KR20170114251A - 지능형 약물 전달을 위한 다중 자극 반응성을 지닌 칼모듈린-엘라스틴 이중 블럭 폴리펩타이드의 동적 나노 전달체 및 제조방법 - Google Patents
지능형 약물 전달을 위한 다중 자극 반응성을 지닌 칼모듈린-엘라스틴 이중 블럭 폴리펩타이드의 동적 나노 전달체 및 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 온도-유발성 자가 조립 미셀은 EBPs의 열적 반응성에 기인한 물리적 가교를 통해 형성되었고, 이러한 미셀 구조는 칼슘 및 리간드의 영향을 받았다. 또한, CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 자가 조립 미셀은 응집된 EBP 블럭의 C-말단에 도입된 시스테인 잔기간 이황화 결합의 형성을 통해 화학적으로 가교되었다. 이러한 다중-자극 반응성을 지닌 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드를 이용한 나노 전달체는 온도, 칼슘 이온, 타겟 리간드 분자, 및 산화-환원 조건에 반응하여 동적 특성을 나타냈다. 이러한 특성을 지닌, 다중-자극 반응성 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드는 동적 약물 전달 시스템의 적용에 유용할 것이다.
Description
본 발명은 지능형 약물 전달을 위한 다중 자극 반응성을 지닌 칼모듈린-엘라스틴 이중 블럭 폴리펩타이드의 동적 나노 전달체 및 제조방법에 관한 것이다.
약제학적 분자의 캡술화 및 방출을 위한 생체적합성 및 낮은 세포 독성을 지닌 물질은 다양한 생체의학 응용 분야에 큰 관심의 대상이었다. 특히, 단백질 기반 물질은 천연 단백질 유래의 고유한 기능, 유전자 수준에서 설계된 단분산 분자량, 낮은 독성을 지닌 우수한 생체 적합성, 및 조절 가능한 생분해능을 가지고 있기 때문에 광범위하게 연구되고 있다. 결과적으로, 이러한 생물학적 방법에 의해 생산되는 단백질 소재는 화학적으로 합성된 폴리머 소재의 대안으로 여겨지고 있다. 특히, 자극-반응성 단백질 기반 소재, 예를 들어, 금속 함유 단백질 (metalloproteins), 엘라스틴 기반 폴리펩타이드, 레질린 유사 폴리펩타이드에 대한 약물 전달체와 이의 조절된 방출능에 대한 연구가 이루어져 왔다. 유전적으로 조작된 다양한 종류의 블럭 구조의 형태 중에서 자극 반응성 융합 단백질은, 소수성 블럭의 자극-유발성 응집에 의해 자가 조립된 나노구조체를 형성할 수 있다.
엘라스틴, 또는 융합 단백질의 소수성 블럭은, 수용액에서의 열반응성 상 전이 거동에 의해 주목받고 있다. 낮은 온도에서 엘라스틴은 가용화 상태이지만, 온도가 특정 전이 온도 (Tt) 이상으로 증가함에 따라, 불용화되고 응집체를 형성한다. 이러한 가역적인 열 반응성을 지닌 엘라스틴은 일반적으로 혈관, 피부 및 폐를 포함하는 다양한 조직에서 발견된다. 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 (EBPs), 트로포엘라스틴의 소수성 도메인으로부터 유래되는 재조합 단백질은 생체의학 응용 분야에 광범위하게 연구되어져 왔다. 상기 EBP는 Val-Pro-(Gly or Ala)-Xaa-Gly의 펜타펩타이드의 서열의 반복 단위로 이루어진 생물학적으로 합성된 폴리펩타이드이며, 여기서 게스트 잔기인 Xaa는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 이들 각각의 기계적 성질으로는 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 (Elastin-based polypeptide with elasticity (EBPE), Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)의 탄력성, 엘라스틴 모방 폴리펩타이드 (Elastin-based polypeptide with plasticity (EBPP), Val-Pro-Ala-Xaa-Gly)의 가소성이 있으며, 이는 세 번째 잔기의 차이로부터 유래된다. 또한, EBP의 전이 온도는 게스트 잔기 및 펜타펩타이드 반복 단위의 수를 변경함으로써 조절 가능하므로, 생체의학적 응용이 가능하다. 따라서, 다양한 종류의 EBP에 대한 보고에 따르면, 세번째 및/또는 네번째 아미노산 잔기의 조합에 따라 다른 물리 화학적 특성을 보여준다.
최근, 다양한 종류의 EBP 및 이들의 융합 단백질은, 약제학적 단백질 및 자가-조립되는 나노구조체를 위한 스마트 생체재료, 및 방출이 조절 가능한 약물 전달체로서 보고되고 있다. 낮은 Tt를 갖는 소수성 EBP와 높은 Tt를 갖는 친수성 EBP로 이루어진 AB 타입 이중 블럭 EBP는, 낮은 Tt 이상에서 소수성 EBP의 소수성 상호작용으로 인해 물리적 가교된 미셀로 자가조립된다. 반면, 화학적으로 가교된 EBP 미셀에 대한 UV 조사, 산화, 클릭 화학, 및 화학적 가교제를 이용한 공유 결합과 같은 다양한 방법이 보고되고 있다. 또한, 소수성 도메인 및 친수성 도메인으로 이루어진 이중 블럭 EBP는 세포 투과 펩타이드 (CPPs) 및 치료학적 도메인과 결합되어 가용성 유니머에 비해 약 10배 이상의 세포 내 흡수를 보여주었다. 모든 진핵세포에서 발현되는 작은 칼슘-결합 단백질인 칼모듈린 (CalM)은 칼슘 (Ca2 +)과의 결합 및 타겟 리간드 분자와의 상호작용에 의해 2가지 구조적 변화를 겪는 다기능 중간 매개체이다. 상기 CalM은 4개의 칼슘 이온이 4개의 EF-hand 모티프에 결합된 경우, 페노티아진 계열의 약물과 같은 타겟 리간드 분자에 결합된 경우보다 수축된 구조를 지니게 되며, 즉 "덤벨 형태"의 구조적 변화를 겪는다. 타겟 리간드 분자가 존재할 때, 칼슘 결합 CalM은 타겟 분자 주위를 감싸게 되지만, 칼슘 이온이 EDTA 및 EGTA와 같은 킬레이트제에 의해 제거된 경우, CalM은 본연의 형태로 구조적 변화를 겪는다. 칼슘, 리간드 및 킬레이트제에 의한 이러한 구조적 변화는 CalM 융합 단백질의 자가-조립된 미셀로부터 조절 가능한 약물 방출 역동학을 보여준다.
CalM-EBP 융합 단백질은 다중 반응성 단백질 기반 생체소재로서, Ca2 + 및 리간드 분자와의 반응성을 보여주었다. 비록 Tt 이상에서 CalM-EBP 융합 단백질의 미셀 구조가 존재하였으나, 리간드 분자가 존재할 때에는 상기 미셀 구조의 안정성에 한계가 있다. 이는 Ca2 + 및 리간드 분자-결합 CalM의 구조적 변화로 인해 Tt 이상에서 강력한 응집을 보였다. 한편, CalM의 EF-hand 모티프만을 갖는 다른 CalM-EBP 융합 단백질은 Ca2 + 존재 하에서 미셀 구조의 안정성을 향상시킴이 보고된 바 있다. 이들은 다른 염들과 비교하여, Ca2 +에 의한 효과의 차이를 보였으나, 임의적으로 설계된 CalM 유전자로 인해 리간드 반응성은 잃었다. 한편, CalM의 동적 미세구체는 혼합 생체재료로서, 폴리(에틸렌 글리콜)과 결합될 수 있음이 보고된 바 있다. 이러한 분자는 Cys 잔기를 갖는 CalM 변이체와 PEG 다이아크릴레이트와의 화학적 결합에 의해 제조되었고, 미세구체의 부피 변화를 통해 Ca2 +및 리간드 반응성을 보여주었다. 그러나 이들은 생체의학 응용분야에 적용함에 있어서, 높은 반응성을 지닌 세포 독성 아크릴레이트 모이어티, 광 개시제 등을 사용하고 있어, 방법론적인 한계가 있다.
본 발명은 상 전이(phase transition) 거동을 가지는 폴리펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 블럭을 포함하는 신규한 이중 블럭 폴리펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 이용하여 제조된 미셀 구조를 갖는 동적 나노 전달체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는 약물 전달 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는 조직 공학용 지지체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는 조직 또는 기관 재생용 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 하기 식 1 내지 식 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 상 전이 거동 (phase transition)을 가지는 폴리펩타이드를 제공한다:
[식 1]
[서열번호 1]n;
[식 2]
[서열번호 2]n;
[식 3]
[서열번호 3]n,
상기 식 1 내지 식 3에서,
상기 서열번호 1은 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]로 구성되고;
상기 서열번호 2는 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]로 구성되고;
상기 서열번호 3은 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]로 구성되고;
n은 1 이상의 정수로서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 반복 횟수이고; 및
상기 X는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 펜타펩타이드 VPGXG, VPAXG, 또는 IPAXG 가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택되는 것임.
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연 아미노산을 의미한다. 예컨대, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신 또는 트립토판 등을 의미한다.
상기 아미노산의 성질은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적으로 친수성 (음전하성 또는 양전하성)을 나타내거나 소수성을 나타내고, 지방족 또는 방향족의 성질도 나타낸다.
본 명세서에서 사용하는 Gly(G), Ala(A) 등의 약어는 아미노산 약어이다. Gly는 글라이신의, Ala는 알라닌의 약어이다. 또한, 글라이신은 G, 알라닌은 A라고도 표현한다. 상기 약어는 이 기술분야에서 널리 사용되는 표현이다.
본 발명에서 "친수성 아미노산"이란, 친수성 성질을 나타내는 아미노산으로, 리신, 아르기닌 등이 있다.
또한 "소수성 아미노산"이란 소수성 성질을 나타내는 아미노산으로, 페닐알라닌, 류신 등이 있다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 체인을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 체인을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
용어 "상 전이(phase transition)"이란, 물이 수증기로 변하거나 얼음이 물로 변하는 것과 같이, 물질의 상태가 변하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드는, 기본적으로, 자극 반응성 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)이다. 상기 "엘라스틴-기반 폴리펩타이드"는 "엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ealstin-like polypeptieds: ELPs)"라고도 불린다. 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다.
본 명세서에서, 상기 X (또는 Xaa)는 "게스트 잔기"라고 칭한다. 상기 Xaa를 다양하게 도입하여 본 발명에 따른 다양한 종류의 EBP를 제조할 수 있다.
상기 EBP는, 전이 온도(transition temperature: Tt)라고도 칭하는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature: LCST)에서 가역 상 전이를 거친다. 이들은, Tt 미만에서 수용성이 크지만, 온도가 Tt를 초과하면 불용성으로 된다.
