KR20180036586A - 코일드-코일 형성 펩타이드를 가지는 엘라스틴 융합 단백질, 그의 자극에 따른 자가조립된 나노구조체 및 하이드로젤, 이의 제조 방법 및 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 코일드-코일 형성 펩타이드(CCP) 블럭; 및 상기 CCP 블럭과 연결되는 자극 반응성을 가지는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(EBP) 블럭으로 구성되는, 자극반응성 융합 폴리펩타이드 를 제공한다.
Description
본 발명은 자극반응성을 가진 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP)와 코일드-코일 형성 펩타이드(coiled-coil forming peptide, CCP)를 포함하는 자극 반응성 융합 폴리펩타이드, 이의 자가조립 나노구조체 및 이를 바이오메디컬 분야에 적용하기 위한 하이드로젤에 대한 것이다.
단백질 기반 생체 재료들은, 생체 재료로서 원하는 특성을 분자 수준에서 조작하여 디자인할 수 있기 때문에 바이오메디컬 분야에 적용이 가능한 도구로서 연구되어 왔다. 최근에는 자극 반응성의 주사가 가능한 주사형 하이드로젤에 대한 관심이 높다. 충분한 강도(strength)와 생체호환성을 가지는 스마트 하이드로젤을 디자인하는 것이 중요하다. 인공 단백질의 아미노산 서열은 미리 서열을 정할 수 있으므로, 분자량, 조성 및 기능을 세심하게 결정하여 생체 재료를 만들 수 있게 해 준다.
엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)는 탄성중합체 도메인(domain)으로부터 유래된 열 반응 생체고분자들이다. 엘라스틴은 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 주요한 단백질 구성요소이다. EBPs는 탄성중합체 도메인을 기반으로 하여 열 감응성(thermal sensitivity)을 가지도록 변형되었고, 5개의 아미노산으로 구성되는 펩타이드인, 펜타펩타이드(pentapeptide)의 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly[VP(G 또는 A)XG]를 갖는다. 본 발명에서는 EBPs는 열-감응성 폴리펩타이드들이고, 이들의 전이 온도는 쉽게 조절되어 블럭 공중합체 구조 기반 자가조립된 나노구조체를 형성할 수 있다. 상기 Xaa는 게스트 잔기(guest residue)이고 프롤린(proline)을 제외한 모든 아미노산일 수 있다.
EBPs는 온도에 따른 가역적 위상 전이를 보이는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature, LCST), 즉 전이 온도(transition temperature, Tt)를 가진다. 전이온도 이하에서는 수용성이고, 전이온도 이상으로 온도가 증가하면 불용성이 된다.
코일드-코일 형성 펩타이드(Coiled-coil forming peptide(s): CCP(s))는 단백질 기반 생체재료로 이용하기 좋은 모듈이다. CCP는 자가조립을 하여 안정된 구조를 만드는데, 이는 생체 재료의 물리적 가교결합제(cross-linker)로 쓰기에 매우 좋은 물질이다.
본 발명자들은 CCP의 자가조립에 영감을 받아, CCP와 열반응성 EBP를 결합시켜서 독특한 특성을 가지는 융합 폴리펩타이드를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
Biomacromolecules 2015, 16, 3389-3398
본 발명의 목적은 새로운 형태의 융합 폴리펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 폴리펩타이드의 자가조립 나노구조체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 이용한 가역적 하이드로젤을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로젤을 바이오메디칼 용도에 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 자극반응성(예: 열 반응성)을 가진 EBP와 자가조립이 가능한 CCP를 융합한 자극 반응성 융합 폴리펩타이드를 제공하며, 이 융합 폴리펩타이드는 자가조립 구조체를 만든다. 본 발명의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는, 이중블럭(CCP-EBP)과 삼중블럭(CCP-EBP-CCP)을 포함한다. 이하에서 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기와 같이 이중블럭 펩타이드로 구성되는 자극 반응성 융합 폴리펩타이드를 제공한다:
코일드-코일 형성 펩타이드(CCP) 블럭; 및
상기 CCP 블럭과 연결되는 자극 반응성을 가지는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(EBP) 블럭.
상기 자극은 열일 수 있으며, 열은 온도로 표현되기도 한다.
상기 CCP 블럭은 서열번호 45 내지 48에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 구성된 아미노산을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 서열번호 45 내지 48에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 구성된 아미노산 서열이 기본 유닛(unit)이고, 이 기본유닛(unit)이 n번 반복될 수 있다(n은 1이상의 정수).
상기 EBP 블럭은,
하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다:
[식 1]
[서열번호 1]n; 또는
[식 2]
[서열번호 2]n,
상기 식 1 또는 식 2에서,
상기 서열번호 1은 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]로 구성되고;
상기 서열번호 2는 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]로 구성되고;
상기 n은 1 이상의 정수이고, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 반복 횟수이고; 그리고
상기 X 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 펜타펩타이드 VPGXG 또는 VPAXG 가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택됨.
상기 EBP 블럭은,
상기 펜타펩타이드 VPGXG 또는 VPAXG에서, 상기 V(발린)가 I(이소루신)으로 치환된 것일 수 있다.
상기 이중블럭의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는, 서열번호 51 내지 67 에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 구성된 것일 수 있다.
상기 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는, 상기 자극 반응성 EBP의 전이온도 미만에서 CCP 블럭이 코어 구조를 형성하여 마이셀 구조의 자가조립 나노구조체를 만들 수 있다(도 2A).
상기 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는, 상기 자극 반응성 EBP의 전이온도 이상에서는 열 자극에 의해 EBP의 상전이 거동을 통한 응집에 의해 EBP 블럭이 코어 구조를 형성하고 양친매성의 CCP 블럭은 쉘 구조를 형성함으로써, 코어-쉘 형태 마이셀 구조의 자가조립 나노구조체를 형성할 수 있다(도 2B).
다른 측면에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는 하이드로젤을 제공한다:
상기 언급한 이중블럭의 자극 반응성 융합 폴리텝타이드에 열 자극을 가하여 코어-쉘 형태 마이셀 구조의 자가조립 나노구조체를 제조하고; 그리고
상기 제조된 자가조립 나노구조체들이 응집하는 단계.
상기 하이드로젤은 상기 자가조립 나노구조체 내의 CCP가 물리적 가교제로 작용하는 가역적 하이드로젤일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기와 같이 삼중 블럭 펩타이드로 구성되는 자극 반응성 융합 폴리펩타이드를 제공한다:
코일드-코일 형성 펩타이드(CCP) 블럭;
상기 CCP 블럭에 연결되는 자극 반응성을 가지는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(EBP) 블럭; 및
상기 EBP 블럭에 연결되는 코일드-코일 형성 펩타이드(CCP) 블럭.
상기 자극은 열이고 온도로 표현될 수 있다.
상기 CCP 블럭 및 EBP 블럭에 대한 설명은 앞서 언급한 것과 같다.
상기 삼중블럭의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는 서열번호 68 내지 85 에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 구성될 수 있다.
상기 삼중블럭의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는, 상기 자극 반응성 EBP의 전이온도 미만에서는 점탄성 액체 상태이고; 상기 자극 반응성 EBP의 전이온도 이상에서는 하이드로젤일 수 있다.
상기 하이드로젤은 물리적으로 가교결합된 하이드로젤일 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은, 삼중블럭의 융합 폴리펩타이드를 이용하여 하기 단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는 가역적 하이드로젤을 제공한다:
앞서 언급한 삼중블럭의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드에 열 자극을 가하고;
상기 열 자극에 의해 상기 자극 반응성 융합 폴리펩타이드 내의 EBP 블럭은 열 응집을 하고 CCP 블럭은 물리적 가교결합제로 작용하여 하이드로젤을 형성하는 단계.
본 발명에서 용어 "코일드-코일 형성 펩타이드(Coiled-coil forming peptide(s): CCP(s))"는 말 그대로 코일-코일 구조를 형성하는 펩타이드를 의미한다. 이는 이 기술분야에 알려진 펩타이드이다. 코일드-코일은 본래의 단백질에 공통된 구조 모티브를 가지고 있는데, 서로 2개 또는 그 이상의 α헬릭스 코일이 있고, 다이머, 트라이머, 또는 펜타머를 형성하고, 아미노산 잔기 사이의 소수성 및 이온성 상호작용에 의해 안정화된다. 코일드-코일의 제1차 구조는 7개의 아미노산 서열이 반복되는 햅태드 서열(heptad sequence)이 특징이다. 햅태드 서열인, (abcdefg)n 에서 n 은 반복 횟수를 의미한다. a 및 d에는 소수성 아미노산 잔기가 위치하고 소수성 코어를 형성한다. e 및 g 위치는 전하성 잔기(charged residue(s))가 있고 이온성 상호작용을 내포한다. 이 소수성 및 이온성 상호작용(코일드-코일 상호작용)에 의해 헬릭스 구조가 안정된다(비특허문헌 1). 코일드-코일 도메인의 자가조립으로 내부 및 그 사이의 가교결합이 이루어지고 네트워크를 형성하여, 용액의 pH 및 온도와 같은 외부 요인을 제어하면서 코일 형성에 스위치 온/오프가 될 수 있다.
용어 "엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide: EBP)" 는 "엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ealstin-like polypeptieds: ELP)"라고도 불린다. 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다.
일반적으로, EBPs의 물리화학적 성질은 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly or Ala)-Xaa-Gly 의 조합을 이용하여 대부분 조절된다. 본 발명에서는 첫번째 아미노산인 Val 을 Ile로 치환하여 Ile-Pro-(Gly or Ala)-Xaa-Gly의 조합도 이용하였다. EBP의 물리화학적 특성들은 펜타펩타이드 반복 단위인 (Val 또는 Ile)- Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly의 조합에 의해 주로 제어된다.
본 명세서에서, 상기 Xaa는 "게스트 잔기"라고 칭한다. 상기 Xaa를 다양하게 도입하여 본 발명에 따른 다양한 종류의 EBP를 제조할 수 있다.
상기 EBP는, 전이 온도(transition temperature: Tt)라고도 칭하는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature: LCST)에서 가역 상 전이를 거친다. 이들은, Tt 미만에서 수용성이 크지만, 온도가 Tt를 초과하면 불용성으로 된다.
구체적으로, 그 반복 단위의 3번째 아미노산은 상대적 기계적 특성을 결정한다. 예를 들어, 본 발명에서, 3번째 아미노산인 Gly 는 탄성(elasticity)을, 또는 Ala는 가소성(plasticity) 결정한다. 구체적으로, 세번째 아미노산이 Gly인 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly은 탄성을 가지는 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with elasticity, EBPE)이고, 세번째 아미노산이 Ala인 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly은 가소성을 가지는 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with plasticity, EBPP)이다. 상기 탄성 또는 가소성은 전이 이후에 나타나는 성질이다. 특히 EBPP의 펜타펩타이드 반복 서열에서 Val 대신 Ile으로 대체한 Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly으로 구성된 EBPP을 소수성이 증가된 EBPPI (EBPP with Ile)로 정의한다.
한편, 4번째 아미노산인 게스트 잔기 Xaa의 소수성과 펜타펩타이드 반복 단위의 다중화(multimerization)는, 모두, Tt에 영향을 끼친다.
반복되는 펜타펩타이드의 독특한 조합, 고유의 물리화학적 성질을 가지는 다양한 EBPs 그리고 Tt 및 이들의 블럭 폴리펩타이드를 제조하고, 여기에 자극을 주어 마이셀을 만들거나 하이드로젤을 만들 수 있다.
본 발명에 따른 EBP는 펜타펩타이드가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 이 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블럭(EBP 블럭)을 형성할 수 있다. 구체적으로 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭을 형성할 수 있다. 본 발명의 EBP 블럭의 친수성 또는 소수성의 성질은 EBP의 전이온도가 깊은 관련성이 있다.
