JP2004501784A - バイオエラストマーのナノマシンとバイオセンサー - Google Patents
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Abstract
ノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰返しペプチド単量体単位をもつバイオエラストマーが、ナノマシン及びナノセンサーの作製に使用される。
Description
【０００１】
技術分野
本発明はナノマシン及びバイオセンサーとしての使用に好適なバイオエラストマーの設計に関する。
【０００２】
背景
ここで「バイオエラストマー」と呼ぶ弾性タンパク質系高分子すなわち生体弾性高分子はしばしば、ノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰返しペプチド単量体単位を含み、該単量体単位は一連のβターンを形成し一連のβターンは該βターン間に吊り下がった動的架橋セグメントで仕切られると説明される。これらのバイオエラストマーは、天然ゴムや合成類縁体などのようなランダム鎖網エラストマーから調製される材料と違い、その構造要素が明確に定義されるため特定の物性をもつように設計、合成することが可能であり、制御性に劣る物性に依存する必要がないため多種多様な用途に好適である。
【０００３】
バイオエラストマーはミリメートル・スケールではすでに６つの強度変数すなわち機械力、温度、圧力、化学ポテンシャル、電気化学ポテンシャル及び電磁放射線が絡む多様な形態のペアワイズ自由エネルギー変換の実行を目的に設計されてきた。バイオエラストマーは、機械仕事の実行を可能にするペアワイズ・エネルギー変換がナノメートル・スケールで行われうるように、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して設計するのが望ましいであろう。
【０００４】
こうした取り組みの狙いは一般的なマイクロ電気化学系（ＭＥＭＳ）のスケールを千分の一に縮小し、また既に開発されている目視観測可能なエネルギー変換型の架橋エラストマーマトリックスのスケールを百万分の一にすることである。その機は熟している。理由は次のとおりである： （１）今日では、ＤＮＡ、多糖、タイチンなどのタンパク質及びポリエチレングリコールで既に立証済みの単一鎖Ｆ−Ｅ （張力−伸び）研究がＡＦＭを使用して行える；（２）今日では、弾性タンパク質系高分子の２組成物について単一鎖Ｆ−Ｅ曲線が得られる；（３）今日では、マクロ（ミリメートル）スケールで既に立証済みの設計バイオエラストマーによる機械仕事の実行を伴う自由エネルギー変換がナノスケールでも現実味を帯びてきた；また（４）取り組みの成果はこれらの生体分子マシンの感度を著しく高め、その潜在用途分野を拡大することになろう。
【０００５】
本発明はバイオエラストマーの使用により上記の課題に応えるための組成物と方法を提供する。開示の方法と組成物により応答時間はミリ秒レンジまで短縮しうるが、いっそうの短縮も可能であるし、また測定可能な長さの変化は１ナノメートル未満となり、測定可能な力の変化は１０ピコニュートン（ｐＮ）レンジとなる。バイオセンサーによる一分子事象の検出も今日では現実味を帯びている。たとえば適当な弾性ポリペプチドと直列をなす疎水的にフォールディングした球状タンパク質上のある部位への一神経ガス分子又は他の重要な分析物の結合を、そうした弾性ナノフィラメント構築体に対応する張力−長さプロフィールの変化から検出することも夢ではない。
【０００６】
発明の概要
本発明の一態様は、ナノマシンとして有用なバイオエラストマーの設計に関する。
本発明の別の態様はノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰返しペプチド単量体単位をもつバイオエラストマーを含むナノマシンであって、該単量体単位が一連のβ−ターンを形成し、一連のβ−ターンはβ−ターン間に吊り下がった動的架橋セグメントで仕切られているナノマシンに関する。
【０００７】
本発明の更に別の態様は、ナノパーティクル又は多ストランド・ナノフィラメントという形のバイオエラストマーを含むナノマシンに関する。
本発明の更に別の態様は、バイオエラストマー鎖と直列をなし、結合部位をもつ単一球状ドメインであって、該結合部位への分析物の結合が疎水的にフォールディングした該球状ドメインを、同等の伸び率にも関わらず異なる（より高い又はより低い）レベルの力でアンフォールディングさせる単一球状ドメインに関する。
【０００８】
個別実施態様の説明
本発明はナノマシン及びバイオセンサーとして有用な幅約５ｎｍ、長さ数百ｎｍという寸法のバイオエラストマー並びにそうしたバイオエラストマーの設計方法に関する。一般に本発明のナノマシン及びバイオセンサーは、生体弾性ノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰返しペプチド単量体単位をもつバイオエラストマーを含む。該バイオエラストマーはナノパーティクル又は多ストランド・ナノフィラメントという形をとる。これらの多様な多ストランド・ナノフィラメントは設計次第でナノケモメカニカル系（ＮＣＭＳ）、ナノエレクトロメカニカル系（ＮＥＭＳ）、ナノバロメカニカル系、ナノサーモメカニカル系及びナノホトメカニカル系（いずれも第１図に記載）として、またナノ電磁放射線駆動機械系（ＮＥＭＲＤＭＳ）として、さらに化学種たとえば神経ガス、ＴＮＴ、ＤＮＴなどの存在を検出するためのバイオセンサーとして、機能させることができる。たとえば極性分析物が結合すると、疎水的フォールディングの転移温度Ｔｔが使用温度の下から上へと上昇し、その結果としてアンフォールディングを招き、張力−長さプロフィールにＡＦＭで測定可能な変化が、又は長さが固定されている場合には平行吸音成分に強度の変化が、もたらされる。さらに、多ストランド・ツイストナノフィラメントではなく、折り返した単一鎖でナノマシン又はバイオセンサーを形成し、第２Ｃ図に示すようなＦ−Ｅプロフィールの張力のピーク到達又は増大を強制的アンフォールディングでもたらすようにすることもできる。また球状タンパク質部分に酵素認識部位たとえばキナーゼ認識部位をもたせ、リン酸化により該部位が疎水的にフォールディングした球状ドメインを、第６図に示すように、より低レベルの力でアンフォールディングさせるようにすることも可能であろう。
【０００９】
本発明は、いくつかのペアワイズ・エネルギー変換をナノスケールで実現しうるようなバイオエラストマーの、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）の使用による設計に関する。これを実現するためにまず、長さが約１０，０００残基の、より一般的には約２０００残基の、１以上の同じタンパク質系高分子ストランドを、その各末端に二酸、三酸及び四酸たとえばアジピン酸（ヘキサン二酸）、ケンプ三酸（第４Ａ図に記載）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を導入して集成する。次に、得られた単ストランド又は多ストランドのツイストナノフィラメントをカンチレバーと基板の間に吊るが、その際の結合には多酸末端に導入したシステイン残基硫黄を用いる。一般にこの結合は、カンチレバー探針と基板表面（どちらも金などの好適材料で被覆するのが好ましい）に対して行う。カンチレバーと基板への結合手段としては、システイン残基のＳＨ基の代わりに他の官能基たとえばアミノ基、カルボキシル基などを用いてもよい。
【００１０】
本発明の一実施態様では、該カンチレバーはバイオエラストマーにより吸収される振動エネルギーを検知する。これを図解したのが第７図である。
バイオエラストマーだけのナノマシンを使用するときは、１００残基ごとに官能基１個又は数個を変化させるだけで完全収縮状態の多ストランド・フィラメントを完全にほぐし、所定の力で長さを数百ナノメートルも変化させることができる。官能基の変化はたとえば３０〜５００アミノ酸残につき、基一般には約１００残基につき１セリン残基のリン酸化； ２０〜２００アミノ酸残基につき、一般には約１００残基につき２側鎖カルボキシル基のイオン化； 又は２０〜２００アミノ酸残基につき、一般には約１００残基につき２結合レドックス官能基 （たとえばＮ−メチルニコチンアミド）の酸化などであろう。ＡＦＭ実験に由来する単一鎖Ｆ−Ｅ曲線は、疎水的にフォールディングした個別球状タンパク質のアンフォールディングに関する張力−長さプロフィールを１０ｐＮ及びｎｍ感度で示すことができる。疎水的にフォールディングした単一球状タンパク質と直列をなすバイオエラストマーと組み合せてＡＦＭを使用すると、該球状タンパク質上の特定部位への一分子の結合を、アンフォールディングに関する張力プロフィールの変化から、選択的に検出するという究極の可能性が開けてくる。
【００１１】
これらの弾性タンパク質系高分子は、約１０１５Ｈｚ（サイクル毎秒）の高周波レンジから１０Ｈｚの低周波までの著しく広い周波数レンジの電磁スペクトルにわたるエネルギー入力の検知又はエネルギー出力の供給が可能である。一般的な周波数は１０〜１０５Ｈｚ、より一般的には１０２〜１０４Ｈｚのレンジ内であろう。高周波レンジでは、光の吸収に伴いその疎水性を変化させる多様な発色団が存在する。誘電緩和スペクトルの５ＧＨｚ中周波レンジでは、疎水性水和の吸収が見られる。やはり誘電緩和スペクトルの５ｋＨｚ中周波レンジでは、疎水的にフォールディングした集成状態の構造的共振が存在する。また１ｋＨｚ近傍の誘電緩和、吸音両スペクトルの低周波レンジでは、機械的共振が存在する。なお第７図に示す１ｋＨｚ近傍の機械的共振は機械力の強度変数を導入する手段として最良と考えられよう。これらの吸収過程はそれぞれ高分子系へのエネルギー入力手段として、系を変化させることが、又は別のエネルギー入力に由来する系の変化に起因するエネルギー出力の変化を表すことができる。たとえば伸びを固定したＡＦＭ単一鎖（又は単一ツイストフィラメント）実験では、フォールディング状態の変化に起因する張力の変化は、第７図に示す（強度変数は温度）ように、機械的共振の強度変化を伴うであろう。高分子の応答を誘発する（たとえば第１図に示すような）任意の自由エネルギー強度変数の導入に由来するツイストフィラメントのフォールディング状態の変化を検出するには、様々な方法がある。たとえば第７図の機械的共振の平行成分の強度変化は高分子のフォールディング状態を変化させた自由エネルギー入力の変化を検出する手段をもたらすので、該エネルギー入力と機械的共振の変化によるその検出とを組み合せれば自由エネルギー変換器が得られよう。
【００１２】
本発明の方法と組成物をさらに詳述する前に、Ｕｒｒｙ， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， １０１：１１００７−１１０２８， １９９７の検討主題であるマクロスコピックなバイオエラストマー分子マシンを理解しておくことが重要である。若干の重要領域すなわちΔＴｔ機構（タンパク質などのような両親媒性高分子の疎水的フォールディング及び集成の温度制御）、ΔＴｔ機構による自由エネルギー変換、及びΔＴｔ機構の物理的な基本原理（水和の無極性−極性反発自由エネルギー）をここでまとめておこう。さらに、天然弾性タンパク質のＡＦＭ単一鎖Ｆ−Ｅ曲線もまた、本発明の範囲を理解するための有益な情報を提供してくれる。この立証済みのマクロスコピックな自由エネルギー変換はＡＦＭを利用することによりナノスコピックな自由エネルギー変換となりうる。そのデータは単一ナノフィラメントＦ−Ｅ曲線の形をとるだろう。その成果はナノマシンたとえばナノエレクトロメカニカル系となる可能性がある。
【００１３】
ΔＴｔ機構（タンパク質やタンパク質系高分子などのような両親媒性高分子の疎水的フォールディング及び集成の温度制御）
Ａ． Ｔｔの定義と逆温度転移
目的のバイオエラストマーは極性（たとえば荷電）部分と無極性（疎水性）部分が均衡を保っている結果として、低温では可溶性であり温度が上昇すると疎水的に折りたたまれ集成する。この疎水的凝集の開始温度をＴｔとする。環状類縁体は温度の上昇に伴い結晶化し、温度の低下に伴い溶液中に再溶解して再びランダムに分散することが既に示されている。さらに巨視的には、分子量の大きい線状高分子は相分離を起こし、また分子レベルで集成して会合ツイストフィラメントを形成することがネガティブ染色顕微鏡写真などで確認されている。
【００１４】
温度の上昇に伴い系のポリペプチド部分の秩序が明らかに増すことから、これは逆温度転移（ｉｎｖｅｒｓｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）と呼ばれてきた。似た用語にタンパク質の低温変性や両親媒性石油系高分子の下部臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）があるが、他の用語よりも一般的、説明的であるため逆温度転移という用語を使用する。たとえばＬＣＳＴは個別球状タンパク質の疎水的フォールディングとは無関係だし、また低温変性にしても立体構造の著しい変化を伴わない結晶の溶解とは無関係である。それにもかかわらずどの場合にも同じ過程すなわち疎水性相互作用とその結果としての系の高分子成分のエントロピーの変化が見られ。タンパク質系高分子の逆温度転移と石油系高分子たとえばポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）［ＰＮＩＰＡＭ］のＬＣＳＴにはもう１つ大きな違いがある。ＰＮＩＰＡＭでは３４℃で相分離が起るが、転移は含水率約３０重量％の無秩序状態に向かう。Ｇｒｉｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ．， “Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｖｏｌｕｍｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ） Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ． １． Ｄｙｎａｍｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ（高感度示差走査マイクロ熱量測定によるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ヒドロゲルの熱体積相転移の研究。１． 動的効果）” ［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：１４７１−１４７５， １９９９］を参照。他方、目的のタンパク質系高分子たとえばポリ（ＧＶＧＶＰ） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］では２５℃で相転移が始まり、含水率６３重量％の構造化βスパイラル状態が形成される。このβスパイラル状態が含水率約３０重量％の無秩序状態へと変性するのは温度が６０℃超に達した後にすぎない。
【００１５】
Ｂ． 多数のＴｔ値制御手段
Ｔｔ値はいくつかの因子に依存する。たとえばｉ）高分子の濃度、ｉｉ）高分子の鎖長、ｉｉｉ）高分子のアミノ酸組成、ｉｖ）塩濃度たとえばＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ （離液）系列、ｖ）有機の溶質及び溶媒、ｖｉ）高分子側鎖のイオン化、ｖｉｉ）高分子側鎖の化学修飾たとえばリン酸化、窒化、硫酸化及びグリコシル化、ｖｉｉｉ）圧力（芳香族残基の特殊な役割）、ｉｘ）高分子に結合した補欠分子族たとえばＮ−メチルニコチンアミド（ＮＭｅＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のレドックス状態、ｘ）高分子に結合した補欠分子族たとえばアゾベンゼン及びシンナミドによる光の吸収、又は１０Ｈｚ〜１０１５Ｈｚレンジの他の任意適切な周波数の電磁スペクトルの吸収、及びｘｉ）イオン対合による側鎖電荷の中性化、たとえば陰イオン側鎖の陽イオン中性化、陽イオン側鎖の陰イオン中性化及び鎖内又は鎖間のイオン対合。以上の因子リストはそのまま、種々の自由エネルギー変換の実現を可能にするＴｔ値制御手段のリストとなる。逆温度転移点Ｔｔのこうした依存関係はＵｒｒｙ， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， １０１：１１００７−１１０２８， １９９７に記載されている。
【００１６】
Ｃ． Ｔｔを基礎とする疎水性尺度
前記の特に有用なＴｔ値制御手段の１つにアミノ酸組成と側鎖の化学修飾の効果がある。このデータはタンパク質工学にとって特に重要なＴｔベース疎水性尺度としてまとめられており、第１Ａ及び１Ｂ表に示すとおりである。これらの表はタンパク質工学向けの、ポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｘ（ＧＸ１ＧＶＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３； 式中Ｘ１は任意の天然アミノ酸又はその化学修飾体である）に関するＴｔベース疎水性尺度並びに逆温度転移に関するΔＨｔ及びΔＳｔ値を記載している。