본 발명에서, EBP의 물리화학적 특성들은 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly[VP(G 또는 A)XG] 등의 조합에 의해 주로 제어된다. 구체적으로, 그 반복 단위의 3번째 아미노산은 상대적 기계적 특성을 결정한다. 예를 들어, 본 발명에서, 3번째 아미노산인 Gly는 탄성(elasticity)을, 또는 Ala는 가소성(plasticity) 결정한다. 상기 탄성 또는 가소성은 전이 이후에 나타나는 성질이다. 한편, 4번째 아미노산인 게스트 잔기 Xaa의 소수성과 펜타펩타이드 반복 단위의 중합화(multimerization)는, 모두, Tt에 영향을 끼친다.
본 발명에 따른 EBP는 펜타펩타이드가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 이 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블럭(EBP 블럭)을 형성할 수 있다. 구체적으로 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭을 형성할 수 있다.
본 발명의 EBP 블럭의 친수성 또는 소수성 성질은 EBP의 전이온도가 깊은 관련성이 있다. 또한 EBP의 전이온도는 또한 아미노산 서열 및 이의 분자량에 달려 있다. EBP 서열과 Tt의 상관 관계에 대해서는 Urry 등이 많은 연구를 수행하였다. Val-Pro-Gly-Val-Gly의 펜타펩타이드에서, 4번째 아미노산인 "게스트 잔기"를 Val 보다 더 친수성을 나타내는 잔기로 치환하는 경우, 원래 서열과 비교하여 Tt가 올라가고, 반대로 Val보다 소수성인 잔기로 게스트 잔기를 치환하면 원래 서열보다 Tt가 낮아진다는 것을 발견하였다. 즉, 친수성 EBP는 Tt가 높고 소수성 EBP는 상대적으로 Tt가 낮다는 것을 발견하였다. 이러한 발견을 통해, EBP 서열의 게스트 잔기로 어떤 아미노산을 사용할지 결정하고, 게스트 잔기의 조성 비율에 변화를 줌으로써 특정 Tt를 가지는 EBP를 제조할 수 있게 되었다.
앞서 설명한 바와 같이, Tt가 높으면 친수성을 나타내고 Tt가 낮으면 소수성을 나타낸다. 본 발명에 따른 EBP 블럭들도 게스트 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 분자량에 변화를 줌으로써 Tt를 올리거나 낮출 수 있다. 그리하여 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭의 제조가 가능하다.
참고로, 체온보다 낮은 Tt를 가지는 EBP는 소수성 블럭으로 사용될 수 있고, 체온 보다 높은 Tt를 가지는 EBP 는 친수성 블럭으로 사용될 수 있다. EBP가 가지는 이러한 성질로 인해, EBP의 친수성과 소수성의 성질은 생체공학적으로 응용할 때에는 상대적으로 정의할 수 있다.
본 발명의 EBP 서열을 예로 들면, Val-Pro-Ala-Xaa -Gly의 가소성 펜타펩타이드가 반복되는 가소성 폴리펩타이드 블럭과 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 탄성 펜타펩타이드 반복되는 탄성 폴리펩타이드 블럭을 비교하였을 때, 3번째 아미노산인 Gly이 Ala보다 높은 친수성을 보인다. 따라서 가소성 폴리펩타이드 블럭 (Elastin-based polypeptide with plasticity: EBPP)이 탄성 폴리펩타이드 블럭 (Elastin-based polypeptide with elasticity: EBPE)보다 Tt가 낮게 나타난다.
본 발명에 따른 EBP들은 앞서 설명한 바와 같이, Tt를 조절하여, 친수성 또는 소수성의 성질을 나타낼 수 있는 것이다. 그리고 하기 설명하는 바와 같이, 소수성 EBP의 Tt 이상에서 형성된 물리적 가교결합 (소수성 상호작용에 기인함)에서, CalM의 칼슘과 리간드와의 결합에 따른 구조 변화가 형성된 미셀 구조를 동적으로 변화시킨다.
상기 폴리펩타이드는 다중 반응성 자극(multi-stimuli responsiveness)을 가질 수 있다.
상기 용어 "다중-자극 반응성"이란, 하나 이상의 자극에 반응성을 가진다는 의미이다. 구체적으로 상기 자극은, 온도, pH, 이온 세기 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서 리간드란, 어떤 목적 물질과 특이적으로 결합하는 물질로서, 예를 들면, 각종 항체, 항원, 효소, 기질, 리셉터, 펩타이드, DNA, RNA, 압타머, 단백질 A, 단백질 G, 아비딘, 비오틴, 킬레이트 화합물, 각종 금속 이온(예, 칼슘 이온 등) 등이다.
본 발명에서 상기 리간드로, 칼슘 이온 및/또는 약물을 이용할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
일 구체예로서. 본 발명은 하기의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다:
상기 식 1에서,
상기 n은 1이고, 즉, [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]이고
상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는
A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 23];
K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 25];
D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 27];
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 29]; 또는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진다 [서열번호 31].
상기 비율은 반복되는 펜타펩타이드의 Xaa의 아미노산 조성비를 의미한다.
상기 폴리펩타이드의 유전자 서열은 서열번호 4(서열번호 23에 대응 하는 서열), 서열번호 6(서열번호 25에 대응하는 서열), 서열번호 8(서열번호 27에 대응하는 서열), 서열번호 10(서열번호 29에 대응하는 서열) 또는 서열번호 12(서열번호 31에 대응하는 서열)일 수 있다.
다른 구체예로서. 본 발명은 하기의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다:
상기 식 2에서,
상기 n은 1이고, 즉, [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]이고,
상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는
A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 24];
K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 26];
D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 28];
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 30];
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 32];
K(Lys), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 33];
D(Asp), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 34];
K(Lys), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 35];
D(Asp), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 36];
H(His), A(Ala), I(Ile)가 3:2:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 37];
H(His), G(Gly)가 5:1의 비율로 이루어지거나[서열번호 38]; 또는
G(Gly), C(Cys), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진다 [서열번호 39].
상기 폴리펩타이드의 유전자 서열은 서열번호 5(서열번호 24에 대응), 서열번호 7(서열번호 26에 대응), 서열번호 9(서열번호 28에 대응), 서열번호 11(서열번호 30에 대응), 서열번호 13(서열번호 32에 대응), 서열번호 14(서열번호 33에 대응), 서열번호 15(서열번호 34에 대응), 서열번호 16(서열번호 35에 대응), 서열번호 17(서열번호 36에 대응), 서열번호 18(서열번호 37에 대응), 서열번호 19(서열번호 38에 대응) 또는 서열번호 20(서열번호 39에 대응)으로 이루어질 수 있다.
다른 구체예로서. 본 발명은 하기의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다:
상기 식 3에서,
상기 n은 1이고, 즉 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]이고,
상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 40]; 또는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진다 [서열번호 41].
상기 폴리펩타이드의 유전자 서열은 서열번호 21 (서열번호 40에 대응) 또는 서열번호 22 (서열번호 41에 대응)로 이루어질 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은
칼모듈린 블럭; 및
상기 칼모듈린 블럭의 일측 말단에 연결되는 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭을 포함하는, 하기 식 4의 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드를 제공한다:
[식 4]
CalM-[소수성 EBP]m,
상기 식 4에서,
상기 CalM는 칼모듈린 블럭이고,
상기 [소수성 EBP]는 전술한 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 소수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 m은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36임.
다른 일 실시예로, 본 발명은
상기 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭은,
상기 식 4의 CalM과 [소수성 EBP] 사이에 추가되어 연결되는 [친수성 EBP]를 추가로 포함하는, 하기 식 5의 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드를 제공한다:
[식 5]
CalM-[친수성 EBP]l-[소수성 EBP]m,
상기 식 5에서,
상기 CalM는 칼모듈린 블럭이고,
상기 [소수성 EBP]는 전술한 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 소수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 C는 상기 [친수성 EBP]는 전술한 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 친수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 l은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36이고,
상기 m은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36임.
상기 [식 3] 및 [식 4]의 이중 블럭 폴리펩타이드는, 각각 차례대로, 도 5A 및 5B에 모식적으로 나타내었다.
상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 구성하고 있는, 상전이 거동을 나타내는 EBP 블럭은, 소수성 EBPs가 친수성 EBPs보다 전이 온도가 낮다. EBP는 전이온도 (Tt 또는 LSCT) 이상에서 불용성을 나타낸다. 본 발명의 이중 블럭 폴리펩타이드는 소수성 EBP의 Tt 이상의 생리적 환경이 되면 소수성 EBP의 구조적 변화에 의한 소수성 상호작용에 의해 물리적으로 가교결합된 미셀 구조를 형성한다. 또한, 본 발명은 친수성 EBPs의 도입으로 인해 미셀의 물리화학적 성질을 조절할 수 있다.
전이온도는 단백질 농도, 이온 세기, pH 등 주위 환경에 위해 달라지므로, 전이온도는 절대적 수치로 정해지는 것이 아니고 상대적 수치로 결정된다. 본 발명은 생체공학적 측면과 연관된 것이기 때문에, EBP의 전이온도가 체온보다 낮은 경우 소수성, 높은 경우 친수성을 나타내게 된다. 즉, 본 발명에서 EBP를 생체공학적으로 이용할 때에, EBP의 친수성과 소수성 성질은 상대적으로 정의할 수 있다. 도 4(F)는 본 발명에 따른 EBP가 소수성을 나타내는 실시예이다. 도 4의 다른 EBPs는 친수성을 나타내는 동시에, 이온 세기와 같은 환경에서 전이온도가 변하는 것을 보여주는 실시예이다.
또한, 칼모듈린 블럭은 리간드 반응성을 가지므로 칼슘 이온 및 약물과 결합하면서 입체구조적 변화가 일어난다. 이에 더하여, 상기 칼모듈린의 블럭 내의 타이로신 잔기가 다이-타이로신으로 가교결합되어 이루어질 수 있다. 그리고 칼모듈린에서 리간드를 제거하면 원래의 칼모듈린 상태로 칼모듈린 단백질 입체형태가 다시 전환될 수 있다. 따라서, 이러한 환경 조건의 변화를 통해 미셀 형태의 나노 구조체를 미세 제어할 수 있다.
상기 칼모듈린 블럭은 칼모듈린 단백질로 구성되는 블럭을 의미한다. 상기 칼모듈린 단백질 서열은 이미 이 기술분야에 알려져 있으므로, 알려진 칼모듈린 서열은 어느 것이나 제한없이 사용가능하다.
또한, 칼모듈린 서열을 일부 변형하여 사용하는 것도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 실시예에서는, 칼모듈린의 Glu 83의 유전자 코드인 GAG를 GAA로 변이시켜 이용하였다 (서열번호 42).
다른 일 실시예로, 본 발명은
상기 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭은,
상기 식 4의 [소수성 EBP]의 말단에 연결되는 시스테인 블럭을 추가로 포함하는, 하기 식 6의 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드를 제공한다:
[식 6]
CalM-[소수성 EBP]m-C,
상기 식 6에서,
상기 CalM는 칼모듈린 블럭이고,
상기 [소수성 EBP]는 전술한 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 소수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 m은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36이고,
상기 C는 시스테인 블럭임.
