JP2023539104A - 止血性エラスチン様ポリペプチド - Google Patents
止血性エラスチン様ポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023539104A JP2023539104A JP2023512085A JP2023512085A JP2023539104A JP 2023539104 A JP2023539104 A JP 2023539104A JP 2023512085 A JP2023512085 A JP 2023512085A JP 2023512085 A JP2023512085 A JP 2023512085A JP 2023539104 A JP2023539104 A JP 2023539104A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- block
- sequence
- polypeptide
- sequences
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 158
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 154
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 153
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 80
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 19
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- 238000003491 array Methods 0.000 claims description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 9
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 8
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 8
- 208000024659 Hemostatic disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 claims description 7
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 claims description 6
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 5
- 206010060906 Dilutional coagulopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 3
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 229930182852 proteinogenic amino acid Natural products 0.000 claims description 3
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 claims description 3
- QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N Apixaban Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1C(C(=O)N(CC2)C=3C=CC(=CC=3)N3C(CCCC3)=O)=C2C(C(N)=O)=N1 QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HGVDHZBSSITLCT-JLJPHGGASA-N Edoxaban Chemical compound N([C@H]1CC[C@@H](C[C@H]1NC(=O)C=1SC=2CN(C)CCC=2N=1)C(=O)N(C)C)C(=O)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C=N1 HGVDHZBSSITLCT-JLJPHGGASA-N 0.000 claims description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 2
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 claims description 2
- 229960003886 apixaban Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000622 edoxaban Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims description 2
- 229940127066 new oral anticoagluant drug Drugs 0.000 claims description 2
- 229960001148 rivaroxaban Drugs 0.000 claims description 2
- KGFYHTZWPPHNLQ-AWEZNQCLSA-N rivaroxaban Chemical compound S1C(Cl)=CC=C1C(=O)NC[C@@H]1OC(=O)N(C=2C=CC(=CC=2)N2C(COCC2)=O)C1 KGFYHTZWPPHNLQ-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007556 vascular defect Effects 0.000 claims description 2
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 claims description 2
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 13
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 abstract description 12
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 abstract description 12
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 abstract description 12
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 abstract description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 108010000196 Factor XIIIa Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 33
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 26
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 20
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 18
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 13
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 11
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 11
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 11
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 10
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 9
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- -1 length Substances 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 5
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 5
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000000518 rheometry Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001783 ELP Anatomy 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108010029660 Intrinsically Disordered Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 3
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 3
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000009432 framing Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000000974 shear rheometry Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003162 Arterial injury Diseases 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102100037845 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- GZUXJHMPEANEGY-UHFFFAOYSA-N bromomethane Chemical compound BrC GZUXJHMPEANEGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000005354 coacervation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- 239000011557 critical solution Substances 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013271 transdermal drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 208000012908 vascular hemostatic disease Diseases 0.000 description 2
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102100033167 Elastin Human genes 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N Glycerol trioctadecanoate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000851054 Homo sapiens Elastin Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001337 Mantel test Methods 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101000882917 Penaeus paulensis Hemolymph clottable protein Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M benzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 229940009662 edetate Drugs 0.000 description 1
- 229950005627 embonate Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229950000206 estolate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002637 fluid replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 229940050411 fumarate Drugs 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 description 1
- 229940099584 lactobionate Drugs 0.000 description 1
- JYTUSYBCFIZPBE-AMTLMPIISA-N lactobionic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JYTUSYBCFIZPBE-AMTLMPIISA-N 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-M mandelate Chemical compound [O-]C(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960003194 meglumine Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229940102396 methyl bromide Drugs 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M methyl sulfate(1-) Chemical compound COS([O-])(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003890 succinate salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 150000003892 tartrate salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 125000005490 tosylate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 229920000428 triblock copolymer Polymers 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-M valerate Chemical class CCCCC([O-])=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/75—Fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、Ｑブロック配列に組み込まれたグルタミンと、任意にＫブロック配列に組み込まれたリジンとを含む止血エラスチン様ポリペプチドに関するものである。生理的条件下では、Ｑブロック配列とＫブロック配列とがヒトトランスグルタミナーゼファクターＸＩＩＩａにより認識され、フィブリンネットワークと架橋される。本発明はまた、ポリペプチドの医療的な使用、ポリペプチドをコードする核酸配列、前記核酸配列を含む発現ベクター、及び前記核酸配列又は前記発現ベクターを含む細胞に関する。【選択図】なし
Description
本願は、２０２０年８月１８日出願の欧州特許出願第２０１９１６２９号の優先権を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、Ｑブロック配列に組み込まれたグルタミンと、任意でＫブロック配列に組み込まれたリジンとを含む止血性エラスチン様ポリペプチド（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）に関するものである。生理的条件下では、Ｑブロック配列とＫブロック配列とがヒトトランスグルタミナーゼファクターＸＩＩＩａにより認識され、フィブリンネットワークと架橋される。本発明はまた、ポリペプチドの医療的な使用、ポリペプチドをコードする核酸配列、前記核酸配列を含む発現ベクター、及び前記核酸配列又は前記発現ベクターを有する細胞にも関する。
重症外傷は、４５歳以下の人の主な死因であり、２０２０年には年間８４０万人もの死因を占めると予測されている。これらの死因の多くは、止血ができなかったことに起因している。大量出血の場合、傷害部位で凝固因子が急速に枯渇し、２５％にも及ぶ外傷患者で外傷性凝固障害（ＴＩＣ：ｔｒａｕｍａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｙ）と呼ばれる状態になり、これは死亡率の上昇に関連している。
止血は２段階で行われ、その第１段階は傷害部位で循環血小板が活性化及び凝集し、血小板栓の形成を引き起こす。第２段階では、フィブリン（Ｆｂ：ｆｉｂｒｉｎ）が重合し、不溶性タンパク質のハイドロゲルを形成し（＝クロット（ｃｌｏｔ：凝塊））、これが構造的な支持と血流の妨げになる。この第２段階では、活性化トロンビンが前駆体タンパク質フィブリノゲン（Ｆｇ：ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）からフィブリノペプチドを切断し、ノブＡ及びＢと呼ばれる配列が現れるとＦｂネットワークが形成される。このノブは隣接するＦｂ／Ｆｇの遠位端のホールＡ及びＢと呼ばれる部位と共有結合的に結合することで、Ｆｂがハーフスタッガード（ｈａｌｆ－ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）構造で自己会合して、プロトフィブリルを形成することを可能にする。次いで、このプロトフィブリルが束になって繊維を形成し、最終的には不溶性のＦｂネットワークが形成される。その後、Ｆｂネットワークは、活性化した凝塊会合したトランスグルタミナーゼＦＸＩＩＩａによって触媒されるリジン残基とグルタミン残基との反応によって形成される共有結合的な架橋によって安定化し、さらにネットワーク全体に分布する血小板によって発揮される収縮力によって剛化する。したがって、ＦｂとＦＸＩＩＩａとはともに止血の重要な担い手であり、止血制御システムの有効な分子標的であるといえる。
ゲル化したＦｂと循環しているＦｇとを識別する特異的な高親和性結合剤を得ることが困難であるため、合成システムによるＦｂの標的は困難である。Ｆｂクロットと可溶性Ｆｇとは配列及び構造の相同性を共有しているため、分子識別の基礎となる立体構造エピトープはごく少数しか存在しない。それにもかかわらず、ファージディスプレイ法を用いてＦｂ特異的結合剤の単離に成功した。これにより、Ｆｂを結合するペプチド又はナノボディを合成ポリマー又は粒子にグラフト化してｉｎ ｖｉｖｏでのクロット形成をサポートすることによるＦｂ標的止血剤が開発されてきた。あるいは、Ｆｂはまた、ノブＡ及びＢ模倣体によって内在性ホールａ及びｂ結合ポケットに係合することによっても標的化されてきた。これらのペプチド模倣体をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のポリマー又はタンパク質などの大きな分子に付加することで、Ｆｂの機械的特性の変化、Ｆｂネットワーク構造の調整、又はＦｂゲルへの治療薬の送達の標的化を可能にする様々な構造体が実現されてきた。
上述の最新技術に基づいて、本発明の目的は、止血を達成するための手段及び方法を提供することである。
この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。
発明の概要
本発明の第１の態様は、
ａ．
ｉ． ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３）、
ｉｉ． ＷＱＨＫＩＤＬＲＹＮＧＡ（配列番号００４）、
ｉｉｉ． ＳＱＨＰＬＰＷＰＶＬＭＬ（配列番号００５）、
ｉｖ． ＥＱＦＰＩＡＦＰＲＹＳＩ（配列番号００６）、
ｖ． ＳＥＱＨＬＬＫＷＰＰＷＨ（配列番号００７）、
ｖｉ． ＷＱＩＰＶＤＷＰＰＬＰＰ（配列番号００８）、
ｖｉｉ． ＤＱＷＭＭＡＷＰＳＬＴＬ（配列番号００９）、及び／又は
ｖｉｉｉ． ＳＱＩＰＭＡＷＰＬＬＳＬ（配列番号０１０）、
から選択されるＱブロックアミノ酸配列、
ｂ． 複数のスペーサーアミノ酸配列ＶＰＧＸＧ（配列番号０１２）；
ｃ． 任意に、少なくとも１個のリジン残基を含むＫブロック配列、
を含むポリペプチドに関する。
本発明の第１の態様は、
ａ．