EBP의 전이온도는 또한 아미노산 서열 및 이의 분자량에 달려 있다. EBP 서열과 Tt의 상관 관계에 대해서는 Urry 등이 많은 연구를 수행하였다 (Urry D.W., Luan C.-H., Parker T.M., Gowda D.C., Parasad K.U., Reid M.C., and Safavy A. 1991. Temperature of polypeptide inverse temperature transition depends on mean residue hydrophobicity. J. Am. Chem. Soc. 113: 4346-4348.). Urry 등은 Val-Pro-Gly-Val-Gly의 펜타펩타이드에서, 4번째 아미노산인 "게스트 잔기"를 Val 보다 더 친수성을 나타내는 잔기로 치환하는 경우, 원래 서열과 비교하여 Tt가 올라가고, 반대로 Val보다 소수성인 잔기로 게스트 잔기를 치환하면 원래 서열보다 Tt가 낮아진다는 것을 발견하였다. 즉, 친수성을 나타내는 아미노산들을 게스트 잔기로 가진 EBP는 상대적으로 Tt가 높고 소수성을 나타내는 아미노산들을 게스트 잔기로 가진 EBP는 상대적으로 Tt가 낮다는 것을 발견하였다. 이러한 발견을 통해, EBP 서열의 게스트 잔기로 어떤 아미노산을 사용할지 결정하고, 게스트 잔기의 조성 비율에 변화를 줌으로써 특정 Tt를 가지는 EBP를 제조할 수 있게 되었다(Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter 18. pp. 329-343).
앞서 설명한 바와 같이, 게스트 잔기를 구성하는 아미노산의 조성 비율의 조절을 통해서 상대적으로 게스트 잔기들의 친수성이 크면 높은 Tt를 나타내는 EBP를, 또는 상대적으로 게스트 잔기들의 소수성이 크면 낮은 Tt를 나타내는 EBP를 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 EBP 블럭들도 게스트 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 분자량에 변화를 줌으로써 Tt를 올리거나 낮출 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연 아미노산을 의미한다. 예컨대 상기 아미노산은 글라이신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 트레오닌, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 라이신, 히스티딘, 아스파트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신 또는 트립토판 등을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 Gly(G), Ala(A) 등의 약어는 아미노산 약어이다. Gly는 글라이신의, Ala는 알라닌의 약어이다. 또한 글라이신은 G, 알라닌은 A라고도 표현한다. 상기 약어는 이 기술분야에서 널리 사용되는 표현이다.
상기 아미노산의 성질은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적으로 친수성(음전하성 또는 양전하성)을 나타내거나 소수성을 나타낸다.
본 발명에서 "친수성 아미노산"이란, 친수성 성질을 나타내는 아미노산으로, 라이신, 아르기닌 등이 있다.
또한 "소수성 아미노산"이란 소수성 성질을 나타내는 아미노산으로, 페닐알라닌, 류신 등이 있다.
중성인 극성 아미노산으로, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 등이 있고, 음전하를 띤 산성 아미노산으로 아스파르트산, 글루탐산등이 있고, 그리고 양전하를 띤 염기성 아미노산으로 아르기닌, 라이신 등이 있다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 체인을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 체인을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
용어 "상 전이(phase transition)"이란, 물이 수증기로 변하거나 얼음이 물로 변하는 것과 같이, 물질의 상태가 변하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "자극 반응성 융합 폴리펩타이드"란, 자극에 반응하여 모양이나 성질이 변하는 융합 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명에서 상기 자극은 열(온도)일 수 있다.
본 발명의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드에 열을 가하면, 즉 온도를 높이면 융합 폴리펩타이드의 모양이 변하고 성질(고체 또는 액체)도 변한다.
본 발명의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드를 구성하는 펩타이드는 CCP 블럭과 EBP 블럭으로 구성된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 중 이중블럭이란, CCP를 구성하는 폴리펩타이드와 EBP를 구성하는 폴리펩타이드가 연결된 것을 말하며 "CCP-EBP" 또는 "CCP-EBP 이중블럭" 이라고 표현하기도 한다. 그리고 EBP는 EBPP(가소성을 가진 EBP) 또는 EBPE(탄성을 가진 EBP)로 표현하기도 한다. 또 다른 용어 삼중블럭이란, CCP를 구성하는 폴리펩타이드와 EBP를 구성하는 폴리펩타이드가 "CCP-EBP-CCP"의 순서로 연결된 폴리펩타이드를 말한다. "CCP-EBP-CCP" 또는 "CCP-EBP-CCP 삼중블럭" 이라고 표현하기도 한다.
본 발명에서는 CCP 또는 EBP로 기재되어 있더라고 복수의 개념(CCPs 또는 EBPs)이 포함되어 있다. 자가조립 나노구조체, 마이셀, 하이드로젤의 경우도 단수로 표현되어 있더라고 복수의 개념이 포함된다.
본 발명은 새로운 합성 폴리펩타이드에 대한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 자가조립하여 다중반응성(multi-responsiveness)을 가지는 마이셀이나 하이드로젤과 같은 나노구조체를 형성할 수 있고 바이오메디칼에 적용할 수 있다.
본 발명은 CCP와 열반응성 EBP를 결합시켜서 독특한 특성을 가지는 융합 폴리펩타이드를 개발하였다. CCP 블럭은 다음과 같다. De novo 디자인(Bojana Apostolovic, Maarten Danial, and Harm-Anton Klok, Coiled coils: attractive protein folding motifs for the fabrication of self-assembled, responsive and bioactive materials, Chemical Society Reviews, 2010, 2010, 39, 3541-3575)을 이용하여 2개의 호모 및 2개의 헤테로 올리고머화 상태를 가지는 4가지 형태의 코일드-코일 형성 서열을 디자인하였다(표 3 및 4).
호모 올리고머 CCP(표 3및 4의 CCP[homo A]/CCP[homo B])는 자기 CCP들끼리만 결합하여 코일드-코일을 형성하는 성질이 있다. 이에 반해 헤테로 올리고머 CCP(표 3및 4의 CCP[hetero A]/CCP[hetero B])는 다른 CCP와 결합하여 코일드-코일을 형성하는 성질이 있다(Bojana Apostolovic, Maarten Danial, and Harm-Anton Klok, Coiled coils: attractive protein folding motifs for the fabrication of self-assembled, responsive and bioactive materials, Chemical Society Reviews, 2010, 2010, 39, 3541-3575). 구체적으로 호모 올리고머의 경우, 코일드-코일 반복 단위 당 양전하와 음전하를 띄는 아미노산들이 공존하기 때문에 분자내 또는 분자간 호모 CPP끼리 스스로 결합을 형성할 수 있다. 이에 반해 헤테로 올리고머의 경우, 코일드-코일 반복단위 당 양전하 혹은 음전하만을 가지고 있기 때문에 다른 전하를 띄는 헤테로 CCP와 만났을 때만 결합이 가능하다.
CCP를 물리적 가교결합제로 이용하여 ABA 타입의 삼중블럭 폴리펩타이드를 디자인할 수 있다. ABA의 A는 CCP로 코일드-코일을 형성하여 물리적 가교결합제 역할을 하고, B는 랜덤 블럭, 폴리펩타이드, 또는 고분자전해질(polyelectrolyte)일 수 있다. 본 발명에서는 폴리펩타이드, 즉 EBP를 이용하였다.
본 발명의 구체예에서, 이중블럭은 EBP의 C 말단에 호모 올리고머 CCP를 융합하여 만들었다. 도 2A에 나타난 것과 같이, EBP의 전이온도(Tt) 미만에서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 EBP는 수용성 상태이고 CCP의 코일드-코일 상호작용으로 자가조립 나노구조체를 형성한다. 도 2B를 보면, EBP의 전이온도 이상에서는 EBP가 열 응집으로 코어를 형성하고 CCP가 쉘을 형성하면서 마이셀 자가조립 나노구조체를 형성한다. 이 자가조립체들은 CCP의 코일드-코일 상호작용에 의해 응집되어 하이드로젤을 형성한다. 이 때 서로 다른 코일과 결합할 수 있는 호모올리고머 CCP 또는 헤테로올리고머 CCP를 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "하이드로젤(hydrogel)이란, 일반적으로 다량의 수분을 함유할 수 있는 삼차원의 친수성 고분자 망상구조를 가진 물질을 의미하며, 수용액상에서 팽윤된 후에 열역학적으로 안정하게 존재하여 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적·물리화학적 특성을 지닌다.
본 발명에서는 융합 폴리펩타이드는 CCP의 자가조립 성질과 EBP의 자극(예: 열) 반응성을 채용한 것이다. CCP-EBP의 융합 폴리펩타이드 또는 CCP-EBP-CCP의 융합 폴리펩타이드 내의 CCP가 물리적 가교제 역할을 하여 하이드로젤을 형성할 수 있다. EBP의 전이온도 이하에서는, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 단지 코일드-코일 상호작용만이 네트워크의 자가조립에 관여하는데, EBP의 전이온도가 증가하면 EBP 소수성 변화에 의한 응집(aggregation)이 일어나므로 코일드-코일의 상호작용은 더욱 강한 물리적 가교결합으로 변하고 하이드로젤을 형성한다(도 3).
본 발명은 가역적 하이드로젤을 제공한다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 자극 반응성을 가지는 EBP에 의해 온도 변화에 따라 상전이 거동을 나타낸다. 즉 전이온도 이하의 저온에서는 하이드로젤이 형성되지 않지만 전이온도 이상에서는 하이드로젤이 형성되고, 다시 온도를 낮추면 하이드로젤이 형성되지 않는다.
본 발명에 따른 가역적 하이드로젤들은 주사형 약물 전달 시스템, 기능적 조직 공학 및 재생 의료에 있어서 유용하다.
본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 생체 환경 이상의 온도에서, 즉, 전이온도 이상의 온도에서, 물리적 가교결합 형성이 가능하다. 따라서 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드를 이용한 하이드로젤은 생체재료 주사에 적합한, 자극 반응성을 가지는 단백질 기반 가역적 하이드로젤이다.
본 발명에 따른 하이드로젤들은, 약물 전달 저장용 주사형 생체 재료, 조직 공학 스캐폴드, 및 재생 의약에서 필러 등에 이용하기 위해 개발되었다.
또 다른 측면에서 본 발명은 상기 언급한 이중블럭 및 삼중블럭의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드로 제조한 하이드로젤을 포함하는 약물 전달 조성물; 및 조직공학용 지지제를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 조직공학용 지지체(scaffold)는 생체 조직의 대용품을 만들어 이식함으로써 신체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 조직 공학(tissue engineering) 분야에서 사용될 수 있는 모든 지지체를 포함한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 상기 언급한 이중블럭 및 삼중블럭의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드로 제조한 하이드로젤을 포함하는 조직 또는 기관 재생용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 조직 또는 기관재생용 키트는 상기 조직공학용 지지체에 더하여, 상기 지지체의 형상 유지를 위한 보강층이 추가될 수 있다. 상기 보강층은 PCL, PLA, PLGA, PGA 등의 생분해성 고분자 물질에서 선택될 수 있다.
