,0 00ダルトンの大きさをもっている。 この特定の単位を選択した理由は、隣接している疎水性エキソンであるエキソ ン24がエラスチンの整列及び集合に役割を果たしていると考えられるPGVG VA配列の7回の繰り返しを含んでいるからである。このドメインの重要性は、 この部位における類似の縦列の繰返しのドメインがいくつかの動物種のエラスチ ンにおいて認められることと、この疎水性の繰返し配列を模擬した合成ペプチド が自己凝集して原繊維構造を形成したという証拠により裏付けられる。また、P GVGVA配列が、その機能の1つがトロポエラスチンの早期の細胞内自己凝集 を妨げるエラスチン結合タンパク質と特異的に相互作用する(Hinekら,J .Cell Biol.126:563−73(1994年))。このトロポエラ スチン結合タンパク質は、可溶化エラスチン断片(κ−エラスチン)のin vitro での自己凝集を抑制することも示された(Hinek,Cell Adhesion & Comm .2:1−9(1994年)。 ヒトエラスチンの他の疎水性ドメインを含むペプチドは、自己集合及び自己整 列する同様の能力を有すると予想され、本発明による適切なMFUである。例え ば、図1Bに示すヒトのエラスチンのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基19〜 160、188〜367及び607〜717を含むペプチドは、適切なMFUで ある。例2. ヒトエラスチンのMFU−1の発現 ヒト胎児大動脈エラスチンcDNAを用いることにより、ヒトエラスチンのエ クソン20、21、23及び24を含む領域がPCRによりクローニングされた 。5’プライマーは、BamHI部位を、続いてメチオニンコドン及びエクソン 20の5’末端と相同の15塩基を含んでいた。メチオニンコドンは、エラスチ ン配列には他のメチオニンが存在しないので、その後臭化シアン分解部位として 使用するために挿入した。3’プライマーは、EcoRI部位を、続いて停止コ ドン及びエクソン24の3’末端と相補的な15塩基を含んでいた(図1C参照) 。PCR産物をBamHI−EcoRIで消化したpGEX−2tベクター(P h armacia)に連結させ、配列を確認した。連結産物を大腸菌にトランスフ ェクトした。発現した融合産物をグルタチオンアフィニティークロマトグラフィ ーにより単離し、エラスチンMFUを臭化シアン処理によりGSTタンパク質か ら解裂させ、10kDaの分解産物を得た。この分解産物をBioGel P− 30クロマトグラフィーにより0.05M酢酸を用いて精製した(図2)。エラス チンのMFU−1は画分1に含まれている。 放出されたMFUの同定は、エラスチンに対する抗体及び疎水性ドメインの1 つに含まれているPGVGVA配列に対する抗体を用いてウエスタンブロッティ ングにより、そしてアミノ酸分析により確認した。特に、図2に示したBioG el P−30クロマトグラフィーから得られた画分1はウエスタンブロット分 析により特徴付けした。CNBr分解前のフィニティー精製産物及び画分1につ いてPGVGVAに対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットを実 施した。画分1についてヒトエラスチンに対するポリクローナル抗体を用いたウ エスタンブロットも実施した。エラスチンポリペプチドの収量は1〜3mg/L と推定される。 次の表にBioGel P−30上のクロマトグラフィーから得られた画分1 のアミノ酸組成を示す。推定(予想)及び実際の(観測)組成を示す。推定 観測 ASP 0 0.7 GLX 4 4.2 HYP 0 0.0 SER 1 1.3 GLY 33 33.8 HIS 0 0.2 ARG 0 0.5 THR 1 1.2 ALA 27 26.9 PRO 15 12.9 TYR 1 1.3 VAL 25 22.3 MET 0 0.3 CYS 0 0.1 ILU 3 3.4 LEU 1 2.4 PHE 3 3.2 LYS 4 5.3 放射性標識MFU−1は、トランスフェクトした大腸菌を放射性標識バリン及 びグリシンの存在下でインキュベートすることにより、実験に用いる通常の手段 により生成した。例3. ヒトエラスチンのMFU−1の自己凝集 上記のように得られたMFU−1は室温で可溶であるが、MFUが自己凝集( 繊維形成の最初の段階)する能力は溶液の塩含量を増加し、温度を上昇させるこ とにより容易に誘発され、コアセルベーションの開始は53℃で起こった。図3 参照。MFU−1のこの挙動は、親分子であるトロポエラスチンの温度依存性の 自己凝集と同様であった。