ｉ． ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３）、
ｉｉ． ＷＱＨＫＩＤＬＲＹＮＧＡ（配列番号００４）、
ｉｉｉ． ＳＱＨＰＬＰＷＰＶＬＭＬ（配列番号００５）、
ｉｖ． ＥＱＦＰＩＡＦＰＲＹＳＩ（配列番号００６）、
ｖ． ＳＥＱＨＬＬＫＷＰＰＷＨ（配列番号００７）、
ｖｉ． ＷＱＩＰＶＤＷＰＰＬＰＰ（配列番号００８）、
ｖｉｉ． ＤＱＷＭＭＡＷＰＳＬＴＬ（配列番号００９）、及び／又は
ｖｉｉｉ． ＳＱＩＰＭＡＷＰＬＬＳＬ（配列番号０１０）、
から選択されるＱブロックアミノ酸配列、
ｂ． 複数のスペーサーアミノ酸配列ＶＰＧＸＧ（配列番号０１２）；
ｃ． 任意に、少なくとも１個のリジン残基を含むＫブロック配列、
を含むポリペプチドに関する。
任意の１個のスペーサーアミノ酸配列内の各Ｘは、独立して、Ｐｒｏを除く任意のタンパク新生アミノ酸から選択することができる。
本発明の第２の態様は、止血障害、過剰出血、又は凝固障害の治療又は予防における使用のための第１の態様によるポリペプチドに関する。
本発明の第３の態様は、第１の態様によるポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
本発明の別の態様は、第３の態様による核酸配列を含む発現ベクターに関する。
本発明のさらに別の態様は、本発明の第３の態様による核酸配列、又は第４の態様による発現ベクターを含む単離細胞に関する。
発明の詳細な説明
用語と定義
本明細書の解釈のために、以下の定義が適用され、適切な場合には、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた然りである。以下に定める定義が、参照により本書に組み込まれた文書と矛盾する場合、定められた定義が優先されるものとする。
用語と定義
本明細書の解釈のために、以下の定義が適用され、適切な場合には、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた然りである。以下に定める定義が、参照により本書に組み込まれた文書と矛盾する場合、定められた定義が優先されるものとする。
本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び他の同様の形態、並びにそれらの文法的に同等な用語は、意味において同等であること、及びこれらの単語のいずれか１つに続く１つ又は複数の項目が、係る１つ又は複数の項目を網羅的にリストするものではない、又はリストした１つ又は複数の項目のみに限定するものではないことにおいてオープンエンドとすることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ及びＣを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」品目は、成分Ａ、Ｂ及びＣからなる（すなわち、成分Ａ、Ｂ及びＣのみを含有する）こともできるし、又は成分Ａ、Ｂ及びＣのみならず、１つ又は複数の他の成分を含むこともできる。そのため、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその類似の形態、並びにその文法的に同等な用語には、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の実施形態の開示が含まれることが意図及び理解されている。
値の範囲が提供されている場合、文脈上明確に別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限の間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載の範囲内の他の記載値又は介在値のそれぞれは、記載の範囲内で具体的に除外される限界に従って、本開示内に包含されると理解される。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除いた範囲もまた開示に含まれる。
本明細書において、ある値又はパラメータに関する「約」の言及は、その値又はパラメータそれ自体を対象とする変化形を含む（及び記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
添付の特許請求の範囲を含み、本明細書で使用されるとおり、単数形の「ａ」、「又は（ｏｒ）」及び「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかに指示されない限り、複数の参照語を含む。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。分子、遺伝、生化学的手法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第４編．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及び化学的手法には、標準的な技術を使用する。
本明細書の文脈における「ＥＬＰ」という用語は、エラスチン様ポリペプチドに関する。
本明細書の文脈における「Ｆｂ」という用語は、フィブリンに関する。
本明細書の文脈における「ｈＥＬＰ」という用語は、止血性（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ）ＥＬＰに関する。
本明細書の文脈における「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸がペプチド結合により接続された直鎖を形成する３０個以上のアミノ酸からなる分子に関する。ポリペプチドのアミノ酸配列は、（生理学的に見出される）タンパク質全体又はその断片のアミノ酸配列を表すこともある。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、タンパク質及びその断片を含む。ポリペプチドは、アミノ酸残基配列として本明細書に開示される。
本明細書の文脈における「ペプチド」という用語は、アミノ酸がペプチド結合によって接続されている直鎖を形成する、最大５０個のアミノ酸、特に８～３０個のアミノ酸、より特に８～１５個のアミノ酸からなる分子に関する。
アミノ酸残基の配列はアミノ末端からカルボキシル末端へ記載される。配列位置の大文字は、１文字コードのＬ－アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３編。ｐ．２１）。アミノ酸配列の位置を示す小文字は、対応するＤ－又は（２Ｒ）－アミノ酸を意味する。配列はアミノ末端からカルボキシ末端に向かって左から右に記載される。標準的な命名法に従い、アミノ酸残基の配列は、以下のように３文字又は１文字のコードのいずれかで表記される。アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
本発明の文脈における「特異的結合」という用語は、リガンドの特性を指し、リガンドは、ある親和性及び標的特異性でその標的に結合するものである。このようなリガンドの親和性は、リガンドの解離定数によって示される。特異的に反応するリガンドは、その標的に結合した際の解離定数が１０－７ｍｏｌ／Ｌ以下であるが、標的と化学組成が全体的に同じであるが立体構造が異なる分子との相互作用では、少なくとも３桁高い解離定数を持つ。注目すべきは、本発明によるポリマーは共有結合しているので、Ｆｂ／Ｆｇに対する「可逆的」結合を持たず、したがって解離定数によって特徴づけられることはない。酵素のＫｍ値（ミケリス・メンテン定数）によって特徴づけられる、ポリマーに対する酵素（ＦＸＩＩＩａ）に関連する親和性を定式化することができる。
モノマーの所定の群の「ポリマー」は、ホモポリマー（複数の同じモノマーから構成される；このモノマーはＱブロック配列又はＫブロック配列である）であり、モノマーのうちの所定の選択のコポリマーは、少なくとも２つの群のモノマーによって構成されるヘテロポリマーである。
本明細書で使用されるとおり、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を伴う、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を指す。特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、局所、非経口又は注入投与に適した形態で提供される。
本明細書で使用されるとおり、「薬学的に許容される担体」という用語には、当業者に知られているとおり、任意の溶媒、分散媒質、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料など、及びそれらの組み合わせを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、ＩＳＢＮ ０８５７１１０６２４を参照）。
本明細書で使用されるとおり、任意の症状、疾患、又は障害（例えば、止血障害）の「治療」又は「治療する」という用語は、一実施形態では、疾患又は障害を改善すること（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発症を遅らせること、阻止すること、又は低減すること）を指す。別の実施形態では、「治療」又は「治療する」は、患者によって識別できない可能性があるものを含む少なくとも１つの身体的パラメータを緩和又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療」又は「治療する」は、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、以下に特に記載しない限り、当該技術分野で一般的に知られている。
本発明は、フィブリンと特異的に結合し、その力学的特性を調節するエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）配列に基づく、天然変性タンパク質（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）に関する。本発明者らは、ＥＬＰのＮ末端とＣ末端とにグルタミン残基とリジン残基とを導入することにより、Ｎ末端とＣ末端とのペプチドタグを含有する止血性ＥＬＰ（ｈＥＬＰ）を設計した。ペプチドタグ（Ｑブロック配列、Ｋブロック配列）は、ヒトのトランスグルタミナーゼＸＩＩＩａ因子によって選択的に認識され、自然の凝固作用カスケードを介してフィブリンネットワークに共有結合的に連結される。下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を超えるｈＥＬＰの相分離により、希釈性凝固障害をシミュレートする条件下で剛化し、クロットの生物物理学的特性の救済につながった。相依存的な硬化に加え、得られたｈＥＬＰ－Ｆｂネットワークは、プラスミン分解に対する耐性、細孔径の縮小、凝固開始後のゲル化速度の加速を示した。
本発明の第１の態様は、以下の各成分の１つ又は複数を含むか、又はそれらからなるポリペプチドに関する：
ａ．
ｉ． ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３）、
ｉｉ． ＷＱＨＫＩＤＬＲＹＮＧＡ（配列番号００４）、
ｉｉｉ． ＳＱＨＰＬＰＷＰＶＬＭＬ（配列番号００５）、
ｉｖ． ＥＱＦＰＩＡＦＰＲＹＳＩ（配列番号００６）、
ｖ． ＳＥＱＨＬＬＫＷＰＰＷＨ（配列番号００７）、
ｖｉ． ＷＱＩＰＶＤＷＰＰＬＰＰ（配列番号００８）、
ｖｉｉ． ＤＱＷＭＭＡＷＰＳＬＴＬ（配列番号００９）、及び／又は
ｖｉｉｉ． ＳＱＩＰＭＡＷＰＬＬＳＬ（配列番号０１０）、
から選択されるＱブロック配列、
ｂ． ＶＰＧＸＧ配列（配列番号０１２）の複数のスペーサー配列；
ｃ． 任意に、少なくとも１個のリジン残基を含むＫブロック配列。
ａ．
ｉ． ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３）、
ｉｉ． ＷＱＨＫＩＤＬＲＹＮＧＡ（配列番号００４）、
ｉｉｉ． ＳＱＨＰＬＰＷＰＶＬＭＬ（配列番号００５）、
ｉｖ． ＥＱＦＰＩＡＦＰＲＹＳＩ（配列番号００６）、
ｖ． ＳＥＱＨＬＬＫＷＰＰＷＨ（配列番号００７）、
ｖｉ． ＷＱＩＰＶＤＷＰＰＬＰＰ（配列番号００８）、
ｖｉｉ． ＤＱＷＭＭＡＷＰＳＬＴＬ（配列番号００９）、及び／又は
ｖｉｉｉ． ＳＱＩＰＭＡＷＰＬＬＳＬ（配列番号０１０）、
から選択されるＱブロック配列、
ｂ． ＶＰＧＸＧ配列（配列番号０１２）の複数のスペーサー配列；
ｃ． 任意に、少なくとも１個のリジン残基を含むＫブロック配列。
スペーサー配列の「ゲスト残基Ｘ」
原則として、各Ｘは、独立して、Ｐｒｏを除く任意のタンパク新生アミノ酸から選択することができる。
原則として、各Ｘは、独立して、Ｐｒｏを除く任意のタンパク新生アミノ酸から選択することができる。
特定の実施形態では、各Ｘは、独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、及びＧｌｕから選択される。
特定の実施形態では、Ｘに使用されるＡｌａ：Ｖａｌ：Ｇｌｕの比率は、１～３ Ａｌａ：７～１０ Ｖａｌ：１ Ｇｌｕである。
特定の実施形態では、Ｘに使用されるＡｌａ：Ｖａｌ：Ｇｌｕの比率は、約２：８：１～２：９：１である。
Ｘ残基のＡｌａ：Ｖａｌ：Ｇｌｕの比率及び正確なアミノ酸は、非常に柔軟で一般的である。ポリマーの温度／ｐＨ応答性がどのように調整されるかによって、分子内のＸ残基の比率及び順序が異なることが可能である。Ｘ残基の相対比率は、分子のｐＨ及び温度による相転移を決定する上で重要であると考えられている。特定の実施形態では、Ｇｌｕ、Ａｌａ、又はＶａｌの古典的な置換のいずれかが、少数のケースでなされ得る。Ｇｌｕの古典的な置換基はＡｓｐである。Ａｌａの古典的な置換は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒである。Ｖａｌの古典的な置換は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、又はＩｌｅである。特定の実施形態では、少数のケースとは、３０％未満である。特定の実施形態では、少数のケースとは、２０％未満である。特定の実施形態では、少数のケースとは、１０％未満である。特定の実施形態では、少数のケースとは、５％未満である。
ＥＬＰの転移温度は、ゲスト残基のその長さ及び組成の両方で決まるため、ペンタペプチドの数が多すぎると、ＥＬＰの長さが長すぎて実質的に発現できない可能性がある。ＥＬＰが室温超過だが、生理的温度未満、同等、あるいはさほど超過しない温度で発現可能かつ転移可能である、実現可能な組成及び長さの領域が存在する。
本発明によるポリペプチドの典型的な長さの値としては、９０～１，３４０アミノ酸長が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これは１０，０００～１５０，０００グラム／モルの分子量値に相当する。
Ｘパラメータ（ゲスト残基の組成）は、可能な長さの範囲に影響を与えない。あるＸ残基の組成に対して、長いＥＬＰと短いＥＬＰとの両方を作ることができる。しかしながら、溶解性は、重要な側面であり、これはゲスト残基の組成、長さ、及びバッファーの組成を含む要因の組み合わせによって制御される。例えば、疎水性のゲスト残基を使用する場合、長すぎると水に溶けなくなり、Ｅ．Ｃｏｌｉで発現しなくなるため、あまり長くすることはできない（これが転移温度にどのように影響するかについては、下記／次頁を参照）。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、２７℃～４７℃の間の転移温度によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本発明の化合物は、３２℃～４２℃の間の転移温度によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本発明の化合物は、３４℃～４０℃の間の転移温度によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本発明の化合物は、３５℃～３９℃の間の転移温度によって特徴づけられる。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、２７℃～３７℃の間の転移温度によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本発明の化合物は、３２℃～３７℃の間の転移温度によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本発明の化合物は、３５℃～３７℃の間の転移温度によって特徴づけられる。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、３７℃～４７℃の間の転移温度によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本発明の化合物は、３７℃～４２℃の間の転移温度によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本発明の化合物は、３７℃～３９℃の間の転移温度によって特徴づけられる。
当業者は、転移温度を調整するために従うことができる明確な規則が存在することを認識している。例えば、ゲスト残基Ｘの位置に疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、又はＶ）を多く添加すると、転移温度が低下するであろう。荷電性又は親水性のアミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）を添加すると、転移温度が上昇する傾向がある。転移温度を決定するために、各組成物をＥ．Ｃｏｌｉで産生し、かつ本質的に約１５℃～１００℃の温度の関数として吸光度を測定する曇点アッセイで試験する（以下の実施例の方法２を参照）。
科学的仮説に縛られることなく、本発明者らは、実際のスペーサー配列はあまり重要ではなく、Ｘに使用されるＡｌａ：Ｖａｌ：Ｇｌｕの定義される比率が、本発明の根底にある問題を解決する１つの方法であることを提案する。ポリペプチドの長さに加え、Ａｌａ：Ｖａｌ：Ｇｌｕの比率が生理的温度に対する相分離を決定する。
本発明者らは、生理的温度で凝集体／ナノ粒子形成を駆動する３７℃未満の転移温度を持つｈＥＬＰを設計した。
これまでに得られたデータは、すべての反復が同じ配列を持つことが特に重要であることは示していない。どれもＸ残基の比率／組成が異なる可能性がある。
Ｑブロック配列
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００３によって同定されるＱブロック配列を含む。特に特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００３によって同定される複数のＱブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００３によって同定されるＱブロック配列を含む。特に特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００３によって同定される複数のＱブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００４によって同定されるＱブロック配列を含む。特に特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００４によって同定される複数のＱブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００５によって同定されるＱブロック配列を含む。特に特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００５によって同定される複数のＱブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００６によって同定されるＱブロック配列を含む。特に特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００６によって同定される複数のＱブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００７によって同定されるＱブロック配列を含む。特に特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００７によって同定される複数のＱブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００８によって同定されるＱブロック配列を含む。特に特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００８によって同定される複数のＱブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００９によって同定されるＱブロック配列を含む。特に特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００９によって同定される複数のＱブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号０１０によって同定されるＱブロック配列を含む。特に特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号０１０によって同定される複数のＱブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２個以上のＱブロック配列を含む。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２個以上の同じＱブロック配列を含む。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２個以上の異なるＱブロック配列を含む。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２個以上のＱブロック配列、スペーサー配列を含むが、Ｋブロック配列は含まない。