다른 일 실시예로, 본 발명은
상기 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭은,
상기 식 6의 CalM과 [소수성 EBP] 사이에 추가되어 연결되는 [친수성 EBP]를 추가로 포함하는, 하기 식 7의 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드를 제공한다:
[식 7]
CalM-[친수성 EBP]l-[소수성 EBP]m-C,
상기 식 7에서,
상기 CalM는 칼모듈린 블럭이고,
상기 [소수성 EBP]는 전술한 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 소수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 C는 상기 [친수성 EBP]는 전술한 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 친수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 l은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36이고,
상기 m은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36이고,
상기 C는 시스테인 블럭임.
상기 시스테인 블럭은, 시스테인이 포함된 펩타이드 서열을 의미한다. 구체적으로, 상기 시스테인 블럭의 아미노산 서열은 (Gly-Ala-Cys)이 1회 이상 반복되어 이루어질 수 있다. 더욱 구체적으로, (Gly-Ala-Cys)n [n은 반복 회수를 나타냄]서열로 이루어진 펩타이드 서열을 시스테인 블럭으로 이용할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 (Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys)[서열번호 44]의 시스테인 블럭을 이용하였다.
상기 [식 6] 및 [식 7]의 이중 블럭 폴리펩타이드는, 각각 차례대로, 도 5C 및 5D에 모식적으로 나타내었다. 상기 이중 블럭 폴리펩타이드는 CalM 블럭의 옆에 EBP 블럭들을 배치하고, 화학적 가교결합을 위해 EBP 블럭들의 말단에 Cys 블럭을 도입한 것이다.
앞서 이미 설명한 바와 같이, CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드들이 형성하는 미셀 구조의 변화는 가역적으로 나타낼 수 있어서, Tt 이상의 생리적 환경에서 소수성 EBPs의 물리적 가교결합이 이루어지고 그 결과 물리적으로 가교결합된 미셀 형태의 나노 구조체를 제조할 수 있다. 또한, 칼모듈린 블럭은 리간드 반응성을 가지므로 칼슘 이온 및/또는 약물과 결합하면서 입체구조적 변화가 일어난다.
상기 자극은 앞서 설명한 바와 같다. 일례로서, 온도 또는 리간드일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 이중 블럭 폴리펩타이드에서, 상기 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭은 열 반응성을 나타내고 상기 칼모듈린 블럭은 리간드 반응성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는, 상기 펜타펩타이드 반복의 고유한 조합에 의존하여, 고유의 물리화학적 특성들과 Tt를 갖는 다양한 EBP들 및 이들의 블럭 폴리펩타이드들을 이용한 미셀 구조를 갖는 동적 나노 전달체를 제공한다.
상기 미셀 구조는, 상기 이중 블럭 펩타이드를 구성하는 시스테인 블럭 내의 시스테인의 티올기가 가교결합되어 이루어질 수 있다.
상기 미셀 구조는, 상기 이중 블럭 펩타이드를 구성하는 칼모듈린의 블럭 내의 타이로신 잔기가 다이-타이로신(di-tyrosine)으로 가교결합되어 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 칼모듈린 블럭의 타이로신 잔기가 UV 조사를 통해 다이-타이로신(di-tyrosine)으로 화학적으로 가교결합될 수 있다.
CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 온도-유발성 자가 조립 미셀은 EBPs의 열적 반응성에 기인하여 물리적 가교를 통해 형성되었고, 이러한 미셀 구조는 칼슘 및 리간드의 영향을 받았다. 또한, CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 자가 조립 미셀은 응집된 EBP 블럭의 C-말단에 도입된 시스테인 잔기간 이황화 결합의 형성을 통해 화학적으로 가교되었다. 이러한 다중-자극 반응성을 지닌 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 나노전달체는 온도, 칼슘 이온, 타겟 리간드 분자, 및 산화-환원 조건에 반응하여 동적 특성을 나타냈다. 자극 유발 약물 방출 역동학을 지닌 다중-자극 반응성 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드는 동적 약물 전달 시스템에 유용하다.
또한, 본 발명에 따른 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드들은, 온도, 칼슘, 및 약물 분자에 대한 다중-자극 반응성을 나타내어, 다중 자극에 의해 개시되는 미셀 구조를 형성하게 된다. 그리고 이러한 미셀 구조들은 주사형 약물 전달 시스템, 기능적 조직 공학 및 재생 의료에 있어서 유용하다.
물리적으로 가교결합된 다양한 EBP 기반의 나노 전달체는, 약물 전달 저장용 주사형 생체 재료, 조직 공학 스캐폴드, 및 재생 의약에서 필러에 이용하기 위해 개발되었다. 낮은 Tt를 갖는 가소성 EBP 블럭과 높은 Tt를 갖는 탄성 EBP 블럭으로 구성된 이중 블럭 폴리펩타이드들이, 응집된 가소성 EBP 블럭들 간의 소수성 상호작용으로 인해, 낮은 Tt 이상에서 물리적으로 가교결합된 미셀 구조들을 형성한다. 이러한 물리적 가교결합이 이루어진 EBP 이중 블럭들은, 생체내 주사형 시스템에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명자들은 산화-환원, UV 또는 감마선 조사, 및 다기능 링커 및 효소를 통한 공유 결합을 포함한 다양한 전략들을 이용하여, 화학적으로 가교결합된 EBP 하이드로젤들을 연구하였다. 이들은, 물리적으로 가교결합된 것들에 비해 개선된 기계적 성질들을 나타내었기 때문에, 연골 조직 복구 및 혈관 이식에 적용될 수 있다.
단백질의 리간드 결합-개시형 입체구조 변화는, 리간드 제거시 단백질 입체형태가 자연적인 입체형태로 다시 전환될 수 있기 때문에 동적 단백질 기반 약물 전달체의 개발에 이용될 수 있다. 특히, 상대 분자 질량이 17,000인 칼모듈린 (CalM), 다기능 중간 메신저 단백질은, 0.1 내지 1mM 범위의 Kd (해리 상수)를 갖는 4개의 고 친화도 Ca2 + 결합 사이트가 있는 칼슘-결합 단백질이다. 칼슘 이온들이 CalM의 4개의 헬릭스-루프-헬릭스 모티프에 결합되면, 단백질의 큰 입체구조적 변화를 겪게 되어, 긴 중심 헬릭스의 양단부에서 덤벨 형상 구조를 얻게 된다. 게다가, CalM이 Ca2 + 결합 상태에서 CalM-의존 단백질과 회합됨에 따라, CalM의 중심 헬릭스가 휘어지게 된다. 마찬가지로, Ca2 + 결합 상태에 있는 CalM이 페노티아진 유도체 및 클로르프로마진 등의 특정한 리간드 분자가 있는 가운데 입체구조적 변화를 나타낸다. 마지막으로, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 에틸렌 글리콜-비스(b-아미노에틸 에테르)-N, N, N′, N′-테트라아세트산(EGTA)을 포함하는 금속 킬레이터는 CalM에 결합된 Ca2 + 및 리간드를 함께 제거할 수 있으며, 이는 결국 CalM이 원래 상태로 될 수 있게 한다.
본 발명을 통해 알 수 있듯이, 미셀 구조의 동적 변화는, CalM에 결합된 Ca2+ 및 리간드; 또는 금속 킬레이터에 의한 Ca2 + 및 리간드 제거시 CalM의 급격한 입체구조적 변화 때문에 발생하였다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는 약물 전달 조성물을 제공한다.
상기 폴리펩타이드는 리간드에 반응하므로, 약물을 주입하여 체내에 안정적으로 전달할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 조직공학용 지지체 (scaffold)는 생체 조직의 대용품을 만들어 이식함으로써 신체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 조직 공학 (tissue engineering) 분야에서 사용될 수 있는 모든 지지체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는 조직 또는 기관 재생용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 조직 또는 기관재생용 키트는 상기 조직공항용 지지체에 더하여, 상기 지지체의 형상 유지를 위한 보강층이 추가될 수 있다. 상기 보강층은 PCL, PLA, PLGA, PGA 등의 생분해성 고분자 물질에서 선택될 수 있다.
본 발명은 칼모듈린-상 전이 거동 폴리펩타이드로 이루어지는 다중-자극 폴리펩타이드 및 이를 이용하여 제조된 동적 나노 전달체를 제공한다. 본 발명에 따른 동적 나노 전달체는 약물 전달체, 조직공학용 지지체 그리고 조직 또는 기관 재생용 키트로 이용될 수 있다.
도 1은, 서로 다른 DNA 크기를 갖는 EBP 유전자 라이브러리를 인코딩하는 플라스미드 및 이들의 블럭 폴리펩타이드의 구축의 개략도이다. 개질된 벡터는, XbaI(RE1), AcuI(RE2), 및 BseRI(RE3)를 포함하는 서로 다른 세 개의 제한 효소(RE)의 인식 사이트들을 포함하도록 설계되었다. 예를 들어, EBPP[G1A3F2]12 에 대한 유전자는 EBPP[G1A3F2]6을 위한 플라스미드계 유전자 벡터(vector)와 인서트(insert) 간의 연결 반응에 의해 구축되었다: EBPP[G1A3F2]6에 대한 플라스미드계 유전자(plasmid-borne gene)의 인서트는 XbaI와 AcuI에 의한 이중 소화 (digestion)에 의해 제조되었다. 한편, EBPP[G1A3F2]6에 대한 플라스미드계 유전자 벡터는 XbaI와 BseRI에 의한 이중 소화에 의해 제조되었다.
도 2는, 본 발명에 따른 EBP 유전자 라이브러리의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. (A) EBPE[A1G4I1], (B) EBPP[A1G4I1], (C) EBPE[K1G4I1], (D) EBPP[K1G4I1], (E) EBPE[D1G4I1], (F) EBPP[D1G4I1], (G) EBPE[E1G4I1], (H) EBPP[E1G4I1], (I) EBPP[G1A3F2], (J) EBPP[K1A3F2], (K) EBPP[D1A3F2], 및 (L) EBPPI[G1A3F2]. EBP 반복 단위의 개수를 각 DNA 대역 아래에 표시하였다. 모든 아가로스 겔 상의 양측 레인은, 서로 다른 DNA 크기 마커 (아래에서 위로, (G, H) 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 및 3.0 kbp 이고; (A-F, I-L) 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 kbp임.)를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 EBP의 구리 염색된 SDS-PAGE 겔 (4-20% 구배)이다. (A) EBPE[A1G4I1], (B) EBPP[A1G4I1], (C) EBPE[K1G4I1], (D) EBPP[K1G4I1]. SDS-PAGE 겔 상의 양측 레인은 표준 단백질 크기 마커 (밑에서 위로 7, 15, 24, 35, 40, 50, 65, 90, 110, 150kDa)를 나타낸다.