例4. ヒト化動物基補てつ物へのMFU−1の使用 MFU−1が動物基補てつ材料を被覆する能力を次のように評価した。 不溶性エラスチンのマトリックスを臭化シアン法を用いてニワトリ大動脈組織 から調製した。この不溶性の非ヒトエラスチンマトリックスを上記のように調製 した放射性標識ヒトMFU−1の存在下で、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩 液中で37℃で16時間インキュベートした。次いで、組織をpH 7.4のリ ン酸緩衝生理食塩液で十分に洗浄した。 ヒトエラスチンMFU−1とニワトリエラスチンとの結合は蛍光顕微鏡により 実証された。ニワトリエラスチンのサンプルをリン酸緩衝生理食塩液(PBS) 単独の存在下で、また、放射性標識ヒトMFU−1(MFU)の存在下でPBS 中でインキュベートした。ヒトMFU−1とのインキュベーションの後のエラス チンの自己蛍光の増加は、ヒトMFU−1のニワトリエラスチンの表面との結合 を示していた。MFU−1被覆ニワトリエラスチンマトリックスは、表面全体に わたって均一な表面の自己蛍光の増大を示し、MFU−1によるマトリックスの 被覆が完全で連続的であることが示唆された。 次の表にヒトエラスチンMFU−1によるニワトリエラスチンの表面被覆の計 算を示す。 表面被覆量の推定ではヒトMFU−1の横断面の直径を6nmと仮定した。ニ ワトリエラスチンマトリックス1mg当たり約1〜3μgのヒトMFU−1がニ ワトリエラスチンの不溶性マトリックスに強固に結合して残留していたと推定さ れた。MFU−1の量はニワトリエラスチンマトリックスの推定される表面を最 高200倍被覆するのに十分なものであり、MFU−1はニワトリエラスチンマ トリックス上に多層被覆を形成することが示されている。例5. ヒトエラスチンのMFU−1による非生物補てつ材料の被覆 被覆材料としてのMFU−1の適切性をダクロン、ポリウレタン及びテフロン を含めた非生物補てつ材料について評価した。 上記の例4に記載したものと同様の手法により、ダクロン、ポリウレタン、エ キスパンデッド・ポリテトラフルオロエチレン(expanded polytetrafluoroethyl en;ePTFE)(Goartex)又はテフロン被覆金属を含めた非生物補てつ 材料を可溶性MFU−1に暴露させたところ、これらの材料がヒトエラスチンM FUの表面層で被覆されていたことがわかった。ダクロン、ポリウレタン及びe PTFEの被覆については、材料の表面積とMFU−1の横断面積の推定値に基 づいて結合したMFUの量は材料を少なくとも2倍被覆するのに十分なものであ った。 テフロン被覆金属については、表面被覆量は約500倍であると推定された。 これらの材料上にMFUの多層が形成されたことは、MFUの最初の層が補て つ材料上に一旦形成されれば、MFUの自己凝集により追加の層が形成されるこ とを示している。 このようにして結合したMFUは、洗浄によっては容易には除去されない。以 前の述べた方法(例えば、米国特許第4,474,851号(Urry),前出) によりMFUを補てつ材料に架橋共有結合させるために材料を処理することによ り、そしてMFUをそれらのアミノ基を介して相互に被覆を架橋させることによ り、被覆を恒久的なものとすることができる。これにより、補てつ材料の表面に 恒久的なエラスチンマトリックスが提供される。 エラスチンは本来非血栓形成性であるので、これらの合成補てつ物をヒトエラ スチンMFUで被覆することにより、これらの材料から製造された補てつ物が血 小板に結合し、活性化する傾向を低減することができる。例えば、我々は、MF U−1で被覆したePTFE材料は血小板接着及び活性化を示さないことを実証 した。 我々は、ヒトエラスチンMFUを被覆した材料は、細胞付着及び増殖のための 表面を提供することも実証した。特に、血管平滑筋細胞及び内皮細胞は、MFU −1で被覆した表面に付着し、広がり、増殖することが認められた。ヒトエラス チンMFUから形成された材料について同様な結果が予想される。例6. ヒトエラスチンのMFU−2の発現 上記の実施例2に記載したものと同様の手法により、ヒトエラスチンをモデル とした第二のポリペプチド(MFU−2)を発現させ、特性を部分的に検討した 。このポリペプチドは、エクソン20、21、23、24、21、23及び24 からなるMFU−1の縦列重複を含んでいた。図4A,4C参照。このポリペプ チドは、3つの疎水性ドメインと2つの架橋ドメインを含んでいた。図4B参照 。MFU−2は、約34℃でコアセルベーションを受けたことから、MFU−1 と比べて自己凝集の傾向が高いことがわかる。この高い傾向は、疎水性及び架橋 ドメインの複重によって生じる。