ABA 타입의 삼중블럭 폴리펩타이드는, EBP의 양 옆에 물리적 가교결합제인 CCP를 융합시켜서 하이드로젤로 작동할 수 있도록 디자인하였다. 저온(EBP 전이온도 이하)에서 삼중블럭 폴리펩타이드(CCP-EBP-CCP)는 코일드-코일의 분자 내부 및 분자 사이의 상호작용에 의해 고탄성 액체 (viscoelastic liquid)상태이고, 중간 EBP블럭의 전이온도 이상에서는 코일드-코일 상호 작용과 함께 열자극에 의한 응집된 EBP 블록들의 강한 물리적 가교결합을 제공하여 점탄성의 고체 (viscoelastic solid)로 변한다. 이러한 물리적 가교결합은 CCP의 체인 길이 변화 및 호모 올리고머 CCP 대 헤테로 올리고머 CCP간에 상호작용 상태에 따라 강화된다. 또한 CCP체인 길이가 늘어나면 소수성 및 이온성 상호작용이 가교결합을 강화된다. 특히 하이드로젤 내 분자간 네트워크를 형성할 때, 브릿지가 아닌 일부 분자의 내부에서 루프를 형성하게 만드는 상호작용을 제거하기 위해, 본 발명자들은 분자 사이의 상호작용을 강화하기 위해 헤테로 올리고머를 디자인하였다. 헤테로 올리고머의 분자 사이의 상호작용으로, EBP의 전이온도 이상에서 중간 EBP 블럭과 더욱 강하게 가교결합이 이루어져서 더 강한 하이드로젤을 형성할 수 있도록 한다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 자가조립 CCP와 열 반응성 EBP로 구성되고, 물리적으로 가교결합된 하이드로젤의 기계적 성질을 강화시킬 수 있다. EBP의 Tt 이하에서는, 단지 코일드-코일 상호작용만이 네트워크의 자가조립에 관여하는데, EBP의 Tt가 증가하면 EBP의 응집(aggregation)이 일어나므로 코일드-코일의 상호작용은 더욱 강한 물리적 가교결합으로 변한다. 이와 같은 강화된 기계적 성질을 이용한 물리적으로 가교결합된 하이드로젤은 생체재료의 기능성을 조절할 수 있을 것이다. 그리고 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 약물 전달, 조직공학 및 재생의학 용도로 이용할 수 있다.
본 발명의 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는 가역적 자가조립 나노구조체를 및 하이드로젤을 형성하는 효과를 제공한다. 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 약물 전달, 조직공학 및 재생의학 용도로 이용할 수 있다.
도 1은 CCP 단일, 이중 및 삼중블럭 폴리펩타이드 유전자 클로닝 과정 모식적으로 나타낸 것이다: A) RDL을 수행하기 위해, AcuI 및 BseRI 제한 사이트를 가지는 어댑터를 삽입할 수 있도록 pET-21a(+)를 변형함. CCP 핵산 카세트가 XbaI 및 BseRI로 절단된 변형 pET-21a(+)로 삽입됨. B) RDL로 CCP 유전자를 다중화함(multimerization). XbaI 및 BseRI 절단에 의해 벡터가 선형화되고 유전자 삽입을 위해 XbaI 및 AcuI 으로 절단됨. 라이게이션 후 원하는 유전자 길이를 얻을 때까지 동일한 과정을 반복함. C) 이중 및 삼중블럭 폴리펩타이드 제조를 위한 이음매 없는 클로닝 과정(seamless cloning). CCP 유전자 함유 플라스미드(XbaI 및 BseRI로 선형화)에 EBPP 유전자(XbaI 및 AcuI로 절단)를 삽입하여 이중블럭 폴리펩타이드 합성. 그 다음 단계는, CCP 유전자(XbaI 및AcuI로 절단)를 이중블럭 함유 플라스미드(XbaI 및 BseRI로 선형화)로 삽입하여 CCP-EBPP-CCP의 삼중블럭 폴리펩타이드 합성.
도 2는 EBPP-CCP 이중블럭 폴리펩타이드의 자가조립 과정을 모식적으로 나타낸 것이다: A) 호모 올리고머를 가지는 EBPP-CCP 이중블럭 폴리펩타이드는, EBPP의 전이온도 이하에서, CCP는 코일드-코일 상호작용으로 코어를 형성하고, EBPP는 수용성 상태이고 쉘(shell) 역할을 함. B) 헤테로 올리고머를 가지는 두 가지의 EBPP-CCP 이중블럭 폴리펩타이드는, EBPP의 전이온도 이상에서, EBPP의 응집과 헤테로 올리고머 CCP의 친수성 성질로 인해 각각 마이셀을 형성함. 이 두 종류의 이중블럭 폴리펩타이드를 혼합하면, CCP헤테로올리고머 분자 사이의 코일드-코일 상호작용 및 이 CCP가 EBPP 블럭 사이에서 물리적 가교결합제로 작용하여, 하이드로젤을 형성할 수 있음.
도 3은 CCP-EBPP-CCP의 삼중블럭 폴리펩타이드의 자가조립 과정을 모식적으로 나타낸 것이다: A)는 호모 올리고머로 구성된 짧은 CCP체인, B)는 더 긴 CCP 체인임. EBPP 전이온도 이하의 낮은 온도에서, EBPP는 수용성 상태이고, CCP의 코일드-코일 상호작용에 의해 생긴 느슨하게 연결된 네트워크로 자가조립됨. EBPP의 전이온도 이상에서는, 느슨하게 연결된 네트워크가 중간 블럭인 EBPP의 열 응집에 의해 가역적 하이드로젤을 형성할 수 있음. C) 헤테로A 및 헤테로B를 가지는 CCP-EBPP-CCP 삼중블럭 폴리펩타이드를 보여줌. 이 두 종류의 삼중블럭 폴리펩타이드를 섞으면, 헤테로올리고머 사이의 코일드-코일 상호작용에 의해 물리적으로 가교결합된 하이드로젤을 형성함. 이 헤테로 올리고머의 코일드-코일 상호작용은 이들의 분자 내 상호작용에 의해 루프 형성을 없앨 수 있음. 느슨하게 연결된 네트워크는 EBPP의 전이온도 이상에서 EBPP의 열 응집과 물리적 가교결합에 의해 높은 기계적 성질 (mechanical property)을 가진 하이드로젤을 형성함.
도 4는 RDL에 의해 유전자 클로닝된 모든 CCP 유전자들의 아가로스 젤 전기영동 사진이다: A) CCP[homoA]n, B), CCP[homoB]n, C) CCP[heteroA]n, D) CCP[heteroB]n. M 레인은 크기 마커이고 각 CCP의 햅태드 개수는 위에 표시하였고 좌측은 유전자크기 마커이고 이들의 유전자 크기는 우측에 표시함.
도 5는 RDL에 의해 유전자 클로닝된 EBPP-CCP 이중블럭 및 CCP-EBPP-CCP 삼중블럭의 아가로스 젤 전기영동 사진이다. A) 이중블럭 폴리펩타이드이고, 레인 1) EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, 레인 2) EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA] 4 , 레인 3) EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]2, 레인 4) EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]4. B) 삼중블럭 폴리펩타이드이고, 레인 1) CCP[homoA]2 -EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, 레인 2) CCP[homoA]4 -EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4, 레인 3) CCP[homoA]2 -EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]2, 레인 4) CCP[homoA]4 -EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]4. 마커의 유전자크기는 좌측에 각 블럭의 유전자크기는 우측에 표시함.
도 6은 ITC로 정제된 EBPP-CCP 이중블럭 및 삼중블럭 폴리펩타이드의 구리 염색 SDA-PAGE(12%) 젤 사진이다: A) 이중블럭 폴리펩타이드로, 레인 1) EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, 레인 2) EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4, 레인 3) EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]2, 레인 4) EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]4. B) 삼중블럭으로, 레인 1) CCP[homoA]2 -EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, 레인 2) CCP[homoA]4 -EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4.레인 M은 크기 마커이고, 마커의 유전자 크기는 좌측에 각 블럭의 분자량은 우측에 표시함.
도 7은 EBPP[G1A3F2]n 라이브러리를 이용한 EBPP 단일블럭, 이중블럭, 삼중블럭의 열 프로필이다. A) EBPP[G1A3F2]6 단일블럭 및 CCP[homoA]1, CCP[homoA]2 또는 CCP[homoA]4를 가지는 이중블럭. B) EBPP[G1A3F2]12 단일블럭 및 CP[homoA]2 또는 CCP[homoA]4를 가지는 이중블럭. C) CCP[homoA]2-EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPP[G1A3F2]6- CCP[homoA]4의 삼중블럭. D) 15 C에서 이중블럭 폴리펩타이드인 EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]1, EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4의 DLS(dynamic light scattering).
도 8은 EBPPI[G1A3F2]6 라이브러리를 이용한 삼중블럭 폴리펩타이드의 전기영동 사진이다: A) 아가로스 젤 및 B) 구리 염색 SDS-PAGE (15 %). M은 크기 마커이고 각 블럭의 예상 크기는 우측에 표시하였다. 레인1) CCP[homoA]2-EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2; 레인 2) CCP[homoA]4-EBPP[G1A3F2]6- CCP[homoA]4 및 레인 M) 크기 마커.
도 9는 10 mM PBS (pH 7.4)에서 EBPPI[G1A3F2]6 라이브러리를 이용한 삼중블럭 폴리펩타이드의 열 프로필이다: A) 및 B)는 차례대로 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 농도 의존적 열 프로필이다. C) 및 D)는 차례대로 25 uM 농도의 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 에 대한 요소의 영향을 농도별로 나타낸 것이다.
도 10은 10C에서 A) CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 B) CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4의 크기 측정 결과이다. PBS, 8 M 요소 포함 PBS, 6 M GndCl 포함 PBS에서 에서 25 uM로 크기를 측정하였다. 샘플들은 측정 전에 10 C 에서 10분 동안 평형화시켰다.
도 11은 10 mM PBS (pH 7.4)의 30 wt%에서 라이브러리를 이용한 삼중블럭 폴리펩타이드의 진동 레올로지 측정 결과이다. A) 및 B)는 4 C 및 37 C (g 2 %)에서, 차례대로, CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 주파수 스위프 테스트(frequency sweep test) 결과이다. C) 및 D)는 차례대로, CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 1 oC/분 가열 속도에서 온도 의존적 레올로지 측정 결과이고, E) 및 F)는 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 1 oC/분 냉각 속도에서 온도 의존적 레올로지 측정 결과이다(g 2 %, 1 rad/s).
도 12는 삼중블럭 폴리펩타이드의 진동 레올로지 측정에 대한 요소의 영향을 나타낸 것이다. A) 및 B)는 차례대로 4 C, 2 M 요소 (urea)를 포함한 10 mM PBS (pH 7.4)를 이용한 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4의 주파수 스위프 테스트 결과이다(γ 2 %). C) 및 D)는, 차례대로 CCP[homoA]2-EBPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 1 °C/분 (γ 2 %, 1 rad/s) 가열 속도에서 2M 요소 포함 PBS를 이용한 온도 스위프 테스트 (temperature sweep test) 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합폴리펩타이드의 가역적 졸-젤 전이를 보여주는 사진 이미지이다.
도 2는 EBPP-CCP 이중블럭 폴리펩타이드의 자가조립 과정을 모식적으로 나타낸 것이다: A) 호모 올리고머를 가지는 EBPP-CCP 이중블럭 폴리펩타이드는, EBPP의 전이온도 이하에서, CCP는 코일드-코일 상호작용으로 코어를 형성하고, EBPP는 수용성 상태이고 쉘(shell) 역할을 함. B) 헤테로 올리고머를 가지는 두 가지의 EBPP-CCP 이중블럭 폴리펩타이드는, EBPP의 전이온도 이상에서, EBPP의 응집과 헤테로 올리고머 CCP의 친수성 성질로 인해 각각 마이셀을 형성함. 이 두 종류의 이중블럭 폴리펩타이드를 혼합하면, CCP헤테로올리고머 분자 사이의 코일드-코일 상호작용 및 이 CCP가 EBPP 블럭 사이에서 물리적 가교결합제로 작용하여, 하이드로젤을 형성할 수 있음.