도 4는, 본 발명에 따른 EBP의 열적 프로파일이다. (a) EBPE[A1G4I1]n, (b) EBPP[A1G4I1]n, (c) EBPE[K1G4I1]n, (d) EBPP[K1G4I1]n, (e) EBPP[D1G4I1]n, 및 (f) EBPP[G1A3F2]n. 열적 프로파일의 350nm에서의 광학 흡광도는, 1℃/분의 가열 속도로 PBS 완충체 혹은 1, 2 내지 3 M NaCl이 보충된 PBS 완충제 내에서 25μM EBP 용액을 가열함으로써 얻었다.
도 5는, 유전적으로 조작된 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드들로 구성된 동적 단백질 미셀들의 개략도이다. 낮은 Tt를 갖는 소수성 EBP와 높은 Tt를 갖는 친수성 EBP와 같이 두 개의 다른 종류의 EBP 블럭이 도입되었다. (A) CalM-소수성 EBP, (B) CalM-소수성 EBP-친수성 EBP, (C) CalM-친수성 EBP-Cys 블럭, 및 (D) CalM-친수성 EBP-소수성 EBP-Cys 블럭이다.
도 6은, 일련의 Cys-EBPP[G1A3F2]6n-CalM-EBPP[G1A3F2]6n-Cys (n: 정수)로 구축된 (왼쪽) DNA 아가로스 겔 전기영동(0.8 %) 및 (오른쪽) 구리 염색된 SDS-PAGE(4-20% 구배) 겔의 사진 이미지이다. 양측 겔의 각 레인은, (1) CalM-EBPP[G1A3F2]6-Cys 블럭, (2) CalM- EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, (3) CalM-EBPP[G1A3F2]18-Cys 블럭, (4) CalM- EBPP[G1A3F2]24-Cys 블럭, (5) CalM- EBPP[G1A3F2]30-Cys 블럭, 및 (6) CalM-EBPP[G1A3F2]36-Cys 블럭이다.
도 7은, CalM-친수성 EBP-소수성 EBP 융합 단백질의 전기영동 결과이다. (A) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 블럭 (a, 2703 bp), CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭 (b, 2703 bp), 및 CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 블럭 (c, 2667 bp)의 아가로스 겔 (1%) 이미지, (B) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭 (a, 75.5 kDa), CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭 (b, 76.5 kDa), 및 CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 블럭 (c, 75.6 kDa)이 발현된, 정제 융합 단백질의 구리-염색된 SDS-PAGE(12%) 이미지이다.
도 8은, 1℃/분의 가열 속도에서 온도에 대한 함수로서 혼탁도 프로파일링에 의해 특징화된 경우, pH 7.4의 10mM HEPES 완충제(A) 및 10mM CaCl2이 보충된 10mM HEPES 완충에서의, CalM-EBPP[G1A3F2]6n-Cys 블럭의 열적 프로파일이다. (A)와 (B)의 각 숫자는, (1) CalM- EBPP [G1A3F2]6-Cys 블럭, (2) CalM- EBPP [G1A3F2]12-Cys 블럭, (3) CalM- EBPP [G1A3F2]18-Cys 블럭, (4) CalM- EBPP [G1A3F2]24-Cys 블럭, (5) CalM- EBPP [G1A3F2]30-Cys 블럭, 및 (6) CalM- EBPP [G1A3F2]36-Cys 블럭을 나타낸다.
도 9는, 다양한 염 농도의 CaCl2, MgCl2 및 NaCl 에서, CalM-친수성 EBP-소수성 EBP 융합 단백질의 열적 프로파일이다. (A) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, (B) CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, 및 (C) CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12이다.
도 10은, 10mM HEPES 완충제에서, CalM-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭에 대한 유체역학적 반경 (Rh) 및 혼탁도를 온도 함수로 나타낸 것이다.
도 11은, 1mM TCEP를 포함하는 10mM HEPES 완충제에서, 25μM의 (A) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, 및 (B) CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭에 대한 10 mM CaCl2 유무에 따른 유체역학적 반경 (Rh)을 온도에 대한 함수로 나타낸 것이다.
도 12는, 10mM HEPES 완충제에서 25μM의 가교된 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 유체역학적 반경 (점선) 및 혼탁도 (실선)를 온도 함수로 나타낸 것이다. (A - D) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭. (E - H) CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭이다. 실험 조건은 A, E) HEPES 완충제, (B, F) 10 mM CaCl2를 포함하는 HEPES 완충제, (C, G) 10 mM CaCl2, 250 μM TFP를 포함하는 HEPES 완충제, (D, H) 10 mM CaCl2, 250 μM TFP, 10 mM EGTA를 포함하는 HEPES 완충제이다.
도 2는, 본 발명에 따른 EBP 유전자 라이브러리의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. (A) EBPE[A1G4I1], (B) EBPP[A1G4I1], (C) EBPE[K1G4I1], (D) EBPP[K1G4I1], (E) EBPE[D1G4I1], (F) EBPP[D1G4I1], (G) EBPE[E1G4I1], (H) EBPP[E1G4I1], (I) EBPP[G1A3F2], (J) EBPP[K1A3F2], (K) EBPP[D1A3F2], 및 (L) EBPPI[G1A3F2]. EBP 반복 단위의 개수를 각 DNA 대역 아래에 표시하였다. 모든 아가로스 겔 상의 양측 레인은, 서로 다른 DNA 크기 마커 (아래에서 위로, (G, H) 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 및 3.0 kbp 이고; (A-F, I-L) 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 kbp임.)를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 EBP의 구리 염색된 SDS-PAGE 겔 (4-20% 구배)이다. (A) EBPE[A1G4I1], (B) EBPP[A1G4I1], (C) EBPE[K1G4I1], (D) EBPP[K1G4I1]. SDS-PAGE 겔 상의 양측 레인은 표준 단백질 크기 마커 (밑에서 위로 7, 15, 24, 35, 40, 50, 65, 90, 110, 150kDa)를 나타낸다.
도 4는, 본 발명에 따른 EBP의 열적 프로파일이다. (a) EBPE[A1G4I1]n, (b) EBPP[A1G4I1]n, (c) EBPE[K1G4I1]n, (d) EBPP[K1G4I1]n, (e) EBPP[D1G4I1]n, 및 (f) EBPP[G1A3F2]n. 열적 프로파일의 350nm에서의 광학 흡광도는, 1℃/분의 가열 속도로 PBS 완충체 혹은 1, 2 내지 3 M NaCl이 보충된 PBS 완충제 내에서 25μM EBP 용액을 가열함으로써 얻었다.
도 5는, 유전적으로 조작된 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드들로 구성된 동적 단백질 미셀들의 개략도이다. 낮은 Tt를 갖는 소수성 EBP와 높은 Tt를 갖는 친수성 EBP와 같이 두 개의 다른 종류의 EBP 블럭이 도입되었다. (A) CalM-소수성 EBP, (B) CalM-소수성 EBP-친수성 EBP, (C) CalM-친수성 EBP-Cys 블럭, 및 (D) CalM-친수성 EBP-소수성 EBP-Cys 블럭이다.
도 6은, 일련의 Cys-EBPP[G1A3F2]6n-CalM-EBPP[G1A3F2]6n-Cys (n: 정수)로 구축된 (왼쪽) DNA 아가로스 겔 전기영동(0.8 %) 및 (오른쪽) 구리 염색된 SDS-PAGE(4-20% 구배) 겔의 사진 이미지이다. 양측 겔의 각 레인은, (1) CalM-EBPP[G1A3F2]6-Cys 블럭, (2) CalM- EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, (3) CalM-EBPP[G1A3F2]18-Cys 블럭, (4) CalM- EBPP[G1A3F2]24-Cys 블럭, (5) CalM- EBPP[G1A3F2]30-Cys 블럭, 및 (6) CalM-EBPP[G1A3F2]36-Cys 블럭이다.
도 7은, CalM-친수성 EBP-소수성 EBP 융합 단백질의 전기영동 결과이다. (A) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 블럭 (a, 2703 bp), CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭 (b, 2703 bp), 및 CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 블럭 (c, 2667 bp)의 아가로스 겔 (1%) 이미지, (B) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭 (a, 75.5 kDa), CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭 (b, 76.5 kDa), 및 CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12 블럭 (c, 75.6 kDa)이 발현된, 정제 융합 단백질의 구리-염색된 SDS-PAGE(12%) 이미지이다.
도 8은, 1℃/분의 가열 속도에서 온도에 대한 함수로서 혼탁도 프로파일링에 의해 특징화된 경우, pH 7.4의 10mM HEPES 완충제(A) 및 10mM CaCl2이 보충된 10mM HEPES 완충에서의, CalM-EBPP[G1A3F2]6n-Cys 블럭의 열적 프로파일이다. (A)와 (B)의 각 숫자는, (1) CalM- EBPP [G1A3F2]6-Cys 블럭, (2) CalM- EBPP [G1A3F2]12-Cys 블럭, (3) CalM- EBPP [G1A3F2]18-Cys 블럭, (4) CalM- EBPP [G1A3F2]24-Cys 블럭, (5) CalM- EBPP [G1A3F2]30-Cys 블럭, 및 (6) CalM- EBPP [G1A3F2]36-Cys 블럭을 나타낸다.
도 9는, 다양한 염 농도의 CaCl2, MgCl2 및 NaCl 에서, CalM-친수성 EBP-소수성 EBP 융합 단백질의 열적 프로파일이다. (A) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, (B) CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, 및 (C) CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12이다.
도 10은, 10mM HEPES 완충제에서, CalM-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭에 대한 유체역학적 반경 (Rh) 및 혼탁도를 온도 함수로 나타낸 것이다.
도 11은, 1mM TCEP를 포함하는 10mM HEPES 완충제에서, 25μM의 (A) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, 및 (B) CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭에 대한 10 mM CaCl2 유무에 따른 유체역학적 반경 (Rh)을 온도에 대한 함수로 나타낸 것이다.
도 12는, 10mM HEPES 완충제에서 25μM의 가교된 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 유체역학적 반경 (점선) 및 혼탁도 (실선)를 온도 함수로 나타낸 것이다. (A - D) CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭. (E - H) CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭이다. 실험 조건은 A, E) HEPES 완충제, (B, F) 10 mM CaCl2를 포함하는 HEPES 완충제, (C, G) 10 mM CaCl2, 250 μM TFP를 포함하는 HEPES 완충제, (D, H) 10 mM CaCl2, 250 μM TFP, 10 mM EGTA를 포함하는 HEPES 완충제이다.