【００１７】
第１Ａ表
天然アミノ酸残基に関するＴｔベース疎水性尺度
【表１】
【００１８】
ａ Ｔｔはリン酸緩衝食塩水（０．１５Ｎ ＮａＣｌ， ０．０１Ｍリン酸塩）中での疎水的フォールディング及び集成転移に関する逆温度転移点であり、水中光散乱法及び示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）で求めた。試料はポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｘ（ＧＸ１ＧＶＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）であり、Ｔｔはｆｘ＝１へと線形に外挿し、５の倍数に丸めた。
ｂ Ｐｒｏに関する計算値ＴｔはＶａｌ及びＧｌｙの実験値が使用されるときはポリ（ＧＶＧＶＰ）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］に由来する。この−８℃という疎水性値は、Ｖａｌ１ ｉγＣＨ３と隣接Ｐｒｏ２ ｉδＣＨ２とらせん巻き間Ｐｒｏ２ ｉ＋３βＣＨ２部分との間に疎水性接触がある場合のβスパイラル構造に特有である。
ｃ ポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｐ（ＧＶＧＰＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）から求めた実験値。
ｄ ポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｘ（ＧＸ１ＧＶＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を使用しｆｘ＝１へと外挿して求めた、ＧＸ１ＧＶＰ五量体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、式中Ｘ１は該五量体のゲスト・アミノ酸残基で、任意の天然アミノ酸又はその化学修飾体とすることができる）モルあたり計算値。
ｅ ΔＨとΔＳはポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｘ（ＧＸ１ＧＶＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を使用しｆｘ＝１へと外挿して求めた、ＧＸ１ＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）モルあたり計算値。ΔＨとΔＳは、高分子の水中転移に関するＤＳＣで求めた吸熱的熱及びエントロピーの線形適合曲線上のｆｘ＝０．２に対応する値である。
【００１９】
第１Ｂ表
タンパク質の化学修飾体及び補欠分子族に関する
Ｔｔベース疎水性尺度
【表２】
【００２０】
ａ 通常の条件は４０ｍｇ／ｍｌ高分子、０．１５Ｎ ＮａＣｌ及び０．０１Ｍリン酸塩（ｐＨ ７．４）である。
ｂ ＮＭｅＮはリシル側鎖上のＮ−メチルニコチンアミド側基、すなわちＬｙｓのε−ＮＨ２にアミド結合で結合したＮ−メチルニコチネートであり、最も疎水性の高い還元状態はＮ−メチル−１，６−ジヒドロニコチンアミド、それに次ぐ還元状態はＮ−メチル−６−ＯＨ，１，４，５，６−テトラヒドロニコチンアミドである。
ｃ 酸化及び還元ニコチンアミド＝アデニンジヌクレオチドでは、条件は２．５ｍｇ／ｍｌ高分子、０．２Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ９．２）である。
ｄ 酸化及び還元Ｎ−メチルニコチンアミドでは、条件は５．０ｍｇ／ｍｌ高分子、０．１Ｍ炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ ９．５）、０．１Ｍ塩化カリウムである。
ｅ 高分子結合−Ｏ−ＳＯ３ＨのｐＫａは８．２である。
ｆ Ｔｙｒ（−Ｏ−ＮＯ２−）のｐＫａは７．２である。
【００２１】
Ｔｔ機構による自由エネルギー変換
第１図に示すように、Ｔｔ値の制御により、機械力、温度、化学ポテンシャル、圧力、電気化学ポテンシャル及び電磁放射線の各強度変数が絡む１５のペアワイズ自由エネルギー変換が可能となる。
【００２２】
Ａ． 第１種のＴｔベース分子マシン（分子エンジン）
分子エンジンは機械仕事の遂行を目的に設計される分子マシン、一般には高分子である。第１種のＴｔベース分子マシンは疎水的フォールディング及び集成転移を機械仕事の遂行に直接利用する。第１図のエネルギー入力はどれも頂点の機械仕事に帰着するが、様々なタイプの第１種Ｔｔベース分子マシンの例となろう。これらの分子エンジンはγ線照射架橋タンパク質系高分子の立体配置において、適当なエネルギー入力があると荷重を持ち上げるような、設計バイオエラストマーからなる厚さ１ｍｍ、幅数ｍｍの弾性バンドを形成することが既に立証されている。本発明はこの種の分子マシンのサイズをナノメートルレベルへと１００万分の１も縮小して特定のナノマシンを作製するようにする。
【００２３】
Ｂ． 第２種のＴｔベース分子マシン
第１図の異なるエネルギー入力に対して敏感な任意の２個の際立った官能基があり、各官能基が個別にＴｔ値を変化させて疎水的フォールディング及び集成を促すことにより機械仕事を遂行しうるとすれば、両官能基を同じ疎水的フォールディング及び集成ドメインの一部とすることにより互いにカップリングすることが可能である。
【００２４】
従って、第２種のＴｔベース分子マシンは、やはり疎水的フォールディング及び集成転移を利用することにより、機械仕事の遂行以外の自由エネルギー変換を実現する。これは第２表の原理４に該当する。第２表は、疎水的フォールディング及び集成の逆温度転移を起こしうるタンパク質系高分子に関するタンパク質工学向けの、様々な現象論的研究から導き出されたの５つの原理をまとめたものである。分子マシン機能設計への５原理の適用に関するＵｒｒｙ， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ （Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）， ４７：１６７−１７８， １９９８の説明をも参照。現象論的観察からだけでも多大の成果が得られるものの、こうした特性を最大限に活用してバイオエラストマーの構造と機能を制御するには、その根本にある物理的原理の理解が求められる。
【００２５】
第２表
原理１ ゲスト・アミノ酸残基又はその化学修飾体が疎水的フォールディング及び／又は集成の転移点Ｔｔを変化させる仕方はその疎水性の関数的な指標である。Ｔｔの低下は疎水性の上昇を、またＴｔの上昇は疎水性の低下を、それぞれ表わす。
原理２ 温度をＴｔの上に上げると結果的に疎水的フォールディング及び集成が起る。この原理を利用すれば荷重の持ち上げといった有用な機械仕事の実現が可能になる。これは熱機械的変換である。
原理３ 定温で、Ｔｔ値を使用温度の上から下へと引き下げても、すなわち第１Ａ及び１Ｂ表の多数の変数のうちの任意の変数により疎水性を高めても、やはり結果的に疎水的フォールディング及び集成が起る。これを利用すれば構造物の構築たとえば荷重の持ち上げなど有用な機械仕事の実現が可能になる。
原理４ 多数の変数［すなわちｉ）温度、ｉｉ）圧力、ｉｉｉ）化学種の濃度の変化、ｉｖ）生体補欠分子族のレドックス状態の変化、ｖ）光（及び構造を変化させる他の電磁スペクトル）誘起型の化学構造変化、及びｖｉ）吸音］のうちの異なる変数に敏感な任意の２個の際立った官能基があり、各官能基をＴｔ値の変更に利用してフォールディング及び集成に由来する機械仕事を遂行させることができるとすれば、両官能基は同じ疎水的フォールディング及び集成ドメインの一部とすることにより互いに結合させることができる。
原理５ 以上のエネルギー変換はより疎水的なドメインの影響下に行われるとより効率的であることが立証可能である。
【００２６】
Ｔｔ機構の物理的原理
（水和の無極性−極性反発自由エネルギー）
Ａ． Ｔｔベース疎水性尺度
第１Ａ及び１Ｂ表を調べると、ＣＨ２基又は芳香族基の付加などのように、より高い疎水性の導入はＴｔ値が低下させることが明らかとなる。疎水性は疎水性水和と関連するため、疎水性水和の増大はＴｔ値を低下させ、疎水性水和の減少はＴｔ値を上昇させるということになる。また第１Ａ及び１Ｂ表からは、電荷の形成がＴｔ値を上昇させることも認められよう。ここから、高分子鎖沿いに存在するよう疎水基により強いられた荷電基は疎水性水和量を減少させるかもしれないとの洞察がまず得られる。
【００２７】
Ｂ． 伸張誘起ｐＫａシフト、（∂μ／∂ｆ）ｎ＝ α＜０
無極性（疎水性）種と極性（たとえば荷電）種の間には水和をめぐる競合関係が存在するという最初の有無を言わさぬ主張は、実験的に立証された伸張誘起ｐＫａシフトに由来した。何より興味深いことに、Ｇｌｕ含有タンパク質系高分子のゴム状弾性バンドを伸張すると、側鎖カルボキシル基のｐＫａはカルボキシラート（ＣＯＯ−状態のカルボキシル基）の自由エネルギーの増大を反映して大きくなる。μを化学ポテンシャル、ｆを印加力、αをイオン化度とすると、これは一定の温度及び組成での偏導関数（∂μ／∂ｆ）Ｔ，ｎ＝ α ＝０．５＜０により、電荷−電荷反発の場合には（∂μ／∂ｆ）Ｔ，ｎ＝ α ＝０．５ ＞０により、それぞれ表わされる。
【００２８】
伸張に伴い疎水的にフォールディングした高分子が強制的に解きほぐされ、またゴム状弾性バンドの水和が、疎水性水和であるにもかかわらず増大する。弾性バンド中の付加水にもかかわらず、カルボキシラートの自由エネルギーは、あたかも該カルボキシラートが十分な水和を実現するのに困難をきたしているかのように、増大する。これはイオン化過程におけるカルボキシル基による疎水性水和水の構造破壊とも符合するので、ここから高分子の無極性種と極性種の間には水和をめぐる競合関係が存在するという主張が起る。
【００２９】
Ｃ． 疎水性誘起ｐＫａシフト
もしそうした競合関係が存在するとすれば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＬｙｓ残基を含む高分子の疎水性を高めるだけで、ｐＫａシフトを起こさせて、カルボキシラートのｐＫａを高くし、アミノ基のｐＫａを低くすることができるはずである。事実、そのとおりである。さらに、疎水性の段階ごとの上昇に比してｐＫａシフトのほうがより大きくなるという非線形性も存在する。これは高分子の疎水性を高める多様な方法を用いて既に立証されている。実際、ナノレベルでの設計によって、ｐＫａ値を制御したり、官能基を利用する諸々の自由エネルギー変換を実現したりすることはごく普通に可能である。
【００３０】
Ｄ． イオン化度上昇に起因する逆温度転移熱の減少
示差操作熱量測定法（ＤＳＣ）によれば、イオン化度の上昇は逆温度転移熱を著しく減少させることがわかる。１００残基につき２個のカルボキシラートで転移熱を、すべてのＧｌｕ残基が非荷電カルボキシル基のままの場合の転移熱の４分の１に減少させることができる。ポリ（ＧＶＧＶＰ）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］の逆温度転移に伴う二次構造の変化は全く見らず、また疎水性水和は発熱的である以上、この吸熱的転移熱は疎水性水和水を構造破壊する主役であると言える。この吸熱的転移熱が疎水性会合の前に存在していた量の疎水性水和を構造破壊するための所要熱である限りで、これは電荷が疎水性水和を実際に構造破壊することを示唆しよう。
【００３１】
Ｅ． マイクロ波誘電緩和による疎水性水和の直接観察
無極性基と極性基という２種類の基が鎖状配列沿いに共存するよう強いられている高分子では無極性基と極性基の間に水和をめぐる競合関係が存在するという主張は、マイクロ波誘電緩和データを用いて既成事実化される。疎水性水和は５ＧＨｚ付近で緩和を示すが、全水の百分率として定量化することができる。この水和は疎水性残基の増加に伴って増大し、疎水的フォールディング及び集成とともに消滅し、また物理的原理の検証にとって最も重要なことに、ｐＨの上昇に伴いカルボキシル基のイオン化が始まると減少する。調べた一連のタンパク質系高分子では１００残基あたり２個未満のカルボキシラートで３分の２の水和を失わせる。こうして、荷電種とＶａｌ及びＰｈｅ残基の疎水性側鎖の間の水和をめぐる競合関係が直接立証された。この種の競合関係は水和の無極性−極性反発自由エネルギーとして説明されよう。
【００３２】
Ｆ． Ｔｔ値を決定する疎水性水和量
以上で明らかなのは疎水性水和の増大とＴｔ値低下の関係である。（ＧＶＧＩＰ）２６１［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ−２６１］の濃度を４０ｍｇ／ｍｌから１０００ｍｇ／ ｍｌへと高めながらＴｔ値と水和量を比較すると、ＤＳＣで求められるＴｔ値とマイクロ波領域の誘電緩和で測定される疎水性水和量の間に線形に近い関係が見い出された。従って、疎水的フォールディング及び集成転移と両親媒性高分子の機能とは疎水性水和量で制御されるとの見通しが強まる。
【００３３】
天然弾性タンパク質と合成バイオエラストマーに関する、ＡＦＭで求めた単一鎖Ｆ−Ｅデータ
Ａ． タイチン及びタイチン成分に関する単一鎖研究
単一鎖の３００万Ｄａタンパク質であるタイチン（コネクチン）について、ＡＦＭを用いて応力−ひずみ曲線を求めた。このタンパク質は大部分が９０〜１００残基の繰返し配列であるが、骨格筋の２０００超残基配列に相当する２２〜２６残基の繰返し配列をも含む。要するにタイチンはタンパク質系高分子であり、既知結晶構造の繰返しペプチド配列からなる。タイチンは、リシーディングメニスカス（ｒｅｃｅｄｉｎｇ ｍｅｎｉｓｃｕｓ）で生じる張力を用いて分子コーミングすると、幅４ｎｍ、長さ１０００ｎｍ超の線状分子を形成する（Ｔｓｋｈｏｖｒｅｂｏａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６５：１００−１０６， １９９７を参照）。
【００３４】
このＡＦＭ実験では、単一鎖の一端をカンチレバー探針（チップ）に、多端を基板表面に結合する。張力は鎖長の関数として測定するが、数ｐＮ／鎖の張力がすでにエントロピー弾性域にわたって求められている（Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ＡｖＨ−Ｍａｇａｚｉｎ， ７１：１１−１８， １９９８を参照）。従って、今日ではエントロピー弾性はランダム鎖網や端間鎖長のランダム又はガウス分布を伴うことなく起りうることが立証されている。これは過去半世紀にわたってエントロピー弾性に関する教示を支配してきた古典的なゴム弾性理論を否定するものである。
【００３５】
前記の９０〜１００残基配列には一般に２タイプがある。いわゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインとフィブロネクチンＩＩＩ （Ｆｎ３）ドメインであり、それぞれ疎水的にフォールディングした類似のβバレルを形成する。これらの類似βバレルは個別にアンフォールディングさせることができ、またこれらの相同球状タンパク質の組成の小さな差異に由来する異なる臨界アンフォールディング力を示す。Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（ＡｖＨ−Ｍａｇａｚｉｎ， ７１：１１−１８， １９９８）及びＲｉｅｆ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７５：３００８−３０１４，１９９８）はそれぞれ一連のＩＧ βバレル及びＣｏｎＦｎ βバレルのアンフォールディングを示す曲線を提供しているが、いずれの曲線でも長さとアンフォールディング力の特徴的な増大が見られる。これらの臨界アンフォールディング力は延伸速度と共に変化し、ごく低速の延伸では基本弾性力にまで低下する。重要なことに、ＣｏｎＩｇ構築体とＴｅｎＦｎ （テネイシンフィブロネクチン）ドメインに関する同等実験条件下のアンフォールディング力は２３７ｐＮ （ＣｏｎＩｇ）〜１１３ｐＮ （ＴｅｎＦｎ）であり、ドメインのアンフォールディングに伴い長さの特徴的な増大が見られる。
【００３６】
相同球状タンパク質のアンフォールディングに際してのアンフォールディング力の小さな差異と長さの変化に関するＡＦＭの検出能は本発明に関わる。アンフォールディング力の検出感度は±１０ｐＮであるが、９０残基球状ドメインの小さな組成差異はずっと大きなアンフォールディング力差異（±１００ｐＮ）を招く。本発明は、結合部位を有する単一の疎水的にフォールディングした球状タンパク質を弾性タンパク質系高分子鎖と直列にして提供するが、該結合部位は結合相手に占有されるとアンフォールディング状態とフォールディング状態との均衡を、及び／又は適切な延伸速度で実施したときに長さの増大を伴うアンフォールディングが起る力を、変化させる。
【００３７】
Ｂ． バイオエラストマーに関する予備的な単一鎖研究