도 3은 CCP-EBPP-CCP의 삼중블럭 폴리펩타이드의 자가조립 과정을 모식적으로 나타낸 것이다: A)는 호모 올리고머로 구성된 짧은 CCP체인, B)는 더 긴 CCP 체인임. EBPP 전이온도 이하의 낮은 온도에서, EBPP는 수용성 상태이고, CCP의 코일드-코일 상호작용에 의해 생긴 느슨하게 연결된 네트워크로 자가조립됨. EBPP의 전이온도 이상에서는, 느슨하게 연결된 네트워크가 중간 블럭인 EBPP의 열 응집에 의해 가역적 하이드로젤을 형성할 수 있음. C) 헤테로A 및 헤테로B를 가지는 CCP-EBPP-CCP 삼중블럭 폴리펩타이드를 보여줌. 이 두 종류의 삼중블럭 폴리펩타이드를 섞으면, 헤테로올리고머 사이의 코일드-코일 상호작용에 의해 물리적으로 가교결합된 하이드로젤을 형성함. 이 헤테로 올리고머의 코일드-코일 상호작용은 이들의 분자 내 상호작용에 의해 루프 형성을 없앨 수 있음. 느슨하게 연결된 네트워크는 EBPP의 전이온도 이상에서 EBPP의 열 응집과 물리적 가교결합에 의해 높은 기계적 성질 (mechanical property)을 가진 하이드로젤을 형성함.
도 4는 RDL에 의해 유전자 클로닝된 모든 CCP 유전자들의 아가로스 젤 전기영동 사진이다: A) CCP[homoA]n, B), CCP[homoB]n, C) CCP[heteroA]n, D) CCP[heteroB]n. M 레인은 크기 마커이고 각 CCP의 햅태드 개수는 위에 표시하였고 좌측은 유전자크기 마커이고 이들의 유전자 크기는 우측에 표시함.
도 5는 RDL에 의해 유전자 클로닝된 EBPP-CCP 이중블럭 및 CCP-EBPP-CCP 삼중블럭의 아가로스 젤 전기영동 사진이다. A) 이중블럭 폴리펩타이드이고, 레인 1) EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, 레인 2) EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA] 4 , 레인 3) EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]2, 레인 4) EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]4. B) 삼중블럭 폴리펩타이드이고, 레인 1) CCP[homoA]2 -EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, 레인 2) CCP[homoA]4 -EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4, 레인 3) CCP[homoA]2 -EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]2, 레인 4) CCP[homoA]4 -EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]4. 마커의 유전자크기는 좌측에 각 블럭의 유전자크기는 우측에 표시함.
도 6은 ITC로 정제된 EBPP-CCP 이중블럭 및 삼중블럭 폴리펩타이드의 구리 염색 SDA-PAGE(12%) 젤 사진이다: A) 이중블럭 폴리펩타이드로, 레인 1) EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, 레인 2) EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4, 레인 3) EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]2, 레인 4) EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]4. B) 삼중블럭으로, 레인 1) CCP[homoA]2 -EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, 레인 2) CCP[homoA]4 -EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4.레인 M은 크기 마커이고, 마커의 유전자 크기는 좌측에 각 블럭의 분자량은 우측에 표시함.
도 7은 EBPP[G1A3F2]n 라이브러리를 이용한 EBPP 단일블럭, 이중블럭, 삼중블럭의 열 프로필이다. A) EBPP[G1A3F2]6 단일블럭 및 CCP[homoA]1, CCP[homoA]2 또는 CCP[homoA]4를 가지는 이중블럭. B) EBPP[G1A3F2]12 단일블럭 및 CP[homoA]2 또는 CCP[homoA]4를 가지는 이중블럭. C) CCP[homoA]2-EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPP[G1A3F2]6- CCP[homoA]4의 삼중블럭. D) 15 C에서 이중블럭 폴리펩타이드인 EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]1, EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2, EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4의 DLS(dynamic light scattering).
도 8은 EBPPI[G1A3F2]6 라이브러리를 이용한 삼중블럭 폴리펩타이드의 전기영동 사진이다: A) 아가로스 젤 및 B) 구리 염색 SDS-PAGE (15 %). M은 크기 마커이고 각 블럭의 예상 크기는 우측에 표시하였다. 레인1) CCP[homoA]2-EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2; 레인 2) CCP[homoA]4-EBPP[G1A3F2]6- CCP[homoA]4 및 레인 M) 크기 마커.
도 9는 10 mM PBS (pH 7.4)에서 EBPPI[G1A3F2]6 라이브러리를 이용한 삼중블럭 폴리펩타이드의 열 프로필이다: A) 및 B)는 차례대로 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 농도 의존적 열 프로필이다. C) 및 D)는 차례대로 25 uM 농도의 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 에 대한 요소의 영향을 농도별로 나타낸 것이다.
도 10은 10C에서 A) CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 B) CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4의 크기 측정 결과이다. PBS, 8 M 요소 포함 PBS, 6 M GndCl 포함 PBS에서 에서 25 uM로 크기를 측정하였다. 샘플들은 측정 전에 10 C 에서 10분 동안 평형화시켰다.
도 11은 10 mM PBS (pH 7.4)의 30 wt%에서 라이브러리를 이용한 삼중블럭 폴리펩타이드의 진동 레올로지 측정 결과이다. A) 및 B)는 4 C 및 37 C (g 2 %)에서, 차례대로, CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 주파수 스위프 테스트(frequency sweep test) 결과이다. C) 및 D)는 차례대로, CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 1 oC/분 가열 속도에서 온도 의존적 레올로지 측정 결과이고, E) 및 F)는 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 1 oC/분 냉각 속도에서 온도 의존적 레올로지 측정 결과이다(g 2 %, 1 rad/s).
도 12는 삼중블럭 폴리펩타이드의 진동 레올로지 측정에 대한 요소의 영향을 나타낸 것이다. A) 및 B)는 차례대로 4 C, 2 M 요소 (urea)를 포함한 10 mM PBS (pH 7.4)를 이용한 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4의 주파수 스위프 테스트 결과이다(γ 2 %). C) 및 D)는, 차례대로 CCP[homoA]2-EBPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 1 °C/분 (γ 2 %, 1 rad/s) 가열 속도에서 2M 요소 포함 PBS를 이용한 온도 스위프 테스트 (temperature sweep test) 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합폴리펩타이드의 가역적 졸-젤 전이를 보여주는 사진 이미지이다.
실시예 1: 재료
Novagen Inc. (Madison, WI, U.S.)로부터 pET-21a 벡터 및 BL21 (DE3) E. coli 세포들을 구입하였다. Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.)로부터 Top 10의 수용세포들(competent cells)을 구입하였다. Cosmo Gene Tech (Seoul, South Korea)에서 올리고뉴클레오티드들을 화학적으로 합성하였다. Fermentas (Ontario, Canada)로부터 감열성 알칼리 포스포타제인 FastAP, 및 BamHI와 XbaI를 포함하는 제한 엔도뉴클레아제를 구매하였다. New England Biolabs (Ipswich, MA, U.S.)로부터 BseRI, AcuI, 및 기타 제한 효소를 포함하는 다른 제한 엔도뉴클레아제를 얻었다. Elpis Bio-tech (Taejeon, South Korea)로부터 T4 DNA 리가아제를 얻었다. Geneall Biotechnology (Seoul, South Korea)에서 DNA 미니-제조, 젤 추출, 및 PCR 정제를 위한 모든 키트들을 얻었다. DYNE BIO (Seongnam, South Korea)로부터 아가로즈젤 전기영동을 위한 Dyne Agarose High를 얻었다. 모든 Top10 세포들을 TB DRY 배양액 (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, U.S.)에서 성장시켰고 클로닝 후 SOC (Formedium, UK) 고체배지에 도말하였다. 모든 BL21(DE3) 세포들을 MP Biomedicals 로부터 구입한 Circle Grow (Solon, OH, U.S.)에서 성장시켰다. SDS-PAGE을 위한 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.4), 암피실린을 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)로부터 구입하였다.
실시예 2: 서로 다른 EBP 블럭들과 이들의 융합 폴리펩타이드에 대한 표기
펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly[VP(G 또는 A)XG]를 갖는 서로 다른 EBP들은 다음과 같이 명명한다. 상기 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 첫째, 가소성이 있는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly(VPAXG)의 펜타펩타이드 반복은 가소성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with plasticity: EBPP)라고 정의한다. 한편 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)의 펜타펩타이드 반복은 탄성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(the elastin-based polypeptide with elasticity: EBPE)라 칭한다. 둘째, [XiYjZk]n에서, 괄호 내의 대문자들은 게스트 잔기의 단글자 아미노산 코드, 즉, EBP 펜타펩타이드의 4번째 위치(Xaa 또는 X)에서의 아미노산이고, 이들의 해당하는 아래 첨자는 반복 단위로서 EBP 모노머 유전자의 게스트 잔기의 비율(ratio)을 나타낸다. [XiYjZk]n의 아래 첨자 수 n은 본 발명의 서열번호 1 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]또는 서열번호 2[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]의 EBP의 반복 횟수의 총 수를 나타낸다. 예를 들어, EBPP[G1A3F2]12는 서열번호 2[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 의 단위가 12번 반복되어 이루어진 EBPP 블럭이며, 여기서 4번째 게스트 잔기 위치(Xaa)에서의 Gly, Ala, 및 Phe의 비는 1:3:2이다.
4개의 CCP는 2개의 호모 및 2개의 헤테로 올리고머를 가지고 de novo디자인하였다(Bojana Apostolovic, Maarten Danial, and Harm-Anton Klok, Coiled coils: attractive protein folding motifs for the fabrication of self-assembled, responsive and bioactive materials, Chemical Society Reviews, 2010, 2010, 39, 3541-3575). 각각의 CCP는 3개의 햅태드로 구성된다. 각각의 CCP의 두번째 및 세번째 햅태드는 유사하고, 반면에 첫번째 CCP는 "f" 위치가 다르다. f 위치가 글라이신(Glycine)으로 치환되었다. 그 이유는 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드의 이음매없는(seamless) 클로닝을 위해 본 발명 벡터 시스템에 CCP 유전자를 삽입하기 위함이다. 두 개의 호모 올리고머는 호모A (서열번호 45) 및 호모 B(서열번호 46) 로 표현되고, "a", "c", "g" 위치의 3개 아미노산 구성이 다르다. 이에 반해 헤테로 올리고머는 헤테로 A (서열번호 47) 및 헤테로 B(서열번호 48) 로 표시되고 "a", "c", "e", "g" 위치의 4개 아미노산 구성이 다르다. CCP[homo/hetero]n 에서 n은 서열번호 45 또는 46 또는 47 또는 48의 반복 횟수의 총수를 나타낸다. CCP-EBP의 이중블럭, CCP-EBP-CCP의 삼중블럭은 EBP와 CCP 사이를 하이픈으로 표시하고 EBP 조성을 표시하였다. 예를 들면, EBPP[G1A3F2]n-CCP[homo/hetero]n 는 이중블럭이고, CCP[homo/hetero]n-EBPP[G1A3F2]n-CCP[homo/hetero]n 는 삼중블럭이다.