例7. ラムプリン及びエラスチン/ラムプリンに基づくMFUsの発現 上記の実施例2に記載したものと同様の手法により、ラムプリンの全ポリペプ チド配列からなる構造物を発現させた。ラムプリンの縦列繰返し配列(GGLG Y)6により両側で隣接したヒトエラスチンの架橋ドメイン(エクソン21及び 23)からなるキメラ構造物も発現させた。例8. MFUsからの原繊維マトリックスの形成及び補てつ材料としてのそれ らの使用 MFUsは、例えば補てつ材料の製造に有用な原繊維マトリックスの製造に用 いることができる。これは、自己凝集過程中又は自己凝集後に適切な媒体中に押 し出すことにより、又は繊維の製造に用いる他の既知の方法により行うことがで きる。ヒトトロポエラスチンにより形成されるのと同様な原繊維構造へのMFU −1の自己集合は、コアセルベートの透過電子顕微鏡観察により確認することが できる。 MFUの多重反復を含む、あるいは2つ又はそれ以上のMFUsを含み、トロ ポエラスチン分子全体まで及びそれを含むヒトエラスチンの領域を含むポリペプ チドも、本発明により繊維を製造するのに用いることができる。より大きいMF Uを含むペプチドは、自己集合又は繊維形成特性の改善を示す可能性があり、あ るいは優れた機械的特性を有する繊維を生じる可能性がある。 一旦形成されると、原繊維マトリックスは、酵素的に(例えば、リシルオキシ ダーゼにより)又は化学的に(二官能アルデヒド又は他の架橋剤により)架橋し て、天然エラスチンと類似の物質を生成して安定化させることができる。MFU −1のコアセルベーション発生重合体は、Stahmannら,Biopolyners 1 6:1307−18(1977)に記載のカテコール/ペルオキシダーゼ法によ りリシン残基側鎖の化学的架橋により安定化された。この方法により重合体が安 定化させることができることから、自己凝集の過程(コアセルベーション)がリ シン残基を架橋のために適切に整列させることが確認される。 MFUは、天然材料をより厳密に模擬するために、コラーゲンのような他のヒト タンパク質と共同凝集及び共同架橋させることもできる。 MFU繊維から製造された材料は、種々の補てつ用のシート又はチューブに形 成又は織ることができる。このヒト様材料は、以前に補てつ用に提案された他の エラスチン含有材料と比較して優れた生体適合性を有している。 本発明の方法及び組成物に対して種々の改良及び変更を行うことができること は同業者にとって明らかであろう。従って、付属の特許請求の範囲及びその同等 物の範囲内にあるならば、本発明は、本発明の改良及び変更を含むことが意図さ れている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S D,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG ,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AT ,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA, CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,F I,GB,GE,GH,HU,IL,IS,JP,KE ,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS, LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,M X,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE ,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT, UA,UG,UZ,VN,YU,ZW (72)発明者 ロススタイン,エイサー カナダ国、エム5ジェイ 2ジー2 オン タリオ、トロント、ハーバー・スクエア 33、アパートメント 2018 (72)発明者 キーリー,フレッド・ダブリュー カナダ国、エム4ケイ 3エックス7 オ ンタリオ、トロント、ミントン・プレイス 17 (72)発明者 ロススタイン,スティーヴン・ジェイ カナダ国、エヌ1エル 1エイ5 オンタ リオ、ゲルフ、フィールドストーン・ロー ド 15