バイオエラストマーの｛（ＧＶＧＶＰ）ｎ｝ｍ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１； ｍ≧２］及び｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０； ｍ≧２］を次の要領で調製した。タンパク質系高分子の（ＧＶＧＶＰ）２５１と（ＧＶＧＩＰ）３２０を各形質転換Ｅ． ｃｏｌｉの発酵で産生させ分離した。得られた遺伝子産物を高レベルに精製し、繰返し配列を１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲで、また鎖長をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で、それぞれ検証した。発現した２５１量体を、ＥＤＣＩを用いて重合させ、生成物が２５１量体の多量体となるようにし、また３２０量体も同様に重合させた。実質的にすべての分子がさらに大きな高分子と化したことをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。２５１量体と３２０量体に対応するバンドはもはや見られず、さらに大きな分子量の高分子が得られたが、それらの高分子は２５１量体と３２０量体の分離に使用されるゲルにはほとんど浸透できなかった。次に、こうして得られた多量体すなわち（ＧＶＧＶＰ）ｎ｝ｍ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１； ｍ≧２］及び｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０； ｍ≧２］の両端にシステイン残基を付加した。要するに、２５１量体又は３２０量体のランダム化学重合で得られた高分子鎖の両端にシステイン残基を付加した。
【００３８】
第２Ａ−２Ｃ図に関する実験条件は水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）から金めっきガラススライド上への物理吸着とＰＢＳ中での金めっき標準窒化ケイ素カンチレバー探針の使用によるその測定であった。高分子は、複数の分子鎖がピックアップされるのを防ぐために、短鎖（≦５０００ＭＷ）のチオール化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で希釈した。これによりバイオエラストマー鎖を表面に分散させ、単一鎖がカンチレバー探針でピックアップされる可能性を高めることができた。第２Ａ及び２Ｂ図に示したのは、Ｃｙｓ（ＧＶＧＶＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１； ｍ≧２］及びＣｙｓ｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０； ｍ≧２］に関する単一鎖Ｆ−Ｅ曲線である。Ｆ−Ｅ曲線の「長さ」は高分子全体の外形の長さではなく延伸部分の長さを反映するものの、観測された７００ｎｍ程度の破断長さはｎ値が２の場合なら適切であろう。
【００３９】
第２Ａ及び２Ｂ図の曲線は、Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（ＡｖＨ−Ｍａｇａｚｉｎ， ７１：１１−１８， １９９８）及びＲｉｅｆ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７５：３００８−３０１４， １９９８） でタイチン・ドメインの弾性挙動の適合に使用されたのと同様のワームライク鎖（ｗｏｒｍ−ｌｉｋｅ ｃｈａｉｎ， ＷＬＣ）モデルに適合した。ＷＬＣモデルは数百ｎＰまでの範囲でうまく機能した。その適合度はタイチンに関する先行研究結果とよく合致したが、適合した持続長はＧＶＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）では０．９ｎｍ、ＧＶＧＩＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）では１．０ｎｍであり、Ｉｇ又はタイチンの場合より長いので、単一鎖としてのバイオエラストマーはタイチンよりも「柔らかい」ことがうかがえる。
【００４０】
より疎水性の高いＣｙｓ｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０； ｍ≧２］に関する第２Ｃ図のデータはヒステリシスを示したが、これは超希釈条件下では観測されなかった。このヒステリシスは、一見延伸で強いられた疎水的なアンフォールディングに起因するが、一本鎖の折り返りよりもむしろ分子間凝集に起因していたのかもしれない。本発明では規則的な多ストランド・ツイストフィラメントの共有結合構築体を用いるが、そこでは延伸で強いられた疎水的アンフォールディングはもっと一様な、再現性の高いＦ−Ｅ曲線を示すものと見込まれる。本発明はまた、折り返り部分を好ましい長さに形成させるような溶媒中での（たとえば分子内イオン対合などを目的とした）配列周期性制御及び成分制御下に単一鎖の折り返りを制御して３−ストランドのセグメントを形成させることを見込む。
【００４１】
本発明のナノマシンは、ＧＶＧＶＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）タイプの五量体ファミリーを基礎にしたバイオエラストマーの分子構造を利用して設計される。この五量体ファミリーでは、第１Ａ及び１Ｂ表に示したような分子構造と逆温度（相）転移の基本的性質を保持したままで２個のＶａｌ残基の置換が可能である。相分離の凝集及びその結果としての分子構造の形成は濃度に依存するため、分子内及び分子間疎水性相互作用を基礎に形成される基本的機能単位すなわちツイストナノフィラメント（後述）をナノレベルで実現することが課題となる。これを用いれば、ミリメートル・スケールで既に立証されている機械仕事の遂行を目的とした諸々のエネルギー変換をナノメートル・スケールで捕えることができる。従って、これを用いて鎖あたり一球状タンパク質をツイストナノフィラメント中に組み込めば、酵素並みの特異性と選択性をそっくり発揮させることができる。従ってナノフィラメント上の官能基の状態の変化又は分析物と球状タンパク質との選択的相互作用を基礎とする変化を伴うＦ−Ｅ曲線の変化から分子事象が検出されることになる。
【００４２】
本発明の方法と組成物の説明に戻る前に、バイオエラストマーを一般的に理解しておくことが重要である。
【００４３】
材料
バイオエラストマーは後述の多数の特許で既に特性記述され開示されている。バイオエラストマーを定義する１つの方法はペプチド配列群について説明することである。これらの材料はイオン性アミノ酸残基（後述の目的に使用）を含む場合も含まない場合もある。特にこれらの材料は式αＰρΩＧ又はαＰθδで示される繰返し単位を含むものとして説明されよう： 式中Ｐはペプチド形成Ｌ−プロリン残基である； Ｇはペプチド形成グリシン残基である； αはペプチド形成Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン残基、又はイオン性ペプチド形成残基（Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ残基及び他のイオン性ペプチド形成Ｌ−アミノ酸からなる群より選択される）である； ρはペプチド形成グリシン残基又はペプチド形成Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｔｙｒ残基又は（随意に）弾性重合体繰返し単位用の他のイオン性ペプチド形成Ｄ−アミノ酸もしくは弾性形成繰返し単位用の任意のＬ−アミノ酸である； Ωはペプチド形成Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン残基又は（随意に）イオン性ペプチド形成Ｌ−アミノ酸もしくは他の任意の天然アミノ酸残基である； δはペプチド形成グリシン残基又はペプチド形成Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｔｙｒ残基又は（随意に）別のイオン性ペプチド形成Ｄ−アミノ酸である； またｄはペプチド形成グリシン残基又はペプチド形成Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ残基又は（随意に）別のイオン性ペプチド形成Ｌ−アミノ酸もしくは他の任意の天然アミノ酸残基である。
【００４４】
これらの人工又は合成バイオエラストマーの例はたとえば次の特許で開示されている：米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．）第４，１３２， ７４６号（ＶＰＧＶＧ及び変異体）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５］；米国特許（Ｕｒｒｙ）第４，５００，７００号、４，８９８，９２６号、５，５２７，６１０号及び５，３３６，２５６号（いずれもテトラペプチド及びペタンペプチド繰返し単位を開示）；米国特許（Ｕｒｒｙ）第４，５８９，８８２号（架橋）；米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．）第４，７８３，５２３号（ＩＰＧＶＧ及び変異体）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６］；米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．）第４，８７０，０５５号（六量体の包含）； 米国特許 （Ｕｒｒｙ） 第５，０６４，４３０号（ノナペプチド繰返し単位）； 米国特許（Ｕｒｒｙ）第５，２５０，５１６号（逆温度転移）； 米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．） 第５，８５４，３８７号（精製）； 及び米国特許（Ｕｒｒｙ）第５，９００，４０５号。以上の特許はすべて参照指示により本書に組み込まれる。
【００４５】
米国出願（Ｕｒｒｙ）Ｎｏ．０９／７４６，３７１， “Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ”では、これらの人工又は合成バイオエラストマーの追加例が、ある種のナノマシン応用分野に関連する特殊な吸音特性を有するものとして開示されている。これも参照指示により本書に組み込まれる。
本書に組み込まれる前記特許では、多数のバイオエラストマーが開示されている。それらの特許はナノマシンに関するものではないが、本書で開示する使用にとって有益な構造的特徴を実現するうえで重要なバイオエラストマー製造に関する指針を与えてくれる。
【００４６】
本発明の方法への使用に好適なバイオエラストマーを説明するもう１つの方法は、疎水性アミノ酸残基及びグリシン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む生体弾性テトラペプチド、ペンタペプチド及びノナペプチド単位からなる群より選択される繰返しエラストマーペプチド単量体単位を含む高分子としてバイオエラストマーを定義することである。これらの単量体単位は一連のβターンを形成し一連のβターンは該βターン間に吊り下がった動的架橋セグメントで仕切られる。すなわち該単量体は次の式で示されるβターンをもつコンフォメーションで存在する：
【００４７】
【化１】
（式中Ｒ１−Ｒ５はアミノ酸残基１−５の側鎖であり、ｍは繰返し単位がテトラペプチドなら０、繰返し単位がペンタペプチドなら１である。）
ノナペプチド繰返し単位は一般に一連のテトラペプチド及びペンタペプチドからなり、しばしばテトラペプチドの位置がグリシンで置き換わる。好ましい疎水性アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びメチオニンからなる群より選択される。多くの場合、繰返し単位の１番目のアミノ酸残基はバリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニン残基であり、２番目のアミノ酸残基はプロリン残基であり、３番目のアミノ酸残基はグリシン残基であり、４番目のアミノ酸残基はグリシン又は疎水性がきわめて強い残基たとえばトリプトファン、フェニルアラン又はチロシン、もしくは他の任意の天然アミノ酸残基であり、また５番目のアミノ酸残基は最も一般的にはグリシンである。
【００４８】
バイオエラストマーは、本発明の方法にふさわしい所望の性質を実現するよう、合理的に設計することができる。エラストマー単位及びその後のポリペプチドの合成原料となる個別アミノ酸の選択は次の条件が満たされる限りで無制限である。すなわち結果として得られる構造は、たとえば本書に組み込まれる米国特許第４，５００，７００及び５，０６４，４３０号で開示されている特徴を備えたエラストマー構造を、特に前述のβターン構成を含み、また結果として得られるバイオエラストマーは本発明の実施態様で意図されている目的に役立つ属性を維持しなければならない。さらに、βターンが折りたたまれてβヘリックスを形成すると、たとえば前掲米国出願（Ｕｒｒｙ） Ｎｏ．０９／７４６，３７１で開示されている特徴を備えたアミノ酸組成に依存して吸音が増大し、結果として得られるバイオエラストマーが本発明の実施態様で意図されている目的に役立つ吸音属性を維持しなければならない。
【００４９】
ポリ（ＧＶＧＶＰ）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］の分子構造は第３図のように一連のβターンとして示される。このβターンは、Ｐｒｏ残基に先立つＶａｌ残基のＣ＝Ｏ基と２個のＧｌｙ残基にはさまれたＶａｌ残基のＮ−Ｈ基が絡む１０原子水素結合環である（第３Ａ及び３Ｂ図）。基本的な問題は逆温度転移点の下と上におけるβターンの相対的配向である。転移点の下では、βターン相互の関係は本質的にランダムである。転移点の上では、βターンは疎水的に折りたたまれ、一巻きあたり約３個の五量体からなるβスパイラルというらせん状配列を形成する（第３Ｄ及び３Ｅ図）。さて分子間疎水会合に由来するこの逆温度転移は濃度に依存するため、βスパイラルは従来しばしば単純化して大まかに示されてきたのとは異なり、単独では存在しないと思われる。βスパイラルは実際は、ネガティブ染色した初期集合体の電子顕微鏡写真に見られるように、また第３Ｆ図及び第４図に示すように、会合した状態で多ストランド・ツイストフィラメントを構成しているはずである。
【００５０】
バイオエラストマーは多数の利点をもつように設計することができる。これは、それ自体が多様な構造や化学的性質を有し、修飾も容易である、容易に得られ結合される単量体単位たとえばアミノ酸などからなる高分子を用意することで実現しうる。従ってバイオエラストマーは、四量体、五量体又は他の単量体単位の混合物を含有する共重合体としても提供することができる。さらに、組換えペプチド工学的な手法を有利に用いて、個別ペプチド主鎖を生体弾性単位又は非弾性二官能セグメントとして生成することもできる。
【００５１】
バイオエラストマーは単量体単位の様々な位置にふさわしい様々なアミノ酸を選択することにより、また最終産物の形成に用いる架橋法（化学法、酵素法、放射線法など）を変えることにより、多様な含水組成、広範囲の疎水性、ほぼ任意所望の弾性率、多彩な物理的形態（シート、ゲル、フォーム、パウダーなど）及び可変的な架橋度に調製することができる。ポリマー設計のこうした様々な側面を考慮した多様なバイオエラストマーの調製については既に、たとえば前記特許で開示されており、ここでは簡単に触れるにとどめる。
【００５２】
本発明の方法に有用な好ましいバイオエラストマーは繰返しテトラペプチド、ペンタペプチド及び／又はノナペプチド単量体単位を含む高分子、すなわちポリテトラペプチド、ポリペンタペプチド及びポリノナペプチドである。本発明に有用なバイオエラストマーは一般に５以上、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上の単量体を、さらにもっと好ましくは１００以上の単量体を含む。バイオエラストマーはまた随意に、単量体単位間へのたとえば単一アミノ酸の挿入、時折出現する単量体中の一アミノ酸の他アミノ酸への置換、又は弾性率の向上や他の所望特性の付与を目的として並列又は直列に付加することのできる異なる配列のテトラペプチド、ペンタペプチド又はノナペプチドの包含も可能である。米国特許第４，５００，７００及び５，０４６，４３０号参照。従って、得られるバイオエラストマーは異なる単量体単位から形成されるため当然にも共重合体と称される。代表的な共重合体は好ましくはテトラペプチド及びペンタペプチド単量体単位の混合物であろうが、それらの単位は同じでも異なってもよい、すなわちすべての四量体が同じでも異なってもよいし、またすべての五量体が同じでも異なってもよい。さらに、バイオエラストマーは前述の単量体単位のうちの１つと１〜１００個のアミノ酸、より一般的には１〜２０個のアミノ酸を含む第２のペプチド単位から形成される共重合体でもよい。その種の第２ペプチドはたとえば米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．）第４，８７０，０５５号で開示されている六量体の−ＡＰＧＶＧＶ− ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７］であり、弾性率の変更を目的とした導入など多くの用途があろう。