실시예 3: 이음매가 없는 (seamless) 유전자 클로닝을 위한 변형된 pET-21a(+) 벡터의 제조
pET-21a(+)는 EBP 및 CCP 유전자들의 RDL (recursive directional ligation)을 위한 BseRI 및 AcuI 제한 사이트(restriction site)를 도입하기 위해 변형되었다. 37 ℃에서 30 분 동안 FastDigest 완충제에서 50 U의 XbaI, 50 U의 BamHI의 이중 소화 (double digestion) 로 벡터를 준비하였고, 37 ℃에서 1 시간 동안 NEB 버퍼에서 10 U의 CIP로 5' 말단을 탈인산화하였다. 제한 벡터를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. XbaI와 BamHI 스티키(sticky) 말단과 BseRI 및 AcuI 제한 사이트를 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드, 즉, 서열번호 49(5'- ctagaaataattttgtttaactttaagaaggaggagtacatatgggctactgataatgatcttcag -3′') 및 서열번호 50(5'- gatcctgaagatcattatcagtagcccatatgtactcctccttcttaaagttaaacaaaattattt -3′')를 디자인하였다. 이 올리고뉴클레오타이드 DNA는 단백질을 분광광도법으로 감지(spectrophotometric detection)하기 위한 Tyr과 개시(Met) 코돈 및 종결 코돈을 포함한다. 2분 동안 95 ℃에서 T4 DNA 리가아제 완충제에서 2 μM 올리고뉴클레오티드 농도의 50μL를 가열함으로써 두 개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 후 그 용액을 3 시간에 걸쳐 실온까지 천천히 냉각하였다. 30분 동안 16 ℃에서 20 pmol의 어닐링된 dsDNA와 0.1 pmol의 선형화된 벡터를 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 T4 DNA 리가아제 완충제에 배양함으로써, 선형화된 pET-21a(+) 벡터 내로 XbaI 및 BamHI 스티키 말단을 가지는 변형된 클로닝 인서트가 삽입되었다. 연결 산물은 화학적 E.Coli Top 10의 수용세포들로 형질전환하였고, 50 μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC(super optimal broth with catabolite repression) 플레이트 상에 도포하였다. 인서트의 크기는 XbaI 및 BamHI로 제한(restriction) 후, 아기로스 젤 전기영동으로 체크하고 서열은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
실시예 4: EBP 및 CCP 단위체(monomer) 유전자 합성 및 이의 올리고머화
4번째 잔기들이 서로 다른 몰비로 가변되는 펜타펩타이드 반복 단위인(Val 또는 Ile)-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly를 갖는 EBP 서열을 DNA 레벨에서 설계하여 생리적 온도 미만으로 Tt를 최적화하였다. 19개의 EBP 라이브러리에 대하여, 다양한 펜타펩타이드 반복 단위들을 갖는 EBP들의 DNA와 아미노산 서열을 표 1과 표 2에 각각 나타나 있다.
[표 1]
EBP 라이브러리의 유전자 서열. Val-Pro-Ala-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 갖는 가소성이 있는 EBP (EBPP); 및 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 갖는 탄성이 있는 EBP (EBPE)은 모두 동일한 게스트 잔기 조성과 비율을 가지도록 복제되었음. Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly 의 펜타펩타이드 반복을 갖는 EBPPI를 디자인하였음.
[표 2]
EBP 라이브러리의 아미노산 서열
온도와 pH를 포함한 고유한 자극 반응성을 갖도록 펜타펩타이드 반복 단위인 (Val 또는 Ile)-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly [여기서 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음] 를 갖는 서로 다른 EBP들을 DNA 레벨에서 설계하였다. Val-Pro-Ala-Xaa-Gly인 펜타펩타이드 반복을 갖는 가소성이 있는 EBPP(EBP with plasticity: EBPP)와, Val-Pro-Gly-Xaa-Gly인 펜타펩타이드 반복을 갖는 탄성이 있는 EBPE(EBP with elasticity: EBPE), 모두를, 동일한 게스트 잔기 조성과 비율을 갖도록 복제하였다. 상기 표 1과 표 2는, 각각 펜타펩타이드 반복 단위를 갖는 서로 다른 EBP들의 유전자 및 아미노산 서열을 나타낸다. 예를 들어, EBPE[G1A3F2]12와 EBPP[G1A3F2]12는 거의 동일한 몰 질량(molar mass)뿐만 아니라, EBP 펜타펩타이드 반복 단위의 4번째 잔기가 동일한 조합을 나타낸다. 그리고 펜타펩타이드 반복 단위의 서로 다른 3번째 아미노산 잔기(Ala 또는 Gly)로 인해 서로 다른 기계적 특성들을 갖는다. 양전하 및 음전하를 가지는 EBPs는 Lys, Asp, Glu, 및 His과 같은 전하를 띤 아미노산을 게스트 잔기로 도입함으로써 제작되었다. 반복 단위 서열의 제1 아미노산(Val 또는 Ile)이 전이온도 이상에서 열 반응성 및 하이드로젤 형성에 영향을 주는지 알아보기 위하여, Val으로 시작하지 않고 Ile로 시작하는 새로운 펜타펩타이드 반복 단위인 Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly 를 가지는 새로운 EBPPI 라이브러리를 제작하였다.
다양한 EBPs를 인코딩(encoding)하는 올리고뉴클레오타이드들의 각각의 쌍의 경우 두 올리고뉴클레오타이드들(각각 2 μM)의 각각 50 μL를 T4 DNA 리가아제 완충제에서, 95 ℃, 2분 동안 가열하고, 그런 다음 상기 반응 용액을 상온에서 3 시간에 걸쳐 천천히 식힘으로써 어닐링하였다. 37 ℃에서 30 분 동안 15 U의 BseRI와 10 U의 FastAP 감열 알칼리 포스파타제로 총 4 μg의 변형된 mpET-21a 복제 벡터를 소화 및 탈인산화하였다. 제한효소처리가 끝난 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40 μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. 30 분 동안 16 ℃에서 90 pmol의 어닐링된 dsDNA와 30 pmol의 선형화된 mpET-21a 복제 벡터를 1 U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 T4 DNA 리가아제 완충제에서 배양함으로써, pET-21a 벡터 내의 특정위치로의 DNA 인서트의 연결 반응을 실시하였다. 연결 반응한 플라스미드를 Top10의 화학적 수용 세포들로 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50 μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 판 상에 도포하였다. 이어서, DNA 시퀀싱에 의해 DNA서열을 확인하였다. 모든 EBP 단위체 유전자를 구축하였다. 단위체 EBP의 유전자의 카피를 함유하는 벡터를, 30 분 동안 37 ℃에서 Cutsmart 완충제에서 10 U의 XbaI, 15 U의 BseRI, 및 10 U의 FastAP 감열 알칼리 포스파타제로 소화 및 탈인산화하였다. 제한된 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40 μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. 인서트 파트를 제조하도록, 30 분 동안 37 ℃에서 총 4 μg의 EBP 모노머 유전자들을 Cutsmart 완충제에서 10 U의 XbaI와 15 U의 AcuI로 소화하였다. 소화 후에, 아가로스 젤을 이용한 전기영동에 의해 반응 산물들을 분리하였고, 젤 추출 키트를 사용하여 인서트를 정제하였다. T4 DNA 리가아제 완충제에서 30분 동안 16 ℃에서 1 U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 30 pmol의 선형화된 벡터와 함께 90 pmol의 정제된 인서트를 배양함으로써 연결 반응을 실시하였다. 산물을 Top10의 화학적 수용 세포들로 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50 μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 플레이트 상에 도말되었다. 형질전환체는 배양 및 유전자 추출 후 제한효소로 처리한 아가로스 젤 전기영동 결과에서 진단 제한 다이제스트에 의해 초기에 선별되었으며, 전술한 바와 같이 DNA 시퀀싱에 의해 추가 확인되었다.
CCP 단위체 유전자 준비는 다음과 같다: 4개의 CCP 유전자를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 각 쌍들을 T4 DNA 리가아제 완충제에서 2 μM의 올리고뉴클레오티드 농도의 50 μL를 2분 동안 95 ℃에서 가열한 후 3시간에 걸쳐 실온까지 천천히 냉각하여 어닐링(annealing)하였다. 이 결과 나온 dsDNA 산물은 비회문구조(nonpalindromic), 2 bp, 3'오버행이다. 벡터 제조를 위해, 37 ℃에서 30 분 동안 FastDigest 버퍼에서15 U의 BseRI 로 총 4 μg의 변형된 pET-21a 벡터를 소화하였다. 제한 벡터를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40 μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. 30 분 동안 16 ℃에서 90 pmol의 어닐링된 dsDNA와 30 pmol의 선형화된 pET-21a 벡터를 1 U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 T4 DNA 리가아제 완충제에서 배양함으로써, 선형화 변형된 pET-21a 벡터로 DNA 인서트를 삽입하였다. 연결 산물을 Top10의 화학적 수용 세포들로 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50 μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 판 상에 도포하였다. 형질전환체는 배양 및 유전자 추출 후 제한효소로 처리한 아가로스 젤 전기영동 결과에 의해 초기에 선별되었으며, DNA 시퀀싱에 의해 DNA 서열을 확인하였다. CCP 단위체 유전자들을 합성하였고, 각 CCP 유전자는 24 햅태드까지 다중화(multimerization)되었다. 인서트를 제조하기 위해, 30 분 동안 37 ℃에서, CCP 단위체 유전자들을 포함하는 총 4 μg의 벡터를 Cutsmart 완충제에서 10 U의 BseRI 와 15 U의 AcuI로 이중 소화하였다. 소화 후에, 아가로스 젤을 이용한 전기영동에 의해 반응 산물들을 분리하였고, 젤 추출 키트를 사용하여 인서트를 정제하였다. T4 DNA 리가아제 완충제에서 30 분 동안 16 ℃에서 1 U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 30 pmol의 선형화된 벡터(BseRI으로 제한됨)와 함께 90 pmol의 정제된 인서트를 배양함으로써 연결 반응을 실시하였다. 산물을 Top10의 화학적 수용 세포들로 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50 μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 플레이트 상에 도금하였다. 형질전환체는 배양 및 유전자 추출 후 제한효소로 처리한 아가로스 젤 전기영동 결과에 의해 초기에 선별되었으며, 전술한 바와 같이 DNA 시퀀싱에 의해 추가 확인되었다.
EBP와 융합시키기 위해, 호모 및 헤테로 올리고머를 이용하여 4가지 형태의 CCPs를 디자인하였다. 모든 CCPs에서, 폴리펩타이드가 코일드-코일 형성을 더 잘 할 수 있도록, "a" 및 "d" 는 소수성 아미노산으로 선택하였고, 이온성 상호작용이 더욱 안정적으로 일어날 수 있게, "e" 및 "g"는 전하성 잔기를 선택하였다. 반응성이 더 크게 일어날 수 있도록 "c"에 전하성 아미노산을 도입하였고, 헬릭스가 잘 형성될 수 있도록 "b" 위치에 Ala을 도입하였다 용매에 노출되는 "f"위치에는 극성 아미노산인 "Gln"을 도입하였는데, 다른 극성 아미노산보다 헬릭스를 더 잘 형성한다(Wayne D. Kohn and Robert S. Hodges, De novo design of a-helical coiled coils and bundles: models for the development of protein-design principles, Trends in Biotechnology, 1998, 16, 379-389).
첫번째 햅태드의 "f" 위치를 변형하여 벡터 시스템의 CCP 유전자 사이에 Gly을 도입하였다. 모든 CCPs 의 핵산 및 아미노산 서열은 표 3 및 4에 각각 나타내었다. CCP 핵산 카세트는 3개의 햅태드로 구성되고, 이는 안정적인 코일드-코일 상호작용을 위한 최소 개수이다.
[표 3]
CCP의 유전자 서열
[표 4]
CCP의 아미노산 서열
먼저, 호모 올리고머가 EBP와 융합하여 자가조립 나노구조체를 형성하였다. 도 2A는 분자 디자인이 EBPP[G1A3F2]n-CCP[homoA/homoB]n 인 이중블럭 폴리펩타이드를 보여주는데, EBP의 전이온도 이하에서 자가조립하여 나노구조체를 형성한다. CCP는 EBPP[G1A3F2]n 의 C-말단에서 EBPP와 융합되고, 저온(전이온도 이하) 에서 코일드-코일을 형성하고, EBP는 전이 온도 이하에서 수용성 상태이다. 저온에서 나노구조체 크기는 CCP 햅태드 개수를 다양하게 조절함으로써 제어할 수 있다. 도 2B는 분자 디자인이 EBPP[G1A3F2]n-CCP[heteroA/heteroB]n 인 이중블럭 폴리펩타이드이다. 전이온도 이상에서 EBPP의 열 응집이 일어나고 CCP의 양친매성 성질 때문에, 이 이중블럭들은 마이셀을 형성할 수 있다. 이 이중블럭 폴리펩타이들을 함께 섞으면 분자 사이의 코일드-코일 상호작용에 의해 하이드로젤을 형성할 수 있다.