本明細書に開示される態様及び一般的な実施形態のいずれかの特に特定の実施形態では、Ｑブロック配列は、ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３）である。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２～５０個のＱブロック配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２～８個のＱブロック配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、３～６個のＱブロック配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは４個のＱブロック配列を含む。
ある特定の実施形態では、本ポリペプチドは、本質的にＱブロック配列及びスペーサー配列のみからなる。Ｑブロック配列は、短い（１～３、特に２アミノ酸）フレーミング配列によって挟まれてもよい。特定の実施形態では、これらのフレーミング配列はＧＳである。フレーミング配列、特にＧＳスペーサーは、通常、タンパク質工学において不活性かつ可溶性の「フレキシブルスペーサー」として使用される。
より特定の実施形態では、本ポリペプチドは、本質的に、Ｑブロック配列及びスペーサー配列のみからなり、本ポリペプチドは以下からなる：
－（ＶＰＧＸＧ）ｎ－［（Ｑブロック）－（ＶＰＧＸＧ）ｎ］ｍで表されるＮ末端Ｑトラクト
－ －［（Ｑブロック）－（ＶＰＧＸＧ）ｎ］ｍ－（ＶＰＧＸＧ）ｏで表されるＣ末端Ｑトラクト
－ 前記Ｎ末端Ｑトラクトと前記Ｃ末端Ｑトラクトとを分離するスペーサー配列多量体［（ＶＰＧＸＧ）ｎ］ｐ、式中、
－ 各ｎは、いずれの他のｎから独立して、８～１４、特に１０～１２の整数であり；
－ 各ｍは、いずれの他のｍから独立して、２～８、特に３～６の整数であり、より特にｍは４であり；
－ ｏは、０～１０の整数であり；
－ ｐは、３～６の整数であり、特にｐは４又は５である。
－（ＶＰＧＸＧ）ｎ－［（Ｑブロック）－（ＶＰＧＸＧ）ｎ］ｍで表されるＮ末端Ｑトラクト
－ －［（Ｑブロック）－（ＶＰＧＸＧ）ｎ］ｍ－（ＶＰＧＸＧ）ｏで表されるＣ末端Ｑトラクト
－ 前記Ｎ末端Ｑトラクトと前記Ｃ末端Ｑトラクトとを分離するスペーサー配列多量体［（ＶＰＧＸＧ）ｎ］ｐ、式中、
－ 各ｎは、いずれの他のｎから独立して、８～１４、特に１０～１２の整数であり；
－ 各ｍは、いずれの他のｍから独立して、２～８、特に３～６の整数であり、より特にｍは４であり；
－ ｏは、０～１０の整数であり；
－ ｐは、３～６の整数であり、特にｐは４又は５である。
さらに特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号１６、又はそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ本明細書の他の箇所で定義される生物活性を少なくとも８０％有する配列である。
Ｑブロック配列及びＫブロック配列
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２個以上のＱブロック配列、スペーサー配列、及びＫブロック配列を含む。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２個以上のＱブロック配列、スペーサー配列、及びＫブロック配列を含む。
Ｑブロック配列とＫブロック配列とは、ヒトトランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩａ因子によって選択的に認識かつ架橋される。架橋は、本発明の２個のポリペプチド（ｈＥＬＰともいう）間、又は本発明の１個のポリペプチドとフィブリン分子との間で行われる。それにより、本発明のポリペプチドはフィブリンネットワークに組み込まれる。Ｑブロック配列とＫブロック配列との両方が、フィブリンで架橋されていてもよい。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、上記のようなＱブロック配列、Ｋブロック配列、及び複数のスペーサー配列から本質的になる。特定の実施形態では、Ｑブロック配列は、ポリペプチドのＮ末端にあり、Ｋブロック配列はポリペプチドのＣ末端にある。特定の実施形態では、Ｋブロック配列は、ポリペプチドのＮ末端にあり、Ｋブロック配列はポリペプチドのＣ末端にある。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、Ｋブロック配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、Ｋブロック配列ＧＳＫＧＳ（配列番号０１１）を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２個以上のＫブロック配列ＧＳＫＧＳ（配列番号０１１）を含む。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２～５０個のＫブロック配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、２～８個のＫブロック配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、３～６個のＫブロック配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、４個のＫブロック配列を含む。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、互いに独立して、２～８個のＱブロック配列及び２～８個のＫブロック配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、互いに独立して、３～６個のＱブロック配列及び３～６個のＫブロック配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、互いに独立して４個のＱブロック配列及び４個のＫブロック配列を含む。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、Ｑブロック配列とスペーサー配列から本質的になる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、Ｑブロック配列、スペーサー配列、及びＫブロック配列から本質的になる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００３によって同定される複数のＱブロック配列、本明細書において同定されるＫブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００４によって同定される複数のＱブロック配列、本明細書において同定されるＫブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００５によって同定される複数のＱブロック配列、本明細書において同定されるＫブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００６によって同定される複数のＱブロック配列、本明細書において同定されるＫブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００７によって同定される複数のＱブロック配列、本明細書において同定されるＫブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００８によって同定される複数のＱブロック配列、本明細書において同定されるＫブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号００９によって同定される複数のＱブロック配列、本明細書において同定されるＫブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、配列番号０１０によって同定される複数のＱブロック配列、本明細書において同定されるＫブロック配列、及び付加的に配列番号０１２によって同定されるスペーサー配列からなる。
特定の実施形態では、スペーサー配列は、Ｑブロック配列又はＫブロック配列でない配列を介在させずに、連続したアミノ酸鎖を形成する。換言すれば、スペーサー配列の後にさらなるスペーサー配列が続き、Ｑブロック配列又はＫブロック配列で中断されるだけである。ポリペプチドの他の構成要素は、Ｑブロック配列、スペーサー配列、及びＫブロック配列以外には、本質的に存在しない。
Ｋブロック及びＱブロックの数は同じである必要はない。ある実施形態では、ＫブロックとＱブロックとは、数が異なる。
ある実施形態では、Ｋブロック配列とＱブロック配列の数は同じである。
特定の実施形態では、各Ｑブロック配列及び各Ｋブロック配列は、他の任意のＱブロック配列及びＫブロック配列と少なくとも２個のスペーサー配列によって分離されている。特定の実施形態では、各Ｑブロック配列及び各Ｋブロック配列は、他の任意のＱブロック配列及びＫブロック配列と少なくとも３又は４個のスペーサー配列によって分離されている。特定の実施形態では、各Ｑブロック配列及び各Ｋブロック配列は、他の任意のＱブロック配列及びＫブロック配列と１０～１４個のスペーサー配列によって分離されている。特定の実施形態では、各Ｑブロック配列及び各Ｋブロック配列は、他の任意のＱブロック配列及びＫブロック配列と１２個のスペーサー配列によって分離されている。
ある実施形態では、Ｑブロック配列とＫブロック配列とはその順序で混合され、つまり、一方の種類のすべての配列がＮ末端にあり、他方の種類の配列がＣ末端にあるわけではないことを意味する。例えば、あるＱブロック配列の後にＫブロック配列が続き、さらに別のＱブロック配列が続くことがある。換言すれば、Ｑブロック配列とＫブロック配列とが配列内で互いに隣接しているのは有効な設計といえる。
ある実施形態では、ポリペプチドに含まれるすべてのＱブロック配列がＱ配列トラクト内に含まれ、かつすべてのＫブロック配列がＫ配列トラクト内に含まれる。
特定の実施形態では、Ｑ配列トラクトはＫ配列トラクトのＮ末端である。
なお、本発明では、Ｑブロック配列トラクトがＮ末端であり、Ｋブロック配列トラクトがＣ末端である必要はない。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、５０～１２００個のスペーサー配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、９０～２５０個のスペーサー配列を含む。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、１２０～１８０個のスペーサー配列を含む。
特定の実施形態では、Ｑ配列トラクトとＫ配列トラクトとは、少なくとも３０個のスペーサー配列によって分離されている。特定の実施形態では、Ｑ配列トラクトとＫ配列トラクトとは、少なくとも４０個のスペーサー配列によって分離されている。特定の実施形態では、Ｑ配列トラクトとＫ配列トラクトとは、少なくとも５０個のスペーサー配列によって分離されている。
ある実施形態では、スペーサー配列は、連続した配列として、６～１５個のスペーサー配列を含むスペーサー配列多量体に含まれる。ある実施形態では、スペーサー配列は、連続した配列として、１０～１４個のスペーサー配列を含むスペーサー配列多量体に含まれる。
特定の実施形態では、各Ｑブロック配列は、１個のスペーサー配列多量体によって他の任意のＱブロック配列から分離されている。
特定の実施形態では、各Ｋブロック配列は、１個のスペーサー配列多量体によって他の任意のＫブロック配列から分離されている。
特定の実施形態では、Ｑ配列トラクトは、３～５個のスペーサー配列多量体によってＫ配列トラクトから分離されている。
特定の実施形態では、すべてのスペーサー配列多量体は同じ配列を有する。特定の実施形態では、スペーサー配列多量体の配列は、配列ＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＡＧ（配列番号０１３）であるか、又はそれを含む。特定の実施形態では、スペーサー配列多量体配列は、配列ＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＡＧ（配列番号０１４）であるか、又はそれを含む。
特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して（≧）８５％以上の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して（≧）９０％以上の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して（≧）９２％以上の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して（≧）９４％以上の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して（≧）９５％以上の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して（≧）９６％以上の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して（≧）９７％以上の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して（≧）９８％以上の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して（≧）９９％以上の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号００１のポリペプチド配列に対して１００％の同一性によって特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ配列番号００１のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる。
生物活性アッセイ
目的のタンパク質を含有するＦｂクロットのレオロジー測定：３０、２０、１０、又は５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）の目的のタンパク質、３０μＭ ｃｏｎＥＬＰ、又は等量のＨＥＰＥＳバッファーを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦｂクロットの機械的特性は、コーンプレート形状（ｄ＝２５ｍｍ；１°角度）を用いるＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＭＣＲ ３０２レオメーターを用いて評価した。振動せん断弾性率を測定するために、周波数掃引測定を、１．５、２．２、３．０ｍｇ ｍＬ－１のフィブリノゲン（Ｆｇ）、目的のタンパク質、ｃｏｎＥＬＰ、又はＨＥＰＥＳバッファー、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．２Ｕ ｍＬ－１トロンビンを含有するクロット溶液を調製することにより実施した。トロンビンを添加した直後に、９０μＬのクロット溶液を２２又は３７℃にて予熱したレオメーターのペルチェプレートに移し、測定コーンを試料上に下ろし、適切な混合と試料分布を確実にするためにコーンを６０ｒｐｍで５秒間回転させる。蒸発を防ぐためにシリコーンオイル（η＝１００ｃＳｔ）を試料の端部に塗布し、このクロットを１時間平衡化させた後、０．１～３Ｈｚの周波数掃引（γ＝１％；この材料の線形粘弾性領域（ＬＶＥ：Ｌｉｎｅａｒ Ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ）に入るように事前に決定した）を行い、目的のタンパク質の生物活性を判定する。測定結果により、材料の貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ’’）の値を得ることができ、このパラメータは、材料科学でよく知られているものであり、材料の剛性（Ｇ’）及び粘性（Ｇ’’）に関連する。これらのパラメータをｈＥＬＰｓ／ＦｂゲルとＦｂ単独との間で比較すると、特に低ひずみ値（すなわち低い力）で剛性（Ｇ’）の増加が観察された。他のパラメータがない場合、生物活性の閾値はＧ’＞２００パスカルの増加である。
目的のタンパク質を含有するＦｂクロットのレオロジー測定：３０、２０、１０、又は５μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）の目的のタンパク質、３０μＭ ｃｏｎＥＬＰ、又は等量のＨＥＰＥＳバッファーを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦｂクロットの機械的特性は、コーンプレート形状（ｄ＝２５ｍｍ；１°角度）を用いるＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＭＣＲ ３０２レオメーターを用いて評価した。振動せん断弾性率を測定するために、周波数掃引測定を、１．５、２．２、３．０ｍｇ ｍＬ－１のフィブリノゲン（Ｆｇ）、目的のタンパク質、ｃｏｎＥＬＰ、又はＨＥＰＥＳバッファー、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．２Ｕ ｍＬ－１トロンビンを含有するクロット溶液を調製することにより実施した。トロンビンを添加した直後に、９０μＬのクロット溶液を２２又は３７℃にて予熱したレオメーターのペルチェプレートに移し、測定コーンを試料上に下ろし、適切な混合と試料分布を確実にするためにコーンを６０ｒｐｍで５秒間回転させる。蒸発を防ぐためにシリコーンオイル（η＝１００ｃＳｔ）を試料の端部に塗布し、このクロットを１時間平衡化させた後、０．１～３Ｈｚの周波数掃引（γ＝１％；この材料の線形粘弾性領域（ＬＶＥ：Ｌｉｎｅａｒ Ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ）に入るように事前に決定した）を行い、目的のタンパク質の生物活性を判定する。測定結果により、材料の貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ’’）の値を得ることができ、このパラメータは、材料科学でよく知られているものであり、材料の剛性（Ｇ’）及び粘性（Ｇ’’）に関連する。これらのパラメータをｈＥＬＰｓ／ＦｂゲルとＦｂ単独との間で比較すると、特に低ひずみ値（すなわち低い力）で剛性（Ｇ’）の増加が観察された。他のパラメータがない場合、生物活性の閾値はＧ’＞２００パスカルの増加である。
本発明の第２の態様は、外傷、止血障害、過剰出血又は凝固障害から選択される症状の治療又は予防に使用するための第１の態様によるポリペプチドに関する。
特定の実施形態では、凝固障害は、希釈性（ｄｉｌｕｔｉｖｅ（ｄｉｌｕｔｉｏｎａｌ））凝固障害又は外傷性凝固障害（ｔｒａｕｍａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｙ）である。
外傷性凝固障害に加えて、本発明による治療は、患者が十分な内在性凝固因子を有しているにもかかわらず、傷の大きさに起因して患者の凝固反応が不十分である内出血の場合にも有用であろう。
希釈性凝固障害とは、大きな外傷及び／又は出血に対する大量輸血の際に見られる凝固障害を指す。大きな外傷及び出血では、凝固因子及び血小板が消費されるため凝固異常が引き起こされる。希釈性凝固障害は、大量輸血の際に血小板が消費されるとともに希釈されることに起因する。これらの症例で蘇生に使用される大量の晶質液もまた血小板減少症の一因となることがある。濃厚赤血球は２４時間以上保存すると血小板がほとんど含まれず、濃厚赤血球に含有される血小板は通常、輸血時に損傷し、循環から除去される。大量輸血時の血小板レベルが５０，０００～７５，０００／ｍｍ３の間の血小板減少症は、血小板濃縮液で治療する必要がある。輸血された濃厚赤血球単位の数は、血小板減少症の程度又は血小板輸血の必要性を正確に予測するものではない。
凝固障害（出血性疾患ともいう）とは、血液を凝固させる（クロットを形成する）能力が低下している症状のことである。凝固障害により、制御できない内出血又は外出血を起こすことがある。治療せずに制御できない出血を放置すると、関節、筋肉、又は内臓に損傷を与える可能性があり、生命を脅かす可能性がある。凝固障害は、凝塊因子又は凝固因子として知られる血液凝固タンパク質レベルの低下又は欠如によって引き起こされる可能性がある。血友病及びフォン・ヴィレブランド病などの遺伝性疾患は、凝固因子の減少を引き起こす可能性がある。
特定の実施形態では、止血障害、過剰出血又は凝固障害は、以下に関連するか、又は以下によって引き起こされる：
ａ． 血小板障害、凝固障害、血管の欠陥、及び／又は血小板減少症、