【００５３】
単一多ストランド・ナノフィラメントの設計
ナノスケールでの基本機能単位はツイストフィラメントである。相分離は濃度に依存するため、凝集段階でナノフィラメントを単離するのは、またすべての鎖を同時に開始、停止させて単離するのももちろん、困難である。ツイストフィラメントの形成方法はたくさんあり、その一例を次に示す。機能単位に関するＦ−Ｅ曲線が得られるようにするには機能単位を化学合成で調製する必要があり、システイン残基の−ＳＨ基を両末端に配して、カンチレバー探針と基板表の金めっき層にしっかりと固定するようにする。タンパク質系高分子のアミノ末端には２ストランド・フィラメントの場合にはアジピン酸を、３ストランド・フィラメントの場合にはケンプ三酸を、また４ストランド・フィラメントの場合にはＥＤＴＡを配する。バイオエラストマーのカルボキシル末端にはこれらのジアミン誘導体を使用し、また閉合固定は超希釈条件下で行う。これにより、側鎖官能基を使用しない熱駆動及び塩駆動ナノマシンが得られよう。使用される高分子は（ＧＶＧＶＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１］及び（ＧＶＧＩＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０］であろう。（ＧＶＧＶＰ）２５１を使用して構築されることになる３ストランド・ナノフィラメントの略図を第４Ａ及び４Ｂ図に示す。長さ約６０ｎｍのこの構築体は約５倍に伸びる力をもとう。
【００５４】
単一ナノフィラメントからなる酸−塩基駆動及びレドックス駆動ナノマシンの設計
ｐＨ駆動及びレドックス駆動ナノマシンでは側鎖官能基が使用されよう。繰返し基本単量体配列中にカルボキシル基を含む高分子では、やはりアミノ末端に多酸を導入し、他末端の閉合は組換えＤＮＡ産生高分子のカルボキシル末端に過剰システイン残基を使用してジスルヒド結合を形成させることによって行う。アミノ基を含む高分子では、カルボキシル末端を使用して初期多量体を形成させ、また組換えＤＮＡ産生高分子のアミノ末端の閉合には過剰システイン残基を使用する。形成された多ストランド・フィラメントの側鎖アミノ基にレドックス官能基を付加すればナノエレクトロメカニカル系が作製されよう。酸−塩基駆動及びレドックス駆動ナノマシンの場合には、第４Ａ又は４Ｂ図の構築体の各ストランドの外部は周期性繰返し官能基で装飾されよう。
【００５５】
アミノ酸の選定
前述のように、本発明の方法に使用されるバイオエラストマーの性能にとって決定的に重要なある種の特性が存在する。しかし、当業者には自明であろうが、所望の特性を発揮させるように調整することができる他の物性も多数存在する。たとえば粘性、粘弾性、コンシステンシー、弾性率、安定性、靭性、含水組成、疎水性度、物理的形態、及び架橋度などであり、そのうちのいくつかについては後述する。従って、特定単量体単位中のアミノ酸の選定及び単量体単位の所望比率の選定は経験的な手続きで行うことができる。この手続きは、既知バイオエラストマーの物性測定（又は検索）に始まり、類似するが異なるバイオエラストマーの製造、及び本書でも前記特許でも述べているような物性の測定へと進む。そこから、選定手続きを合理的に修正して所望の物性を備えたバイオエラストマーを探し出すことができる。
【００５６】
特に興味深い四量体又はテトラペプチド単量体単位はＶＰＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）及びＧＧＸ２Ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９； 式中Ｘ２はバリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はアラニン（Ａ）である］などである。
好適な五量体又はペンタペプチド単量体単位は、説明のため非限定的に例示すると、式ＧＸ３ＧＸ４Ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０； 式中Ｘ３はバリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、リシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）及びアラニン（Ａ）からなる群より選択され、またＸ４はＶ、Ｅ、Ｆ及びＩからなる群より選択される］で示される単位、具体的にはＧＶＧＶＰ、ＧＶＧＩＰ、ＧＶＧＦＰ、ＧＦＧＦＰ、ＧＦＧＥＰ、ＧＦＧＩＰ、ＧＥＧＦＰ、ＧＥＧＶＰ、ＧＫＧＦＰ、ＧＫＧＶＰ、ＧＥＧＩＰ、ＧＫＧＩＰ及びＧＹＧＩＰなどである。他の特に好ましい個別単量体単位及びバイオエラストマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１２、１６及び１７、それに参照指示により本書に組み込まれる任意の特許を参照。
【００５７】
特に好ましい生体弾性材料は、式ＧＸ３ＧＸ４Ｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）の繰返しペンタペプチドを少なくとも１個、より好ましくはＧＶＧＶＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はＧＶＧＩＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のペンタペプチドを少なくとも１個含む材料であり、これはａ−（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ｂ又はａ−（ＧＶＧＩＰ）ｎ−ｂバイオエラストマーともいえる（式中ｎは１〜１０，０００好ましくは３〜７００の整数であり、ａとｂはポリテトラペプチド、ポリペンタペプチド、ノナペプチド又はそれらの共重合体である）。
【００５８】
特に、酸−塩基駆動及びレドックス駆動ナノマシンを含むバイオエラストマーの個別配列は、多ストランド・ナノフィラメントの形成を増進し鎖のいっそうの凝集を制限するように選択されよう。本発明の一実施態様では、基本単量体単位は（ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ ＧＸ５ＧＶＰ）ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１； 式中Ｘ５はグルタミン酸（Ｅ）又はリシン（Ｋ）であり、またｐは１〜６００の整数である］の形をとろう。第５図に示すように、この配列はより疎水性の高いＰｈｅ （Ｆ）残基をツイストフィラメントの内側に配する。他方、カルボキシル基又はアミノ基はレドクッス基が結合した又は結合しない状態でナノフィラメントの外側に位置するため、その荷電又は酸化状態により鎖のさらなる会合を制限することができる。
【００５９】
弾性
バイオエラストマーの弾性率を制御する一手段は転移点（Ｔｔ）という特性に関連する。一部のバイオエラストマーに見られる独特の性質は、それらが逆温度転移を起こし、その際に典型的なゴムに見られるランダム網目構造とは異なる規則的な構造が発現することである。これは米国特許（Ｕｒｒｙ）第５，２５０，５１６号で詳しく説明している。バイオエラストマーはそのＴｔを超える温度では、可逆的に会合してコアセルベートと呼ばれる濃密な含水粘弾性相を形成し、またコアセルベートの上の溶液は平衡溶液と呼ばれる。ゴム弾性状態を形成するこの温度上昇過程は規則構造のβスパイラルを出現させる結果となる。これはゆるい含水らせん構造であり、らせん巻き間にはスペーサーとしてのβターンが存在し、この構造によりらせん巻き間の、及びβターン間に吊り下がったペプチドセグメントとの、疎水性接触が実現する。従って、これらのバイオエラストマーのゴム弾性力は規則構造の発現に伴って発現する。成分繰返し単位のモル量を種々変化させた生体弾性材料を合成することにより、またこの初期粘弾性相を支持するための特定の溶媒を選択することにより、得られるバイオエラストマーが弾性力を発現する温度を厳密に制御することが可能となる。極大弾性力は約７５℃を上限とする比較的狭い温度帯で発現する。
【００６０】
従って、特定単量体単位中のアミノ酸の選定及び単量体単位の所望比率の選定は、本書でも前記特許でも述べているように、既知バイオエラストマーの物性測定（又は検索）に始まり、類似するが異なるバイオエラストマーの製造、及びＴｔ及び物性の測定へと進む経験的な手続きで行うことができる。たとえば転移点Ｔｔの値に対するアミノ酸組成変更の効果は疎水性尺度を用いてバイオエラストマーの単量体単位中の個別アミノ酸残基の平均疎水性の総和を求め、その結果をＴｔが既に判明しているバイオエラストマーに関して得られた総和と比較することで、見込まれるＴｔの大まかな推定値が得られるようにして割り出すことができる。一般に、疎水性がより高い残基（Ｉｌｅ、Ｐｈｅなど）はＴｔを低くし、疎水性がより低い残基（Ａｓｐ、Ｌｙｓなど）はＴｔを高くする。ほぼどの変数も、バイオエラストマーの適切な組成と共に、Ｔｔ値を変化させることができる。そうした変数の例は（１）高分子の濃度、（２）高分子の長さ、（３）アミノ酸組成、（４）塩濃度たとえばＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ （離液）系列、（５）有機の溶質及び溶媒、（６）高分子側鎖のイオン化、（７）高分子側鎖の化学修飾たとえばリン酸化、硫酸化及び窒化、（８）圧力（芳香族残基に及ぼすものなど）、（９）高分子に結合した化学基のレドックス状態、（１０）高分子に結合した化学基による光の吸収、及び（１１）イオン対合による側鎖電荷の中性化、たとえば陰イオン側鎖の陽イオン中性化、陽イオン側鎖の陰イオン中性化及び鎖内又は鎖間のイオン対合などである。
【００６１】
主鎖の修飾
バイオエラストマーはマトリックスを形成するペプチド単位で構成されるが、多様な方法で修飾を加え追加の物性をもたせることができる。たとえば１以上のペプチド結合を随意に、還元又は脱離によって得られる置換結合で取って代えることができる。こうして、技術上周知の方法により１以上の−ＣＯＮＨ−ペプチド結合を他タイプの結合たとえば−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓ及びｔｒａｎｓ）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＳＯ−で取って代えることができる。そうした方法の概論としては、たとえば “Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ” （Ｂ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） ｐ．２６７所収のＳｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ． （１９８３） を参照。アミノ酸残はこれらの高分子主鎖の好ましい成分である。もちろん、エラストマー単位レベルで主鎖に修飾を加える場合には、高分子の弾性と逆温度転移が維持されるようにするのが好適な主鎖修飾である。
【００６２】
架橋
架橋度は、単量体単位の異なる位置に対応した異なるアミノ酸を選定することで、また最終産物を形成するために用いる架橋法（化学法、酵素法、放射線法など）を変更することで、制御することができる。たとえばバイオエラストマーの特性は多様な架橋法のうちの任意の方法（化学法、酵素法、放射線法など）を用いる架橋により左右することができる。架橋はバイオエラストマーに機械的強度と剛性をもたらすが、要求剛性の増大に応じて架橋量を増大させるのが適切である。一般に許容されるのは２００〜５００繰返し単位につき１架橋結合を実現する架橋であるが、より低い粘性のバイオエラストマーでは架橋量をもっと多くすることやその逆も許容される。バイオエラストマーの架橋方法は、酵素的架橋性単位をもつブロック重合体を合成することによる酵素的架橋法を教示している米国特許（Ｕｒｒｙ）第４，５８９，８８２号などで公知である。たとえばバイオエラストマーにシステインを導入すれば、ジスルヒド架橋を介した表面との結合が可能になるし、またリシンを導入すればコラーゲンやエラスチンなどを架橋する酵素を用いて表面との酵素的結合を実現することができる。別の例はリシン（Ｋ）残基をもつ１以上の単量体たとえばＧＸ３ＧＸ４Ｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）のＸ３がＫ、Ｘ４がＶであるＧＫＧＶＰなどを含むバイオエラストマーであり、これは既に架橋酵素リシルオキシダーゼの基質であることが示されている。
【００６３】
水溶性カルボジイミドを使用して、ある鎖上のグルタミン酸（Ｇｌｕ， Ｅ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）のカルボキシル基を他鎖上のリシン残基（Ｌｙｓ， Ｋ）のアミノ基に架橋結合しアミドを形成させる架橋法もある。これはカルボキシル基又はＧｌｕを含む配列とアミノ基又はＬｙｓを含む配列との結合に関連する。水溶性カルボジイミドを使用するこの化学架橋法は次の要領で行う。Ｇｌｕを含むバイオエラストマーの水溶液（４０ｍｇ／ｍＬ， ｐＨ ７．５）とＬｙｓを含むバイオエラストマーの水溶液（４０ｍｇ／ｍＬ， ｐＨ ７．５）とを混合する。この混合溶液をその転移点の２〜３℃上で平衡させる。計算量のＥＤＣｌとＨＯＢｔを加える。Ｎ−メチルモルホリンでｐＨを７．５に調整し上記温度を維持しながら２日間振とうする。
【００６４】
さらに放射線による架橋も本書で参照指示したほぼすべての特許に詳しく記載されている。たとえば（ＧＶＧＶＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］はｎをおよそ２００として２０Ｍｒａｄのγ線照射で架橋すると、弾性率１０５Ｎ／ｍ２程度の弾性マトリックスを形成するが、この弾性率は組成と条件を変えることにより１０４〜１０８Ｎ／ｍ２の範囲内で加減することができる。Ｘ２０−ポリ（ＧＶＧＶＰ） ［Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍ． ６：２６３−２８２ （１９９１）］もまた放射線架橋バイオエラストマーの例である。放射線架橋法で調製されるバイオエラストマーは「Ｘ２０−ポリＧＶＧＶＰ」などと表記して識別するが、それは線量２０Ｍｒａｄのコバルト６０照射で架橋し不溶性マトリックスとした、ＰＧＰＧＶペプチド単位からなるバイオエラストマーを表わす。架橋コアセルベートもまた、ずっと大きな及び小さな線量で、すなわち５０Ｍｒａｄもの線量で、だが通常は２０Ｍｒａｄ未満、しばしば１０Ｍｒａｄ未満、さらには５Ｍｒａｄ未満の線量で得ることができる。
【００６５】
総括アミノ酸組成
得られるバイオエラストマーの様々な位置に存在するアミノ酸を大幅に変化させることもまた、吊り下がった架橋セグメントを間に挟む多重βターンが維持されることにより弾性が保持される限り、可能である。この理由から、好ましくはポリペプチドの５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにもっと好ましくは９０％以上が繰返し単量体単位で構成されるようにする。それにもかかわらず、他の目的のために設計されたペプチド・セグメントを含むより大きなポリペプチド全体にこれらの単量体単位を分散させたポリペプチドを調製することも可能である。そうした配列は所望の機能を実現するために共有的かつ直列的に又は側鎖として付加することができる。これら他配列の単量体残余に対する比は１：２〜１：５０００の範囲としうるが、好ましくは１：１０〜１：１００である。置換基の数と種類に対する上限は、バイオエラストマーの、緩和状態でβスパイラルを形成するための適正なフォールディング／集成能にも左右される。
【００６６】
総括疎水性
全バイオエラストマーの疎水性（従ってまたバイオエラストマー中の官能基の平均疎水性）は、種々の単量体単位の比率を変えることで加減することができる。これらは一官能基を含み転移を起こす単量体単位でも、バイオエラストマー中の他単量体単位でもよい。たとえば基本単量体単位がＧＶＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であり、転移を起こす単位がＧＸ６ＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２； 式Ｘ６中は電気応答性側鎖をもつよう修飾されたアミノ酸残基である）であるとすれば、適切な転移点が実現されるまで、ＧＶＧＶＰ単位のＧＸ６ＧＶＰ単位に対する比を変化させていくか、又は異なる構造単位たとえばＧＶＧＩＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、量を変えながら加えていくことができる。さらに、バイオエラストマーの配列は厳密に指定しうるため、構造成分の最適配置が可能になる。たとえば、カップリングした残基を主鎖上に互いに隣接し合うように（すなわち一次配列に基づいて）配置することにより、さらにまたらせん巻き間近接性を持たせるよう配置することにより、最適の空間近接性を実現することができる。