실시예 1. 실험 재료
Novagen Inc. (Madison, WI, U.S.)로부터 pET-21a 벡터 및 BL21(DE3) E. coli 세포들을 구입하였다. Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.)로부터 Top 10의 수용세포들(competent cells)을 구입하였다. Cosmo Gene Tech (Seoul, South Korea)에서 올리고뉴클레오티드들을 화학적으로 합성하였다. Fermentas (Ontario, Canada)로부터 감열성 알칼리 포스포타제인 FastAP, 및 BamHI와 XbaI를 포함하는 제한 엔도뉴클레아제를 구매하였다. New England Biolabs(Ipswich, MA, U.S.)로부터 BseRI, AcuI, 및 기타 제한 효소를 포함하는 다른 제한 엔도뉴클레아제를 얻었다. Elpis Bio-tech (Taejeon, South Korea)로부터 T4 DNA 리가아제를 얻었다. Geneall Biotechnology (Seoul, South Korea)에서 DNA 미니-제조, 겔 추출, 및 PCR 정제를 위한 모든 키트들을 얻었다. DYNE BIO (Seongnam, South Korea)로부터 Dyne Agarose High를 얻었다. 모든 Top 10 세포들을 TB DRY 배양액 (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, U.S.)에서 성장시키고, 20mM 글루코스가 보충된 SOC (super optimal broth with catabolite repression) 배양액 (Formedium, UK)을 얻었다. 모든 BL21(DE3) 세포들을 MP Biomedicals(Solon, OH, U.S.)로부터 얻은 원형 성장 배양액에서 성장시켰다. 프리캐스트 겔인 Ready Gel (Tris-HCI, 2-20%)을 Bio-Rad (Hercules, CA, U.S.)로부터 얻었다. 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4), 암피실린, 폴리에틸렌이민 (PEI), 염화칼슘, 에틸렌이다민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌 글리콜-비스 (β-아미노에틸 에테르)-N, N, N', N'-테트라아세트산 (EGTA), 페노티아진 (PTZ), 클로르프로마진(CPZ), 및 트리플루오페라진 (TFP)을 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)로부터 구입하였다.
실시예 2. 서로 다른 EBP 블럭들과 이들의 블럭 폴리펩타이드에 대한 표기
펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly[VP(G 또는 A)XG]를 갖는 서로 다른 EBP들은 다음과 같이 명명한다. 상기 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 첫째, 가소성이 있는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly(VPAXG)의 펜타펩타이드 반복은 가소성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with plasticity: EBPP)라고 정의한다. 한편 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)의 펜타펩타이드 반복은 탄성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(the elastin-based polypeptide with elasticity: EBPE)라 칭한다. 또한, Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly(IPAXG)의 펜타펩타이드 반복은 첫번째 위치가 Ile로 대체된 가소성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPPI)라고 정의한다. [XiYjZk]n에서, 괄호 내의 대문자들은 게스트 잔기의 단글자 아미노산 코드, 즉, EBP 펜타펩타이드의 4번째 위치(Xaa 또는 X)에서의 아미노산이고, 이들의 해당하는 아래 첨자는 반복 단위로서 EBP 모노머 유전자의 게스트 잔기의 비율(ratio)을 나타낸다. [XiYjZk]n의 아래 첨자 수 n은 본 발명의 서열번호 1 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG], 서열번호 2[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG], 또는 서열번호 3 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]의 반복 횟수를 나타낸다. 예를 들어, EBPP[G1A3F2]12는 서열번호 2[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 의 단위가 12번 반복되어 이루어진 EBPP 블럭이며, 여기서 4번째 게스트 잔기 위치(Xaa)에서의 Gly, Ala, 및 Phe의 비는 1:3:2이다.
실시예
3. 이음매가 없는 (seamless) 유전자
클로닝을
위한 변형된
pET
-21a 벡터의 제조
37℃에서 20분 동안 FastDigest 완충제에서 50U의 XbaI, 50U의 BamHI, 10U와 함께 pET-21a 벡터를 소화(digestion) 및 탈인산화하였다. 제한된 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. XbaI와 BamHI 호환 가능한 접착 말단을 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드, 즉, (5'-ctagaaataatt tt gtt taactt taagaaggaggagtacatatgggctactgataatgatctt cag-3') 및 (5'-gatcctgaagatcatt atcagtagcccatatgtactcctccttcttaaagttaaacaaaattattt-3')를 설계하였다. 2분 동안 95℃에서 T4 DNA 리가아제 완충제에서 2μM 농도의 올리고뉴클레오티드 50μL를 가열함으로써 두 개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 후 그 용액을 3 시간에 걸쳐 실온까지 천천히 냉각하였다. 30분 동안 16℃에서 20pmol의 어닐링된 dsDNA와 0.1pmol의 선형화된 벡터를, 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 T4 DNA 리가아제 완충제에 배양함으로써, pET-21a 벡터 내의 다수의 복제 사이트로의 DNA 인서트의 연결 반응 (ligation)을 실시하였다. 이음매가 없는 (seamless) 유전자 클로닝과 발현을 위하여, 변형된 pET-21a(mpET-21a) 벡터로 Top 10 수용세포들을 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC (super optimal broth with catabolite repression) 플레이트 상에 도포하였다. 이어서, mpET-21a 벡터의 DNA 서열을 형광 색소 종료자 DNA 시퀀싱 (Applied Biosystems Automatic DNA Sequencer ABI 3730)에 의해 검증하였다.
실시예 4. EBP 유전자 단위체 합성 및 이의 올리고머화
4번째 잔기들이 서로 다른 몰비로 가변되는 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly를 갖는 EBP 서열을 DNA 레벨에서 설계하여 생리적 온도 미만으로 Tt를 최적화하였다. 19개의 EBP 라이브러리에 대하여, 다양한 펜타펩타이드 반복 단위들을 갖는 EBP들의 DNA와 아미노산 서열은 표 1과 표 2에 각각 나타내었다.
[표 1]
EBP
라이브러리의 유전자 서열
[표 2]
EBP
라이브러리의 아미노산 서열
상기 표 1에서 서열번호 4-11은 친수성 EBP 블럭을 위한 유전자 서열로 분류될 수 있고, 서열번호 12-22번은, Phe, His이 들어간 소수성 EBP 블럭을 위한 유전자 서열로 분류될 수 있다. 상기 표 2에서 아미노산 서열번호 23-30는 친수성으로 분류될 수 있고, Phe, His이 들어간 아미노산 서열번호 31-41은 소수성 EBP 블럭으로 분류될 수 있다. 즉, EBP의 LCST가 체온보다 낮은 경우 소수성을 띠고, EBP의 LCST가 체온보다 높은 경우 친수성을 띤다. EBP가 가지는 이러한 성질로 인해, EBP의 친수성과 소수성의 성질은 생체공학적으로 응용할 때에는 상대적으로 정의할 수 있다.
온도와 pH를 포함한 고유한 자극 반응성을 갖도록 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly [여기서 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음]를 갖는 서로 다른 EBP들을 DNA 레벨에서 설계하였다. Val-Pro-Ala-Xaa-Gly인 펜타펩타이드 반복을 갖는 가소성이 있는 EBPP(EBP with plasticity: EBPP)와, Val-Pro-Gly-Xaa-Gly인 펜타펩타이드 반복을 갖는 탄성이 있는 EBPE(EBP with elasticity: EBPE), 모두를, 동일한 게스트 잔기 조성과 비율을 갖도록 복제하였다. 상기 표 1과 표 2는, 각각 펜타펩타이드 반복 단위를 갖는 서로 다른 EBP들의 유전자 및 아미노산 서열을 나타낸다. 예를 들어, EBPE[G1A3F2]12와 EBPP[G1A3F2]12는 거의 동일한 몰 질량(molar mass)뿐만 아니라, EBP 펜타펩타이드 반복 단위의 4번째 잔기가 동일한 조합을 나타낸다. 그리고 펜타펩타이드 반복 단위의 서로 다른 3번째 아미노산 잔기(Ala 또는 Gly)로 인해 서로 다른 기계적 특성들을 갖는다. Lys, Asp, Glu, His 등의 대전된 아미노산을 게스트 잔기로 도입함으로써 양 또는 음으로 대전된 EBP들을 구축하였다.
4번째 잔기들이 서로 다른 몰비로 가변되는 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly를 갖는 EBP 서열을 DNA 레벨에서 설계하여 생리적 온도 미만으로 Tt를 최적화하였다. 2분 동안 95℃에서 T4 DNA 리가아제 완충제에서 2μM농도 의 올리고뉴클레오티드 50μL를 가열함으로써 다양한 EBP들의 인코딩을 위한 올리고뉴클레오티드의 각 쌍에 대한 어닐링(annealing)한 후, 3시간에 걸쳐 실온까지 천천히 냉각하였다. 37℃에서 30분 동안 15U의 BseRI와 10U의 XbaI로 총 4μg의 변형된 mpET-21a 복제 벡터를 소화시켰다. 제한 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. 30분 동안 16℃에서 90pmol의 어닐링된 dsDNA와 30pmol의 선형화된 mpET-21a 복제 벡터를 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 T4 DNA 리가아제 완충제에서 배양함으로써, pET-21a 벡터 내의 다수의 복제 사이트로의 DNA 인서트의 연결 반응을 실시하였다. 연결 반응한 플라스미드를 이용하여 Top 10 화학적 수용 세포들을 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 판 상에 도포하였다. 이어서, DNA 시퀀싱에 의해 DNA 서열을 확인하였다. 모든 EBP 단위체 유전자를 구축한 후에, 다음과 같이, n개의 반복 유전자를 함유하는 대응하는 벡터 내로의 동일한 n개의 반복 인서트를 연결 반응화함으로써 각 EBP 유전자를 합성하였다. EBP 라이브러리를 위한 복제 절차 및 이들의 융합이 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 단위체 EBP의 유전자의 카피를 함유하는 벡터를, 30분 동안 37℃에서 FastDigest 완충제에서 10U의 XbaI과 15U의 BseRI, 및 10U의 FastAP 감열 알칼리 포스파타제로 소화시켰다. 제한된 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. 인서트 파트를 제조하도록, 30분 동안 37℃에서 총 4μg의 EBP 모노머 유전자들을 FastDigest 완충제에서 10U의 XbaI와 15U의 AcuI로 소화하였다. 소화 후에, 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 의해 반응 산물들을 분리하였고, 겔 추출 키트를 사용하여 인서트를 정제하였다. T4 DNA 리가아제 완충제에서 30분 동안 16℃에서 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 30pmol의 선형화된 벡터와 함께 90pmol의 정제된 인서트를 배양함으로써 연결 반응을 실시하였다. 산물을 이용하여 Top 10 화학적 수용 세포들을 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 플레이트 상에 도포하였다. 형질전환체는 아가로스 겔에서 진단 제한 다이제스트에 의해 초기에 선별되었으며, 전술한 바와 같이 DNA 시퀀싱에 의해 추가 확인되었다.