ｂ． 過度の抗凝固、特にワルファリン、ヘパリン、又は直接経口抗凝固薬（例：アピキサバン、エドキサバン、リバーロキサバン）の投与により引き起こされる抗凝固；
ｃ． 肝疾患（凝固因子の産生不全）、
ｄ． フォン・ヴィレブランド病、
ｅ． 血友病、
ｆ． 外傷。
ａ． 血小板障害、凝固障害、血管の欠陥、及び／又は血小板減少症、
ｂ． 過度の抗凝固、特にワルファリン、ヘパリン、又は直接経口抗凝固薬（例：アピキサバン、エドキサバン、リバーロキサバン）の投与により引き起こされる抗凝固；
ｃ． 肝疾患（凝固因子の産生不全）、
ｄ． フォン・ヴィレブランド病、
ｅ． 血友病、
ｆ． 外傷。
過剰出血のさらなる詳細は、以下で得ることができる：
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｓｄｍａｎｕａｌｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ－ａｎｄ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ／ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ－ｂｌｅｅｄｉｎｇ．
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｓｄｍａｎｕａｌｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ－ａｎｄ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ／ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ－ｂｌｅｅｄｉｎｇ．
本発明の第３の態様は、本明細書に記載の態様及び実施形態のいずれかに記載された、本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
本発明の別の態様は、第３の態様による核酸配列を含む発現ベクターに関する。発現ベクター又は発現コンストラクトであり得る。
本発明の第５の態様は、第３の態様による核酸配列又は第４の態様による発現ベクターを含む細胞に関する。
医療、剤形、及び塩
同様に、本発明の範囲内には、上記の説明によるポリペプチドを患者に投与することを含む、それを必要とする患者において、止血障害、過剰出血又は凝固障害を治療すること、又はその方法である。
同様に、本発明の範囲内には、上記の説明によるポリペプチドを患者に投与することを含む、それを必要とする患者において、止血障害、過剰出血又は凝固障害を治療すること、又はその方法である。
同様に、本発明の上記態様又は実施形態のいずれかによる非アゴニストリガンドを含む、止血障害、過剰出血又は凝固障害の予防又は治療のための剤形が提供される。
当業者は、具体的に言及された任意の薬剤が、当該薬剤の薬学的に許容される塩として存在し得ることを認識している。薬学的に許容される塩は、イオン化された薬物及び逆帯電した対イオンを含む。薬学的に許容されるアニオン性塩形態の非限定的な例としては、酢酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、酒石酸水素塩（ｂｉｔａｔｒａｔｅ）、臭化物、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エンボン酸塩、エストール酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硫酸メチル、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、サリチル酸塩、ジサリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、及び吉草酸塩が挙げられる。薬学的に許容されるカチオン塩形態の非限定的な例としては、アルミニウム、ベンザチン、カルシウム、エチレンジアミン、リジン、マグネシウム、メグルミン、カリウム、プロカイン、ナトリウム、トロメタミン、及び亜鉛が挙げられる。
投与形態は、鼻腔、口腔、直腸、経皮、若しくは経口投与などの経腸投与用、又は吸入剤若しくは坐剤とすることができる。あるいは、皮下、静脈内、肝内、若しくは筋肉内の注入形態などの非経口投与が用いられてもよい。任意に、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。
局所投与もまた、本発明の有利な使用の範囲内である。当業者は、以下の内容によって例示されるように、局所製剤を提供するための可能な広い範囲の処方について理解している：Ｂｅｎｓｏｎ及びＷａｔｋｉｎｓｏｎ（編），Ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第１編，Ｗｉｌｅｙ ２０１１，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０４７０４５０２９１）；及びＧｕｙ及びＨａｎｄｃｒａｆｔ：Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ（第２編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ２００２，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７０８６１０）；Ｏｓｂｏｒｎｅ及びＡｍａｎｎ（編）：Ｔｏｐｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（第１編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９；ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７８１８３５）。
局所投与は、局所創傷上に押し出すことができるか、又は包帯などの創傷被覆材への添加剤とすることができる２成分の前駆体溶液として二筒式注射器において実現可能である。
医薬組成物及び投与
本発明の別の態様は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。さらなる実施形態では、該組成物は、本明細書に記載されるものなどの少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
本発明の別の態様は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。さらなる実施形態では、該組成物は、本明細書に記載されるものなどの少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。
本発明の特定の実施形態では、本発明の化合物は、典型的には、薬物の容易に制御可能な投与量を提供し、かつ患者に簡潔かつ容易に取り扱い可能な製品を付与するような薬学的剤形に製剤化される。
本発明の化合物の局所的使用に関する本発明の実施形態では、医薬組成物は、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル又は噴霧可能な製剤、例えばエアゾール等による送達用のものなど、局所投与に適した方法で製剤化され、活性成分を当業者に知られている１つ又は複数の可溶化剤、安定剤、等張化増強剤、緩衝液及び防腐剤とともに含んでいる。
医薬組成物は、経口投与、非経口投与、又は直腸投与用に製剤化することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定されないが、カプセル、錠剤、丸薬、顆粒、粉末又は坐剤を含む）、又は液体形態（限定されないが、溶液、懸濁液又は乳濁液を含む）において構成することができる。
本発明の化合物の投与レジメンは、特定の薬剤の薬力学的特性及びその投与の様式及び経路などの既知の要因：レシピエントの種、年齢、性別、健康状態、病状、及び体重；症状の性質と程度；同時治療の種類；治療の頻度；投与経路、患者の腎機能及び肝機能、並びに所望の効果、に応じて変化するであろう。特定の実施形態では、本発明の化合物は、１日１回の用量で投与されてもよいし、又は１日の総用量が、１日２回、３回、又は４回に分割した用量で投与されてもよい。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物又は組み合せは、約５０～７０ｋｇの対象に対して約１～１０００ｍｇの活性成分（複数可）の単位用量であり得る。化合物、医薬組成物、又はそれらの組み合わせの治療上有効な投与量は、対象の種、体重、年齢及び個々の状態、治療される障害又は疾患又はその重篤度に依存する。通常の技術を有する医師、臨床医又は獣医師であれば、障害又は疾患の予防、治療又は進行抑制に必要な各有効成分の有効量を容易に決定することができる。
本発明の医薬組成物は、滅菌などの従来の医薬操作にかけることができ、及び／又は従来の不活性希釈剤、潤滑剤、又は緩衝剤、並びに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤及び緩衝剤などのアジュバントを含有することができる。これらは、標準的なプロセス、例えば、従来の混合、造粒、溶解又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物を調製するための多くのそのような手順及び方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら、Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第４編，２０１３（ＩＳＢＮ ８１２３９２２８９２）を参照されたい。
本明細書において、例えばアイソタイプタンパク質又は医療適応などの単一の分離可能な特徴の代替形態が「実施形態」として記載されている場合、そのような代替形態は自由に組み合わせて、本明細書に開示した発明の別個の実施形態を形成してもよいと理解されたい。したがって、アイソタイプタンパク質に関する代替実施形態のいずれもが、本明細書で言及される医療適応の代替実施形態のいずれかと組み合わされ得る。
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
実施例１：止血性ＥＬＰ（ｈＥＬＰ）の設計及び特性評価
本発明者らは、ＡＢＣトリブロック構造を持つｈＥＬＰを設計した（図１ａ）。すべての３個のブロックに存在する反復ＥＬＰ成分は、ゲスト位置にアラニン、バリン、及びグルタミン酸残基を２：８：１（Ａ２Ｖ８Ｅ１）の比率で持つ１１個のＶＰＧＸＧ（配列番号０１２）ペンタペプチドを含んだ。Ｑブロックと呼ばれるＮ末端ｈＥＬＰブロックは、４個のトランスグルタミナーゼタグ（図１ａ）をさらに含有し、コンテクスト配列
（ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３））
内に埋め込まれた１個のグルタミン残基をそれぞれ含む。これらのトランスグルタミナーゼタグは、ヒトＦＸＩＩＩａにより高特異的に認識されることが以前に報告されている。本発明者らは、これらのＦＸＩＩＩａ感受性配列をより広範なｈＥＬＰ配列に埋め込むことで、ｈＥＬＰは可溶性フィブリノゲンとの標的外相互作用を避けつつ、ＦＸＩＩＩが活性化する創傷部位のＦｂネットワークに選択的に統合されるという仮説を立てた。中間ｈＥＬＰブロックは、相分離能を付与するもので、４個の連続したＡ２Ｖ８Ｅ１ユニットからなり、ペンタペプチドの繰り返しが合計４８個である。この刺激応答性中間ブロックは、生理的温度（３７℃）に反応してｈＥＬＰの相分離を引き起こした。最後に、ｈＥＬＰのＣ末端には４個のリジンブロック
を含有し、これはＦＸＩＩＩａにより触媒される反応においてグルタミンに対して相補的なパートナーとして機能した。対照ＥＬＰ（ｃｏｎＥＬＰ）はまた、グルタミン及びリジン残基を、グリシンに変異させてｃｏｎＥＬＰがＦＸＩＩＩａにより架橋されないようにした以外は、ｈＥＬＰと同じ配列で調整した。
本発明者らは、ＡＢＣトリブロック構造を持つｈＥＬＰを設計した（図１ａ）。すべての３個のブロックに存在する反復ＥＬＰ成分は、ゲスト位置にアラニン、バリン、及びグルタミン酸残基を２：８：１（Ａ２Ｖ８Ｅ１）の比率で持つ１１個のＶＰＧＸＧ（配列番号０１２）ペンタペプチドを含んだ。Ｑブロックと呼ばれるＮ末端ｈＥＬＰブロックは、４個のトランスグルタミナーゼタグ（図１ａ）をさらに含有し、コンテクスト配列
（ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３））
内に埋め込まれた１個のグルタミン残基をそれぞれ含む。これらのトランスグルタミナーゼタグは、ヒトＦＸＩＩＩａにより高特異的に認識されることが以前に報告されている。本発明者らは、これらのＦＸＩＩＩａ感受性配列をより広範なｈＥＬＰ配列に埋め込むことで、ｈＥＬＰは可溶性フィブリノゲンとの標的外相互作用を避けつつ、ＦＸＩＩＩが活性化する創傷部位のＦｂネットワークに選択的に統合されるという仮説を立てた。中間ｈＥＬＰブロックは、相分離能を付与するもので、４個の連続したＡ２Ｖ８Ｅ１ユニットからなり、ペンタペプチドの繰り返しが合計４８個である。この刺激応答性中間ブロックは、生理的温度（３７℃）に反応してｈＥＬＰの相分離を引き起こした。最後に、ｈＥＬＰのＣ末端には４個のリジンブロック
を含有し、これはＦＸＩＩＩａにより触媒される反応においてグルタミンに対して相補的なパートナーとして機能した。対照ＥＬＰ（ｃｏｎＥＬＰ）はまた、グルタミン及びリジン残基を、グリシンに変異させてｃｏｎＥＬＰがＦＸＩＩＩａにより架橋されないようにした以外は、ｈＥＬＰと同じ配列で調整した。
本発明者らは、逆転移サイクリング（ＩＴＣ：ｉｎｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｃｙｃｌｉｎｇ）によりｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰをクローニング、発現及び精製し、曇点アッセイを用いてＬＣＳＴを測定した（Ｃ．Ｂｏｕｔｒｉｓら，Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｇｕｉｌｄｆ）．１９９７，３８，２５６７）。３０μＭの作動濃度では、ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰの両方が３７℃未満の曇点を示し（それぞれ３２．７及び３４．１℃）、このことは、両ＥＬＰが生理的温度で凝集したことを示す（図２ａ）。次に、本発明者らは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてＦｇの非存在下でＦＸＩＩＩａがｈＥＬＰを架橋する能力を試験することにより、Ｑブロック及びＫブロックの機能性を確認した（図２ｂ）。単一のｈＥＬＰポリマーに相当するバンド（約６９．５ｋＤａ）の強度の低下、及びｈＥＬＰの二量体及び多量体に相当する高分子量のバンドの出現により、ＦＸＩＩＩａがｈＥＬＰを架橋できたことが確認された。一方、ＦＸＩＩＩａとインキュベートしたｃｏｎＥＬＰの試料は、架橋されなかった。ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰの分子量は、質量分析により確認した。
実施例２：ＦｂネットワークへのｈＥＬＰの統合
本発明者らは、ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰをＡｔｔｏ６４７－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（赤色チャンネル）でＮ末端標識し、それらがまだＦＸＩＩＩａによって架橋されていたことを確認した。次に、蛍光－ｈＥＬＰ（ｆ－ｈＥＬＰ）又は蛍光－ｃｏｎＥＬＰ（ｆ－ｃｏｎＥＬＰ）を、１％ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８標識フィブリノゲン（Ｆｇ－４８８、緑色チャンネル）を添加したＦｂクロットに組み込んだ。本発明者らは、２色共焦点蛍光顕微鏡を用いて、ｈＥＬＰとＦｂとのネットワーク形態、ｈＥＬＰ及びＦｂの共局在化の程度、及びｈＥＬＰの相転移がクロットの構造に与える影響について特性評価を行った。２２℃では、３つのクロット（ＨＥＰＥＳ－Ｆｂ、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂ、ｈＥＬＰ－Ｆｂ）すべてが、緑色のＦｂチャンネルで撮像すると、はっきりとしたＦｂネットワークが得られた（図３ａ、左）。赤色のｈＥＬＰチャンネルで撮像すると、ｆ－ｈＥＬＰ蛍光も同様に、ｈＥＬＰシグナルとＦｂシグナルの間に高度な空間的な共局在を伴う秩序あるネットワークが示された（図３ａ、左、ｈＥＬＰ）。本発明者らは、Ｆｂネットワーク形成時にＨＥＰＥＳバッファー又はｆ－ｃｏｎＥＬＰのみを添加した場合、赤チャンネルの蛍光強度がほとんどないことを確認した（図３ａ、左、ＨＥＰＥＳ及びｃｏｎＥＬＰ）。
本発明者らは、ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰをＡｔｔｏ６４７－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（赤色チャンネル）でＮ末端標識し、それらがまだＦＸＩＩＩａによって架橋されていたことを確認した。次に、蛍光－ｈＥＬＰ（ｆ－ｈＥＬＰ）又は蛍光－ｃｏｎＥＬＰ（ｆ－ｃｏｎＥＬＰ）を、１％ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８標識フィブリノゲン（Ｆｇ－４８８、緑色チャンネル）を添加したＦｂクロットに組み込んだ。本発明者らは、２色共焦点蛍光顕微鏡を用いて、ｈＥＬＰとＦｂとのネットワーク形態、ｈＥＬＰ及びＦｂの共局在化の程度、及びｈＥＬＰの相転移がクロットの構造に与える影響について特性評価を行った。２２℃では、３つのクロット（ＨＥＰＥＳ－Ｆｂ、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂ、ｈＥＬＰ－Ｆｂ）すべてが、緑色のＦｂチャンネルで撮像すると、はっきりとしたＦｂネットワークが得られた（図３ａ、左）。赤色のｈＥＬＰチャンネルで撮像すると、ｆ－ｈＥＬＰ蛍光も同様に、ｈＥＬＰシグナルとＦｂシグナルの間に高度な空間的な共局在を伴う秩序あるネットワークが示された（図３ａ、左、ｈＥＬＰ）。本発明者らは、Ｆｂネットワーク形成時にＨＥＰＥＳバッファー又はｆ－ｃｏｎＥＬＰのみを添加した場合、赤チャンネルの蛍光強度がほとんどないことを確認した（図３ａ、左、ＨＥＰＥＳ及びｃｏｎＥＬＰ）。
ｈＥＬＰとＦｂとの空間的な共局在を定量化するために、本発明者らは、ＩｍａｇｅＪのＣｏｌｏｃ２を用いて、ピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を算出した（Ｊ．Ａｄｌｅｒ，Ｉ．Ｐａｒｍｒｙｄ，Ｃｙｔｏｍ．Ｐａｒｔ Ａ ２０１０，７７，７３３．）。２２℃でのｆ－ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットでは、ｆ－ｈＥＬＰチャンネルとＦｂチャンネルの間のＰＣＣが０．６９±０．１となり、高い空間的相関を示した。ｆ－ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットでは、ＰＣＣ値が０．０５±０．０９であり、空間的相関がないことを示した（図３ｂ）。これらの結果は、ｈＥＬＰがＦｂ及びＦＸＩＩＩａとＬＣＳＴ未満で混合される場合、特異的にＦｂ繊維に架橋され、かつ局在することを示す。
ｈＥＬＰのＬＣＳＴを超える３７℃では（図３ａ、右）、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂ及びｈＥＬＰ－Ｆｂのクロットで観察された構造は、予想された相分離と一致した。高いＥＬＰ密度の点状スポットは、Ｔ＞ＬＣＳＴにてＥＬＰに富むコアセルベートが形成されることを示した。ＥＬＰに富むコアセルベートの密度は、ｆ－ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットの方がｆ－ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットよりも高く、これはｃｏｎＥＬＰが共有結合性の組み込みに必要なＱ残基及びＫ残基を欠いているためであった。Ｆ－ｈＥＬＰのコアセルベートはＦｂネットワークに対してランダムに分布しておらず、Ｆｂフィブリルとのいくらかの共局在も見られた。３７℃でのｈＥＬＰ－Ｆｂクロットの画像解析の結果、ＰＣＣ値は０．１６３±０．０４となった。本発明者らは、３７℃で形成されたｆ－ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットについて、ＰＣＣ値が－０．０４±０．０６を測定し、これは空間相関がないことを示した。ｈＥＬＰのコアセルベートの平均半径を３つの別々のクロットの閾値（処理）画像から求めたところ、０．５７±０．１７μｍであることがわかった（図７）。中央に明確なピークを有するｈＥＬＰのコアセルベートのサイズの単峰性分布は、Ｆｂゲル内でのｈＥＬＰのコアセルベートの成長を制限するエネルギーバランスを示唆している。酵素的に架橋されたＥＬＰヒドロゲル、又はコラーゲンネットワークへのＥＬＰの酵素的組み込みに関する以前の研究では、酵素媒介架橋がＬＣＳＴ超過で阻害されなかったことが報告されている。本発明者らの結果もまた、これらの知見と一致し、コアセルベーションがＦｂネットワークとのｈＥＬＰ会合を阻害しなかったことを示している。実際、局所的に濃度を高めたＱブロック及びＫブロックを有する多価のｈＥＬＰに富むコアセルベートは、ＦＸＩＩＩａ介在型架橋を促進し得る。