【００６７】
生体弾性ポリペプチドの大きな利点は、疎水性／極性度の微調整及びその結果として得られる逆温度転移シフトを実現しうる度合いにある。Ｔｔを変化させるには、前述のアミノ酸組成の変化に加えて、バイオエラストマーの平均疎水性を変化させる任意の化学的手段たとえば脱リン酸とリン酸化、レドックス・カップルの酸化と還元、イオン化と脱イオン、プロトン化と脱プロトン、開裂とライゲーション、アミド化と脱アミド、立体構造又は構成の変化（ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化など）、電気化学的変化（ｐＫａシフトなど）、発光／吸光又は他の物理的変化（熱エネルギー放射／吸収など）、圧力（米国特許第５，２２６，２９２号を参照）、光応答又は電気応答効果、もしくはそれらの組み合わせ用いることができる。
【００６８】
疎水性の設計はアミノ酸残基を適切に選定すれば容易である。この選定手続きについてはバイオエラストマー一般の疎水特性に関わるので、後で取り上げる。本発明の方法への具体的な使用には、バイオエラストマーを構成する１以上の単量体単位に現れる３つの好ましい残基すなわちフェニルアラン、チロシン及びイソロイシンが存在する。従って、本発明の好ましい一実施態様ではバイオエラストマーはフェニルアラニン又はイソロイシン残基をもつ１以上の単量体単位を含む。特に興味深い五量体はＧＶＧＶＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＧＶＧＩＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）ペンタペプチドを基礎とするバイオエラストマーの、荷電した、かつ疎水的に多様な類縁体である。従って、本発明の一実施態様では、好ましいバイオエラストマーは式ＧＸ３ＧＸ４Ｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０； 式中Ｘ３はＶ、Ｅ、Ｆ、Ｙ又はＫであり、Ｘ４はＶ、Ｅ、Ｆ又はＩである）で示されるその種の五量体の類縁体を１以上含む。
【００６９】
好ましいＸ３残基はＦ （五量体ＧＦＧＦＰ、ＧＦＧＥＰ、ＧＦＧＶＰ及びＧＦＧＩＰなどの場合）、Ａ （五量体ＧＡＧＶＰ及びＧＡＧＩＰなどの場合）、Ｙ （五量体ＧＹＧＶＰ、ＧＹＧＩＰなどの場合）、Ｅ （五量体ＧＥＧＩＰ、ＧＥＧＶＰなどの場合）及びＫ （五量体ＧＫＧＩＰ、ＧＫＧＶＰなどの場合）などである。好ましいＸ４残基はＦ及びＩからなる群より選択され、五量体はＧＡＧＩＰ、ＧＡＧＦＰ、ＧＶＧＩＰ、ＧＦＧＩＰ、ＧＶＧＦＰ、ＧＦＧＦＰ、ＧＥＧＦＰ及びＧＫＧＦＰなどとなる。特に好ましい生体弾性材料は１以上のＧＶＧＩＰ単量体を含む材料である。というのは、その種の単量体が１以上存在するとマトリックスがより強靭になり、また疎水性度が高まると判明しているからである。
【００７０】
これらの好ましい単量体単位を１以上含むバイオエラストマーの例を以下、説明を目的に、非限定的に列挙する：
（ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ ＧＸ５ＧＶＰ）ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１； 式中Ｘ５はＥであり、ｐは１〜６００の整数である。］
（ＧＡＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＩＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＫＧＶＰ）ｑ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３； 式中ｑは１〜６００の整数である。］
上記の例では式中の整数ｐ及びｑの値を与えているが、その趣旨はあくまでも本発明のバイオエラストマーの例示であって限定ではない。
【００７１】
合成
高分子量のバイオエラストマーを高収率で得るためのアプローチは多数ある。生体弾性繰返し単位の合成は簡単であり、ペプチド化学者にも、又は組換えＤＮＡ技術や微生物発酵の標準方法によっても、楽に行える。バイオエラストマーの有機合成はたとえば参照指示により本書に組み込まれる種々の特許に記載されている。具体的にはポリ（ＧＶＧＶＰ）の合成と架橋は米国特許第４，７８３，５２３号に、ポリ（ＩＰＧＧ）の合成は米国特許第５，２５０，５１６号に、またポリ（ＧＧＡＰ）の合成は米国特許第５，５２７，６１０号に、それぞれ記載されている。従ってこれらの特許の教示は種々の単量体単位をもつバイオエラストマーの合成に応用することができる。バイオエラストマーを化学合成で生産するときは、不純物を避けるよう注意する必要がある。低濃度の不純物でも、重合過程を終了させたり、得られるバイオエラストマーの物性を変化させかねないラセミ化を招いたりするおそれがあるためだが、それ以外、格別の合成問題は存在しない。ペプチド単位の純度は好適な物性を備えた材料を得るうえで重要である。というのは、たとえばバイオエラストマー合成のわずかな変化でもＴｔを１５℃も変化させる結果となりうるからである。この潜在的な問題への対策はペプチド合成に使用する単位成分の精製に尽きる。
【００７２】
バイオエラストマーは単独重合体又は共重合体として合成することができる。２以上の単量体単位から合成されるランダム又はブロック共重合体は本発明の方法に有用であるが、同等の単独重合体が所望の物性を備えるときはあまり好ましくない。その訳は合成がより複雑であることに尽きる。バイオエラストマーはその合成方法とは無関係に、必要ならさらに誘導体化することができる。たとえば米国特許（Ｕｒｒｙ）第５，９００，４０５号（電気的暴露）に記載されているように電気応答性側鎖をバイオエラストマーに組み込むこともできる。
【００７３】
バイオエラストマーはまた遺伝子工学的手法で合成することもできる。このアプローチでは、所望のペプチド配列をコードする遺伝子を構築し、宿主生物に人工的に導入し、そこで発現させる。宿主生物は細菌などのような原核生物でも酵母や植物などのような真核生物でもよい。適切な宿主生物中で効果的に遺伝子を発現させるための遺伝子情報（ＤＮＡ配列など）操作技術は分子生物学の世界では周知であり［たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）を参照］、ポリヌクレオチドの開裂、結合、複写又は他の組換えを行いうる酵素の使用などが含まれる。さらに、この情報を宿主細胞に、発現に好適な仕方で導入しうるようにするベクターも公知である。ポリＶＰＧＶＧの詳しい合成例は本発明者の研究所に由来する出版物ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ８：３４７−３５２ （１９９２）及びＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７：５１−５７ （１９９６）に記載されており、これらの出版物は本発明に使用される材料の遺伝子工学的調製のための手引きとして利用できる。既に２０００ものアミノ酸残基をもつバイオエラストマーを適切なＥ． ｃｏｌｉ株で効率的に発現させている。たとえば（ＧＶＧＶＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝１２１］の発現が既にＥ． ｃｏｌｉ細胞容積の８０％のレベルで起きている。従って、本発明の方法への使用に好適なバイオエラストマーは、（ＧＶＧＩＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； 式中ｎ＝２６０］を産生するよう形質転換したＥ． ｃｏｌｉ及び測定が容易な発現産物を同時発現するよう組み換えた発現ベクターの使用により低コストで合成しうるものも多い。
【００７４】
一般に、所望エラストマーの特定部分をコードする一本鎖オリゴヌクレオチドは商業的供給元により化学合成される。これらのオリゴヌクレオチドを次にその３’末端相補領域全体にわたってアニールし、ハイフィデリティ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで完全長の二本鎖基本遺伝子断片へと伸張する。得られた遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、クローニングベクターｐＵＣ１１８へとライゲーションにより挿入する。クローニング用宿主Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ａＦ’の形質転換後、選択プレートからポジティブクローンを回収し、各クローンからプラスミドＤＮＡを単離しスクリーニングにかける。得られたプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、アガロースゲル上で分離する。次の配列確認に回す候補クローンを選別する。配列が確認されクローンを、後続の遺伝子構築のための所望バイオエラストマー供給源として使用する。コンカテマー（多量体）遺伝子を構築するために、単量体遺伝子を含むプラスミドを前記制限酵素で消化し大量の単量体遺伝子断片を調製する。得られた単量体遺伝子断片を次に、後続操作のためのクローニング部位を種々のベクターにもたらすＮ−及びＣ−末端アダプターの存在下に、鎖状に連結（ライゲート）する。得られた鎖状連結産物は多様な鎖長の多量体遺伝子からなるが、それらをｐＵＣ１１８中にライゲートし、ベクターごとＥ． ｃｏｌｉに導入する。選択プレート上の有力クローンをスクリーニングし、種々の酵素による一連の消化を経てポジティブクローンを特定する。
【００７５】
組換えＤＮＡ技術の使用によるバイオエラストマーは生産コスト面で合成有機高分子やかなりの精製を必要とする天然材料に対し競争力をもちうる。工業用タンパク質メーカーはバイオ工学で生産されるタンパク質のコストを大幅に低減しうることを既に立証している。吸音体用のバイオエラストマーは大量に必要とされるため、その生産コストは特に重要である。
【００７６】
生体弾性ポリペプチドはたとえば発酵槽で増殖させた菌株から、又は有機合成から、その逆温度転移能を利用して精製することができる。微生物系で発現させた遺伝子工学的高分子では、タンパク質系高分子の逆温度転移特性を利用した精製が好ましい。この方法を用いるとエンドトキシン濃度でさえも格別に引き下げられることが立証済みだからである。Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ． ９：１０１５−１０４８ （１９９８）を参照。
【００７７】
使用方法
以下の実施例では当業者向けの本発明の例示と説明を目的に、本発明の特定の態様を説明する。実施例は本発明の理解と実施にとって有益な特定の方法論を示すにすぎず、本発明を限定するものではない。
【００７８】
実施例
バイオエラストマーの調製では、以下の個別実施例で説明するような遺伝子構築、発現系の開発、発酵及び精製を利用する。遺伝子構築に関しては、 （発現に使用されることになるベクターに存在する制限部位の考察など標準的な手法を用いて選択された）適切な制限部位配列を含む適切な付着端をもつように基本単量体遺伝子を設計した。基本遺伝子の合成は制限エンドヌクレアーゼによる消化による付着末端の生成、それに続くＤＮＡリガーゼを使用したライゲーションによる基本遺伝子の多量体の形成によって行った。このプロトコールを使用して各単量体遺伝子配列を首尾よく生成した。次に単量体遺伝子をコンカテマー化（重合）して繰返し単位数が種々異なる多量体遺伝子を形成し、以下簡潔に報告するように数多くの多量体遺伝子を高レベルで発現させた。
【００７９】
実施例１
ナノマシンの調製
Ａ． 組換えＤＮＡ技術によるバイオエラストマーの調製
組換えＤＮＡ技術を用いて、基本単量体遺伝子の調製、そのコンカテマー化による多量体遺伝子の調製、Ｅ． ｃｏｌｉへの導入、高レベルでの発現によりバイオエラストマーを調製する。一般的なアプローチはＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７：５１−５７， １９９６に記載されている。
【００８０】
Ｂ． 遺伝子配列
（ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ ＧＸ５ＧＶＰ）ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１； 式中Ｘ５はＥ、ｐは５０である］及び（ＧＡＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＩＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＫＧＶＰ）ｑ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３； 式中ｑは４５である］に対応する個別遺伝子の設計が必要である。
（ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ ＧＥＧＶＰ）ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１； 式中ｐは２である］に対応するヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を一例として次に掲げる。
【００８１】
【化２】
【００８２】
Ｃ． 一連の長いバイオエラストマーの間への球状モジュールの挿入
ＧＲＧＤＳＰを含むＦｎ３球状ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を用いて一連の長いバイオエラストマーの間に球状ドメインを挿入することができるが、その目的はＧＲＧＤＳＰ細胞接着部位をＲＧＹＳＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）などのようなキナーゼ認識部位に置き換えることに尽きる。あるいは、ＲＧＹＳＬＧキナーゼ認識部位をもつ小さな球状タンパク質のリゾチームを用いることもできる。ＲＧＹＳＬＧキナーゼ認識部位をもつＦｎ３ドメインすなわちＦｎ３：ＲＧＹＳＬＧのアミノ酸配列は次のとおりである。
【００８３】
【化３】
【００８４】
この球状Ｆｎ３ドメインをコードする遺伝子は、バイオエラストマーたとえば（ＧＶＧＩＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝１０］をコードする遺伝子との鎖状連結が可能なように構築した。さらに、該遺伝子はそれ自体との鎖状連結によりＦｎ３：ＲＧＹＳＬＧの多量体の生成も可能なようにした。単量体Ｆｎ３：ＲＧＹＳＬＧ遺伝子は次に示す合成ヌクレオチドを用いて２個の「半」遺伝子として構築した（Ｎはアミノ末端側の半分を示し、Ｃはカルボキシル末端側の半分を示す）。
【００８５】
【化４】
【００８６】
具体的には、各「半」遺伝子について２個のオリゴヌクレオチドをその３’末端相同領域にわたってアニールした。これらの末端をサーマルサイクラー中で熱安定ＤＮＡポリメラーゼと遊離デオキシヌクレオチドにより伸張して、二本鎖ＤＮＡ断片を得た。この反応生成物を分取して、最初の２オリゴヌクレオチドの二本鎖断片の３’末端と相同の３’末端をもつ別の２オリゴヌクレオチドを含む類似の反応混合液と混ぜた。これらの反応の二本鎖生成物を次に、それらがコードするアミノ酸配列と併せて示す。Ｆｎ３：ＲＧＹＳＬＧをコードするＤＮＡ配列は大文字で示す。
【００８７】
【化５】
【００８８】
【化６】
【００８９】
これらＦｎ３：ＲＧＹＳＬＧ「半」遺伝子を各々、末端ＢａｍＨＩ部位を利用して多目的クローニングベクターたとえばｐＣＵ１１８中にクローニングし、ＤＮＡ配列解析で確認した。次いでそれらを各々Ｐｆ１ＭＩでの開裂によりクローニングベクターから遊離させることで、各々独立にＰｆ１ＭＩ消化単量体バイオエラストマー遺伝子と鎖状連結することができた。各「半」遺伝子はリガーゼと共にバイオエラストマー遺伝子と、半遺伝子繰返し配列数あたりの所望バイオエラストマー繰返し配列数に有利となる比率で混合することができた。
【００９０】