앞에서 기술한 바와 같이, 설계된 플라스미드 벡터와 함께 세 개의 서로 다른 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 서로 다른 DNA 크기의 EBP 유전자 라이브러리들을 합성하였다. 도 1은, RDL (recursive directional ligation) 방법을 나타내는데, 이 방법을 이용하여 EBP 모노머 유전자들이 연결되어서 올리고머화된 EBP 유전자들을 형성한다. 예를 들어, EBPP[G1A3F2]12 에 대한 유전자는 EBPP[G1A3F2]6을 위한 플라스미드계 유전자 벡터와 인서트 간의 연결 반응에 의해 구축되었다: EBPP[G1A3F2]6 에 대한 플라스미드계 유전자(plasmid-borne gene)의 인서트는 XbaI와 AcuI에 의한 이중 소화(digestion)에 의해 제조되었다. 한편, EBPP[G1A3F2]6에 대한 플라스미드계 유전자 벡터는 XbaI와 BseRI에 의한 이중 소화와 알칼리 포스파타제에 의한 탈인산화에 의해 제조되었다. 두 개의 서로 다른 이중 제한효소를 이용하는 이 RDL 방법은 여러 장점들을 갖는다. 첫째, 인서트와 벡터 모두의 돌출부의 서로 다른 형상들로 인해, 제한 벡터의 자기 연결 반응이 발생하지 않았으며, 이들은 머리-꼬리 배향으로 효율적으로 연결되었다. 둘째, 이는, 유형 III 제한 엔도뉴클레아제의 메커니즘 때문에 각 블럭 사이의 링커를 인코딩하는 데 추가 DNA 서열을 갖지 않는다. 각 EBP 유전자를 올리고머화하여 6, 12, 18, 24, 30, 및 36 EBP 올리고머 반복을 생성하였다. 두 개의 제한 엔도뉴클레아제인 XbaI과 BamHI를 사용하여, 606, 1146, 1686, 2226, 2766, 및 3306 염기 쌍(bps)을 갖는 올리고머화된 유전자 크기를 확인하였다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 특징화되는 바와 같이, 도 2는 양측 말단 레인 상의 DNA 크기 마커와 함께 EBP 라이브러리들의 제한된 DNA 대역을 나타낸다. 예를 들어, 도 2 (A)의 EBPE[A1G4I1]는, Ala, Gly, Ile를 게스트 잔기로 해서 1:4:1 비로 함유하는 올리고머화된 펜타펩타이드 서열을 인코딩하는 제한 DNA 대역을 명확하게 나타낸다. 제한 DNA 대역들 모두는, 분자 크기 마커와 비교하여, 해당하는 길이로 도시되어 있다.
EBP 유전자들과 이들의 블럭 폴리펩타이드들을 T7 프로모터를 갖는 E. coli 에서 과발현하였고, ITC (inverse transition cycling)의 다수 사이클에 의해 정제하였다. 도 3은 정제된 EBP의 구리 염색된 SDS-PAGE 겔화상을 나타낸다. EBP들은, 이론적으로 산출된 분자량보다 적어도 20% 더 이동하였다. SDS-PAGE 겔 상의 양측 레인들은 표준 단백질 크기 마커 (바닥부터 상부로 7, 15, 24, 35, 40, 50, 65, 90, 110, 150kDa)를 함유한다. 도 3 (A)와 3 (B)의 EBPE[A1G4I1]와 EBPP[A1G4I1]는, 이론적 분자량보다 큰 분자량을 가지는 일련의 대응 단백질들을 나타낸다(EBPE[A1G4I1]는 좌에서 우로 14.0, 27.7, 41.3, 55.0, 68.6kDa). 일반적으로, 도 3 (C)와 3 (D)의 EBPE[K1G4I1]와 EBPP[K1G4I1]를 포함하는 양으로 대전된 EBP 라이브러리들은, EBPE[A1G4I1]와 EBPP[A1G4I1]의 비극성 EBP 라이브러리들보다 큰 분자량으로 이동하였다.
EBP 라이브러리의 특징을 분석하였다. 도 4는, 1℃/분의 가열 속도로 350nm에서의 광학 흡광도(Absorbance350)를 측정함으로써 EBP들의 열적 전이 거동을 확인한 것이다. 전이 온도 (Tt)는, 온도에 대한 함수인 혼탁도(turbidity)의 제1 미분값(d(OD350)/dT)이 최대이었던 온도로서 정의된다. 염 농도와 pH 등의 환경적 조건들과 EBP 펜타펩타이드 반복 단위의 서로 다른 3번째 및 4번째 아미노산에 따라, EBP의 Tt를 PBS에서 미세 제어하였고, PBS에는 1 내지 3M의 NaCl을 보충하였다. 예를 들어, EBP 펜타펩타이드 반복의 3번째 아미노산에서의 Gly를 갖는 EBPE[A1G4I1]12(도 4 (A))는, EBP 펜타펩타이드 반복의 3번째 아미노산에서의 Gly가 Ala보다 높은 친수성을 갖기 때문에, 1M NaCl을 갖는 PBS에서 EBP 펜타펩타이드 반복의 3번째 아미노산에서 Ala를 갖는 EBPP[A1G4I1]12 (도 4 (B))보다. 높은 Tt (약 15℃)를 나타낸다. 일반적으로, 대전된 EBP 라이브러리들은, 대전된 잔기들을 EBP 펜타펩타이드 반복의 4번째 아미노산에 도입하기 때문에, 비극성 EBP 라이브러리들보다 높은 Tt를 갖는 것으로 나타난다. EBPP[D1G4I1](도 4 (E))의 음으로 대전된 EBP 라이브러리들은, EBP 펜타펩타이드 반복의 4번째 아미노산에서의 Asp와 Lys의 서로 다른 pKa 값들 때문에, EBPE[K1G4I1](도 4 (C))와 EBPP[K1G4I1] (도 4 (D))의 양으로 대전된 EBP 라이브러리들보다 높은 Tt를 갖는다.
실시예
5. 칼모듈린 및
Cys
포함
블럭의
유전자 설계
Rattus norvegicus CalM 3(GenBank: BC063187.1)로부터 CalM 유전자를 유도하였다. 초기에, 이것은, 서열이 GAGGAG인 BseRI의 두 개의 인식 사이트를 갖는다. 이에 따라, 분자 복제에 의해 EBP-CalM 이중 블럭 폴리펩타이드의 유전자 라이브러리를 구축하기 위해, GAG와 GAA가 Glu 코드이기 때문에 CalM의 Glu 83의 유전자 코드인 GAG를 GAA로 변이시켰다. Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.)의 유전자 합성 서비스에 의해, 합리적으로 설계된 재조합 CalM 유전자를 제조하였으며, EBP-CalM 이중 블럭 폴리펩타이드의 유전자 라이브러리를 구축하기 위한 이음매가 없는 연결 반응을 실행하도록 XbaI와 BseRI에 의해 제한하였다. 또한, 화학 치료요법을 위한 약물 접합뿐만 아니라 산화와 환원에 의해 가역되는 분자간 가교결합을 형성하기 위해, Cys가 반복되는 유전자 서열 (Gly-Ala-Cys)을 주기적으로 포함하는, Cys-포함 블럭(Cys 블럭)을 설계하였다. AcuI와 BseRI에 의해 소화될 때 Cys 블럭의 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 Cosmo Genetech (Seoul, Korea)에 의해 화학적으로 합성하고 AcuI 및 BseRI로 dsDNA 프래그먼트를 어닐링하였다. 산물을 이용하여 Top 10 화학적 수용 세포들을 형질전환하였으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 플레이트 상에 도포하였다. 형질전환체는 아가로스 겔에서 진단 제한 다이제스트에 의해 초기에 선별되었으며, 전술한 바와 같이 DNA 시퀀싱에 의해 추가 확인되었다.
또한, 전술한 바와 같이, Rattus norvegicus CalM 3으로부터 유래한 CalM 유전자를 준비하였으며, 구체적인 서열은 표 3에 나타내었다. GAG와 GAA는 모두 Glu에 대한 유전자 서열이므로 CalM의 Glu 83의 유전자 코드인 GAG를 GAA로 변이시켰다. 이렇게 변이된 CalM 유전자를 사용하여, XbaI와 BseRI인 제한 효소를 갖는 EBP-CalM 이중 블럭 폴리펩타이드들의 유전자 라이브러리의 구축을 위한 이음매가 없는 연결 반응을 실행하였다.
[표 3] 칼모듈린(
CalM
)의 유전자(서열번호 42) 및 아미노산 서열(서열번호 43)
실시예
6.
EBP
-
CalM
이중
블럭
폴리펩타이드의
유전자 구축
소수성 EBP, 친수성 EBP, CalM, 또는 Cys-포함 블럭을 함유하는 각 플라스미드를 사용하여, Cys 블럭이 C-말단에 있는 CalM-EBPP[G1A3F2]n 및 CalM-EBPE 또는 EBPP[A1G4I1]12- EBPP[G1A3F2]12의 융합 폴리펩타이드 라이브러리를 위한 유전자를 생성하였다. 37℃에서 30분 동안 Cys를 인코딩하는 플라스미드 벡터를 FastDigest 완충제에서 10U의 XbaI, 15U의 BseRI로 소화시켰다. 제한 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. EBPP[G1A3F2]n 유전자를 인서트로 제조하기 위하여, 37℃에서 30분 동안 FastDigest 완충제에서 10U의 XbaI와 15U의 AcuI로 총 4μg의 CalM 유전자를 소화하고, 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의한 분리 및 겔 추출 키트를 사용한 정제를 실행하였다. 16℃에서 30분 동안 T4 DNA 리가아제 완충제에서 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 30pmol의 선형화된 벡터에 의해 90pmol의 정제된 인서트를 배양함으로써 연결 반응을 실시하였다. 산물을 이용하여 Top 10 화학적 수용 세포들을 형질전환한 후 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 판 상에 도포하였다. 형질전환체는 아가로스 겔에 대하여 진단 제한 다이제스트에 의해 초기에 선별되었으며, 전술한 바와 같이 DNA 시퀀싱에 의해 추가 확인되었다.
37℃에서 30분 동안 EBPP[G1A3F2]n-Cys를 인코딩하는 플라스미드 벡터를 FastDigest 완충제에서 감열 알칼리 포스파타제로서 10U의 XbaI, 10U의 BseRI, 및 10U의 FastAP로 소화 및 탈인산화하였다. 제한 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. CalM 유전자를 인서트로서 제조하도록 37℃에서 30분 동안 FastDigest 완충제에서 10U의 XbaI와 15U의 AcuI로 총 4μg의 CalM 유전자를 소화하고, 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의한 분리 및 겔 추출 키트를 사용한 정제를 실행하였다. 6℃에서 30분 동안 T4 DNA 리가아제 완충제에서 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 30pmol의 선형화된 벡터에 의해 90pmol의 정제된 인서트를 배양함으로써 연결 반응을 실시하였다. 산물을 이용하여 Top 10 화학적 수용 세포들을 형질전환한 후, 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 판 상에 도포하였다. 형질전환체는 아가로스 겔에 대하여 진단 제한 다이제스트에 의해 초기에 선별되었으며, 전술한 바와 같이 DNA 시퀀싱에 의해 추가 확인되었다.
실시예
7.