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.少なくとも3つのβシート/βターン構造と架橋に関与することができる 少なくとも1つのアミノ酸残基とを含み、天然に存在する繊維状タンパク質でな いポリペプチド。 2.βシート構造の各々が3個から約7個のアミノ酸残基を含む請求項1に記 載のポリペプチド。 3.βシート構造の各々が約5個から約7個のアミノ酸残基を含む請求項2に 記載のポリペプチド。 4.図1Bに示されるアミノ酸配列の部分から本質的になる請求項1に記載の ポリペプチド。 5.それぞれ図1Bのアミノ酸残基374〜499、19〜160、188〜 367及び607〜717からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項 4に記載のポリペプチド。 6.図1Bに示すアミノ酸配列の部分が1個から約10個のアミノ酸残基の付 加、欠失又は置換により修飾されている請求項4に記載のポリペプチド。 7.図1Bに示すアミノ酸配列の部分の縦列繰返しを含む請求項4に記載のポ リペプチド。 8.図4Cに示すアミノ酸配列から本質的になる請求項7に記載のポリペプチ ド。 9.1個から約10個のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換により修飾されて いる図4Cに示すアミノ酸配列から本質的になる請求項7に記載のポリペプチド 。 10.表面が請求項4に記載のポリペプチドで被覆された動物材料を含む補て つ物。 11.表面が請求項4に記載のポリペプチドで被覆された合成材料を含む補て つ物。 12.表面が請求項4に記載のポリペプチドで被覆された金属を含む補てつ物 。 13.請求項4に記載のポリペプチドから本質的になるヒトへの移植に適した 材料。 14.血管置換用材料、心臓弁置換用材料、熱傷被覆用材料、創傷被覆用材料 及びステントからなる群から選択される請求項13に記載の材料。 15.請求項4に記載のポリペプチドを含む化粧品材料。 16.請求項1に記載のポリペプチドを含む弾性材料。 17.請求項1に記載のポリペプチドを含む高引張強度材料。 18.動物のエラスチンのアミノ酸配列の部分から本質的になる請求項1に記 載のポリペプチド。 19.ラムプリンのアミノ酸配列の部分から本質的になる請求項1に記載のポ リペプチド。 20.クモのシルクプロテインのアミノ酸配列の部分から本質的になる請求項 1に記載のポリペプチド。 21.(A)少なくとも3つのβシート/βターン構造を含む図1Bに示すア ミノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチドと、 (B)少なくとも3つのβシート/βターン構造を含む動物のエラスチンのアミ ノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチドと、 (C)少なくとも3つのβシート/βターン構造を含むラムプリンのアミノ酸配 列の部分から本質的になるポリペプチドと、 (D)少なくとも3つのβシート/βターン構造を含むクモのシルクプロテイン のアミノ酸配列の部分から本質的になるポリペプチドと からなる群から選択した2つ又はそれ以上のポリペプチドを含み、2つ又はそれ 以上の該ポリペプチドが同じであっても又は異なっていてよいポリペプチドを含 む材料。 22.2つ又はそれ以上のポリペプチドの混合物を含む請求項21に記載の材 料。 23.2つ又はそれ以上のポリペプチドを含む融合タンパク質を含む請求項2 1に記載の材料。 24.2つ又はそれ以上のポリペプチドが相互に化学結合している請求項21 に記載の材料。 25.(A)ポリペプチドが架橋に関与することができるすくなとも1つのア ミノ酸残基を含み、(B)βシート/βターン構造の各々が3個から約7個のア ミノ酸残基を含み、(C)ポリペプチドが天然に存在する繊維状タンパク質でな いことを特徴とする、天然に存在する繊維状タンパク質の一部の一次構造と少な くとも3つのβシート/βターン構造とを含む二次構造を有するポリペプチド。 26.少なくとも3つのβシート/βターン構造と架橋に関与することができ る少なくとも1つの第一のアミノ酸残基とを含む、天然に存在する繊維状タンパ ク質でない第一のポリペプチドと、 少なくとも3つのβシート/βターン構造と架橋に関与することができるすく なとも1つの第二のアミノ酸残基とを含む、天然に存在する繊維状タンパク質で ない第二のポリペプチドと を含んでなる材料であって、 第一のポリペプチドは第二のポリペプチドと同じものであっても、又は、異な っていてよく、 第一のアミノ酸残基が第二のアミノ酸残基との架橋に関与できるように、第一 及び第二のポリペプチドが整列していことを特徴とする材料。 27.第一のアミノ酸残基が第二のアミノ酸残基と酵素的に架橋している請求 項26に記載の材料。
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