たとえばＦｎ３Ｄｏｍ−Ｎ単量体遺伝子と（ＧＶＧＩＰ）１０単量体遺伝子とを含む鎖状連結ライゲーション反応液から、両端を１以上のＦｎ３Ｄｏｍ−Ｎ遺伝子繰返し配列にはさまれた１以上の（ＧＶＧＩＰ）１０遺伝子繰返し配列からなるコンカテマーを生成することができる。このコンカテマー遺伝子（Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｎ）ｘ｛（ＧＶＧＶＩＰ）１０｝ｙ（Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｎ）ｚ ［式中ｘ、ｙ及びｚは１以上である］をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化すると、ｙコピーの（ＧＶＧＶＰ）１０遺伝子を５’末端に付加されたＦｎ３Ｄｏｍ−Ｎ半遺伝子が得られよう。同様にＦｎ３Ｄｏｍ−Ｃ半分遺伝子と（ＧＶＧＩＰ）１０単量体遺伝子の鎖状連結ライゲーション反応により（Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｃ）ｑ｛（ＧＶＧＶＩＰ）１０｝ｒ（Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｃ）ｓ ［式中ｑ、ｒ及びｓは１以上である］が得られ、この生成物をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ で消化すると、ｒコピーの（ＧＶＧＩＰ）１０遺伝子を３’末端に付加されたＦｎ３Ｄｏｍ−Ｃ半遺伝子が得られよう。これら２つの鎖状連結生成物をそれらのＥｃｏＲＩ末端を介してライゲートすると、その５’末端、３’末端にそれぞれｙコピー、ｒコピーの（ＧＶＧＩＰ）１０を付加された完全なＦｎ３：ＲＧＹＳＬＧ遺伝子配列が得られよう。さらに、Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｎ、Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｃの各「半」遺伝子はそれぞれ、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ 末端のＧＶＧＩＰコード配列並びにこれらの末端の開始及び終止コドンに寄与する。得られる遺伝子はＧＶＧＩＰ｛（ＧＶＧＩＰ）１０｝ｙＦｎ３： ＲＧＹＳＬＧ｛（ＧＶＧＩＰ）１０｝ｒＧＶＧＩＰをコードしており、またＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ 末端を介してたとえば発現ベクター中にクローニングすることができる。
【００９１】
Ｄ． 多ストランド・ツイストフィラメントの化学的調製
以下は可能なアプローチの１つである。側鎖カルボキシル基をもつバイオエラストマーでは、たとえばトリシステイン誘導体化ケンプ三酸をアミノ基によるストランドの結合に使用する。バイオエラストマー鎖の他末端は、鎖状連結に際して使用したアダプター・オリゴヌクレオチドにより付加されたシステイン残基に由来するジスルフィド結合により架橋する。このカルボキシル末端のシステイン残基の数と位置は、未反応−ＳＨ基をもたせて分子間ジスルフィド架橋と金表面への結合の両方を実現するように選択する。同様に、側鎖アミノ基をもつバイオエラストマーでは、たとえばトリエチレンジアミンすなわちケンプ三酸のトリシステイン誘導体をカルボキシル基によるストランドの固定に使用する。同様に、アミノ末端で求められる鎖間ジスルフィド架橋のためのシステイン残基の挿入にはアダプター・オリゴヌクレオチド配列を使用し、残ったシステイン残基は保持し、その−ＳＨ基を金めっき表面への結合に当てる。
【００９２】
実施例２
ナノマシンのＡＦＭによる特性決定
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は、液体環境で使用することができる高解像度の走査型プローブ顕微鏡である。ＡＦＭは最も一般的な画像化装置としての用途に次いで、単一分子鎖による機械的実験の実施に使用できるｎｍ、ｐＮスケールのフォースセンサーとして浮上してきた。ツイストフィラメント・ナノマシンの特性決定にはこうした最新ＡＦＭ技術の両面を使用する。
【００９３】
Ａ． 単一フィラメント張力−伸び（Ｆ−Ｅ）曲線
単一フィラメントの弾性特性の決定では、ＡＦＭを基礎とした単一分子力分光法を用いてそのＦ−Ｅ曲線を調べる。これには、ＡＦＭ探針／基板表面間の個別高分子鎖の最適スパニング及び伸張を可能にするような専門の装置が使用される。試料の左右走査をやめるときのピエゾ変換器のｚ軸レンジは８（ｍであり、ピエゾ伸張は内蔵ひずみ計で制御する。この装置を用いると、数Åの精密さでカンチレバー位置の制御が可能であり、その場合の力分解能はｐＮオーダーである（カンチレバー振動に起因する熱雑音は１０ｐＮ未満であり、フィルター処理により
【数１】
へとさらに改善することができる）。ポリペプチドの弾性試験に使用したカンチレバーの公称ばね定数は約１０ｎＭ／ｍであり、液体環境でのカンチレバー共振周波数は一般に１ｋＨｚ程度であった。基板表面へのＡＦＭ探針の最初の接近に先立って、各レバーのばね定数を個別に、その熱振動振幅を測定することにより校正した。単一伸張トレースを記録するための一般的なタイムスケールは１ミリ秒〜１００秒である。
【００９４】
一般に、実験は室温で、液体環境たとえば純ＭｉｌｌｉＱ水又は水性電解質緩衝液中で行う。装置の試料セルは液体交換を可能にして、高分子鎖をＡＦＭ探針と基板の間に保持した状態で塩又はｐＨ条件を変えられようにしてある。さらに、金めっきした探針と基板は導電性であり、従って分子レベルで起るレドックス過程を刺激するための電極として使用することができる。最後に、外部光刺激（レーザー光）の系へのカップリングを可能にするようにして実験を行うこともできる。実験のさらなる詳細はＯｅｓｔｅｒｈｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ １：６．１−６．１１， １９９９及びＣｌａｕｓｅｎ−Ｓｃｈａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７８：１９９７−２００７， ２０００に記載されている。
【００９５】
バイオエラストマー試料のＡＦＭ探針と基板への結合には特異的リガンド−レセプター結合、共有結合、金表面へのチオールの特異的吸着、又は非特異的吸着などを用いることができる。予備作業としてバイオエラストマーＣｙｓ｛（ＧＶＧＶＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１； ｍ≧２］及びＣｙｓ｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝３２０； ｍ ≧２］の個別ストランドを４℃（バイオエラストマーの転移点Ｔｔを下回る温度）の希釈水溶液から金めっきガラススライド上に吸着させた。表面でのバイオエラストマーの希釈分散を実現するために、低平均分子量（ＭＷ が約５０００ｇ／ｍｏｌすなわち平均外形長３０ｎｍ）のチオールを末端基とするポリエチレングリコール（ＰＥＧ， Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を共吸着剤を使用した。
【００９６】
ＡＦＭ実験では、手動制御で金めっきＳｉ３Ｎ４カンチレバー探針（Ｍｉｃｒｏｌｅｖｅｒ， Ｐａｒｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を界面高分子層と１０〜３０秒間、密接触させた。カンチレバーを戻すと、１本又は数本の高分子ストランドが探針に接着したので、光てこ検出法を用いてカンチレバーばねのたわみから、得られる張力−距離プロフィールを測定した。共吸着ＰＥＧの使用により、ＡＦＭ探針と金めっき基板の間の非特異的接着は界面高分子層に由来する立体反発のために完全に抑制される。さらに、共吸着ＰＥＧの平均外形長は試料バイオエラストマー・ストランド長よりも桁違いに短いため、この戦略は実験で単一バイオエラストマー・ストランドをピックアップする公算を大きくしてくれる。このずっと短いＰＥＧ鎖はその特徴的なＦ−Ｅ曲線からすぐに判別される。最後に、バイオエラストマーのチオール末端基と金めっき探針の間の特異的結合は１本の個別バイオエラストマー・ストランドの弾性特性をナノニュートン張力まで繰返し測定することを可能にする。
【００９７】
第２図に示すような個別バイオエラストマー・ストランドの予備試験は、単一多ストランド・ツイストフィラメントの制御された機械的操作の基礎となるＡＦＭによるバイオエラストマー特性決定計画の実現性を証明している。
Ｂ． ツイストフィラメント・ナノマシンの画像化
多ストランド・ツイストフィラメントの弾性特性決定はＡＦＭによる画像化で補足されよう。これは基板表面でのバイオエラストマー・ナノマシン構造の研究と制御の改善とを可能にしよう。
【００９８】
ツイストフィラメント・ナノマシンの画像化は室温（２５℃）で、市販装置（Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＩＩ ａ， Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行われよう。試料の画像化は空気中でも適当な緩衝液中でも可能である。緩衝液中で画像化では、長時間の研究に際して緩衝液が蒸発するのを防ぐために密封性の液体セルに試料をセットすることになろう。最大レンジ１５（ｍのピエゾスキャナーと酸化物探針を一体化した窒化ケイ素カンチレバー（やはりＤｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｔｓ製で、公称ばね定数は３０ｍＮ／ｍ）を使用することになろう。タッピングモードは探針／基板間横力の最小化を可能にしよう（Ｈａｎｓｍａ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６４：１７３８， １９９４及びＰｕｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６４：２４５４， １９９４を参照）。
【００９９】
Ｃ． これら生体弾性高分子の吸音特性の利用
タッピングモードの顕著な進歩は、これら生体弾性高分子の吸音周波数レンジにわたって振動するようにＡＦＭカンチレバーを製作することが可能になったことである（Ｔａｍａｙｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ７７ （４） ：５８２−５８４， ２０００を参照）。基板に平行な振動のＡＦＭ走査モードで使用すると、これは貯蔵剪断弾性率Ｇ’と損失剪断弾性率Ｇ”の周波数依存（第７図の単位体積あたり吸音に相当）をもたらす（Ａｎｔｏｇｎｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ８６：２２３−２３２， ２００１を参照）。これは疎水的フォールディング及び集成の逆温度転移を通過することに由来する構造的変化をモニターする手段をもたらす。もし振動が基板に対して垂直であって、かつＡＦＭが張力−伸びモードで作動するとしたら、これはツイストフィラメント軸に平行な機械的共振成分の特性決定を可能にしよう。本発明の一実施態様では、エネルギー入力の導入に伴う検出対象の構造状態の変化が機械的共振の強度と周波数の変化によって検知しうるように生体弾性ツイストフィラメントを設計する。
【０１００】
米国出願 （Ｕｒｒｙ） Ｎｏ． ０９／７４６，３７１（前掲）で開示されている以下の生体弾性高分子は周波数レンジと吸音強度の制御を実現するうえで特に好適である。
【０１０１】
【化７】
【０１０２】
このリストでは整数ｎの値を与えているが、それは本発明の高分子を例示するのが目的であって、限定するものではない。１〜５０００の範囲内のｎ値で、高分子Ｉ〜ＸＶに関して記載したような繰返し単位をもつ高分子を設計することができる。以下の高分子もまた有用である（ｎは約１〜５０００の整数）。
【０１０３】
【化８】
【０１０４】
実施例３
多ストランド・ナノフィラメント及びナノケモメカニカル系の構築及び特性決定
２ストランド、３ストランド及び４ストランドのツイストフィラメントを調製し、その特性決定をＡＦＭで行うことができる。さらに、Ｐｈｅ及びＧｌｕ残基配列を利用して凝集を制御しながらナノフィラメント形成へと導くようにし、ナノケモメカニカル系（ＮＣＭＳ）を調製することも可能である。第５Ａ−５Ｃ図に模式的に示すような配列すなわち（ＧＥＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ）ｒ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７； 式中ｒは１〜５００の整数］にし、収縮／緩和の駆動にはカルボキシル基を用いることになろう。
【０１０５】
発生力と長さ変化のｐＨ依存を決定する際には、一般的な特性決定に加えてＡＦＭ研究からも（∂ｆ／∂μ）ｌ及び（∂ｌ／∂μ）ｆを評価し、ナノフィラメントによるケモメカニカル変換を可能にする最も好適な実験条件を求めることができる。
【０１０６】
実施例４
ナノケモメカニカル系用多ストランド・ナノフィラメントの構築と特性決定
第５Ａ−５Ｃ図に示したものと類似の、ただしより極性の高い（酢様）残基Ｌｙｓをもつ配列 （ＧＫＧＶＰ ＧＡＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＩＧＦＰ ＧＦＧＶＰ）ｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８； 式中ｓは１〜５００の整数］を用い、収縮／緩和の駆動にはアミノ基と付加レドックス基を結合させて用いることができる。発生力と長さ変化のｐＨ依存はＬｙｓ含有官能基で決定し、また発生力と長さ変化に対するレドックス官能基の酸化体の効果はレドックス含有官能基で決定することになろう。第１Ｂ表に示す任意のレドックス・カップルたとえばＮ−メチルニコチンアミド（ＮＭｅＮ）を使用することができる。
【０１０７】
実施例５
疎水的にフォールディングした球状タンパク質の組み込み
疎水的にフォールディングした球状タンパク質をバイオエラストマーに直列に組み込むための遺伝子を作る。疎水的にフォールディングした球状タンパク質を直列に組み込んだバイオエラストマーはたとえば疎水的にフォールディングした球状タンパク質の緩和（アンフォールディング）を促す駆動力となる毒ガス、ＤＮＴ及びＴＮＴとの相互作用を検知する機能的センサーのモデルとなる。このアプローチの物理的原理は水和の無極性−極性反発自由エネルギーであり、これは高分子鎖に沿って共存するよう強いられた極性部分と疎水性部分の水和をめぐる競合関係にほかならない。疎水的にフォールディングした球状タンパク質モジュールに極性種が結合すると、フォールディングした状態に対応する疎水性水和の一部が構造破壊され、それによってアンフォールディング状態の側へ平衡がシフトする。一般に、この原理を用いれば球状タンパク質の全体又は一部のアンフォールディングを検出することができる。ナノフィラメントを含む球状モジュールの外形長さはＦ−Ｅ曲線で測定すると、アンフォールディング鎖の追加長さ分だけ増大することになるからである。
【０１０８】
たとえば、正確な使用温度範囲に合わせて設計した場合、ＧＶＧＩＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の３００残基につき１個のリン酸基が結合するだけで完全な疎水性アンフォールディングを起こすことが既に示されている。タイチン様βバレル中の正しく配置されたキナーゼ認識部位はリン酸化に伴い、βバレルのアンフォールディングとタイチンの球状単位に見られるような球状単位に特有の幅だけ外形長さの増大をもたらす。そこに、疎水的にフォールディングした球状タンパク質上のある部位に位置する極性種の相互作用を、又は疎水性ドメインの強度変数を変化させるような分子の付加を検出する見通しが生まれる。さらに、ＡＦＭの利用によるその種の観測もまた、そうした見通しから開けてくる諸々の可能性を秘めた自由エネルギー変換機構を立証することになる。
【０１０９】
チロシン残基の窒化はＴｔ値を著しく高める（第１Ｂ表を参照）。従って、球状単位たとえばタイチン様βバレルの好適部位にＤＮＴが結合すれば、疎水的にフォールディングした球状単位が不安定化し、それに伴いナノフィラメントＦ−Ｅ曲線に変化が生じると見込まれる。あるいは、ＤＮＴを還元する酵素すなわち球状タンパク質はそのレドックス補欠分子族を酸化させよう。補欠分子族の酸化はＴｔ値を変化させるので、この効果を利用すれば目的の分析物をＡＦＭで検出することが可能になる。
【０１１０】
最も単純な試験構築体にバイオエラストマー（ＢＥ）−球状タンパク質（ＧＰ）−バイオエラストマー（ＢＥ）がある。２個の同じバイオエラストマー部分は第２Ａ及び２Ｂ図のような単純単調な曲線を示し、１個の球状タンパク質は特有の鋸歯パターンを示すであろうが、この鋸歯パターンは歯が１個だけの場合も、もっと複雑なパターンを示す（１以上のドメインが別々に折りたたまれている）場合もあろう。この種の構築体がセンサーとして使用できるのは、分析物の結合により遊離球状タンパク質の特徴として認められるパターンが変化するからである。最初に立証されそうなのはキナーゼ認識部位である。
【０１１１】
２つのアプローチが考えられよう。１つは本来的にキナーゼ認識部位を含む小さな球状タンパク質たとえば配列ＲＧＹＳＬＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）をもつリゾチームの使用であろう。別のアプローチは細胞接着部位たとえばＧＲＧＤＳＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）細胞接着部位をキナーゼ認識部位たとえばＲＧＹＳＬＧに置き換えることであろう。前述のように、ポリ（ＧＶＧＩＰ） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２］配列中のＲＧＹＳＬＧ配列はＴｔ値を劇的にシフトさせ、疎水的アンフォールディングを促すが、その除去は疎水的フォールディングを促す（Ｐａｔｔａｎａｉｋ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １７８：５３９−５４５， １９９１）。