実施例３：孔径の定量化
孔径は、Ｆｂクロットの剛性及び酵素分解に対する抵抗性に寄与する重要な構造的特徴である。ＦＸＩＩＩａによるＦｂフィブリルの共有結合型の架橋は孔径を小さくし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦＸＩＩＩａ補充は、剛性及び線維素溶解に対する抵抗性を増加させる。本発明者らは、ｈＥＬＰの効果を、本発明者らがｈＥＬＰ－Ｆｂクロットを通る液体流量を測定した重量灌流アッセイを用いて調べ、次いでダルシーの法則及びＣａｒｒとＨａｒｄｉｎにより開発されたモデル（Ｌ．Ｗ．Ｃｈａｎら，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１５，７，２７７ｒａ２９；Ｍ．Ｅ．Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８７，２５３，Ｈ１０６９）により、孔径を推定した。
孔径は、Ｆｂクロットの剛性及び酵素分解に対する抵抗性に寄与する重要な構造的特徴である。ＦＸＩＩＩａによるＦｂフィブリルの共有結合型の架橋は孔径を小さくし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦＸＩＩＩａ補充は、剛性及び線維素溶解に対する抵抗性を増加させる。本発明者らは、ｈＥＬＰの効果を、本発明者らがｈＥＬＰ－Ｆｂクロットを通る液体流量を測定した重量灌流アッセイを用いて調べ、次いでダルシーの法則及びＣａｒｒとＨａｒｄｉｎにより開発されたモデル（Ｌ．Ｗ．Ｃｈａｎら，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１５，７，２７７ｒａ２９；Ｍ．Ｅ．Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８７，２５３，Ｈ１０６９）により、孔径を推定した。
２２℃では、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂ及びｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂの対照クロットを通る流量は、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットを通る流量の１００倍程度高かった（図８参照）。これらの流量は、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロット、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロット、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットの平均孔径がそれぞれ６８６．６±３９．３、７６１．２±４１．８、７３．６±５．４ｎｍに相当した（図３Ｃ）。ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットで観察された約１０倍小さい細孔径は、ＦＸＩＩＩ添加（２．１倍減少）、又は合成フィブリン結合ポリマー（１．５倍減少）のいずれかで処理したクロットで以前に報告されたものより著しく大きな細孔径の減少を示した。ＨＥＰＥＳ－Ｆｂ及びｈＥＬＰ－Ｆｂの真空下でのＳＥＭ分析でも、細孔径の縮小と定性的に一致した。
３７℃では、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂ及びｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂの対照クロットの孔径は２２℃でのものよりも小さく（それぞれ３９０．３±２８．９ｎｍ及び５０４．３±５１．３ｎｍ）、これはＦＸＩＩＩａ活性の温度依存性に起因すると発明者らは考えている。しかし、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットでは、３７℃での細孔径は１２４．８±１１．５ｎｍで、２２℃での半径よりわずかに大きかったが有意差はなかった（図３ｃ）。したがって、２２℃から３７℃への温度上昇は、これらの対照で観察されたとおり、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットの重量灌流により測定される見かけの孔径に大きな変化をもたらしはしなかった。これは、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットが２２℃にてすでに最大限の架橋がなされていることを示すと考えられる。
実施例４：ゲル化動態
本発明者らは、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計において、濁度アッセイ（Ｌ．Ｗ．Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１５，７，２７７ｒａ２９；Ａ．Ｓ．Ｗｏｌｂｅｒｇ，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．２００７，２１，１３１；Ｅ．Ｍｉｈａｌｋｏ，Ａ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２０１９）を用いてゲル化動態に対するｈＥＬＰの効果を調査した（図４ａ）。ゲル化するＦｂクロットの吸光度を３７℃で１時間かけて５００～８００ｎｍの範囲で測定した。異なる群の間で、複数の別個のゲル化プロファイルが現れた。ＨＥＰＥＳ－Ｆｂバッファー対照クロットは、実験の時間経過とともに、すべての波長で吸光度が着実に増加した。ＣｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットはゲル化後５分に吸光度が最大になり、その後吸光度は一定になった。ＨＥＬＰ－Ｆｂクロットは２段階のゲル化プロファイルを示し、吸光度は最初の３分以内に急速に上昇し、その後、８分における最終的な最大値までゆっくりと上昇した。波長の関数としてのＦｂクロットの濁度の分析は、以前は繊維の質量／長さの比率を推定するために使用されていたが、未知である屈折率の違い、及びｈＥＬＰ－Ｆｂ複合ヒドロゲル内のｈＥＬＰのコアセルベートの濁度のために、そのような分析はこの系では簡単ではなかった。
本発明者らは、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計において、濁度アッセイ（Ｌ．Ｗ．Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１５，７，２７７ｒａ２９；Ａ．Ｓ．Ｗｏｌｂｅｒｇ，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．２００７，２１，１３１；Ｅ．Ｍｉｈａｌｋｏ，Ａ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２０１９）を用いてゲル化動態に対するｈＥＬＰの効果を調査した（図４ａ）。ゲル化するＦｂクロットの吸光度を３７℃で１時間かけて５００～８００ｎｍの範囲で測定した。異なる群の間で、複数の別個のゲル化プロファイルが現れた。ＨＥＰＥＳ－Ｆｂバッファー対照クロットは、実験の時間経過とともに、すべての波長で吸光度が着実に増加した。ＣｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットはゲル化後５分に吸光度が最大になり、その後吸光度は一定になった。ＨＥＬＰ－Ｆｂクロットは２段階のゲル化プロファイルを示し、吸光度は最初の３分以内に急速に上昇し、その後、８分における最終的な最大値までゆっくりと上昇した。波長の関数としてのＦｂクロットの濁度の分析は、以前は繊維の質量／長さの比率を推定するために使用されていたが、未知である屈折率の違い、及びｈＥＬＰ－Ｆｂ複合ヒドロゲル内のｈＥＬＰのコアセルベートの濁度のために、そのような分析はこの系では簡単ではなかった。
本発明者らはさらに、生理学的条件下で低ひずみ振動せん断レオロジーを使用して、特にせん断貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ’’）に焦点を当て、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットのゲル化動態を測定した。ＨＥＰＥＳ－Ｆｂ及びｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットの場合、初期の遅滞期の後に急速なゲル化の期間、及びＧ’の緩やかな漸近成長の第２段階が続いた（図９）。ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロット及びＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロットのゲル化時間（Ｇ’＝Ｇ’’の点として定義）は、両方の試料で約２７０秒で発生したが、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットのゲル化点は約５１０秒で有意に遅く発生した。ゲル化の開始後、ｈＥＬＰ－ＦｂクロットのＧ’は、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロット又はｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットよりも急速に増加した。一次導関数の最大値は、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂ、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロット、及びｈＥＬＰ－Ｆｂについて、それぞれ０．１５、０．１４、及び０．３９Ｐａ ｓ－１であった。したがって、ｈＥＬＰのコアセルベートの存在は、凝固開始までの時間に抑制性効果があったが、開始後の凝固成長速度及び最大剛性に正の効果があった。
実施例５：トロンボエラストグラフィにおけるｈＥＬＰの影響
トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧ：ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）は、血液の凝固能を測定する臨床技術である（Ｄ．Ｗｈｉｔｉｎｇ，Ｊ．Ａ．ＤｉＮａｒｄｏ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１４，８９，２２８）。ここで、本発明者らは、クロット形成開始までの時間を示すＲ、クロット形成速度を示すアルファ角、クロットの剛性を示す最大振幅（ＭＡ）という３つのＴＥＧパラメータを評価した。ここでも、前述の濁度実験及びレオロジー実験で観察されたのと同様に、ｈＥＬＰ－Ｆｂのクロット形成の２段階の図式が得られた。Ｆｂ濃度が低い場合も高い場合も、ｈＥＬＰ－ＦｂクロットはｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロット又はＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロットよりも凝固開始までにより長い時間を要した（図４ｂ）。しかし、凝固開始後、１．５ｍｇ ｍＬ－１ Ｆｂを含有するｈＥＬＰ－Ｆｂクロットは、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂ又はｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂの対照（それぞれ２７．８３±１．９５°、２５．９３±３．２６°）よりも、アルファ角が著しく高かった（図４Ｃ）。Ｆｂ濃度を３．０ｍｇ ｍＬ－１に上げると、対照に対するｈＥＬＰ－Ｆｂクロットのアルファ角の増加はより緩やかであった。この場合、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットのアルファ角は５８．２±１．６°であったが、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロット及びｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットのアルファ角はそれぞれ４７．９±２．３１°及び４７．０７±４．０４°であった。以前の研究で、ＦＸＩＩＩはゲル化時のクロット剛化の第２段階に重要であることがわかっている。ｈＥＬＰはＦＸＩＩＩによってＦｂクロットに組み込まれるため、これは、その存在によりこの第２段階の速度が高められるケースであり得る。
トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧ：ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）は、血液の凝固能を測定する臨床技術である（Ｄ．Ｗｈｉｔｉｎｇ，Ｊ．Ａ．ＤｉＮａｒｄｏ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１４，８９，２２８）。ここで、本発明者らは、クロット形成開始までの時間を示すＲ、クロット形成速度を示すアルファ角、クロットの剛性を示す最大振幅（ＭＡ）という３つのＴＥＧパラメータを評価した。ここでも、前述の濁度実験及びレオロジー実験で観察されたのと同様に、ｈＥＬＰ－Ｆｂのクロット形成の２段階の図式が得られた。Ｆｂ濃度が低い場合も高い場合も、ｈＥＬＰ－ＦｂクロットはｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロット又はＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロットよりも凝固開始までにより長い時間を要した（図４ｂ）。しかし、凝固開始後、１．５ｍｇ ｍＬ－１ Ｆｂを含有するｈＥＬＰ－Ｆｂクロットは、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂ又はｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂの対照（それぞれ２７．８３±１．９５°、２５．９３±３．２６°）よりも、アルファ角が著しく高かった（図４Ｃ）。Ｆｂ濃度を３．０ｍｇ ｍＬ－１に上げると、対照に対するｈＥＬＰ－Ｆｂクロットのアルファ角の増加はより緩やかであった。この場合、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットのアルファ角は５８．２±１．６°であったが、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロット及びｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットのアルファ角はそれぞれ４７．９±２．３１°及び４７．０７±４．０４°であった。以前の研究で、ＦＸＩＩＩはゲル化時のクロット剛化の第２段階に重要であることがわかっている。ｈＥＬＰはＦＸＩＩＩによってＦｂクロットに組み込まれるため、これは、その存在によりこの第２段階の速度が高められるケースであり得る。
ＭＡ値に対するｈＥＬＰの効果は、Ｒ及びアルファ角で観察されたものと同様であった。３０μＭのｈＥＬＰと１．５ｍｇ ｍＬ－１のＦｂを含有するｈＥＬＰ－Ｆｂクロットでは，ＨＥＰＥＳ含有クロット及びｃｏｎＥＬＰ含有クロットに対し、それぞれ６２％及び５９％のＭＡの上昇があった。３．０ｍｇ ｍＬ－１のＦｂで形成されたｈＥＬＰ－Ｆｂクロットでは、ＭＡはＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロットより１６％高く、かつｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットより２４．５％高い（図４ｄ）。まとめると、これらのＴＥＧの結果はせん断レオロジーと一致しており、Ｆｇの臨界未満の閾値濃度が低いクロットのクロット特性に対して、ｈＥＬＰがより顕著な正の効果を持っていることを示唆した。
実施例６：Ｆｂクロットメカニクスに及ぼすｈＥＬＰのコアセルベートの効果
約２．３ｍｇ ｍＬ－１未満のＦｂ濃度は、臨床的止血において、死亡率の増加に関連する。本発明者らは、振動せん断レオロジーを使用して、この閾値を上回る及び下回るＦｂ濃度のクロット剛性（Ｇ’）に対するｈＥＬＰの効果を測定した。２２℃では、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロット、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロット、又はｈＥＬＰ－ＦｂクロットのいずれのＦｂ濃度でもＧ’に有意差は観察されなかった（図５ａ）。しかしながら、３７℃では、ｈＥＬＰ－ＦｂクロットのすべてのＦｂ濃度でＧ’が有意に増加することを本発明者らは発見した。最も低いＦｂ濃度（１．５ｍｇ ｍＬ－１）のＨＥＬＰ－Ｆｂクロットは２０１．３±１６．４ＰａのＧ’を示し、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂ（７１．０±１１．６Ｐａ）クロット及びＨＥＰＥＳ－Ｆｂ（４５．０±１２．８Ｐａ）クロットより有意に高かった。１．５ｍｇ ｍＬ－１のＦｂで形成されたｈＥＬＰ－ＦｂクロットのＧ’は、２．２ｍｇ ｍＬ－１の生理的Ｆｂ濃度にて形成された対照クロットのＧ’と同等であった。このことから、Ｔ＞ＬＣＳＴにおいて、ｈＥＬＰのコアセルベートは、ＴＩＣ及びＦｇ枯渇の模擬条件下で、クロットの剛性を生理的な値まで回復させたことが示された。
約２．３ｍｇ ｍＬ－１未満のＦｂ濃度は、臨床的止血において、死亡率の増加に関連する。本発明者らは、振動せん断レオロジーを使用して、この閾値を上回る及び下回るＦｂ濃度のクロット剛性（Ｇ’）に対するｈＥＬＰの効果を測定した。２２℃では、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロット、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロット、又はｈＥＬＰ－ＦｂクロットのいずれのＦｂ濃度でもＧ’に有意差は観察されなかった（図５ａ）。しかしながら、３７℃では、ｈＥＬＰ－ＦｂクロットのすべてのＦｂ濃度でＧ’が有意に増加することを本発明者らは発見した。最も低いＦｂ濃度（１．５ｍｇ ｍＬ－１）のＨＥＬＰ－Ｆｂクロットは２０１．３±１６．４ＰａのＧ’を示し、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂ（７１．０±１１．６Ｐａ）クロット及びＨＥＰＥＳ－Ｆｂ（４５．０±１２．８Ｐａ）クロットより有意に高かった。１．５ｍｇ ｍＬ－１のＦｂで形成されたｈＥＬＰ－ＦｂクロットのＧ’は、２．２ｍｇ ｍＬ－１の生理的Ｆｂ濃度にて形成された対照クロットのＧ’と同等であった。このことから、Ｔ＞ＬＣＳＴにおいて、ｈＥＬＰのコアセルベートは、ＴＩＣ及びＦｇ枯渇の模擬条件下で、クロットの剛性を生理的な値まで回復させたことが示された。
実施例７：Ｆｂクロットのひずみ剛化に対するｈＥＬＰの効果
Ｆｂクロットのひずみ剛化（Ｓｔｒａｉｎ－ｓｔｉｆｆｅｎｉｎｇ）は、単一モノマーからプロトフィブリル、プロトフィブリル束、線維に至るＦｂネットワークのマルチスケール構造組織に起因するとされている。この理論によると、Ｆｂネットワークが歪むと、まず柔軟なフィブリル間架橋の熱揺らぎを最小化することでエントロピー的に力が散逸し、その後、フィブリル自体の伸縮によって力が散逸するとされている。最終的に、より高い張力では、Ｆｂドメイン内の折り畳み領域の２次、３次、４次構造要素が変性し、合成架橋ポリマーネットワークではまれにひずみ剛化挙動を生じる（Ｉ．Ｋ．Ｐｉｅｃｈｏｃｋａら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２０１０，９８，２２８１；Ｉ．Ｋ．Ｐｉｅｃｈｏｃｋａら，Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ２０１６，１２，２１４５）。
Ｆｂクロットのひずみ剛化（Ｓｔｒａｉｎ－ｓｔｉｆｆｅｎｉｎｇ）は、単一モノマーからプロトフィブリル、プロトフィブリル束、線維に至るＦｂネットワークのマルチスケール構造組織に起因するとされている。この理論によると、Ｆｂネットワークが歪むと、まず柔軟なフィブリル間架橋の熱揺らぎを最小化することでエントロピー的に力が散逸し、その後、フィブリル自体の伸縮によって力が散逸するとされている。最終的に、より高い張力では、Ｆｂドメイン内の折り畳み領域の２次、３次、４次構造要素が変性し、合成架橋ポリマーネットワークではまれにひずみ剛化挙動を生じる（Ｉ．Ｋ．Ｐｉｅｃｈｏｃｋａら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２０１０，９８，２２８１；Ｉ．Ｋ．Ｐｉｅｃｈｏｃｋａら，Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ２０１６，１２，２１４５）。