자극 반응성을 가지는 자가 조립 하이드로젤 구조체를 디자인하기 위해 ABA 형태의 삼중블럭 폴리펩타이드를 디자인하였다. 이는 조직 재생 용도로 이용할 수 있다. CCP는 물리적 가교결합제 역할을 한다. 열 전이 성질을 가지는 EBP는 자극 반응성을 주기 위해 이용하였다. 도 3A 및 3B는 서로 다른 길이를 가지는 햅태드를 이용한 삼중블럭 폴리펩타이드를 모식적으로 나타낸 것으로, 온도 변화에 반응하여 물리적 가교 결합 네트워크 내로 자가조립이 이루어진다. EBP블럭이 가운데 있고, EBP블럭 양 말단에 CCP 블럭이 융합되어 분자 내 및 분자 사이의 가교결합 네트워크를 형성한다. 가교결합 네트워크의 물리적 강도는 열 응집을 하는 EBP의 열 반응성에 의해 더욱 강화된다. 도 3C는 물리적 가교결합 젤의 분자 사이의 상호작용을 강화시키기 위한, 헤테로 올리고머를 가지는 삼중블럭 폴리펩타이드들을 모식적으로 나타낸 것이다. 각각의 삼중블럭 폴리펩타이드는 양 말단에 동일한 CCP 블럭을 가지는데, 분자 내의 상호작용으로 루프 형성이 발생하지 않도록 한다. 도 3C에 나타낸 두 개의 삼중블럭 폴리펩타이드를 섞으면, EBP의 전이온도 이하 또는 미만에서 분자 사이의 상호 작용(코일드-코일 상호작용)이 일어나고 네트워크는 상대적으로 느슨한 상태이다. 그러나 전이온도 이상으로 온도가 올라가면 EBP의 열 응집과 CCPs 헤테로 올리고머들의 가교결합에 의해 더욱 단단한 하이드로젤이 형성된다.
CCP의 단일, 이중 및 삼중블럭 폴리펩타이드 유전자를 제조하기 위해 유전자 클로닝을 수행하였다. 도 1A는 XbaI 및 BamHI 스티키 말단을 가지고, RDL(recursive directional ligation) 을 위한 BseRI 및 AcuI 서열을 함유하고 있는 어댑터를 도입한 변형 pET21a(+) 이다. 먼저, XbaI 및 BamHI 스티키 말단을 가지는 어댑터가 pET21a(+) 로 삽입되고, XbaI 및 BamHI 로 절단되는 mpET21a(+)를 형성한다. 두 번째 단계에서, CCP 유전자 핵산 카세트가 mpET21a(+)로 삽입된다(도 1B). 도 1C는 EBP-CCP 이중블럭 및 CCP-EBP-CCP 삼중블럭 폴리펩타이드 클로닝 모식도이다. 먼저, CCP 함유 플라스미드에 EBPP 유전자를 삽입하여 EBP-CCP 이중블럭 폴리펩타이드 클론을 만든다. 그 다음 CCP 유전자를 EBP-CCP 이중블럭에 삽입하여 CCP-EBP-CCP 삼중블럭 폴리펩타이드를 얻는다.
이중블럭 및 삼중블럭 펩타이드에서 CCP의 코일드-코일 길이의 영향을 알아보기 위해, 모든 CCP 유전자들은 24 햅태드까지 다중화(multimerization)되었다. 원하는 유전자 길이는 아가로스 젤로 체크하였고, 시퀀싱으로 DNA 서열을 확인하였다. 도 4는 BamHI 및 XbaI로 절단된 모든 CCPs의 길이를 보여준다. 아가로즈 젤 상에서 어댑터를 포함하는 CCPs의 길이는 3-24 햅태드 별로 각각 129bp-570bp로 다양하다.
실시예 4: 융합 폴리펩타이드의 클로닝, 정제 및 특징 분석
첫번째, CCP-EBP의 이중블럭 융합 폴리펩타이드는 EBP 유전자(BseRI 및 AcuI로 절단)를 코일드-코일 서열이 포함된 벡터(BseRI에 의한 제한)에 삽입하여 합성하였다. CCP-EBP-CCP의 삼중블럭 융합 폴리펩타이드는, 상기 합성된 EBP-CCP 이중블럭이 포함된 플라스미드에 코일드-코일 유전자를 삽입하여 합성하였다. 모든 블럭 길이를 XbaI 및 Bam HI 로 절단 후 아가로스 젤 전기영동으로 선별하여 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
융합 폴리펩타이드를 발현시키기 위해서, 각각 이중블럭 및 삼중블럭을 포함하는 mpET-21a(+) 벡터를 E.Coli BL21(DE3)로 형질전환하였다. 250 mL 플라스크에서 50 ?g/mL 암피실린을 포함하는 50 mL의 Circlegrow에 단일 콜로니를 주입하고 37 ℃에서 200 rpm으로 쉐이킹 인큐베이터에서 12 시간 동안 배양하였다. 이어서 2 L 플라스크에서 50 μg/mL 암피실린을 포함하는 500 mL의 Circlegrow에 주입하고 37에서 200 rpm으로 쉐이킹 인큐베이터에서 8 시간동안 2차 배양하였다. 24개의 2 L 플라스크에서 50 μg/mL 암피실린을 포함하는 500 mL의 Circlegrow에 2차 배양된 상기 플라스크에서 각각 20 ml씩을 주입하고 37 ℃에서 200 rpm으로 쉐이킹 인큐베이터에서 배양하였고, 흡광도 값이 1.0에 도달했을 때 1 mM 의 IPTG를 주입하였다. 12 시간 배양 후 배양물을 수확하고 ITC로 융합 폴리펩타이드를 ITC (inverse transition cycling)방법 으로 정제하였다. 세포 펠릿은 PBS에서 재현탁하였고 세포 용해물은 얼음 수조에서 초음파로 파쇄하여 얻었다(VC-505, Sonic and materials Inc, Danbury, CT). 세포 잔해물은 4 ℃에서 20 분 동안 16000 rpm으로 원심분리하여 분리하고, 수용성 용해물은 새로운 튜브에 옮기고 PEI 용액을 최종 농도 0.5 %(w/v) 로 첨가하여 잘 섞었다. 4 ℃에서 15 분 동안 16000 rpm으로 원심분리하여 핵산 오염물을 제거하였다. PEI 처리 샘플에 NaCl 염을 최종 농고 3-4 M로 첨가하여 융합 단백질의 상전이를 촉발하였다. 응집된 융합 단백질을 40 ℃에서 20 분 동안 16000 rpm으로 원심분리하여 분리하였다. 응집된 융합 단백질은 차가운 PBS 용액에서 재현탁하였고, 상기 샘플을 4 ℃에서 15 분 동안 16000 rpm으로 원심분리하여 남아 있는 불용성 물질을 제거하였다. 융합 단백질의 순도가 >95%에 도달할 때까지 이 응집 및 재현탁 과정을 4-5번 반복하였다. 이중블럭 및 삼중블럭 폴리펩타이드의 순도 및 분자량은 구리 염색 SDS-PAGE로 분석하였다. 융합 폴리펩타이드의 상전이 거동은 UV/Vis 분광 광도계 및 DLS(dynamic light scattering)로 측정하였다. PBS 의 이중블럭 및 삼중블럭 각각의 25 μM 용액의 350 nm 광학밀도 (OD350) 는 10 ℃에서 80 ℃까지 1 ℃/분의 가열 속도를 가진 온도의 함수로서 측정되었다. 전이 온도(Tt)는, 온도에 대한 함수인 혼탁도(turbidity)의 제1 미분값(d(OD350)/dT)이 최대이었던 온도로서 정의된다. 분산각 90° 및 특정 온도에서 25 μM 농도의 이중블럭 및 삼중블럭의 수력학적 반경(hydrodynamic radius(Rh))을 측정하기 위해 DLS를 수행하였다. 각각의 온도에서, 광분산 전에 상기 샘플들을 10 분 동안 평형화하였다.
EBPPs의 열 반응과 코일드-코일 상호작용의 영향을 알아보기 위해, de novo 디자인된 CCPs, 3, 6, 12 햅태드를 가지는 CCP[homo/hetero]는 EBPP[G1A3F2]n 및 EBPPI[G1A3F2]n 와 결합되었다. 표 5 및 6은 서로 다른 길이의EBPP-CCP[homo] 및 EBPP-CCP[hetero] 의 이중블럭과 예상 분자량을 나타낸다.
[표 5]
CCP-EBP의 이중블럭 폴리펩타이드. 호모 올리고머 CCP와 EBPP[G1A3F2]6 &12 가 결합하여 마이셀을 형성함
[표 6]
CCP-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드. CCP 헤테로머가 EBPP[G1A3F2]6, 12 와 결합하여 마이셀을 형성함
표 7 및 8은 서로 다른 길이의 CCP[homo]-EBPP-CCP[homo] 및 CCP[hetero]-EBPP-CCP[hetero]의 삼중블럭과 예상 분자량을 나타낸다.
[표 7]
CCP[homo]-EBPP-CCP[homo]의 삼중블럭 폴리펩타이드. EBPP의 양 말단에 CCP[homo]가 융합되어 물리적으로 가교결합된 하이드로젤을 형성함.
[표 8]
CCP[hetero]-EBPP-CCP[hetero]의 삼중블럭 폴리펩타이드. EBPP의 양 말단에 CCP[hetero]가 융합되어 물리적으로 가교결합된 하이드로젤을 형성함.