EBP와
이의
블럭
폴리펩타이드의
유전자 발현 및 정제
대장균 스트레인 BL21(DE3) 세포들을 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는 각 벡터로 형질전환한 후, 50μg/mL 암피실린이 보충된 50mL의 CircleGrow 배양액에 주입하였다. 37℃에서 밤새도록 200rpm으로 셰이킹 인큐베이터에서 전배양을 수행하였다. 이어서, 50mL의 CircleGrow 배양액을 50μg/mL 암피실린이 있는 500mL의 TB DRY 배양액에 주입하고 37℃에서 16시간 동안 200rpm으로 셰이킹 인큐베이터에서 배양하였다. 600nm에서의 광학 밀도(OD600)가 1.0에 도달했을 때, 최종 농도 1mM의 IPTG 첨가에 의해 EBP 블럭 폴리펩타이드 유전자의 과발현을 유도하였다. 4℃에서 10분 동안 4500rpm에서 세포들을 원심분리하였다. 기존에 보고된 바와 같이, 발현된 EBP 블럭 폴리펩타이드를 ITC(inverse transition cycling)에 의해 정제하였다. 세포 펠릿을 30mL의 HEPES 완충제에서 재현탁하고, 얼음 수조에서 20초 간격으로 10초 동안 음파처리(VC-505, Sonic and materials Inc, Danbury, CT)에 의해 세포들을 용해하였다. 4℃에서 15분 동안 13000rpm으로 50mL 원심분리 튜브에서 세포 용해물을 원심분리하여 세포 용해물의 불용성 잔해를 침전시켰다. 이어서, 수용성 EBP를 함유하는 상청액을 새로운 50mL 원심분리 튜브에 옮겨 0.5% w/v의 PEI의 보충 후에 4℃에서 15분 동안 13000rpm으로 원심분리하였다. 2 내지 3M의 최종 농도의 염화나트륨을 첨가함으로써 EBP 블럭 펩타이드의 상 전이를 개시하고, 응집된 EBP 블럭 폴리펩타이드를 37℃에서 15분 동안 13000rpm으로 원심분리에 의해 용해액으로부터 분리하였다. 응집된 폴리펩타이드를 차가운 HEPES 완충제에서 재현탁하고, EBP 용액을 4℃에서 15분 동안 13000rpm으로 원심분리하여 임의의 응집된 단백질 오염물을 제거하였다. Shodex GPC column OHpak SB-804 HQ(Showa Denko Co., Tokyo, Japan)를 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 1260 시리즈 기기(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 이용한 겔 투과 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의해 결정되는 바와 같이, EBP의 순도가 약 95%에 도달할 때까지 이러한 응집 및 재현탁 공정을 5번 내지 10번 반복하였다. 20℃에서의 HEPES 버퍼를 0.8 ml/분의 유속에서 용리액으로서 사용하고 GPC 컬럼을 20℃에서 유지하였다. 다양한 분자량을 갖는 EBPP 라이브러리, EBPP[G1A3F2]6 -36을 표준으로 사용하였다. EBP 블럭 펩타이드는, 280nm에서 굴절률 검출기(RID) 및 가변 파장 검출기(VWD)로 분석하였다.
도 5는 CalM-EBP 융합 단백질의 분자적 설계 및 이들의 전이 거동을 개략적으로 나타낸다. 낮은 Tt를 갖는 소수성 EBP (표 1-(10); EBPP[G1A3F2])와 높은 Tt를 갖는 친수성 EBP (표 1-(1); EBPE[A1G4I1] 또는 표 1-(2); EBPP[A1G4I1])의 세 개의 서로 다른 EBP 블럭을 도입하였다. 도 5의 일련의 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드들을 다음과 같이 설계하였다: (A) CalM-소수성 EBP, (B) CalM-소수성 EBP-친수성 EBP, (C) CalM-친수성 EBP-Cys 블럭, (D) CalM-친수성 EBP-소수성 EBP-Cys 블럭. 또한, 다양한 EBP 블럭에 대칭적으로, CalM은 N-말단, Cys 블럭은 C-말단에 화학적 가교를 통해 도입되었다. 특히, (B) 및 (D) 각각은 친수성 EBP의 높은 용해도로 인해 Tt 이상에서 안정한 미셀 구조를 형성하였다. 본 발명자들은 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 물리적으로 가교된 미셀 구조는 환경적 반응을 통해 가역적인 자가-조립 거동을 보여줄 수 있어서, 물리적으로 가교된 다중-반응성 동적 나노 전달체를 제조할 수 있을 것으로 전제하였다. 구체적으로, 물리적으로 가교된 미셀의 CalM 블럭은 칼슘 이온 또는 페노티아진과 같은 약물에 반응될 수 있다. 또한, Cys 블럭의 4개의 Cys 잔기는 코어 내에서 산화를 통해 화학적으로 가교되고, CalM 블럭 내 2개의 Tyr 잔기 (T99, T138)는 UV 조사에 의해 화학적으로 가교될 수 있다. 또한, 도 (D)의 CalM-친수성 EBP-소수성 EBP-Cys 블럭은 쉘의 열-반응성 및 미셀 구조의 안정성을 지니도록 유전적으로 제조되었다. CalM-EBP 이중 블럭의 다중 반응성에 따라, 이들의 물리화학적 특성과 기계적 특성을 동적으로 미세하게 제어할 수 있다. 그 결과, 상기 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드는 온도, 칼슘, 리간드에 대한 다중-반응성을 나타내어, 다중 자극에 의해 개시되는 동적 약물 전달 캐리어가 형성될 수 있다.
한편, 1℃/분의 속도로 10℃ 내지 85℃에서, 다중 세포 열전 온도 제어기를 갖춘 Cary 100 Bio UV/Vis 분광 광도계(Varian Instruments, Walnut Creek, CA)로 OD350을 측정함으로써, HEPES 완충제 내의 25μM 농도의 다양한 EBP 블럭 폴리펩타이드의 가역 상 전이에 대한 온도의 영향을 결정하였다. 10 내지 60℃에서, 다양한 농도의 CaCl2, 및 리간드 분자를 포함하는 25μM 농도의 HEPES 내 다양한 CalM-EBP 융합 폴리펩타이드 용액의 유체역학적 반경을 결정하고자, Zetasizer (Malvern, UK)를 이용하여 동적 광산란법 (DLS)을 실시하였다.
실시예
8.
CalM
-
EBP
이중
블럭
폴리펩타이드의
물리화학적 특성
다양한 분자량 (M.W.)을 갖는 CalM 블럭 및 Cys 블럭이 측면에 위치하는 소수성 EBPP[G1A3F2] 블럭을 유전자 레벨에서 제조하였다. 도 6 (왼쪽)의 DNA 아가로스 겔 전기영동의 겔 사진 화상은, 제1 레인으로부터 제6 레인으로 1020, 1560, 2100, 4640, 3180, 및 3720 염기 쌍(bps)의 범위로 구축된 일련의 CalM-EBPP[G1A3F2]6n-Cys (n은 정수) 블럭을 보여준다. CalM-친수성 EBP-소수성 EBP 융합 단백질 역시 도 7 (A)에서 확인되었다. 모든 종류의 이중 블럭 폴리펩타이드는 E. coli에서 발현되고, 5 내지 6회의 ITC를 통하여, GPC 분석으로 확인된 바와 같이 적어도 95%의 순도로 정제되었다. 도 6(B)의 구리 염색된 SDS-PAGE는 1 레인으로부터 제6 레인으로 32.9, 48.0, 63.1, 78.1, 93.2, 및 108.3 kDa의 범위로 정제된 일련의 CalM-EBPP[G1A3F2]6n-Cys 블럭을 보여준다. 도 7 (A)에서 75.5 kDa의 CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, 도 7 (B)에서 76.5 kDa의 CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭, 도 7 (C)에서 75.6 kDa의 CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12이 확인되었다. 이들은 SDS-PAGE 동안 부분적으로 산화되어 이황화 결합 브릿지를 통해 이량체를 형성함을 발견하였다.
도 8은, 이들이 1℃/분의 가열 속도에서 온도 함수로서 혼탁도 프로파일링에 의해 특징화된 경우, (A) 10mM CaCl2이 없을 때와 (B) 10mM CaCl2이 있을 때의 열적 전이 거동을 나타낸다. 소수성 EBP 블럭에 의한 서로 다른 EBPP[G1A3F2] 블럭의 크기 및 CalM에 대한 칼슘의 결합에 따라, 이들의 Tt를 29.6℃에서 54.0℃의 범위에서 미세 제어하였다 (표 4 참조). EBP 폴리펩타이드 단위체에 의한 소수성 EBP 블럭의 길이가 감소함에 따라 이들의 Tt는 높아졌다. 칼슘-이온의 존재에 따라 CalM은 본연의 형태에서 덤벨 형태로 구조적인 변화를 보였다. 결과적으로, 10mM의 CaCl2이 있는 경우 이들의 Tt는, CalM의 입체 구조적 변화로 인해, 칼슘 이온들이 없는 경우의 온도보다 약 1.6℃ 내지 7.1℃ 가량 낮았다. 결과적으로, 칼슘이 결합된 덤벨 형상 구조의 CalM는, 본래의 구조에 비해 CalM 블럭의 소수성을 강화시킨다.
[표 4]
도 9에 나타낸 바와 같이, CalM-친수성 EBP-소수성 EBP 융합 단백질의 다중-반응성을 열적 프로파일에 의해 특징화하였다. 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl 및 30 mM NaCl과 같이 다른 염의 농도에 따른 이들의 열적 프로파일은, 1mM TCEP를 포함하는 10mM HEPES에서 확인되었다. 특히, CalM-친수성 EBP-소수성 EBP 융합 단백질의 Tt 는 버퍼 용액 및 2가 이온의 이온 강도에 따라 감소하였다.
실시예
9.
CalM
-
EBP
이중
블럭
폴리펩타이드의
다중-자극 반응성
도 10은 칼슘이 없는 완충액으로서 10mM의 HEPES 버퍼에서, 10μM의 CalM-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭에 대한 혼탁도 프로파일과 유체역학적 반경을 비교한 것이다. 10μM의 HEPES 완충액에서 CalM-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드가 제조되었을 때, 10℃에서의 단량체는 응집된 EBP 블럭 사이에서의 물리적 가교로 인해 41℃에서 미셀 구조를 형성하였다. 비록 열적-유발된 자가-조립 미셀이 형성되었으나, CalM-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭의 미셀 크기 (도 10; 점선)는 불안정하였으며, OD350에서의 혼탁도 (도 10: 실선)는 개시되었던 결과들보다 높았다. 한편, 약 37℃에서 25 μM의 CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭 및 CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭의 물리적으로 가교된 미셀은 DLS 특성에 따라 안정적이었다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 칼슘 이온의 존재에 따른, CalM-친수성 EBP-소수성 EBP 융합 단백질의 자가-조립된 미셀의 유체역학적 반경은 DLS를 통해 확인되었다. 구체적으로, 1 mM TCEP를 포함하는 HEPES에서 자가-조립된 CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭의 유체역학적 반경은 Ca2+가 없을 때, 61.86 nm (A 붉은 선)였고, Ca2+가 있을 때 228.1 nm (A 보라색 선)였다. 1 mM TCEP를 포함하는 HEPES에서 자가-조립된 CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 의 유체역학적 반경은 Ca2 +가 없을 때, 30.29nm (B, 붉은 선)였고, Ca2 +가 있을 때 46.89nm (B 보라색 선)으로서, Ca2 +에 의해 상대적으로 증가된 유체역학적 반경을 나타냈다.