ｈＥＬＰがＦｂのひずみ剛化にどのような効果を有するかを調べるため、本発明者らは０．１～１００％のひずみ傾斜を用いた振動レオロジーを実施した（図５ｂ）。低ひずみ（０．１～１％）では、３０μＭのｈＥＬＰ及び２．２ｍｇ ｍＬ－１Ｆｂを含有するｈＥＬＰ－Ｆｂクロットは、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロット又はＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロットと比較してＧ’が増加し、低振幅周波数掃引実験での観察と一致した（図５ａ）。中ひずみ（１～１０％）及び高ひずみ（１０～１００％）では、すべてのクロットがひずみ剛化挙動を示したが、しかしながら、剛化の開始ひずみは、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロット又はＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロット（約２～３％）と比較してｈＥＬＰ－Ｆｂ（約１０％）ではより大きかった。ＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロット及びｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットでは、各曲線の一次微分の最大値（それぞれ３８．１Ｐａ、３８．８、２３．１Ｐａ）が示すとおり、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットよりもひずみ剛化の速度が速かった。１００％のひずみでは、すべてのクロットのＧ’はほぼ等しかった（約１４００～１５００Ｐａ）。０．１～１００％の間のひずみのＧ’を比較すると、ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットは４．６倍硬く、一方でｃｏｎＥＬＰ－ＦｂとＨＥＰＥＳ－Ｆｂとはそれぞれ８．８倍、８．４倍硬くなった。これらの結果をＦｂ階層構造において考えると、プロトフィブリルを架橋することにより、ｈＥＬＰは低ひずみ範囲でネットワークの非構造化領域の熱変動を最小限に抑える可能性が高いと考えられる。クロットが十分に伸張されると、弾性応答は個々のプロトフィブリルの伸張によって支配されるため、ｈＥＬＰｎｏコアセルベートの形態でのさらなる架橋の追加はもはや役割を果たさない。以前の研究は、ＦＸＩＩＩ添加がフィブリンの線形粘弾性領域内の低ひずみでＦｂクロットの弾性率を増加させるが、応力－ひずみ曲線の非線形部分では増加しないことが示されており、これは本発明者らがｈＥＬＰを添加したものを用いて本明細書で観察したものと同様である。
ＦｂクロットにおけるｈＥＬＰの剛化効果の相転移依存性は、複数の方法で説明することができる。第１に、コアセルベート中のｈＥＬＰ分子の高い局所濃度により、より多くの分子間ｈＥＬＰ－ｈＥＬＰ架橋の形成が促進され、低ひずみ範囲でＦｂより硬い二次ネットワークが確立され得る。ｉｎ ｖｉｖｏで同様の効果が、生体分子凝縮体の相分離駆動型形成において観察され、基質及び酵素の局所濃度増強が化学反応を加速することができる。これは、例えば、アクチン重合及びＲＮＡ触媒における反応速度を増加させることがわかっている。第２に、ＬＣＳＴを超えるｈＥＬＰの凝集は、ｈＥＬＰ間架橋の形成とは無関係に、Ｆｂ分子間の架橋の二次ネットワークの形成を駆動し得る。ＥＬＰの熱集合によるヒドロゲル内の二次ネットワークの形成は、Ｗａｎｇらによっても報告されており、Ｗａｎｇらはヒアルロン酸ヒドロゲルに架橋されたヒドラジド修飾ＥＬＰの凝集が、これらの材料の機械的剛化をもたらすことを示した。最後に、Ｆｂに結合したｈＥＬＰの相分離は、Ｆｂ繊維に機械的な力を及ぼすことができ、外部張力がなくてもひずみ剛化効果を生み出し、線維芽細胞及び血小板が埋め込まれたフィブリンネットワークで発生する能動的な細胞駆動型収縮性のひずみ剛化を概要する。ひずみ剛化は、Ｆｂネットワークのよく知られた特性であり、ＥＬＰのコアセルベーションはＥＬＰヒドロゲルを硬くさせ、機械的な力を及ぼすことが知られている。分子凝集の機械的な力が、ｉｎ ｖｉｖｏの他の状況において適用されることを示すエビデンスがある：Ｓｈｉｎらは、近年、クロマチンに関連するＩＤＰの相分離が、ＤＮＡ転写を制御するメカニズムにおいて、遠位のゲノム要素を物理的に引き合わせるように機能するが、他のものは機械的に排除するように機能することを明らかにした（Ｙ．Ｓｈｉｎら，Ｃｅｌｌ ２０１８，１７５，１４８１．）。ただし、Ｆｂ重合の前に事前に加熱／凝集されたｈＥＬＰで剛化効果が観察されることを考えると、ｈＥＬＰのコアセルベートによるネットワークの能動的な収縮／剛化は考えにくいと思われる。
実施例８：プラスミノリシス（ｐｌａｓｍｉｎｏｌｙｓｉｓ）におけるｈＥＬＰのコアセルベートの効果
体内では、クロットは、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ：ｔｉｓｓｕｅ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）の活性化時にプラスミノーゲンから生成されるプロテアーゼプラスミンによって酵素的に分解される。プラスミンのタンパク質分解活性は、露出したＦｂクロット上の隠された（Ｃｒｙｐｔｉｃ）結合部位にｔＰａとプラスミノーゲンとが結合することによって時空間的に制御されている。ＦＸＩＩＩａによる架橋はｉｎ ｖｉｖｏでの線維素溶解（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）に対して抑制性の効果があることが以前に示されていた。ｈＥＬＰのコアセルベートはＦＸＩＩＩａによってＦｂクロットに共有結合的に組み込まれるため、本発明者らは、ｈＥＬＰがプラスミンの存在下でＦｂクロットの寿命を延ばすことができると仮定した。これを評価するために、本発明者らは、タイムラプス共焦点顕微鏡を実施した。
体内では、クロットは、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ：ｔｉｓｓｕｅ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）の活性化時にプラスミノーゲンから生成されるプロテアーゼプラスミンによって酵素的に分解される。プラスミンのタンパク質分解活性は、露出したＦｂクロット上の隠された（Ｃｒｙｐｔｉｃ）結合部位にｔＰａとプラスミノーゲンとが結合することによって時空間的に制御されている。ＦＸＩＩＩａによる架橋はｉｎ ｖｉｖｏでの線維素溶解（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）に対して抑制性の効果があることが以前に示されていた。ｈＥＬＰのコアセルベートはＦＸＩＩＩａによってＦｂクロットに共有結合的に組み込まれるため、本発明者らは、ｈＥＬＰがプラスミンの存在下でＦｂクロットの寿命を延ばすことができると仮定した。これを評価するために、本発明者らは、タイムラプス共焦点顕微鏡を実施した。
３０μＭのｈＥＬＰ、ｃｏｎＥＬＰ、又は等量のＨＥＰＥＳを含有する蛍光Ｆｂクロットをチャンバー型カバースリップ中で形成し、生理的濃度のプラスミン溶液をクロットの前面に塗布した。一定時間ごとに画像を撮影し、時間の経過とともに溶解したクロットの割合を評価するために分析した。その結果、ｈＥＬＰクロットと対照クロットの間でプラスミノリシスの速度に大きな差があることを示した。一般に、ＨＥＰＥＳ対照クロットはプラスミン適用後４分に顕微鏡視野から完全に分解されたが、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂは約２０％、ｈＥＬＰ－Ｆｂは約８５％残存していた（図６）。ｈＥＬＰ－Ｆｂクロットの溶解速度は、ｃｏｎＥＬＰ－Ｆｂクロットに見られる溶解速度よりも約３倍遅く、ＨＥＰＥＳ－Ｆｂクロットに見られる溶解速度よりも約５倍遅かった。ＨＥＬＰはプラスミンによって認識される配列を含まないため、ゲル中のさらなる非分解性成分が線維素溶解を阻害した。
実施例９：ｈＥＬＰの細胞傷害性
ＥＬＰは一般に生体適合性があり無毒であるとして認められているが、Ｅ．Ｃｏｌｉから組換え生産された多くのタンパク質と同様に、精製されたタンパク質産物に細菌性エンドトキシン（すなわち、リポ多糖類、ＬＰＳ）が保持される可能性があり、これにより体内の炎症反応及び免疫反応を引き起こし得る。ここで、本発明者らは、ｈＥＬＰの細胞毒性を測定するために、新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｎ：ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのレサズリンベースの細胞毒性アッセイを適用した。この実験では、低分子量及び非凝集ＬＰＳを除去するために、ＩＴＣ精製に続いてＥＬＰをさらなる透析工程及び凍結乾燥工程にかけた。未治療の対照細胞と比較して、ＨＤＦｎ細胞を３０μＭの標準作動濃度のｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰに２４時間曝露した後に、細胞生存率の有意な低下は観察されなかった（図６）。５０μＭのｃｏｎＥＬＰに暴露した場合、ＨＤＦｎの生存率の有意な低下が観察され、一方、８０μＭのＥＬＰに暴露した場合、ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰ治療の両方で細胞の生存率の有意な低下が観察された。しかし、８０μＭという最高の試験濃度でも、細胞生存率は対照の８０％を下回らなかった。したがって、ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰは、これらの条件下で最小限の細胞毒性作用しか持たない。
ＥＬＰは一般に生体適合性があり無毒であるとして認められているが、Ｅ．Ｃｏｌｉから組換え生産された多くのタンパク質と同様に、精製されたタンパク質産物に細菌性エンドトキシン（すなわち、リポ多糖類、ＬＰＳ）が保持される可能性があり、これにより体内の炎症反応及び免疫反応を引き起こし得る。ここで、本発明者らは、ｈＥＬＰの細胞毒性を測定するために、新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｎ：ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのレサズリンベースの細胞毒性アッセイを適用した。この実験では、低分子量及び非凝集ＬＰＳを除去するために、ＩＴＣ精製に続いてＥＬＰをさらなる透析工程及び凍結乾燥工程にかけた。未治療の対照細胞と比較して、ＨＤＦｎ細胞を３０μＭの標準作動濃度のｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰに２４時間曝露した後に、細胞生存率の有意な低下は観察されなかった（図６）。５０μＭのｃｏｎＥＬＰに暴露した場合、ＨＤＦｎの生存率の有意な低下が観察され、一方、８０μＭのＥＬＰに暴露した場合、ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰ治療の両方で細胞の生存率の有意な低下が観察された。しかし、８０μＭという最高の試験濃度でも、細胞生存率は対照の８０％を下回らなかった。したがって、ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰは、これらの条件下で最小限の細胞毒性作用しか持たない。
実施例１０：凝固促進ｈＥＬＰのｉｎ ｖｉｖｏ試験
ラットのｉｎ ｖｉｖｏ出血モデルを用いて、ｈＥＬＰの止血剤としての有効性を評価した。１０匹の雄ＣＤラットを２つの試験群に分けた：ｈＥＬＰ（４Ｔｇ－４Ｔｇ；配列番号１６）、ｃｏｎＥＬＰ（対照ＥＬＰ）。４Ｔｇは、凝固体ＦＸＩＩＩａ（配列番号００３）によって認識される「Ｑブロック」トランスグルタミナーゼ基質配列を指す。対照ＥＬＰは、Ｑブロック配列のグルタミンがグリシンに変異しており、ＦＸＩＩＩによって認識されないようになっている。手術当日、ラットはイソフルランで麻酔され、保温ベッドに静置され、２本のカテーテルを挿入された：一方は頸動脈であり、他方は頸静脈である。ＣＯ２、Ｏ２、及び乳酸のベースラインレベルが定められた後、左大腿動脈の近位端と遠位端とにクランプを設置し、その後にその動脈に３ｍｍの切開を入れた。カテーテル出血を制御して各動物の平均動脈圧（ＭＡＰ：ｍｅａｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を４０～６０ｍｍ Ｈｇに下げた後、大腿動脈のクランプを外し、ラットに標記治療薬を５ｍＬ ｋｇ－１の容量でボーラス注入した（最大２ｍＬ ｍｉｎ－１）。各ラットの血液量を６４ｍＬ ｋｇ－１と仮定し、目標とする血中ＥＬＰの最終濃度は３０μＭであった。これは、体重１ｋｇあたり約１４０ｍｇのＥＬＰの投与量に相当する。クランプを外した後、動物を１５分間自由に出血させ、あらかじめ重さを量ったガーゼを使用して出血量を測定した。１５分間の自由出血の期間の後に、血液試料を採取し、血液ガスを測定し、並びにプロトロンビン時間を測定した。その後、ＭＡＰを６０ｍｍ Ｈｇ超過にするため、必要に応じて生理食塩水を動物に投与した（３ｍＬ／ｋｇ／分の速度で、総量６０ｍＬ ｋｇ－１まで）。出血量及びＭＡＰは、ＭＡＰが２０ｍｍ Ｈｇ未満になるまで、あるいは実験終了時点（ｔ＝７５分）まで連続的にモニターし、その時点で動物を安楽死させた。この研究設計は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの施設内動物管理使用委員会が承認した。
ラットのｉｎ ｖｉｖｏ出血モデルを用いて、ｈＥＬＰの止血剤としての有効性を評価した。１０匹の雄ＣＤラットを２つの試験群に分けた：ｈＥＬＰ（４Ｔｇ－４Ｔｇ；配列番号１６）、ｃｏｎＥＬＰ（対照ＥＬＰ）。４Ｔｇは、凝固体ＦＸＩＩＩａ（配列番号００３）によって認識される「Ｑブロック」トランスグルタミナーゼ基質配列を指す。対照ＥＬＰは、Ｑブロック配列のグルタミンがグリシンに変異しており、ＦＸＩＩＩによって認識されないようになっている。手術当日、ラットはイソフルランで麻酔され、保温ベッドに静置され、２本のカテーテルを挿入された：一方は頸動脈であり、他方は頸静脈である。ＣＯ２、Ｏ２、及び乳酸のベースラインレベルが定められた後、左大腿動脈の近位端と遠位端とにクランプを設置し、その後にその動脈に３ｍｍの切開を入れた。カテーテル出血を制御して各動物の平均動脈圧（ＭＡＰ：ｍｅａｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を４０～６０ｍｍ Ｈｇに下げた後、大腿動脈のクランプを外し、ラットに標記治療薬を５ｍＬ ｋｇ－１の容量でボーラス注入した（最大２ｍＬ ｍｉｎ－１）。各ラットの血液量を６４ｍＬ ｋｇ－１と仮定し、目標とする血中ＥＬＰの最終濃度は３０μＭであった。これは、体重１ｋｇあたり約１４０ｍｇのＥＬＰの投与量に相当する。クランプを外した後、動物を１５分間自由に出血させ、あらかじめ重さを量ったガーゼを使用して出血量を測定した。１５分間の自由出血の期間の後に、血液試料を採取し、血液ガスを測定し、並びにプロトロンビン時間を測定した。その後、ＭＡＰを６０ｍｍ Ｈｇ超過にするため、必要に応じて生理食塩水を動物に投与した（３ｍＬ／ｋｇ／分の速度で、総量６０ｍＬ ｋｇ－１まで）。出血量及びＭＡＰは、ＭＡＰが２０ｍｍ Ｈｇ未満になるまで、あるいは実験終了時点（ｔ＝７５分）まで連続的にモニターし、その時点で動物を安楽死させた。この研究設計は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの施設内動物管理使用委員会が承認した。
方法
特に断りのない限り、すべての化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ブフス、スイス）から購入した。ＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）、ＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）－Ｔｇｆ１１、ＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）－ＧＳＫＧＳ（ＧＳＫＧＳモジュールは配列番号１１である）、ＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）－Ｔｇｆ１１（Ｑ６５Ｇ）、及びＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）－ＧＳＧＧＳ（ＧＳＧＧＳモジュールは配列番号１５である）をコードする遺伝子含有プラスミドは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で合成した。ヒトフィブリノゲン（ＦＩＢ ３、プラスミノーゲン、フィブロネクチン、及びフォンウィルブランド因子の枯渇）、トロンビン、及びＦＸＩＩＩａは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ラインフェルデン、スイス）から購入した。蛍光タグ付きフィブリノゲン（Ｆｇ－４８８）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（バーゼル、スイス）から購入した。
特に断りのない限り、すべての化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ブフス、スイス）から購入した。ＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）、ＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）－Ｔｇｆ１１、ＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）－ＧＳＫＧＳ（ＧＳＫＧＳモジュールは配列番号１１である）、ＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）－Ｔｇｆ１１（Ｑ６５Ｇ）、及びＥＬＰ（Ａ２Ｖ８Ｅ１）－ＧＳＧＧＳ（ＧＳＧＧＳモジュールは配列番号１５である）をコードする遺伝子含有プラスミドは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で合成した。ヒトフィブリノゲン（ＦＩＢ ３、プラスミノーゲン、フィブロネクチン、及びフォンウィルブランド因子の枯渇）、トロンビン、及びＦＸＩＩＩａは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ラインフェルデン、スイス）から購入した。蛍光タグ付きフィブリノゲン（Ｆｇ－４８８）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（バーゼル、スイス）から購入した。
方法１：ＥＬＰの発現及び精製
ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰのタンパク質を、標準的な分子クローニング技術を使用して設計及び製造した。完全長ＥＬＰをコードする遺伝子は、５種の１１－ペンタペプチド遺伝子モノマー：Ａ２Ｖ８Ｅ１－Ｔｇｆ１１、Ａ２Ｖ８Ｅ１、Ａ２Ｖ８Ｅ１－ＧＳＫＧＳ（配列番号１１）、Ａ２Ｖ８Ｅ１－Ｔｇｆ１１（Ｑ６５Ｇ）、又はＡ２Ｖ８Ｅ１－ＧＳＧＧＳ、のうちの１つから出発して製造した。これらは、反復性遺伝子配列の伸長に関する既知の技術である再帰的方向性ライゲーション（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ）に従って、繰り返し消化され、ともにライゲーションされた。所望の長さと組成のＥＬＰをコードする遺伝子を調整した後、それをｐｅｔ２８ａ発現ベクターに挿入し、得られたプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．Ｃｏｌｉに形質転換した。ＥＬＰは、１Ｌのテリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）（ＴＢ）中で、誘導剤を加えず、代わりにＴ７プロモーターの漏出性に依存して、３７℃、２４時間発現させた。発現後、細胞ペレットを遠心分離し、４０ｍＬの２０／１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌに再懸濁し、３サイクルの超音波破砕により溶解した。この溶解液を４℃で遠心分離して細胞デブリを除去し、その後、反復転移サイクル（ＩＴＣ：Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｎｇ）によりＥＬＰを精製した。簡潔には、細胞溶解液を遠心分離した後に残った上澄み液に１ＭのＮａＣｌを加えた。試料を６５℃で１０分間加熱し、４０℃で１８０００ｇにて１５分間遠心分離を行った。上清を捨て、得られたペレットを６ｍＬの冷ＨＥＰＥＳバッファーに再懸濁した。再懸濁したペレットを再度１８０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、冷バッファーで再可溶化できなかった混入物質を廃棄した。これらの工程を合わせて１回のＩＴＣとし、このプロセスをさらに２回繰り返して最終的なＥＬＰ溶液を得て、これを使用前に分注してそのまま－２０℃で保存した。１回の発現で得られる一般的な収量は、培養液が５０～１００ｍｇ／Ｌの範囲であった。
ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰのタンパク質を、標準的な分子クローニング技術を使用して設計及び製造した。完全長ＥＬＰをコードする遺伝子は、５種の１１－ペンタペプチド遺伝子モノマー：Ａ２Ｖ８Ｅ１－Ｔｇｆ１１、Ａ２Ｖ８Ｅ１、Ａ２Ｖ８Ｅ１－ＧＳＫＧＳ（配列番号１１）、Ａ２Ｖ８Ｅ１－Ｔｇｆ１１（Ｑ６５Ｇ）、又はＡ２Ｖ８Ｅ１－ＧＳＧＧＳ、のうちの１つから出発して製造した。これらは、反復性遺伝子配列の伸長に関する既知の技術である再帰的方向性ライゲーション（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ）に従って、繰り返し消化され、ともにライゲーションされた。所望の長さと組成のＥＬＰをコードする遺伝子を調整した後、それをｐｅｔ２８ａ発現ベクターに挿入し、得られたプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．Ｃｏｌｉに形質転換した。ＥＬＰは、１Ｌのテリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）（ＴＢ）中で、誘導剤を加えず、代わりにＴ７プロモーターの漏出性に依存して、３７℃、２４時間発現させた。発現後、細胞ペレットを遠心分離し、４０ｍＬの２０／１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌに再懸濁し、３サイクルの超音波破砕により溶解した。この溶解液を４℃で遠心分離して細胞デブリを除去し、その後、反復転移サイクル（ＩＴＣ：Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｎｇ）によりＥＬＰを精製した。簡潔には、細胞溶解液を遠心分離した後に残った上澄み液に１ＭのＮａＣｌを加えた。試料を６５℃で１０分間加熱し、４０℃で１８０００ｇにて１５分間遠心分離を行った。上清を捨て、得られたペレットを６ｍＬの冷ＨＥＰＥＳバッファーに再懸濁した。再懸濁したペレットを再度１８０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、冷バッファーで再可溶化できなかった混入物質を廃棄した。これらの工程を合わせて１回のＩＴＣとし、このプロセスをさらに２回繰り返して最終的なＥＬＰ溶液を得て、これを使用前に分注してそのまま－２０℃で保存した。１回の発現で得られる一般的な収量は、培養液が５０～１００ｍｇ／Ｌの範囲であった。
方法２：ＥＬＰの雲点の特性評価
ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰの曇点を３０μＭの濃度で測定した。ＥＬＰを２０／１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌバッファー（ｗ／２０ｍＭ ＣａＣｌ２）に適切な濃度に溶解し、キュベットに移し、１５℃の紫外線可視分光光度計（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２６０ Ｂｉｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に配置した。試料を開始温度まで１０分間平衡化させた後、１５～６０℃まで１℃ ｍｉｎ－１の速度で温度傾斜を実行した。３５０ｎｍの吸光度を０．２５分ごとに測定し、この値からＨＥＰＥＳのみを含有するキュベットのブランク読み取り値を差し引いて補正した吸光度値を得、次いでこれを透過率に変換して最大及び最小の吸光度値に対して正規化した。各ＥＬＰの曇点は、正規化した透過率が９５％未満になった点と定義した。
ｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰの曇点を３０μＭの濃度で測定した。ＥＬＰを２０／１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌバッファー（ｗ／２０ｍＭ ＣａＣｌ２）に適切な濃度に溶解し、キュベットに移し、１５℃の紫外線可視分光光度計（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２６０ Ｂｉｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に配置した。試料を開始温度まで１０分間平衡化させた後、１５～６０℃まで１℃ ｍｉｎ－１の速度で温度傾斜を実行した。３５０ｎｍの吸光度を０．２５分ごとに測定し、この値からＨＥＰＥＳのみを含有するキュベットのブランク読み取り値を差し引いて補正した吸光度値を得、次いでこれを透過率に変換して最大及び最小の吸光度値に対して正規化した。各ＥＬＰの曇点は、正規化した透過率が９５％未満になった点と定義した。
方法３：ＦＸＩＩＩａによるＥＬＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ架橋
ＦＸＩＩＩによりｈＥＬＰ又はｃｏｎＥＬＰが架橋される能力を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した。ｈＥＬＰ又はｃｏｎＥＬＰをＨＥＰＥＳバッファーで５０μＭの濃度に希釈し、０．２Ｕ ｍＬ－１のトロンビン及び２０ｍＭのＣａＣｌ２もまたこの研究を通して使用される標準凝固条件の再現するために各試料に加えた。ＦＸＩＩＩａを最終濃度１０μｇ ｍＬ－１で実験試料に添加し、一方、対照試料には同量のＨＥＰＥＳバッファーを添加した。その後、すべての試料を３７℃で１時間インキュベートし、その後、非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。試料はクマシーベースのインスタントブルー染色で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｍｐイメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて画像化した。
ＦＸＩＩＩによりｈＥＬＰ又はｃｏｎＥＬＰが架橋される能力を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した。ｈＥＬＰ又はｃｏｎＥＬＰをＨＥＰＥＳバッファーで５０μＭの濃度に希釈し、０．２Ｕ ｍＬ－１のトロンビン及び２０ｍＭのＣａＣｌ２もまたこの研究を通して使用される標準凝固条件の再現するために各試料に加えた。ＦＸＩＩＩａを最終濃度１０μｇ ｍＬ－１で実験試料に添加し、一方、対照試料には同量のＨＥＰＥＳバッファーを添加した。その後、すべての試料を３７℃で１時間インキュベートし、その後、非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。試料はクマシーベースのインスタントブルー染色で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｍｐイメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて画像化した。
方法４：ＥＬＰ含有Ｆｂクロットのレオロジー測定
ｈＥＬＰ、ｃｏｎＥＬＰ、又は等量のＨＥＰＥＳバッファーを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｆｂクロットの機械的特性は、コーンプレート形状（ｄ＝２５ｍｍ；１°角度）のＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＭＣＲ ３０２レオメーターを使用して評価した。振動せん断弾性率を測定するために、周波数掃引測定を行い、ここでは１．５、２．２、又は３．０ｍｇ ｍＬ－１のフィブリノゲン（Ｆｇ）、３０μＭ ｈＥＬＰ若しくはｃｏｎＥＬＰ、若しくはＨＥＰＥＳバッファー、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．２Ｕ ｍＬ－１トロンビンを含有するクロット溶液を調整することで行った。トロンビンを添加した直後に、９０μＬのクロット溶液を３７℃に予熱したレオメーターのペルチェプレートに移し、測定コーンを試料上に下ろし、コーンを６０ｒｐｍで５秒間回転させて適切な混合と試料分布とを確保した。シリコーンオイル（η＝１００ｃＳｔ）を、蒸発を防ぐために試料の端部に塗布し、このクロットを１時間平衡化させた後、０．１～３Ｈｚの周波数掃引を行った（γ＝１％；この材料については線形粘弾性領域（ＬＶＥ）内にあると以前に測定された）。
ｈＥＬＰ、ｃｏｎＥＬＰ、又は等量のＨＥＰＥＳバッファーを含有するｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｆｂクロットの機械的特性は、コーンプレート形状（ｄ＝２５ｍｍ；１°角度）のＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＭＣＲ ３０２レオメーターを使用して評価した。振動せん断弾性率を測定するために、周波数掃引測定を行い、ここでは１．５、２．２、又は３．０ｍｇ ｍＬ－１のフィブリノゲン（Ｆｇ）、３０μＭ ｈＥＬＰ若しくはｃｏｎＥＬＰ、若しくはＨＥＰＥＳバッファー、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．２Ｕ ｍＬ－１トロンビンを含有するクロット溶液を調整することで行った。トロンビンを添加した直後に、９０μＬのクロット溶液を３７℃に予熱したレオメーターのペルチェプレートに移し、測定コーンを試料上に下ろし、コーンを６０ｒｐｍで５秒間回転させて適切な混合と試料分布とを確保した。シリコーンオイル（η＝１００ｃＳｔ）を、蒸発を防ぐために試料の端部に塗布し、このクロットを１時間平衡化させた後、０．１～３Ｈｚの周波数掃引を行った（γ＝１％；この材料については線形粘弾性領域（ＬＶＥ）内にあると以前に測定された）。
Ｆｂクロット中のＥＬＰの剛性調節特性に対する温度の効果を評価するために、１．５又は３．０ｍｇ ｍＬ－１のＦｇ、ｈＥＬＰ、ｃｏｎＥＬＰ、又はＨＥＰＥＳバッファーを含有する試料を、２２℃又は３７℃のいずれかに予熱したレオメーターのペルチェプレート上に前述と同様に形成した。上記のようにクロットの平衡化後に周波数掃引を行った。
Ｆｂクロットのひずみ剛化挙動に対するＥＬＰの効果を評価するため、２．２ｍｇ ｍＬ－１のＦｇ、及び３０μＭのｈＥＬＰ、ｃｏｎＥＬＰ、又はＨＥＰＥＳバッファーを含有する試料を、レオメーターのコーンとプレートとの間に３７℃で前述のとおり形成した。１時間の平衡化後、０．１～１００％ひずみの振動掃引を行った（ｆ＝１Ｈｚ）。
ＥＬＰの存在下で形成されたＦｂクロットのゲル化速度を追跡するために、上記のとおりクロット溶液を調製し、次いで３７℃へ予熱したレオメーターのコーンとプレートとの間に配置した。形成したクロットに小振幅の振動せん断応力を適用し（γ＝１％；ｆ＝１Ｈｚ）、Ｇ’とＧ’’との推移を測定した。各クロットのゲル点は、Ｇ’がＧ’’を超え、かつその後、実験の残りの間、Ｇ’’を下回らなかった時点と定義された。
方法５：ゲル化動態の濁度測定
ゲル化動態（ｇｅｌａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を研究するために、Ｆｂクロットのゲル化における濁度の推移を様々な波長で測定した。一般的実験では、２．２ｍｇ ｍＬ－１のＦｇ、２０ｍＭのＣａＣｌ２、０．１Ｕ ｍＬ－１のトロンビン、並びに３０μＭのｈＥＬＰ、３０μＭのｃｏｎＥＬＰ、又はＨＥＰＥＳの内の１つからなるクロット溶液をキュベットで調製し、すぐに３７℃に予熱したＥｖｏｌｕｔｉｏｎ ２６０ Ｂｉｏ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。次に、吸光度を５ｎｍ間隔で５００～８００ｎｍの範囲で測定し、このスキャンを実験の１時間の時間経過の間、１分ごとに繰り返した。
ゲル化動態（ｇｅｌａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を研究するために、Ｆｂクロットのゲル化における濁度の推移を様々な波長で測定した。一般的実験では、２．２ｍｇ ｍＬ－１のＦｇ、２０ｍＭのＣａＣｌ２、０．１Ｕ ｍＬ－１のトロンビン、並びに３０μＭのｈＥＬＰ、３０μＭのｃｏｎＥＬＰ、又はＨＥＰＥＳの内の１つからなるクロット溶液をキュベットで調製し、すぐに３７℃に予熱したＥｖｏｌｕｔｉｏｎ ２６０ Ｂｉｏ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。次に、吸光度を５ｎｍ間隔で５００～８００ｎｍの範囲で測定し、このスキャンを実験の１時間の時間経過の間、１分ごとに繰り返した。
方法６：Ｆｂクロットの細孔径を決定するための灌流アッセイ
ＥＬＰを有する又は有さないＦｂクロットの孔径を、Ｃａｒｒ及びＨａｒｄｉｎによる以前の研究（Ｓｈｉｎら，Ｃｅｌｌ ２０１８，１７５，１４８１）により適応された灌流アッセイにより評価した。ゲル化中にクロット溶液を支持するために、先端を切断してパラフィルムで密閉した直立重力ろ過カラムの底にクロットを形成した。各実験では、１．５ｍｇ ｍＬ－１、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１Ｕ ｍＬ－１トロンビン、及び３０μＭ ｈＥＬＰ若しくはｃｏｎＥＬＰ、又は等量のＨＥＰＥＳバッファーからなるクロット溶液１ｍＬを使用した。２２℃又は３７℃で１時間、クロットを形成させ、その後、１３ｍＬの等張及び等温ＨＥＰＥＳバッファーを各クロットの上に分注し、クロットを１０分間平衡化させた。その後、１０分ごとにクロットを通過するバッファーの質量を５０分間測定することにより流量を重量的測定で決定した。次に、ＥＬＰを含むクロットと、ＥＬＰを含まないクロットとの細孔半径（ｒｐ）を、ダルシーの法則と、埋め込まれた赤血球を含有するＦｂクロットの孔径を決定するためのＣａｒｒ及びＨａｒｄｉｎによって開発されたモデル（Ｓｈｉｎら，Ｃｅｌｌ ２０１８，１７５，１４８１）とに従う体積流量から計算した：
式中、Ｖは体積流量であり、ηは水の粘度（２２℃にて０．９５４４ｍＰａ ｓ、３７℃にて０．６９１３ｍＰａ ｓ）、ｈはクロットの長さであり、Ａは断面積であり、ｔは時間であり、Ｐは実験期間にクロット上のバッファーが及ぼした平均静水圧である。
ＥＬＰを有する又は有さないＦｂクロットの孔径を、Ｃａｒｒ及びＨａｒｄｉｎによる以前の研究（Ｓｈｉｎら，Ｃｅｌｌ ２０１８，１７５，１４８１）により適応された灌流アッセイにより評価した。ゲル化中にクロット溶液を支持するために、先端を切断してパラフィルムで密閉した直立重力ろ過カラムの底にクロットを形成した。各実験では、１．５ｍｇ ｍＬ－１、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１Ｕ ｍＬ－１トロンビン、及び３０μＭ ｈＥＬＰ若しくはｃｏｎＥＬＰ、又は等量のＨＥＰＥＳバッファーからなるクロット溶液１ｍＬを使用した。２２℃又は３７℃で１時間、クロットを形成させ、その後、１３ｍＬの等張及び等温ＨＥＰＥＳバッファーを各クロットの上に分注し、クロットを１０分間平衡化させた。その後、１０分ごとにクロットを通過するバッファーの質量を５０分間測定することにより流量を重量的測定で決定した。次に、ＥＬＰを含むクロットと、ＥＬＰを含まないクロットとの細孔半径（ｒｐ）を、ダルシーの法則と、埋め込まれた赤血球を含有するＦｂクロットの孔径を決定するためのＣａｒｒ及びＨａｒｄｉｎによって開発されたモデル（Ｓｈｉｎら，Ｃｅｌｌ ２０１８，１７５，１４８１）とに従う体積流量から計算した：
方法７：共焦点像
共焦点顕微鏡を用いて、ｈＥＬＰのＦｂネットワークへの組み込み、及びプラスミン存在下でのＦｂネットワークの分解を調査した。これらのタンパク質のＮ末端アミンをＡｔｔｏ－６４７－ＮＨＳ色素で優先的に官能化させることにより、蛍光性のｈＥＬＰ（ｆ－ｈＥＬＰ）又はｃｏｎＥＬＰ（ｆ－ｃｏｎＥＬＰ）を調製した。一般的な反応では、Ａｔｔｏ－６４７－ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解し、ｈＥＬＰ又はｃｏｎＥＬＰの溶液に、ＥＬＰ１分子あたり１．２の色素分子の比率で添加した。反応は、Ｎ末端アミンを優先的に標的にするためｐＨ８．０で行われ、これはリジンのε－アミノ基よりもｐｋａが低い（それぞれ約８及び１０）。反応を室温で１時間進行させ、次いでこの反応を１００倍過剰のＴＲＩＳ－ＨＣｌの添加によりクエンチした。その後、上記のとおり２回のＩＴＣを行うことで、反応混合物から官能基化ＥＬＰを精製した。
共焦点顕微鏡を用いて、ｈＥＬＰのＦｂネットワークへの組み込み、及びプラスミン存在下でのＦｂネットワークの分解を調査した。これらのタンパク質のＮ末端アミンをＡｔｔｏ－６４７－ＮＨＳ色素で優先的に官能化させることにより、蛍光性のｈＥＬＰ（ｆ－ｈＥＬＰ）又はｃｏｎＥＬＰ（ｆ－ｃｏｎＥＬＰ）を調製した。一般的な反応では、Ａｔｔｏ－６４７－ＮＨＳをＤＭＳＯに溶解し、ｈＥＬＰ又はｃｏｎＥＬＰの溶液に、ＥＬＰ１分子あたり１．２の色素分子の比率で添加した。反応は、Ｎ末端アミンを優先的に標的にするためｐＨ８．０で行われ、これはリジンのε－アミノ基よりもｐｋａが低い（それぞれ約８及び１０）。反応を室温で１時間進行させ、次いでこの反応を１００倍過剰のＴＲＩＳ－ＨＣｌの添加によりクエンチした。その後、上記のとおり２回のＩＴＣを行うことで、反応混合物から官能基化ＥＬＰを精製した。
簡単な画像化実験には、１．５ｍｇ ｍＬ－１フィブリノゲン（１％蛍光Ｆｇ－４８８を添加）、０．２Ｕ ｍＬ－１トロンビン、２０ｍＭ ＣａＣｌ２；及び３０μＭ ｆ－ｈＥＬＰ、３０μＭ ｆ－ｃｏｎＥＬＰ、若しくはＨＥＰＥＳバッファーのうちの１つからなる４０μＬクロット溶液からＩｂｉｄｉ μ－ｓｌｉｄｅ ＶＩ ０．５（ガラス底）のチャンネルにクロットを形成した。クロットは２２℃又は３７℃のいずれかで１時間形成した後、適用温度に予熱したＮｉｋｏｎ Ｔｉ２－Ａ１共焦点顕微鏡の画像化チャンバーに移した。実験の過程でクロットから水分が失われるのを避けるため、スライドの各ポートに４０μＬのバッファーを添加した。５．０６μｍ、５スライスのＺスタックを、最初に４８８ｎｍ（Ｆｂチャンネル）、次に６４０ｎｍ（ＥＬＰチャンネル）のレーザーを用いて、各クロットの３つの異なる位置で撮影した。各治療群につき３つの異なるクロットが撮影された。
分解実験では、１．５ｍｇ ｍＬ－１フィブリノゲン（１％Ｆｇ－４８８を添加）、０．２Ｕ ｍＬ－１トロンビン、２０ｍＭ ＣａＣｌ２；及び３０μＭ ｈＥＬＰ、３０μＭ ｃｏｎＥＬＰ、又はＨＥＰＥＳバッファーのうちの１つからなる１００μＬのクロット溶液から、μ－ｓｌｉｄｅ ｉｂｉｄｉ ８ウェルチャンバー付きカバースリップにおいてクロットを形成した。試料を３７℃で１時間ゲル化させた後、形成された各クロットの半分を外科用メスを用いてカバースリップのウェルから切り取った。次に、カバースリップを３７℃の顕微鏡のイメージングチャンバーに入れ、４８８ｎｍレーザーを使用してＦｂネットワークの端部の位置を特定した。次に、予熱した１０μｇ ｍＬ－１プラスミンの溶液をクロットの端部に塗布し、顕微鏡の視野からクロットが完全に除かれるまで１０秒ごとに画像を撮影した。画像を各クロットの３つの異なる位置で撮影し、各治療群に対して３つの異なるクロットが形成された。
方法８：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイ
ヒト皮膚線維芽細胞（新生児；ＨＤＦｎ）細胞の生存率に対するＥＬＰのコアセルベートの効果を、レサズリンベースのアッセイによって調べた。ＨＤＦｎ細胞を９６ウェル組織培養処理プレートのウェルに２００００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次に、ＤＭＥＭに溶解したｃｏｎＥＬＰ又はｈＥＬＰのストック溶液で細胞を治療し、最終濃度を３０、５０、又は８０μＭのＥＬＰとした。対照ウェルの細胞は、同量のＤＭＥＭで治療した後、３７℃、５％ ＣＯ２でさらに２４時間インキュベートした。次に、１０ｍＭ ＰＢＳ中のレサズリンのストック溶液を、最終濃度１０μｇ ｍＬ－１まで各実験ウェル及び対照ウェルに適用し、プレートを３７℃で４時間インキュベートした後、Ｓａｆｉｒｅ ＩＩプレートリーダーで各ウェルの蛍光を測定した（λｅｘｃ＝５３１ｎｍ、λｅｍｉ＝５７２ｎｍ）。各治療における最終的な細胞生存率は、（細胞を含まないブランクを除いた）治療ごとの平均の蛍光強度をとり、ＥＬＰを含まない対照の平均蛍光強度で割ることによって決定した。
ヒト皮膚線維芽細胞（新生児；ＨＤＦｎ）細胞の生存率に対するＥＬＰのコアセルベートの効果を、レサズリンベースのアッセイによって調べた。ＨＤＦｎ細胞を９６ウェル組織培養処理プレートのウェルに２００００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次に、ＤＭＥＭに溶解したｃｏｎＥＬＰ又はｈＥＬＰのストック溶液で細胞を治療し、最終濃度を３０、５０、又は８０μＭのＥＬＰとした。対照ウェルの細胞は、同量のＤＭＥＭで治療した後、３７℃、５％ ＣＯ２でさらに２４時間インキュベートした。次に、１０ｍＭ ＰＢＳ中のレサズリンのストック溶液を、最終濃度１０μｇ ｍＬ－１まで各実験ウェル及び対照ウェルに適用し、プレートを３７℃で４時間インキュベートした後、Ｓａｆｉｒｅ ＩＩプレートリーダーで各ウェルの蛍光を測定した（λｅｘｃ＝５３１ｎｍ、λｅｍｉ＝５７２ｎｍ）。各治療における最終的な細胞生存率は、（細胞を含まないブランクを除いた）治療ごとの平均の蛍光強度をとり、ＥＬＰを含まない対照の平均蛍光強度で割ることによって決定した。
方法９：ｈＥＬＰの蛍光標識