도 5A 및 5B는 EBPP[G1A3F2]n 및 CCP[homoA]n 을 가지는 이중블럭 및 삼중블럭 각각의 아가로스 젤을 보여준다. 이중블럭에서 오른쪽에 표시된 유전자 크기는 732, 858, 1272, 및 1398 bp이고, XbaI 및 BamHI로 절단되었고 DNA 서열을 확인하였다. 이중블럭과 같이 삼중블럭도 RDL로 클로닝되었고 XbaI 및 BamHI로 절단된 유전자 크기는 858, 1110, 1398 및 1650 bp이다. 폴리펩타이드 합성 및 정제를 위해서, 4 개의 이중블럭과 4 개의 삼중블럭을 BL21(DE3)로 형질전환하여 대장균에서 발현시키고 ITC로 정제하였다. 이는 EBP의 열적 전이 거동을 이용하여 EBPs를 정제하기 위한 비크로마토그래피 방법이다. 4 개의 이중블럭과 4 개의 삼중블럭은 다음과 같다:
이중블럭: EBPP[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2, EBPP[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4, EBPP[G1A3F2]12 -CCP[homoA]2, EBPP[G1A3F2]12 -CCP[homoA]4,
삼중블럭: CCP[homoA]2-EBPP[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2, CCP[homoA]4-EBPP[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4, CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]12 -CCP[homoA]2, CCP[homoA]4-EBPP[G1A3F2]12 -CCP[homoA]4
도 6A는 EBPP[G1A3F2]n -CCP[homoA]n 의 이중블럭 폴리펩타이드의 구리 염색 SDS-PAGE 결과로, EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2 및 EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]2 의 분자량은 이들의 예상 분자량과 유사하다. 반면에 더 긴 CCP를 가지는 이중블럭인 EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4 및 EBPP[G1A3F2]12-CCP[homoA]4, 는 SDS-PAGE에서 움직이지 않았다. 이는 SDS 처리 이후에도 강한 코일드-코일 상호 작용이 남아 있고 올리고머화된 CCP 블럭이 움직이지 않고 젤의 맨 위에 머물러 있기 때문으로 보인다. 도 6B에 나타난 것과 같이, 삼중블럭 폴리펩타이드의 경우도 유사한 패턴을 보인다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드의 열 전이는, 1 ℃/분의 가열 속도에서 온도에 대한 함수로서 혼탁도 프로파일링로 측정하였다. 전이 온도(Tt)는, 온도에 대한 함수인 혼탁도(turbidity)의 제1 미분값이 최대이었던 온도로서 정의된다. 도 7A 및 7B는 PBS (10 mM, pH 7.4) 25 uM 에서, EBPP 단일 블럭과, EBPP[G1A3F2]6 및 EBPP[G1A3F2]12을 가지는 이중블럭 폴리펩타이드의 열 프로필을 나타낸다. 단일 블럭인 EBPP[G1A3F2]6, EBPP[G1A3F2]12 는 Tt 이하에서 완전히 용해되어 있고, LCST 이상에서는 열 응집 때문에 급격한 전이가 이루어진다. 반면에 EBPP-CCP 이중블럭은 저온에서(전이온도 이하) 코일드-코일 상호작용에 의해 나노구조체를 형성하고, EBPP의 LCST 이상에서는 전체 응집이 일어난다. EBPP[G1A3F2]6 를 가지는 이중블럭이 나노구조체 형성을 더욱 명확하게 보여주고 있는데, 이는 EBP가 저온(전이온도 이하)에서 높은 수용성을 나타내기 때문에, EBP의 체인 길이가 중요할 수 있음을 보여준다. CCP 길이가 3에서 12로 늘어날수록 LCST가 감소하는데, 이는 CCP 길이가 늘어날수록 소수성 상호작용이 증가하여 코일드-코일 햅태드가 증가하기 때문이다. 도 7C는 EBPP 단일 블럭과 EBPP[G1A3F2]6가지는 삼중블럭의 열 프로필이다. 도 7D는 저온에서 이중블럭의 Rh 를 보여준다. EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]1, EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]2및 EBPP[G1A3F2]6-CCP[homoA]4의 크기는 각각 135, 161 및 201 nm이다. 나노구조체 크기는 CCP 길이와 관련이 있다. CCP 블럭의 길이가 작으면 나노구조체의 크기가 작고, 햅태드 수가 증가하여 CCP 블럭의 길이가 길어지면 나노구조체의 사이즈가 커진다.
펜타펩타이드의 첫번째 아미노산인 Val을 Ile로 치환하여 새롭게 디자인한 EBPPI를 가지는 ABA 형태의 삼중블럭으로 하이드로젤 네트워크를 연구하였다. 도 8A 및 8B는 아가로스 젤과 ITC로 정제한 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의SDS-PAGE 결과를 보여준다. SDS-PAGE에서 CCP[homoA]2 를 가지는 삼중블럭은 예상 분자량만큼 이동하였다. 반면에 CCP[homoA] 4 는 예상 크기보다 더 높이 이동하였다. 이러한 경향은 CCP[homoA]4를 가지는 이중블럭에서도 유사하게 관찰되었다. 삼중블럭의 열 거동은 1 ℃/분의 가열 속도에서 350 nm의 흡광도를 측정하여 분석하였다. 도 9는 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4의 코일드-코일 상호작용에 대한 시료의 농도 및 요소(urea)의 영향을 보여준다. 예상한 바와 같이, CCP 블럭의 길이가 짧을 때가 블럭의 길이가 길 때보다 높은 전이를 나타내는데, 이는 코일드-코일 형성이 덜 이루어지기 때문이다. 삼중블럭 모두에서 농도가 증가할수록 LCST가 감소하였다. 삼중블럭 모두에서 요소 농도가 증가하면 전이온도가 증가하였고, 요소 농도가 8 M일때는 10-80 °C의 전체 온도 범위에서 어떠한 전이도 일어나지 않았다. 저온에서 요소는 코일드-코일 상호작용을 깨고, 고온에서는 EBP 응집을 감소시킨다. 고온에서, EBPP 및 EBPPI의 열 전이 때문에, 모든 삼중블럭 펩타이드의 전체 응집이 형성된다. 도 10은 PBS, 8 M 요소 포함 PBS, 6 M GndCl 포함 PBS의 25 uM 농도에서 삼중블럭 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4의 크기를 보여준다. PBS에서, 두 블럭은 수용성 피크를 가지는 나노구조체 영역의 메인 피크를 보여준다. 반면에 8 M 요소 포함 PBS, 6 M GndCl 포함 PBS는 나노구조체 피크가 수용성 또는 더 작은 크기의 영역으로 이동하였으나, 여전히 더 높은 사이즈 피크를 가진다. 이 크기 측정 결과는 요소 및 GndCl의 농도가 높더라도 이 폴리펩타이드들은 코일드-코일 상호작용을 가짐을 보여준다. 이들 두 개의 삼중블럭은 중간 블럭인 EBP의 LCST 이상에서 물리적 가교결합을 형성할 수 있으므로 하이드로젤로 이용할 수 있다.
실시예 5: 삼중블럭 폴리펩타이드의 레올로지 측정
10 mM PBS(pH 7.4)로 다양한 농도의 CCP-EBPP-CCP 삼중블럭 폴리펩타이드 용액을 제조하였고, 동적-전단 레올로지 테스트(dynamic-shear rheological test)를 연구하여, 탄성율(G′), 손실 탄성율(G″), 복소 전단 탄성계수(G*), 복소 점도(η*), 및 손실 각(δ)을 온도와 주파수의 함수로서 정량화하였다. G″은 재료의 탄성 거동을 특징화하는 한편 G″은 그 재료의 점성 거동을 특징화한다. G*와 η*는, 점탄성 액체 또는 고체의, 주파수 의존 강성도 및 주파수 의존 점성 드래그를 각각 나타낸다. 손실 각(δ)은 탄성에 대한 점성의 상대 측정값이다(뉴턴 점성 유체:δ = 90 °; 탄성 고체:δ = 0 °). 완전 수화 상태 하에서의 금속 용제 트랩을 사용하여 10 ℃ 내지 45 ℃의 온도 범위에 걸쳐 용제 증발을 방지하였다. 10 분 동안 모든 샘플들을 각 실험 전에 원하는 온도에서 평형화하였다. 독립적 스트레인 스위프 테스트(스트레인 스위프 범위: 0.2-20 %, 각 주파수: 0.1 또는 10 rad/s)에 의해 확인된 바와 같이, 서로 다른 온도에서 선형 점탄성 영역에서 동적 주파수 스위프 측정을 수행하였다. 각 주파수 범위는 주파수 스위치 테스트에 대하여 4 ℃(Tt 미만) 및 37 ℃(Tt 초과)에서 0.1 내지 10 rad/s이었다. 순방향 가열과 역방향 냉각 측정을 위해 도당 1 분의 지속 기간으로 1 ℃ 내지 40 ℃의 온도 범위에 걸쳐 1 rad/s와 2 % 스트레인으로 온도 스위프 테스트를 실시하여 이들의 레올로지 성질 및 기계적 성질의 가역성을 조사하였다.
도 11은 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP [homoA]4의 30 wt % 용액의 진동 레오로지(oscillatory rheology) 측정 결과이다. 도 11A 및 11B는 각각 4 oC (전이온도 이하) 및 37 oC (전이온도 이상), PBS에서 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4의 주파수 의존적 레올로지 거동을 나타낸다. 4 oC에서 G′ 및 G″는 주파수 의존적이고 0.1 내지 10 rad/s에 걸져서 G′및 G″ 사이에 교차점이 없다. 37 oC에서 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 의 G′값은 모든 주파수 범위(0.1 내지 10 rad/s )에서 G″보다 높다. 반면에 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4는 0.3 rad/s에서 교차점이 있는데, 이는 Tt 이상에서 물리적 가교결합 젤임을 보여준다. 도 11C 및 11D는 차례대로 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4가 1 oC/ 분 가열 속도에서 온도 의존적 순환을 보여준다. 4 oC에서, CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 는 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 와 비교하여 더 높은 G′및 G″, 더 낮은 Tt를 가지는데, CCP 길이가 길수록 더 강한 코일드-코일 상호작용을 하기 때문이다. CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4는 각각 14 oC 및 7 oC에서 열 전이가 일어나고, CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4는 각각 30 oC 및 23 oC 에서 교차점이 있다. 두 개의 삼중블럭 폴리펩타이드에서 EBPPI의 전이온도 이상에서 보이는 명확한 교차점은, 전이온도 이상에서 물리적 가교결합된 하이드로젤을 확인해주는 것이다. 도 11E 및 11F는 1 oC/분의 냉각 속도에서 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 각각의 온도 스위프(sweep)로, 가열 시와 비슷한 ABA 형태 삼중블럭의 가역성을 보여준다. CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 의 Tt 및 교차점의 후퇴는 더욱 강한 코일드-코일 상호작용을 확실하게 보여준다.
그 다음으로, 4 oC에서 자가조립 ABA 형태 삼중블럭의 코일드-코일 상호작용에 대한 요소의 영향을 관찰하였다. 도 12A 및 12B는 4 oC(전이온도 이하)에서 2 M 요소 포함 PBS에서 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4의 주파수 의존적 레올로지 거동을 보여준다. 도 12C 및 12D는 2 M 요소 포함 PBS, 1 oC/분의 가열 속도에서 CCP[homoA]2-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]2 및 CCP[homoA]4-EBPPI[G1A3F2]6 -CCP[homoA]4 각각의 온도 의존적 순환을 보여준다. 저온에서 요소는, 요소가 없는 것과 비교하였을 때, 자가조립체 말단 블럭들의 코일드-코일 상호 작용을 감소시켜서 두 삼중블럭의 G′' 및 G″ 값을 감소시킨다. 반면에 고온에서 요소는 EBPPI 응집에 영향을 주고, 1 oC - 40 oC 범위에 걸쳐서 교차점이 관찰되지 않았다. 이러한 경향은 삼중블럭들의 낮은 농도(25 uM)에서의 열 프로필에서도 관찰되었다.
도 13은 10 mM PBS (pH 7.4)에서 CCP[homoA]6 -EBPPI[G1A3F2]6-CCP[homoA]6의 25 wt% 용액의 가역적 졸-젤 전이를 보여주는 사진 이미지이다. EBPPI 전이온도 이하의 저온에서는 점성 액체를 띠는데, 중간의 EBPPI 블럭이 수용성이고 양 말단 블럭이 코일드-코일 상호작용을 하기 때문이다. 온도가 EBPPI의 LCST 이상으로 증가하면 응집이 일어나는데, 열 자극으로 인해 중간 블록인 EBPPI이 응집하여 물리적 가교결합된 하이드로젤을 형성하기 때문이다. 이 자가조립은 온도가 37 ℃에서 4 ℃로 감소하면 점탄성 고체에서 점성 액체로 가역적으로 변하는데, 젤화 과정의 가역성을 보여주는 것이다.
본 발명은 자극반응성을 가진 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP)와 코일드-코일 형성 펩타이드(coiled-coil forming peptide, CCP)를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 이의 나노구조체 및 이를 바이오메디컬 분야에 적용하기 위한 하이드로젤에 대한 것이다. 본 발명은 자극반응성(예: 열 반응성)을 가진 EBP와 자가조립이 가능한 CCP를 융합한 폴리펩타이드를 제공하며, 이 융합 폴리펩타이드는 자가조립 구조체를 만든다.
CCP-EBP의 이중블럭의 경우, 전이온도(transition temperature, Tt) 이하에서 EBP는 수용성이고 CCP 블럭은 분자내 그리고 분자 사이의 상호작용읕 통해 마이셀(micelle) 코어를 형성한다. 자극반응성 자가조립 하이드로젤의 경우, EBP-CCP 이중블럭 또는 CCP-EBP-CCP의 삼중블럭 폴리펩타이드는 열 응집(thermal aggregation)에 의해 자가조립되고, CCP는 물리적 가교결합을 하여, 자극반응성 자가조립 하이드로젤을 형성한다.