【０１１２】
第６図はＦ−Ｅ曲線の模式図であり、曲線Ａは第２Ａ及び２Ｂ図のバイオエラストマー（ＢＥ）の単一ストランドに対応する。第６図の曲線ＢはＢＥ−ＧＰ−ＢＥのＦ−Ｅ曲線であり、ＧＰは小アンフォールディング力と大アンフォールディング力の２個のフォールディングドメインをもつリゾチームなどのような球状タンパク質である。曲線Ｃは仮想例であり、分析物の結合たとえばリゾチームの場合にはリン酸化により、弱いドメインは完全にアンフォールディングし、また強いドメインのアンフォールディング力は低下する。
【０１１３】
本書で言及した諸々の公報及び特許出願は参照指示により本書に組み込まれ、その効果は各個別公報又は出願が引用の場に明確かつ個別に参照指示により組み込まれる旨を記したのと同じとする。本発明を説明し尽くした今、その精神又は範囲から逸脱することなく数多くの変更や修正を加えうることが当業者には明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＴｔベースの分子マシンがなしうる種々のペアワイズ・エネルギー変換の図解である。これはタンパク質のフォールディングと機能のためのＴｔ疎水性変化系列を表わす。
【図２】第２Ａ−２Ｃ図は単一鎖Ｆ−Ｅ曲線である。第２Ａ図は２５１ステップの（最も合理的な特定鎖長は５０２ステップ）の希釈及び超希釈Ｃ（ＧＶＧＶＰ）ｎＣに関するＦ−Ｅ曲線である。（ＧＶＧＶＰ）ｎはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、式中ｎは２５１〜１００４の整数、Ｃは単一鎖両末端のシステイン残基である。第２Ｂ図は超希釈（ＧＶＧＩＰ）ｎ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； 式中ｎは２６０〜１２８０の整数）に関するＦ−Ｅ曲線であり、第２Ｃ図は疎水性鎖間相互作用が存在する場合の希釈（ＧＶＧＩＰ）ｎに関するＦ−Ｅ曲線である。
【図３】第３Ａ−３Ｇ図はＮＭＲ、電子顕微鏡、計算処理及び結晶構造データを基礎とするポリ（ＧＶＧＶＰ） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］の分子構造を示す。その基本単位は第３Ｇ図に示すβスパイラルのツイストフィラメントであると考えられる。第３Ａ図はＰｒｏ−Ｇｌｙ挿入βターンをもつ延伸鎖の略図である。第３Ｂ図は、環状類縁体のシクロ（ＧＶＧＶＰ）３ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝３］の結晶構造によって確認されたβターンの詳細である。第３Ｃ図は、ポリペンタペプチド・バイオエラストマーβスパイラルと同じ大きさのらせんの模式図である。第３Ｄ図は該βスパイラルの帯模式図であり、βターンがらせん巻き間のスペーサーとなっている。第３Ｅ及び３Ｆ図は結合の詳細を示すステレオ図であり、βターンとβターン間に吊り下がったセグメント、それにβスパイラル内の水占有空間とを示す。第３Ｅ図は側面ステレオ図であり、第３Ｆ図は軸ステレオ図である。
【図４】第４Ａ及び４Ｂ図は（ＧＶＧＶＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１］の３ストランド・ツイストフィラメントの模式図である。第４Ａ図： フィラメントの各末端でケンプ三酸が３本のストランドを保持しており、また各ストランドの両末端にはシステイン残基を付加し原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）実験で用いる金めっき表面に結合しうるようにしてある。第４Ｂ図： Ｒは一連のリシン残基などに見られるアミノ基又は一連のグルタミン酸残基などなどに見られるカルボキシル基を表わす。
【図５】第５Ａ−５Ｃ図はアミノ酸配列の制御が３ストランド・ツイストフィラメントの形成を導く仕組みを示す。第５Ａ及び５Ｂ図は、油様Ｒ基を酢様Ｒ基から分け隔てるフォールディングβスパイラル構造を示す。第５Ａ図は両側に分かれた油様残基と酢様残基を示し、また第５Ｂ図はツイストフィラメントの油様側を示す。第５Ｃ図は油様残基を疎水的に埋め込んでいる会合フォールディング鎖の軸方向断面であり、中央の油様Ｒ基がその周辺の酢様残基と水から隔離されている。
【図６】第６図は、分析物と単一球状タンパク質（ＧＰ）の相互作用の効果を示す仮想Ｆ−Ｈプロフィールである。曲線Ａはバイオエラストマー（ＢＥ）の単一ストランドに対応する。曲線Ｂは、間に２個の疎水的にフォールディングしたドメインからなる球状タンパク質を挟んだＢＥ−ＧＰ−ＢＥに対応する。曲線Ｃは、「曲線Ｂ」プラス「ＧＰの２個の疎水的にフォールディングしたドメインのうちの１個をアンフォールディングさせる結果となる、該ドメインと既に結合し分析物」に対応する。
【図７】第７図は２０Ｍｒａｄ γ線架橋（ＧＶＧＩＰ）２６０［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝２６０］の吸音データであり、疎水的フォールディング及び集成の逆温度転移の始点の下から上へと温度が上昇すると周波数レンジに限定された機械的共振が増大することを示す。２つの重なりピークが観察されるが、それらはらせん構造の光吸収から類推すると、らせん（βスパイラル）軸に平行及び垂直な、機械的共振の分解成分であるかもしれない。この機械的共振は、高分子の別の機能性に作用する別の自由エネルギー強度変数により誘発された（フォールディング、又はアンフォールディング）状態の変化をモニターする手段をもたらす。
技術分野
本発明はナノマシン及びバイオセンサーとしての使用に好適なバイオエラストマーの設計に関する。
【０００２】
背景
ここで「バイオエラストマー」と呼ぶ弾性タンパク質系高分子すなわち生体弾性高分子はしばしば、ノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰返しペプチド単量体単位を含み、該単量体単位は一連のβターンを形成し一連のβターンは該βターン間に吊り下がった動的架橋セグメントで仕切られると説明される。これらのバイオエラストマーは、天然ゴムや合成類縁体などのようなランダム鎖網エラストマーから調製される材料と違い、その構造要素が明確に定義されるため特定の物性をもつように設計、合成することが可能であり、制御性に劣る物性に依存する必要がないため多種多様な用途に好適である。
【０００３】
バイオエラストマーはミリメートル・スケールではすでに６つの強度変数すなわち機械力、温度、圧力、化学ポテンシャル、電気化学ポテンシャル及び電磁放射線が絡む多様な形態のペアワイズ自由エネルギー変換の実行を目的に設計されてきた。バイオエラストマーは、機械仕事の実行を可能にするペアワイズ・エネルギー変換がナノメートル・スケールで行われうるように、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して設計するのが望ましいであろう。
【０００４】
こうした取り組みの狙いは一般的なマイクロ電気化学系（ＭＥＭＳ）のスケールを千分の一に縮小し、また既に開発されている目視観測可能なエネルギー変換型の架橋エラストマーマトリックスのスケールを百万分の一にすることである。その機は熟している。理由は次のとおりである： （１）今日では、ＤＮＡ、多糖、タイチンなどのタンパク質及びポリエチレングリコールで既に立証済みの単一鎖Ｆ−Ｅ （張力−伸び）研究がＡＦＭを使用して行える；（２）今日では、弾性タンパク質系高分子の２組成物について単一鎖Ｆ−Ｅ曲線が得られる；（３）今日では、マクロ（ミリメートル）スケールで既に立証済みの設計バイオエラストマーによる機械仕事の実行を伴う自由エネルギー変換がナノスケールでも現実味を帯びてきた；また（４）取り組みの成果はこれらの生体分子マシンの感度を著しく高め、その潜在用途分野を拡大することになろう。
【０００５】
本発明はバイオエラストマーの使用により上記の課題に応えるための組成物と方法を提供する。開示の方法と組成物により応答時間はミリ秒レンジまで短縮しうるが、いっそうの短縮も可能であるし、また測定可能な長さの変化は１ナノメートル未満となり、測定可能な力の変化は１０ピコニュートン（ｐＮ）レンジとなる。バイオセンサーによる一分子事象の検出も今日では現実味を帯びている。たとえば適当な弾性ポリペプチドと直列をなす疎水的にフォールディングした球状タンパク質上のある部位への一神経ガス分子又は他の重要な分析物の結合を、そうした弾性ナノフィラメント構築体に対応する張力−長さプロフィールの変化から検出することも夢ではない。
【０００６】
発明の概要
本発明の一態様は、ナノマシンとして有用なバイオエラストマーの設計に関する。
本発明の別の態様はノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰返しペプチド単量体単位をもつバイオエラストマーを含むナノマシンであって、該単量体単位が一連のβ−ターンを形成し、一連のβ−ターンはβ−ターン間に吊り下がった動的架橋セグメントで仕切られているナノマシンに関する。
【０００７】
本発明の更に別の態様は、ナノパーティクル又は多ストランド・ナノフィラメントという形のバイオエラストマーを含むナノマシンに関する。
本発明の更に別の態様は、バイオエラストマー鎖と直列をなし、結合部位をもつ単一球状ドメインであって、該結合部位への分析物の結合が疎水的にフォールディングした該球状ドメインを、同等の伸び率にも関わらず異なる（より高い又はより低い）レベルの力でアンフォールディングさせる単一球状ドメインに関する。
【０００８】
個別実施態様の説明
本発明はナノマシン及びバイオセンサーとして有用な幅約５ｎｍ、長さ数百ｎｍという寸法のバイオエラストマー並びにそうしたバイオエラストマーの設計方法に関する。一般に本発明のナノマシン及びバイオセンサーは、生体弾性ノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰返しペプチド単量体単位をもつバイオエラストマーを含む。該バイオエラストマーはナノパーティクル又は多ストランド・ナノフィラメントという形をとる。これらの多様な多ストランド・ナノフィラメントは設計次第でナノケモメカニカル系（ＮＣＭＳ）、ナノエレクトロメカニカル系（ＮＥＭＳ）、ナノバロメカニカル系、ナノサーモメカニカル系及びナノホトメカニカル系（いずれも第１図に記載）として、またナノ電磁放射線駆動機械系（ＮＥＭＲＤＭＳ）として、さらに化学種たとえば神経ガス、ＴＮＴ、ＤＮＴなどの存在を検出するためのバイオセンサーとして、機能させることができる。たとえば極性分析物が結合すると、疎水的フォールディングの転移温度Ｔｔが使用温度の下から上へと上昇し、その結果としてアンフォールディングを招き、張力−長さプロフィールにＡＦＭで測定可能な変化が、又は長さが固定されている場合には平行吸音成分に強度の変化が、もたらされる。さらに、多ストランド・ツイストナノフィラメントではなく、折り返した単一鎖でナノマシン又はバイオセンサーを形成し、第２Ｃ図に示すようなＦ−Ｅプロフィールの張力のピーク到達又は増大を強制的アンフォールディングでもたらすようにすることもできる。また球状タンパク質部分に酵素認識部位たとえばキナーゼ認識部位をもたせ、リン酸化により該部位が疎水的にフォールディングした球状ドメインを、第６図に示すように、より低レベルの力でアンフォールディングさせるようにすることも可能であろう。
【０００９】
本発明は、いくつかのペアワイズ・エネルギー変換をナノスケールで実現しうるようなバイオエラストマーの、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）の使用による設計に関する。これを実現するためにまず、長さが約１０，０００残基の、より一般的には約２０００残基の、１以上の同じタンパク質系高分子ストランドを、その各末端に二酸、三酸及び四酸たとえばアジピン酸（ヘキサン二酸）、ケンプ三酸（第４Ａ図に記載）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を導入して集成する。次に、得られた単ストランド又は多ストランドのツイストナノフィラメントをカンチレバーと基板の間に吊るが、その際の結合には多酸末端に導入したシステイン残基硫黄を用いる。一般にこの結合は、カンチレバー探針と基板表面（どちらも金などの好適材料で被覆するのが好ましい）に対して行う。カンチレバーと基板への結合手段としては、システイン残基のＳＨ基の代わりに他の官能基たとえばアミノ基、カルボキシル基などを用いてもよい。
【００１０】
本発明の一実施態様では、該カンチレバーはバイオエラストマーにより吸収される振動エネルギーを検知する。これを図解したのが第７図である。
バイオエラストマーだけのナノマシンを使用するときは、１００残基ごとに官能基１個又は数個を変化させるだけで完全収縮状態の多ストランド・フィラメントを完全にほぐし、所定の力で長さを数百ナノメートルも変化させることができる。官能基の変化はたとえば３０〜５００アミノ酸残につき、基一般には約１００残基につき１セリン残基のリン酸化； ２０〜２００アミノ酸残基につき、一般には約１００残基につき２側鎖カルボキシル基のイオン化； 又は２０〜２００アミノ酸残基につき、一般には約１００残基につき２結合レドックス官能基 （たとえばＮ−メチルニコチンアミド）の酸化などであろう。ＡＦＭ実験に由来する単一鎖Ｆ−Ｅ曲線は、疎水的にフォールディングした個別球状タンパク質のアンフォールディングに関する張力−長さプロフィールを１０ｐＮ及びｎｍ感度で示すことができる。疎水的にフォールディングした単一球状タンパク質と直列をなすバイオエラストマーと組み合せてＡＦＭを使用すると、該球状タンパク質上の特定部位への一分子の結合を、アンフォールディングに関する張力プロフィールの変化から、選択的に検出するという究極の可能性が開けてくる。
【００１１】
これらの弾性タンパク質系高分子は、約１０１５Ｈｚ（サイクル毎秒）の高周波レンジから１０Ｈｚの低周波までの著しく広い周波数レンジの電磁スペクトルにわたるエネルギー入力の検知又はエネルギー出力の供給が可能である。一般的な周波数は１０〜１０５Ｈｚ、より一般的には１０２〜１０４Ｈｚのレンジ内であろう。高周波レンジでは、光の吸収に伴いその疎水性を変化させる多様な発色団が存在する。誘電緩和スペクトルの５ＧＨｚ中周波レンジでは、疎水性水和の吸収が見られる。やはり誘電緩和スペクトルの５ｋＨｚ中周波レンジでは、疎水的にフォールディングした集成状態の構造的共振が存在する。また１ｋＨｚ近傍の誘電緩和、吸音両スペクトルの低周波レンジでは、機械的共振が存在する。なお第７図に示す１ｋＨｚ近傍の機械的共振は機械力の強度変数を導入する手段として最良と考えられよう。これらの吸収過程はそれぞれ高分子系へのエネルギー入力手段として、系を変化させることが、又は別のエネルギー入力に由来する系の変化に起因するエネルギー出力の変化を表すことができる。たとえば伸びを固定したＡＦＭ単一鎖（又は単一ツイストフィラメント）実験では、フォールディング状態の変化に起因する張力の変化は、第７図に示す（強度変数は温度）ように、機械的共振の強度変化を伴うであろう。高分子の応答を誘発する（たとえば第１図に示すような）任意の自由エネルギー強度変数の導入に由来するツイストフィラメントのフォールディング状態の変化を検出するには、様々な方法がある。たとえば第７図の機械的共振の平行成分の強度変化は高分子のフォールディング状態を変化させた自由エネルギー入力の変化を検出する手段をもたらすので、該エネルギー入力と機械的共振の変化によるその検出とを組み合せれば自由エネルギー変換器が得られよう。
【００１２】
本発明の方法と組成物をさらに詳述する前に、Ｕｒｒｙ， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， １０１：１１００７−１１０２８， １９９７の検討主題であるマクロスコピックなバイオエラストマー分子マシンを理解しておくことが重要である。若干の重要領域すなわちΔＴｔ機構（タンパク質などのような両親媒性高分子の疎水的フォールディング及び集成の温度制御）、ΔＴｔ機構による自由エネルギー変換、及びΔＴｔ機構の物理的な基本原理（水和の無極性−極性反発自由エネルギー）をここでまとめておこう。さらに、天然弾性タンパク質のＡＦＭ単一鎖Ｆ−Ｅ曲線もまた、本発明の範囲を理解するための有益な情報を提供してくれる。この立証済みのマクロスコピックな自由エネルギー変換はＡＦＭを利用することによりナノスコピックな自由エネルギー変換となりうる。そのデータは単一ナノフィラメントＦ−Ｅ曲線の形をとるだろう。その成果はナノマシンたとえばナノエレクトロメカニカル系となる可能性がある。
【００１３】
ΔＴｔ機構（タンパク質やタンパク質系高分子などのような両親媒性高分子の疎水的フォールディング及び集成の温度制御）
Ａ． Ｔｔの定義と逆温度転移