ＦｂクロットへのｈＥＬＰのＦＸＩＩＩａ媒介性組み込みを研究するために、本発明者らは、蛍光色素Ａｔｔｏ６４７－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（Ａｔｔｏ６４７－ＮＨＳ）を用いてタンパク質のＮ末端で優先的にｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰを標識した。ｐＨ ８で反応を行うことにより、本発明者らは、より低いｐＫａを有するαアミノ基を選択的に標的して、標識後のＦＸＩＩＩａ媒介性架橋のためにＫブロック内のリジンεアミノ基を保存した。ｈＥＬＰ／ｃｏｎＥＬＰの消光係数（ε２８０＝２．７５×１０４Ｍ－１ｃｍ－１）とＡｔｔｏ６４７の消光係数（ε６４７＝１．５×１０５Ｍ－１ｃｍ－１）を用いて、ＥＬＰ分子あたりの蛍光色素分子の平均数は約０．９５であると発明者らは決定した。本発明者らは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて、蛍光性ＨＥＬＰ（ｆ－ｈＥＬＰ）がＦＸＩＩＩａによって架橋される能力を維持しているかどうかを試験した。ＦＸＩＩＩａ含有試料では、約６９．５ｋＤａの単一のｆ－ｈＥＬＰのバンドが消失したことから、Ａｔｔｏ６４７－ＮＨＳによる蛍光標識後、ｆ－ｈＥＬＰがＦＸＩＩＩａによって架橋されるのに十分な活性リジン残基が残存していると考えられた。
ＦｂクロットへのｈＥＬＰのＦＸＩＩＩａ媒介性組み込みを研究するために、本発明者らは、蛍光色素Ａｔｔｏ６４７－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（Ａｔｔｏ６４７－ＮＨＳ）を用いてタンパク質のＮ末端で優先的にｈＥＬＰ及びｃｏｎＥＬＰを標識した。ｐＨ ８で反応を行うことにより、本発明者らは、より低いｐＫａを有するαアミノ基を選択的に標的して、標識後のＦＸＩＩＩａ媒介性架橋のためにＫブロック内のリジンεアミノ基を保存した。ｈＥＬＰ／ｃｏｎＥＬＰの消光係数（ε２８０＝２．７５×１０４Ｍ－１ｃｍ－１）とＡｔｔｏ６４７の消光係数（ε６４７＝１．５×１０５Ｍ－１ｃｍ－１）を用いて、ＥＬＰ分子あたりの蛍光色素分子の平均数は約０．９５であると発明者らは決定した。本発明者らは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて、蛍光性ＨＥＬＰ（ｆ－ｈＥＬＰ）がＦＸＩＩＩａによって架橋される能力を維持しているかどうかを試験した。ＦＸＩＩＩａ含有試料では、約６９．５ｋＤａの単一のｆ－ｈＥＬＰのバンドが消失したことから、Ａｔｔｏ６４７－ＮＨＳによる蛍光標識後、ｆ－ｈＥＬＰがＦＸＩＩＩａによって架橋されるのに十分な活性リジン残基が残存していると考えられた。
配列
エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ：Ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、ヒト細胞外マトリックスタンパク質トロポエラスチンの疎水性ドメインに由来し、反復性ペンタペプチドＶＰＧＸＧ配列（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）を含む、天然変成タンパク質ベースのポリマーである。ＶＰＧＸＧは、本発明で使用したヒトトロポエラスチンの内在性配列の必須部分を示している。
エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ：Ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、ヒト細胞外マトリックスタンパク質トロポエラスチンの疎水性ドメインに由来し、反復性ペンタペプチドＶＰＧＸＧ配列（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）を含む、天然変成タンパク質ベースのポリマーである。ＶＰＧＸＧは、本発明で使用したヒトトロポエラスチンの内在性配列の必須部分を示している。
本発明者らは、止血性ＥＬＰ（ｈＥＬＰ：ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ＥＬＰ）を、ＡＢＣトリブロック構造を有するように設計した。反復ＥＬＰ成分は、３ブロックすべてに存在し、ゲスト残基の位置にアラニン、バリン、グルタミン酸残基を２：８：１の割合（Ａ２Ｖ８Ｅ１）で持つ１１個のＶＰＧＸＧ（配列番号０１２）ペンタペプチドを含んだ。ゲスト位置の残基は理論的にはこの組成から変更可能であるが、本設計は、生理的な温度範囲にある転移温度を持つｈＥＬＰを製造するために選択した。Ｎ末端のｈＥＬＰブロックは、４個のトランスグルタミナーゼタグ（Ｑブロックと呼ぶ）をさらに含有し、これらは、ヒトＦＸＩＩＩａによって高い特異性で認識されることが以前に示されるコンテクストペプチド配列（ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３））に埋め込まれたグルタミン残基を含んだ。これらの配列をより広範なｈＥＬＰ配列に含めることで、本発明者らは、ＦＸＩＩＩが活性化される体内の創傷部位でＦｂネットワークに選択的に組み込まれ、同時に、循環するフィブリノゲンとの標的外相互作用を回避するｈＥＬＰを設計した。中間ｈＥＬＰブロックは、４個の連続したＡ２Ｖ８Ｅ１ユニット、合計４８個のペンタペプチドリピートからなる相分離ブロックであった。この刺激応答性中間ブロックは、生理的温度（３７℃）に反応してｈＥＬＰの相分離を引き起こした。最後に、ｈＥＬＰのＣ末端には４個のリジンブロック（Ｋブロック。ＧＳＫＧＳ（配列番号０１１））を含有し、これはＦＸＩＩＩａが触媒する反応においてグルタミン残基に対して相補的なパートナーとして機能した。
Claims (26)
- ａ．
ｉ． ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３）、
ｉｉ． ＷＱＨＫＩＤＬＲＹＮＧＡ（配列番号００４）、
ｉｉｉ． ＳＱＨＰＬＰＷＰＶＬＭＬ（配列番号００５）、
ｉｖ． ＥＱＦＰＩＡＦＰＲＹＳＩ（配列番号００６）、
ｖ． ＳＥＱＨＬＬＫＷＰＰＷＨ（配列番号００７）、
ｖｉ． ＷＱＩＰＶＤＷＰＰＬＰＰ（配列番号００８）、
ｖｉｉ． ＤＱＷＭＭＡＷＰＳＬＴＬ（配列番号００９）、及び／又は
ｖｉｉｉ． ＳＱＩＰＭＡＷＰＬＬＳＬ（配列番号０１０）、
から選択されるＱブロック配列、
ｂ． 配列ＶＰＧＸＧ（配列番号０１２）の複数のスペーサー配列であり、各Ｘが独立して、Ｐｒｏを除く任意のタンパク新生アミノ酸から選択される、前記複数のスペーサー配列、
ｃ． 任意に、少なくとも１個のリジン残基を含むＫブロック配列、
を含むか、又は本質的にそれからなる、ポリペプチド。 - 各Ｘは、独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、及びＧｌｕから選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
- Ｘに使用されるＡｌａ：Ｖａｌ：Ｇｌｕの比率は、
－ １～３ Ａｌａ：７～１０ Ｖａｌ：１ Ｇｌｕ
であり、
－ 特に、Ｘに使用されるＡｌａ：Ｖａｌ：Ｇｌｕの比率は、約２：８：１～２：９：１である、
請求項２に記載のポリペプチド。 - 前記Ｑブロック配列は、ＤＱＭＭＬＰＷＰＡＶＡＬ（配列番号００３）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、２個以上のＱブロック配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、２～５０個のＱブロック配列を含み、特に２～８個のＱブロック配列、より特に３～６個のＱブロック配列、さらにより特に４個のＱブロック配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、Ｑブロック配列とスペーサー配列とから本質的になり、
特に前記ポリペプチドは、
－（ＶＰＧＸＧ）ｎ－［（Ｑブロック）－（ＶＰＧＸＧ）ｎ］ｍにより記載されるＮ末端Ｑトラクト
－ －［（Ｑブロック）－（ＶＰＧＸＧ）ｎ］ｍ－（ＶＰＧＸＧ）ｏにより記載されるＣ末端Ｑトラクト
－ 前記Ｎ末端Ｑトラクトと前記Ｃ末端Ｑトラクトとを分離するスペーサー配列多量体［（ＶＰＧＸＧ）ｎ］ｐ
からなり、
式中、
－ 各ｎは、いずれの他のｎから独立して、８～１４の整数であり、特に１０～１２の整数であり；
－ 各ｍは、いずれの他のｍから独立して、２～８の整数であり、特に３～６の整数であり、より特にｍは４であり；
－ ｏは、０～１０の整数であり；
－ ｐは、３～６の整数であり、特にｐは４又は５であり、
より特に、前記ポリペプチドは、配列番号１６である、
請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドは、Ｋブロック配列を含み、特にＫブロック配列ＧＳＫＧＳ（配列番号０１１）を含み、より特に２個以上のＫブロック配列ＧＳＫＧＳ（配列番号０１１）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、２～５０個のＫブロック配列を含み、特に２～８個のＫブロック配列を含み、特に３～６個のＫブロック配列を含み、より特に４個のＫブロック配列を含む、請求項１～６又は８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、互いに独立して：
－ ２～８個のＱブロック配列及び２～８個のＫブロック配列、
を含み、
－ 特に３～６個のＱブロック配列及び３～６個のＫブロック配列、
－ より特に４個のＱブロック配列及び４個のＫブロック配列、
を含む、請求項１～６又は８又は９のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 各Ｑブロック配列及び各Ｋブロック配列は、いずれの他のＱブロック配列及びＫブロック配列から、
－ 少なくとも２個のスペーサー配列、
によって分離され、
－ 特に少なくとも３又は４個のスペーサー配列、
－ より特に１０～１４個のスペーサー配列、
－ さらにより特に１２個のスペーサー配列、
によって分離される、
請求項８～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドは、Ｑブロック配列、スペーサー配列、及び任意にＫブロック配列から本質的になる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記スペーサー配列は、Ｑブロック配列又はＫブロック配列でない配列を介在させずに連続したアミノ酸鎖を形成する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドに含まれるすべてのＱブロック配列は、Ｑ配列トラクト内に含まれ、かつすべてのＫブロック配列は、Ｋ配列トラクト内に含まれる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、５０～１２００個のスペーサー配列を含み、特に９０～２５０個のスペーサー配列を含み、より特に１２０～１８０個のスペーサー配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Ｑ配列トラクト及び前記Ｋ配列トラクトは、少なくとも３０個のスペーサー配列によって分離され、特に少なくとも４０個のスペーサー配列によって分離され、より特に少なくとも５０個のスペーサー配列によって分離されている、請求項１４又は１５に記載のポリペプチド。
- スペーサー配列は、連続した配列として、６～１５個のスペーサー配列を含むスペーサー配列多量体に含まれ、特に１０～１４個のスペーサー配列を含むスペーサー配列多量体に含まれる、請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ａ． 各Ｑブロック配列は、１個のスペーサー配列多量体によっていずれの他のＱブロック配列から分離されており、及び／又は
ｂ． 各Ｋブロック配列は、１個のスペーサー配列多量体によっていずれの他のＫブロック配列から分離されており、及び／又は
ｃ． 前記Ｑ配列トラクトは、３～５個のスペーサー配列多量体によって前記Ｋ配列トラクトから分離されている、
請求項１７に記載のポリペプチド。 - すべてのスペーサー配列多量体は、同じ配列を有し、特に前記スペーサー配列多量体の配列は、ＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＡＧ（配列番号０１３）、又はＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＡＧ（配列番号０１４）の配列であるか、又はそれを含む、請求項１６又は１７に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、
ａ． 配列番号００１又は配列番号１６のポリペプチド配列に対して、（≧）８５％以上の同一性、特に（≧）９０％以上の同一性、さらにより特に（≧）９２％以上、（≧）９４％以上、（≧）９５％以上、（≧）９６％以上、（≧）９７％以上、（≧）９８％以上、（≧）９９％以上、又は１００％の同一性により特徴づけられるアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になり、かつ
ｂ． 配列番号００１又は配列番号１６のポリペプチド配列の少なくとも８５％の生物活性によって特徴づけられる、
請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 止血障害、過剰出血、又は凝固障害の治療又は予防における使用のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記凝固障害は、希釈性凝固障害又は外傷性凝固障害である、請求項２１に記載の使用のためのポリペプチド。
- 止血障害、過剰出血、又は凝固障害は、
ａ． 血小板障害、凝固障害、血管の欠陥、及び／又は血小板減少症、
ｂ． 過度の抗凝固、特にワルファリン、ヘパリン、又は直接経口抗凝固薬（例えば、アピキサバン、エドキサバン、リバーロキサバン）の投与により引き起こされる抗凝固；
ｃ． 肝疾患（凝固因子の産生不全）、
ｄ． フォン・ヴィレブランド病、
ｅ． 血友病、
ｆ． 外傷、
に関連するか、又はそれによって引き起こされる、請求項２２に記載の使用のためのポリペプチド。 - 請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
- 請求項２４に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
- 請求項２４に記載の核酸配列又は請求項２５に記載の発現ベクターを含む細胞。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20191629 | 2020-08-18 | ||
| EP20191629.3 | 2020-08-18 | ||
| PCT/EP2021/072863 WO2022038155A1 (en) | 2020-08-18 | 2021-08-17 | Hemostatic elastin-like polypeptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023539104A true JP2023539104A (ja) | 2023-09-13 |
Family
ID=72147927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023512085A Pending JP2023539104A (ja) | 2020-08-18 | 2021-08-17 | 止血性エラスチン様ポリペプチド |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240010682A1 (ja) |
| EP (1) | EP4200326A1 (ja) |
| JP (1) | JP2023539104A (ja) |
| WO (1) | WO2022038155A1 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5082094B2 (ja) * | 2005-12-28 | 2012-11-28 | 国立大学法人名古屋大学 | トランスグルタミナーゼ基質反応性を有するペプチド及びその利用 |
| US8513380B2 (en) * | 2009-07-09 | 2013-08-20 | Georgia Tech Research Corporation | Peptides for binding fibrinogen and fibrin |
-
2021
- 2021-08-17 WO PCT/EP2021/072863 patent/WO2022038155A1/en active Application Filing
- 2021-08-17 US US18/042,001 patent/US20240010682A1/en active Pending
- 2021-08-17 JP JP2023512085A patent/JP2023539104A/ja active Pending
- 2021-08-17 EP EP21765874.9A patent/EP4200326A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240010682A1 (en) | 2024-01-11 |
| WO2022038155A1 (en) | 2022-02-24 |
| EP4200326A1 (en) | 2023-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hosoyama et al. | Peptide-based functional biomaterials for soft-tissue repair | |
| JP6455862B2 (ja) | コラーゲン様構造を有する重合ペプチド及びゲル | |
| JPH05500750A (ja) | 血小板凝集阻害剤 | |
| KR20160105820A (ko) | 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 펩타이드 덴드리머 | |
| JP2022031835A (ja) | 診断的および治療的使用を有するタンパク質 | |
| US10231993B2 (en) | Biocompatible polymeric system for targeted treatment of thrombotic and hemostatic disorders | |
| WO2014059384A2 (en) | ICAM-1 TARGETING ELPs | |
| JP2017532365A (ja) | コラーゲンｉｖの置き換え | |
| Urosev et al. | Phase separation of intrinsically disordered protein polymers mechanically stiffens fibrin clots | |
| Matthyssen et al. | The potential of modified and multimeric antimicrobial peptide materials as superbug killers | |
| KR20070030159A (ko) | 엔도스타틴의 ｎ-말단으로부터의 항-혈관형성 펩티드 | |
| US10335449B2 (en) | Rho associated kinase (ROCK) inhibitors and their use in treating disease | |
| JP2023539104A (ja) | 止血性エラスチン様ポリペプチド | |
| TWI664188B (zh) | 去整合蛋白變異體及其用途 | |
| CN101657465B (zh) | 肽、组合物及其应用 | |
| CN104602701B (zh) | 作为抗纤维蛋白溶解剂的纤维蛋白溶酶原活化剂的突变体 | |
| US20150258211A1 (en) | Hydrogels for delivery of therapeutic polypeptides | |
| WO2023127888A1 (en) | Novel peptides | |
| CA2478675A1 (en) | Inhibitors for use in hemostasis | |
| TWI445543B (zh) | 一種用以治療眼部脈絡膜血管新生之醫藥組合物 | |
| CN112206310B (zh) | 一组用于抑制补体的寄生绦虫多肽 | |
| Buhrman | Recombinant Protein Immobilization and Controlled-Release Mediated by a Non-Covalent Protein Anchor | |
| Urosev | Applications of the Phase Separation of Intrinsically Disordered Proteins in the Design of Intravenous Hemostatic Agents | |
| RU2614694C1 (ru) | Средство, обладающее нейропротекторными свойствами в эксперименте и способ его получения | |
| WO2013184915A1 (en) | Hydrogels for delivery of therapeutic polypeptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240514 |