본 발명자들은, 자가조립 네트워크의 물리적 반응을 강화하기 위해, 분자량이 다른 EBP를 이용하여 CCP 체인 길이 효과 및 호모(homo) 대 헤테로 (hetero) 올리고머화를 연구하였다. 본 발명의 EBP-CCP 융합 폴리펩타이드는 다양한 바이오메디컬 용도의 나노구조체 및 물리적 가교결합 수단을 제공한다.
자가조립 CCP와 열 반응성 EBP가 융합하여 자가조립 나노구조체 및 하이드로젤을 형성하고, 바이오메디칼 분야에 이용할 수 있다. EBP-CCP 이중블럭은 EBP의 전이온도 이하에서 코일드-코일 상호작용과 수용성 EBP 부분으로 인해 나노구조체를 형성한다. CCP-EBP-CCP 삼중블럭은 코일드-코일 상호작용과 EBP 응집으로 인해 물리적 가교결합된 하이드로젤을 형성한다. 레올로지 측정 결과는 전이 온도 이상에서 교차점을 명확하게 보여주고, 37 C에서 더 높은 탄성 모듈을 보여준다. CCP의 물리적 가교결합을 강화시키는 여러가지 파라미터에 대해 연구하였다. 예를 들면, CCP 블럭의 소수성 상호 작용 및 이온성 상호작용은 CCP 체인 길이가 길어질수록 증가한다. 호모 올리고머의 내부 루프를 제거하기 위해, 헤테로 올리고머를 도입하여 폴리펩타이드 사이에 다리 역할을 하는 분자 사이의 반응을 만들었다. 본 발명의 자극반응성 융합 폴리펩타이드는 조직 재생을 위한 주사용 하이드로젤로도 이용할 수 있다.
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<220>
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non-natural
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Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly
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<211> 30
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<220>
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non-natural
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gtccctggta ttggcgtacc tggaggcggc 90
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Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly
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Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly
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Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly
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Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly
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Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly
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Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly
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Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
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Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly
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Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
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<220>
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Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
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<211> 30
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Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
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Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
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Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
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165 170 175
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180 185 190
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
195 200 205
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Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
245 250 255
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
275 280 285
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
290 295 300
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
305 310 315 320
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
325 330 335
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
340 345 350
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Ala Arg Leu Glu Gly Arg Val
355 360 365
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Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
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Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
165 170 175
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
180 185 190
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
195 200 205
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
210 215 220
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
225 230 235 240
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
245 250 255
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Ile Ala Glu Leu Glu Gly Glu Ile
260 265 270
Ala Ser Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu
275 280 285
Leu Glu Gly Glu Ile Ala Ser Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu
290 295 300
Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gly Glu Ile Ala Ser Leu Glu Gln Glu
305 310 315 320
Ile Ala Glu Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gly Glu Ile Ala
325 330 335
Ser Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gln Glu
340 345
<210> 81
<211> 528
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCP[heteroA]4-EBPP[G1A3F2]12-CCP[heteroA]4
<400> 81
Ile Ala Glu Leu Glu Gly Glu Ile Ala Ser Leu Glu Gln Glu Ile Ala
1 5 10 15
Glu Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gly Glu Ile Ala Ser Leu
20 25 30
Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gly
35 40 45
Glu Ile Ala Ser Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gln Glu Ile
50 55 60
Ala Glu Leu Glu Gly Glu Ile Ala Ser Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu
65 70 75 80
Leu Glu Gln Glu Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
85 90 95
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
100 105 110
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
115 120 125
Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
130 135 140
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
145 150 155 160
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
165 170 175
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
180 185 190
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
195 200 205
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
210 215 220
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
225 230 235 240
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
245 250 255
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
260 265 270
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
275 280 285
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
290 295 300
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
305 310 315 320
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
325 330 335
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
340 345 350
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
355 360 365
Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
370 375 380
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
385 390 395 400
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
405 410 415
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
420 425 430
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Ile Ala Glu Leu
435 440 445
Glu Gly Glu Ile Ala Ser Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gln
450 455 460
Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gly Glu Ile Ala Ser Leu Glu Gln Glu Ile
465 470 475 480
Ala Glu Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gly Glu Ile Ala Ser
485 490 495
Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu
500 505 510
Gly Glu Ile Ala Ser Leu Glu Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Gln Glu
515 520 525
<210> 82
<211> 264
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCP[heteroB]2-EBPP[G1A3F2]6- CCP[heteroB]2
<400> 82
Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala
1 5 10 15
Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu
20 25 30
Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val Pro Ala Ala Gly Val
35 40 45
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
65 70 75 80
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
85 90 95
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
100 105 110
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
115 120 125
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
130 135 140
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
145 150 155 160
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
165 170 175
Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
180 185 190
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
195 200 205
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Ala
210 215 220
Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu
225 230 235 240
Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln
245 250 255
Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys
260
<210> 83
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCP[heteroB]2-EBPP [G1A3F2]12-CCP[heteroB]2
<400> 83
Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala
1 5 10 15
Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu
20 25 30
Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val Pro Ala Ala Gly Val
35 40 45
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
65 70 75 80
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
85 90 95
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
100 105 110
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
115 120 125
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
130 135 140
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
145 150 155 160
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
165 170 175
Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
180 185 190
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
195 200 205
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
210 215 220
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
225 230 235 240
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
245 250 255
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
260 265 270
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
275 280 285
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
290 295 300
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
305 310 315 320
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
325 330 335
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
340 345 350
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
355 360 365
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
370 375 380
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
385 390 395 400
Phe Gly Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys
405 410 415
Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala
420 425 430
Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys
435 440
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<211> 348
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCP[heteroB]4-EBPP[G1A3F2]6-CCP[heteroB]4
<400> 84
Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala
1 5 10 15
Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu
20 25 30
Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly
35 40 45
Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val
50 55 60
Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys
65 70 75 80
Leu Lys Gln Lys Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
85 90 95
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
100 105 110
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
115 120 125
Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
130 135 140
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
145 150 155 160
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
165 170 175
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
180 185 190
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
195 200 205
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
210 215 220
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
225 230 235 240
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
245 250 255
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val
260 265 270
Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys
275 280 285
Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys
290 295 300
Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys
305 310 315 320
Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala
325 330 335
Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys
340 345
<210> 85
<211> 528
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCP[heteroB]4-EBPP [G1A3F2]12-CCP[heteroB]4
<400> 85
Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala
1 5 10 15
Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu
20 25 30
Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly
35 40 45
Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val
50 55 60
Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys
65 70 75 80
Leu Lys Gln Lys Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
85 90 95
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
100 105 110
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
115 120 125
Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
130 135 140
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
145 150 155 160
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
165 170 175
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
180 185 190
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
195 200 205
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly
210 215 220
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
225 230 235 240
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro
245 250 255
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
260 265 270
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala
275 280 285
Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
290 295 300
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
305 310 315 320
Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
325 330 335
Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
340 345 350
Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala
355 360 365
Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
370 375 380
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
385 390 395 400
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro
405 410 415
Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala
420 425 430
Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Ala Lys Leu
435 440 445
Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln
450 455 460
Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val
465 470 475 480
Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser
485 490 495
Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys
500 505 510
Gly Lys Val Ala Ser Leu Lys Gln Lys Val Ala Lys Leu Lys Gln Lys
515 520 525
Claims (20)
- 코일드-코일 형성 펩타이드(CCP) 블럭; 및
상기 CCP 블럭과 연결되는 자극 반응성을 가지는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(EBP) 블럭;
으로 구성되는, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 자극은 열인 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 CCP 블럭은 서열번호 45 내지 48에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 구성된 아미노산을 포함하는 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 EBP 블럭은,
하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드:
[식 1]
[서열번호 1]n; 또는
[식 2]
[서열번호 2]n,
상기 식 1 또는 식 2에서,
상기 서열번호 1은 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]로 구성되고;
상기 서열번호 2는 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]로 구성되고;
상기 n은 1 이상의 정수이고, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 반복 횟수이고; 그리고
상기 X 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 펜타펩타이드 VPGXG 또는 VPAXG 가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택됨.
- 제4항에 있어서,
상기 EBP 블럭은,
상기 펜타펩타이드 VPGXG 또는 VPAXG에서, 상기 V(발린)가 I(이소루신)으로 치환된 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는,
서열번호 51 내지 67 에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 구성된 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는,
상기 자극 반응성 EBP의 전이온도 미만에서 CCP 블럭이 코어 구조를 형성하여 마이셀 구조의 자가조립 나노구조체를 이루는 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는,
상기 자극 반응성 EBP의 전이온도 이상에서 열 자극에 의해 EBP의 상전이 거동을 통한 응집으로 EBP 블럭이 코어 구조를 형성하고 양친매성의 CCP 블럭은 쉘 구조를 형성함으로써, 코어-쉘 형태 마이셀 구조의 자가조립 나노구조체를 형성하는 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 자극 반응성 융합 폴리펩타이드에 열 자극을 가하여 코어-쉘 형태 마이셀 구조의 자가조립 나노구조체를 제조하고; 그리고
상기 제조된 자가조립 나노구조체들이 응집하는;
단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는 하이드로젤로,
상기 자가조립 나노구조체 내의 CCP가 물리적 가교제로 작용하는 가역적 하이드로젤.
- 코일드-코일 형성 펩타이드(CCP) 블럭;
상기 CCP 블럭에 연결되는 자극 반응성을 가지는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(EBP) 블럭; 및
상기 EBP 블럭에 연결되는 코일드-코일 형성 펩타이드(CCP) 블럭으로 구성되는, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서,
상기 자극은 열인 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서,
상기 CCP 블럭은 서열번호 45 내지 48 에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 구성된 아미노산을 포함하는 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서,
상기 EBP 블럭은,
하기 식 1 또는 식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드:
[식 1]
[서열번호 1]n; 또는
[식 2]
[서열번호 2]n,
상기 식 1 또는 식 2에서,
상기 서열번호 1은 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]로 구성되고;
상기 서열번호 2는 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]로 구성되고;
상기 n은 1 이상의 정수이고, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 반복 횟수이고; 그리고
상기 X 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 펜타펩타이드 VPGXG 또는 VPAXG 가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택됨.
- 제13항에 있어서,
상기 EBP는
상기 펜타펩타이드 VPGXG 또는 VPAXG에서, 상기 V(발린)가 I(이소루신)으로 치환된 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서,
상기 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는 서열번호 68 내지 85 에 기재된 아미노산 서열 중 하나로 구성된 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서,
상기 자극 반응성 융합 폴리펩타이드는,
상기 자극 반응성 EBP의 전이온도 미만에서는 점탄성 액체 상태이고; 상기 자극 반응성 EBP의 전이온도 이상에서는 물리적으로 가교결합된 하이드로젤을 형성하는 것인, 자극 반응성 융합 폴리펩타이드.
- 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 자극 반응성 융합 폴리펩타이드에 열 자극을 가하고;
상기 열 자극에 의해 상기 자극 반응성 융합 폴리펩타이드 내의 EBP 블럭은 열 응집을 하고 CCP 블럭은 물리적 가교결합제로 작용하여 하이드로젤을 형성하는;
단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는 가역적 하이드로젤.
- 제9항 또는 제 17항에 따른 하이드로젤을 포함하는 약물 전달 조성물.
- 제9항 또는 제17항에 따른 하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체.
- 제9항 또는 제 17항에 따른 하이드로젤을 포함하는 조직 또는 기관 재생용 키트.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210089102A (ko) * | 2020-01-07 | 2021-07-15 | 에이치케이이노엔 주식회사 | 알부민 및 코일드코일 형성 도메인이 연결된 융합단백질, 및 이를 이용한 이중 표적 결합체 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102039460B1 (ko) | 2019-11-04 |
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