칼슘 이온 및 리간드가 없을 때, LCST 이상에서 형성된 열적으로 유발된 자가-조립 미셀은 Cys 블럭 사이의 산화를 통해 화학적으로 가교되었다. 티올 산화제로서 다이아민이 화학적으로 Cys 블럭의 화학적 가교를 위해 사용되었고, 다중-반응성을 갖는 전체의 온도 범위에서 미셀은 안정적이었다. 결론적으로, 도 12에 나타낸 바와 같이, 가교된 CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 미셀의 유체역학적 반경은 CalM 블럭의 반응에 따라, 칼슘-이온, TFP, 및 EGTA가 있거나 없을 때, 10℃ 내지 60℃에서 차이를 보였다. 구체적으로, Ca2 +가 없는 상태에서의 화학적으로 가교된 미셀은 비결합된 상태로서, 유체역학적 반경 (Rh)은 10℃에서 90nm, 60℃에서 42nm를 나타냈다. 미셀이 Ca2 +에 노출되었을 때, 칼슘 결합 상태로서, 미셀의 Rh는 10℃에서 86nm, 60℃에서 40nm로 감소하였다. 그러나, 이러한 미셀이 뒤이어 TPF에 노출되었을 때, 리간드 결합 상태로서, 미셀의 유체역학적 반경은 10℃에서 95nm, 60℃에서 56nm로 증가하였다. 최종적으로, EGTA를 사용하여 Ca2 + 및 TFP를 제거함으로써, 이러한 미셀의 미셀 구조를 비결합 상태로 회복시켰을 때, 미셀의 Rh는 10℃에서 90nm, 60℃에서 43nm으로 감소되었다. 25 μM에서, CalM-EBPE[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭 및 CalM-EBPP[A1G4I1]12-EBPP[G1A3F2]12-Cys 블럭의 미셀 구조는 온도, 칼슘 이온, 및 리간드 분자와 같은 다중-자극 반응에 안정적이었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Elastin-based peptide, Xaa can be any amino acid, natural or
non-natural
<400> 1
Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Elastin-based peptide, Xaa can be any amino acid, natural or
non-natural
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Val Pro Ala Xaa Gly Val Pro Ala Xaa Gly Val Pro Ala Xaa Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Xaa Gly Val Pro Ala Xaa Gly Val Pro Ala Xaa Gly
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Elastin-based peptide, Xaa can be any amino acid, natural or
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Ile Pro Ala Xaa Gly Ile Pro Ala Xaa Gly Ile Pro Ala Xaa Gly Ile
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Pro Ala Xaa Gly Ile Pro Ala Xaa Gly Ile Pro Ala Xaa Gly
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gtccctggta ttggcgtacc tggaggcggc 90
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
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gtgcctgcaa taggagttcc cgctggtggc 90
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<213> Artificial Sequence
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ggtgttccgg gtatcggtgt tccgggtggc 90
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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20 25 30
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<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 31
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly
20 25 30
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 32
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
20 25 30
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 33
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
20 25 30
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 34
Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly
20 25 30
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 35
Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Lys Gly
20 25 30
<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 36
Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Phe Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Asp Gly
20 25 30
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 37
Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala His Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly
20 25 30
<210> 38
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 38
Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly
20 25 30
<210> 39
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 39
Val Pro Ala Cys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Cys Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Cys Gly Val Pro Ala Phe Gly
20 25 30
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 40
Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Gly Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile
1 5 10 15
Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Phe Gly Ile Pro Ala Ala Gly
20 25 30
<210> 41
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EBP
<400> 41
Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Phe Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Phe Gly
20 25 30
<210> 42
<211> 438
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CaIM
<400> 42
gctgaccagc tgaccgaaga acagattgca gagttcaagg aagccttctc cctctttgac 60
aaggatggag atggcaccat taccaccaag gagctgggga ctgtgatgag atcgctgggg 120
caaaacccca ctgaggcgga actgcaggac atgatcaatg aggtggatgc tgatggcaat 180
gggaccattg acttcccaga gttcctgacc atgatggcca gaaagatgaa ggatacagac 240
agcgaggaag agataccaga ggccttccgt gtctttgaca aggatgggaa tggctacatc 300
agtgctgctg agctgcgtca cgtcatgacg aacctggggg agaagctgac tgatgaggaa 360
gtggatgaga tgatccgaga ggcggacatt gatggaggcg gccaggtcaa ttatgaagag 420
tttgtacaga tgatgact 438
<210> 43
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CaIM
<400> 43
Ala Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe
1 5 10 15
Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu
20 25 30
Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu
35 40 45
Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile Asp
50 55 60
Phe Pro Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp
65 70 75 80
Ser Glu Glu Glu Ile Pro Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly
85 90 95
Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu
100 105 110
Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala
115 120 125
Asp Ile Asp Gly Gly Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met
130 135 140
Met Thr
145
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cys block
<400> 44
Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys
1 5 10
Claims (23)
- 하기 식 1 내지 식 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 상 전이 거동 (phase transition)을 가지는 폴리펩타이드:
[식 1]
[서열번호 1]n;
[식 2]
[서열번호 2]n;
[식 3]
[서열번호 3]n,
상기 식 1 내지 식 3에서,
상기 서열번호 1은 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]로 구성되고;
상기 서열번호 2는 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]로 구성되고;
상기 서열번호 3은 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]로 구성되고;
n은 1 이상의 정수로서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 반복 횟수이고; 및
상기 X 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 펜타펩타이드 VPGXG, VPAXG, 또는 IPAXG 가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택되는 것임.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 다중-자극 반응성을 가지는 것인, 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드.
- 제2항에 있어서,
상기 자극은, 온도 또는 리간드 중 1 이상인, 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 식 1에서,
상기 n은 1이고,
상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는
A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 23];
K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 25];
D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 27];
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 29]; 또는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지는[서열번호 31] 것인, 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드.
- 제4항에 있어서,
상기 폴리펩타이드의 유전자 서열은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12인, 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 식 2에서,
상기 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는
A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 24];
K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 26];
D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 28];
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 30];
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 32];
K(Lys), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 33];
D(Asp), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 34];
K(Lys), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 35];
D(Asp), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 36];
H(His), A(Ala), I(Ile)가 3:2:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 37];
H(His), G(Gly)가 5:1의 비율로 이루어지거나[서열번호 38]; 또는
G(Gly), C(Cys), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지는[서열번호 39] 것인, 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드.
- 제6항에 있어서,
상기 폴리펩타이드의 유전자 서열은 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20인, 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 식 3에서,
상기 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 40]; 또는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지는 [서열번호 41] 것인, 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드.
- 제8항에 있어서,
상기 폴리펩타이드의 유전자 서열은 서열번호 21 또는 서열번호 22인, 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드.
- 칼모듈린 블럭; 및
상기 칼모듈린 블럭의 일측 말단에 연결되는 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭을 포함하는, 하기 식 4의 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드:
[식 4]
CalM-[소수성 EBP]m,
상기 식 4에서,
상기 CalM는 칼모듈린 블럭이고,
상기 [소수성 EBP]는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 소수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 m은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36임.
- 제10항에 있어서,
상기 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭은,
상기 식 4의 CalM과 [소수성 EBP] 사이에 추가되어 연결되는 [친수성 EBP]를 추가로 포함하는, 하기 식 5의 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드:
[식 5]
CalM-[친수성 EBP]l- [소수성 EBP]m,
상기 식 5에서,
상기 CalM는 칼모듈린 블럭이고,
상기 [소수성 EBP]는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 소수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 C는 상기 [친수성 EBP]는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 친수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 l은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36이고,
상기 m은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36임.
- 제10항에 있어서,
상기 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭은,
상기 식 4의 [소수성 EBP]의 말단에 연결되는 시스테인 블럭을 추가로 포함하는, 하기 식 6의 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드:
[식 6]
CalM-[소수성 EBP]m-C,
상기 식 6에서,
상기 CalM는 칼모듈린 블럭이고,
상기 [소수성 EBP]는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 소수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 m은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36이고,
상기 C는 시스테인 블럭임.
- 제12항에 있어서,
상기 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭은,
상기 식 6의 CalM과 [소수성 EBP] 사이에 추가되어 연결되는 [친수성 EBP]를 추가로 포함하는, 하기 식 7의 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드:
[식 7]
CalM-[친수성 EBP]l- [소수성 EBP]m-C,
상기 식 7에서,
상기 CalM는 칼모듈린 블럭이고,
상기 [소수성 EBP]는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 소수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 C는 상기 [친수성 EBP]는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 중에서 선택되는 친수성 폴리펩타이드로 구성되고,
상기 l은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36이고,
상기 m은 6, 12, 18, 24, 30 또는 36이고,
상기 C는 시스테인 블럭임.
- 제10항에 있어서,
상기 자극은, 온도 또는 리간드 중 1 이상이고,
상기 이중 블럭 폴리펩타이드에서,
상기 상 전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭은 열 반응성을 나타내고 상기 칼모듈린 블럭은 리간드 반응성을 나타내는 것인, 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서,
상기 칼모듈린는 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
- 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 시스테인 블럭의 아미노산 서열은 (Gly-Ala-Cys)이 1회 이상 반복되어 이루어지는 것인, 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
- 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 시스테인 블럭의 아미노산 서열은 (Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys-Gly-Ala-Cys)[서열번호 44]로 이루어지는 것인, 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서,
상기 이중 블럭 폴리펩타이드는 열 자극에 의하여, 상기 소수성 EBP가 가교결합되어 미셀 구조를 형성하는 것인, 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서,
상기 이중 블럭 폴리펩타이드는 칼모듈린 블럭이 리간드에 특이적으로 결합하여, 형성된 미셀의 구조가 변화되는 것인, 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
- 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 이중 블럭 폴리펩타이드 말단의 시스테인 블럭은,
열 자극에 의하여 형성된 미셀 구조 내 화학적 가교 결합을 형성하는 것인, 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
- 제20항에 있어서,
상기 화학적 가교 결합은 이황화 결합이며, 산화-환원 조건에 따라 가역적으로 형성 또는 분해되는 것인, 다중-자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는, 약물 전달용 조성물.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는, 조직공학용 지지체.
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JP5395664B2 (ja) * | 2006-09-06 | 2014-01-22 | フェーズバイオ ファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド | 融合ペプチド治療用組成物 |
-
2017
- 2017-03-24 KR KR1020170037344A patent/KR102028931B1/ko active IP Right Grant
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KR20140006721A (ko) * | 2012-07-05 | 2014-01-16 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 자발적 구조 변환에 의한 자극반응성을 지닌 이방성 단백질 나노구조체 및 이의 제조방법 |
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NCBI REFERENCE SEQUENCE; XP_009319198.1 * |
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