目的のバイオエラストマーは極性（たとえば荷電）部分と無極性（疎水性）部分が均衡を保っている結果として、低温では可溶性であり温度が上昇すると疎水的に折りたたまれ集成する。この疎水的凝集の開始温度をＴｔとする。環状類縁体は温度の上昇に伴い結晶化し、温度の低下に伴い溶液中に再溶解して再びランダムに分散することが既に示されている。さらに巨視的には、分子量の大きい線状高分子は相分離を起こし、また分子レベルで集成して会合ツイストフィラメントを形成することがネガティブ染色顕微鏡写真などで確認されている。
【００１４】
温度の上昇に伴い系のポリペプチド部分の秩序が明らかに増すことから、これは逆温度転移（ｉｎｖｅｒｓｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）と呼ばれてきた。似た用語にタンパク質の低温変性や両親媒性石油系高分子の下部臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）があるが、他の用語よりも一般的、説明的であるため逆温度転移という用語を使用する。たとえばＬＣＳＴは個別球状タンパク質の疎水的フォールディングとは無関係だし、また低温変性にしても立体構造の著しい変化を伴わない結晶の溶解とは無関係である。それにもかかわらずどの場合にも同じ過程すなわち疎水性相互作用とその結果としての系の高分子成分のエントロピーの変化が見られ。タンパク質系高分子の逆温度転移と石油系高分子たとえばポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）［ＰＮＩＰＡＭ］のＬＣＳＴにはもう１つ大きな違いがある。ＰＮＩＰＡＭでは３４℃で相分離が起るが、転移は含水率約３０重量％の無秩序状態に向かう。Ｇｒｉｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ．， “Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｖｏｌｕｍｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ） Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ． １． Ｄｙｎａｍｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ（高感度示差走査マイクロ熱量測定によるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ヒドロゲルの熱体積相転移の研究。１． 動的効果）” ［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：１４７１−１４７５， １９９９］を参照。他方、目的のタンパク質系高分子たとえばポリ（ＧＶＧＶＰ） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］では２５℃で相転移が始まり、含水率６３重量％の構造化βスパイラル状態が形成される。このβスパイラル状態が含水率約３０重量％の無秩序状態へと変性するのは温度が６０℃超に達した後にすぎない。
【００１５】
Ｂ． 多数のＴｔ値制御手段
Ｔｔ値はいくつかの因子に依存する。たとえばｉ）高分子の濃度、ｉｉ）高分子の鎖長、ｉｉｉ）高分子のアミノ酸組成、ｉｖ）塩濃度たとえばＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ （離液）系列、ｖ）有機の溶質及び溶媒、ｖｉ）高分子側鎖のイオン化、ｖｉｉ）高分子側鎖の化学修飾たとえばリン酸化、窒化、硫酸化及びグリコシル化、ｖｉｉｉ）圧力（芳香族残基の特殊な役割）、ｉｘ）高分子に結合した補欠分子族たとえばＮ−メチルニコチンアミド（ＮＭｅＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のレドックス状態、ｘ）高分子に結合した補欠分子族たとえばアゾベンゼン及びシンナミドによる光の吸収、又は１０Ｈｚ〜１０１５Ｈｚレンジの他の任意適切な周波数の電磁スペクトルの吸収、及びｘｉ）イオン対合による側鎖電荷の中性化、たとえば陰イオン側鎖の陽イオン中性化、陽イオン側鎖の陰イオン中性化及び鎖内又は鎖間のイオン対合。以上の因子リストはそのまま、種々の自由エネルギー変換の実現を可能にするＴｔ値制御手段のリストとなる。逆温度転移点Ｔｔのこうした依存関係はＵｒｒｙ， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， １０１：１１００７−１１０２８， １９９７に記載されている。
【００１６】
Ｃ． Ｔｔを基礎とする疎水性尺度
前記の特に有用なＴｔ値制御手段の１つにアミノ酸組成と側鎖の化学修飾の効果がある。このデータはタンパク質工学にとって特に重要なＴｔベース疎水性尺度としてまとめられており、第１Ａ及び１Ｂ表に示すとおりである。これらの表はタンパク質工学向けの、ポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｘ（ＧＸ１ＧＶＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３； 式中Ｘ１は任意の天然アミノ酸又はその化学修飾体である）に関するＴｔベース疎水性尺度並びに逆温度転移に関するΔＨｔ及びΔＳｔ値を記載している。
【００１７】
第１Ａ表
天然アミノ酸残基に関するＴｔベース疎水性尺度
【表１】
ａ Ｔｔはリン酸緩衝食塩水（０．１５Ｎ ＮａＣｌ， ０．０１Ｍリン酸塩）中での疎水的フォールディング及び集成転移に関する逆温度転移点であり、水中光散乱法及び示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）で求めた。試料はポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｘ（ＧＸ１ＧＶＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）であり、Ｔｔはｆｘ＝１へと線形に外挿し、５の倍数に丸めた。
ｂ Ｐｒｏに関する計算値ＴｔはＶａｌ及びＧｌｙの実験値が使用されるときはポリ（ＧＶＧＶＰ）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］に由来する。この−８℃という疎水性値は、Ｖａｌ１ ｉγＣＨ３と隣接Ｐｒｏ２ ｉδＣＨ２とらせん巻き間Ｐｒｏ２ ｉ＋３βＣＨ２部分との間に疎水性接触がある場合のβスパイラル構造に特有である。
ｃ ポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｐ（ＧＶＧＰＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）から求めた実験値。
ｄ ポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｘ（ＧＸ１ＧＶＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を使用しｆｘ＝１へと外挿して求めた、ＧＸ１ＧＶＰ五量体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、式中Ｘ１は該五量体のゲスト・アミノ酸残基で、任意の天然アミノ酸又はその化学修飾体とすることができる）モルあたり計算値。
ｅ ΔＨとΔＳはポリ｛ｆｖ（ＧＶＧＶＰ），ｆｘ（ＧＸ１ＧＶＰ）｝（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を使用しｆｘ＝１へと外挿して求めた、ＧＸ１ＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）モルあたり計算値。ΔＨとΔＳは、高分子の水中転移に関するＤＳＣで求めた吸熱的熱及びエントロピーの線形適合曲線上のｆｘ＝０．２に対応する値である。
【００１９】
第１Ｂ表
タンパク質の化学修飾体及び補欠分子族に関する
Ｔｔベース疎水性尺度
【表２】
ａ 通常の条件は４０ｍｇ／ｍｌ高分子、０．１５Ｎ ＮａＣｌ及び０．０１Ｍリン酸塩（ｐＨ ７．４）である。
ｂ ＮＭｅＮはリシル側鎖上のＮ−メチルニコチンアミド側基、すなわちＬｙｓのε−ＮＨ２にアミド結合で結合したＮ−メチルニコチネートであり、最も疎水性の高い還元状態はＮ−メチル−１，６−ジヒドロニコチンアミド、それに次ぐ還元状態はＮ−メチル−６−ＯＨ，１，４，５，６−テトラヒドロニコチンアミドである。
ｃ 酸化及び還元ニコチンアミド＝アデニンジヌクレオチドでは、条件は２．５ｍｇ／ｍｌ高分子、０．２Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ９．２）である。
ｄ 酸化及び還元Ｎ−メチルニコチンアミドでは、条件は５．０ｍｇ／ｍｌ高分子、０．１Ｍ炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ ９．５）、０．１Ｍ塩化カリウムである。
ｅ 高分子結合−Ｏ−ＳＯ３ＨのｐＫａは８．２である。
ｆ Ｔｙｒ（−Ｏ−ＮＯ２−）のｐＫａは７．２である。
【００２１】
Ｔｔ機構による自由エネルギー変換
第１図に示すように、Ｔｔ値の制御により、機械力、温度、化学ポテンシャル、圧力、電気化学ポテンシャル及び電磁放射線の各強度変数が絡む１５のペアワイズ自由エネルギー変換が可能となる。
【００２２】
Ａ． 第１種のＴｔベース分子マシン（分子エンジン）
分子エンジンは機械仕事の遂行を目的に設計される分子マシン、一般には高分子である。第１種のＴｔベース分子マシンは疎水的フォールディング及び集成転移を機械仕事の遂行に直接利用する。第１図のエネルギー入力はどれも頂点の機械仕事に帰着するが、様々なタイプの第１種Ｔｔベース分子マシンの例となろう。これらの分子エンジンはγ線照射架橋タンパク質系高分子の立体配置において、適当なエネルギー入力があると荷重を持ち上げるような、設計バイオエラストマーからなる厚さ１ｍｍ、幅数ｍｍの弾性バンドを形成することが既に立証されている。本発明はこの種の分子マシンのサイズをナノメートルレベルへと１００万分の１も縮小して特定のナノマシンを作製するようにする。
【００２３】
Ｂ． 第２種のＴｔベース分子マシン
第１図の異なるエネルギー入力に対して敏感な任意の２個の際立った官能基があり、各官能基が個別にＴｔ値を変化させて疎水的フォールディング及び集成を促すことにより機械仕事を遂行しうるとすれば、両官能基を同じ疎水的フォールディング及び集成ドメインの一部とすることにより互いにカップリングすることが可能である。
【００２４】
従って、第２種のＴｔベース分子マシンは、やはり疎水的フォールディング及び集成転移を利用することにより、機械仕事の遂行以外の自由エネルギー変換を実現する。これは第２表の原理４に該当する。第２表は、疎水的フォールディング及び集成の逆温度転移を起こしうるタンパク質系高分子に関するタンパク質工学向けの、様々な現象論的研究から導き出されたの５つの原理をまとめたものである。分子マシン機能設計への５原理の適用に関するＵｒｒｙ， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ （Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）， ４７：１６７−１７８， １９９８の説明をも参照。現象論的観察からだけでも多大の成果が得られるものの、こうした特性を最大限に活用してバイオエラストマーの構造と機能を制御するには、その根本にある物理的原理の理解が求められる。
【００２５】
第２表
原理１ ゲスト・アミノ酸残基又はその化学修飾体が疎水的フォールディング及び／又は集成の転移点Ｔｔを変化させる仕方はその疎水性の関数的な指標である。Ｔｔの低下は疎水性の上昇を、またＴｔの上昇は疎水性の低下を、それぞれ表わす。
原理２ 温度をＴｔの上に上げると結果的に疎水的フォールディング及び集成が起る。この原理を利用すれば荷重の持ち上げといった有用な機械仕事の実現が可能になる。これは熱機械的変換である。
原理３ 定温で、Ｔｔ値を使用温度の上から下へと引き下げても、すなわち第１Ａ及び１Ｂ表の多数の変数のうちの任意の変数により疎水性を高めても、やはり結果的に疎水的フォールディング及び集成が起る。これを利用すれば構造物の構築たとえば荷重の持ち上げなど有用な機械仕事の実現が可能になる。
原理４ 多数の変数［すなわちｉ）温度、ｉｉ）圧力、ｉｉｉ）化学種の濃度の変化、ｉｖ）生体補欠分子族のレドックス状態の変化、ｖ）光（及び構造を変化させる他の電磁スペクトル）誘起型の化学構造変化、及びｖｉ）吸音］のうちの異なる変数に敏感な任意の２個の際立った官能基があり、各官能基をＴｔ値の変更に利用してフォールディング及び集成に由来する機械仕事を遂行させることができるとすれば、両官能基は同じ疎水的フォールディング及び集成ドメインの一部とすることにより互いに結合させることができる。
原理５ 以上のエネルギー変換はより疎水的なドメインの影響下に行われるとより効率的であることが立証可能である。
【００２６】
Ｔｔ機構の物理的原理
（水和の無極性−極性反発自由エネルギー）
Ａ． Ｔｔベース疎水性尺度
第１Ａ及び１Ｂ表を調べると、ＣＨ２基又は芳香族基の付加などのように、より高い疎水性の導入はＴｔ値が低下させることが明らかとなる。疎水性は疎水性水和と関連するため、疎水性水和の増大はＴｔ値を低下させ、疎水性水和の減少はＴｔ値を上昇させるということになる。また第１Ａ及び１Ｂ表からは、電荷の形成がＴｔ値を上昇させることも認められよう。ここから、高分子鎖沿いに存在するよう疎水基により強いられた荷電基は疎水性水和量を減少させるかもしれないとの洞察がまず得られる。
【００２７】
Ｂ． 伸張誘起ｐＫａシフト、（∂μ／∂ｆ）ｎ＝ α＜０
無極性（疎水性）種と極性（たとえば荷電）種の間には水和をめぐる競合関係が存在するという最初の有無を言わさぬ主張は、実験的に立証された伸張誘起ｐＫａシフトに由来した。何より興味深いことに、Ｇｌｕ含有タンパク質系高分子のゴム状弾性バンドを伸張すると、側鎖カルボキシル基のｐＫａはカルボキシラート（ＣＯＯ−状態のカルボキシル基）の自由エネルギーの増大を反映して大きくなる。μを化学ポテンシャル、ｆを印加力、αをイオン化度とすると、これは一定の温度及び組成での偏導関数（∂μ／∂ｆ）Ｔ，ｎ＝ α ＝０．５＜０により、電荷−電荷反発の場合には（∂μ／∂ｆ）Ｔ，ｎ＝ α ＝０．５ ＞０により、それぞれ表わされる。
【００２８】
伸張に伴い疎水的にフォールディングした高分子が強制的に解きほぐされ、またゴム状弾性バンドの水和が、疎水性水和であるにもかかわらず増大する。弾性バンド中の付加水にもかかわらず、カルボキシラートの自由エネルギーは、あたかも該カルボキシラートが十分な水和を実現するのに困難をきたしているかのように、増大する。これはイオン化過程におけるカルボキシル基による疎水性水和水の構造破壊とも符合するので、ここから高分子の無極性種と極性種の間には水和をめぐる競合関係が存在するという主張が起る。
【００２９】
Ｃ． 疎水性誘起ｐＫａシフト
もしそうした競合関係が存在するとすれば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＬｙｓ残基を含む高分子の疎水性を高めるだけで、ｐＫａシフトを起こさせて、カルボキシラートのｐＫａを高くし、アミノ基のｐＫａを低くすることができるはずである。事実、そのとおりである。さらに、疎水性の段階ごとの上昇に比してｐＫａシフトのほうがより大きくなるという非線形性も存在する。これは高分子の疎水性を高める多様な方法を用いて既に立証されている。実際、ナノレベルでの設計によって、ｐＫａ値を制御したり、官能基を利用する諸々の自由エネルギー変換を実現したりすることはごく普通に可能である。
【００３０】
Ｄ． イオン化度上昇に起因する逆温度転移熱の減少
示差操作熱量測定法（ＤＳＣ）によれば、イオン化度の上昇は逆温度転移熱を著しく減少させることがわかる。１００残基につき２個のカルボキシラートで転移熱を、すべてのＧｌｕ残基が非荷電カルボキシル基のままの場合の転移熱の４分の１に減少させることができる。ポリ（ＧＶＧＶＰ）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］の逆温度転移に伴う二次構造の変化は全く見らず、また疎水性水和は発熱的である以上、この吸熱的転移熱は疎水性水和水を構造破壊する主役であると言える。この吸熱的転移熱が疎水性会合の前に存在していた量の疎水性水和を構造破壊するための所要熱である限りで、これは電荷が疎水性水和を実際に構造破壊することを示唆しよう。
【００３１】
Ｅ． マイクロ波誘電緩和による疎水性水和の直接観察
無極性基と極性基という２種類の基が鎖状配列沿いに共存するよう強いられている高分子では無極性基と極性基の間に水和をめぐる競合関係が存在するという主張は、マイクロ波誘電緩和データを用いて既成事実化される。疎水性水和は５ＧＨｚ付近で緩和を示すが、全水の百分率として定量化することができる。この水和は疎水性残基の増加に伴って増大し、疎水的フォールディング及び集成とともに消滅し、また物理的原理の検証にとって最も重要なことに、ｐＨの上昇に伴いカルボキシル基のイオン化が始まると減少する。調べた一連のタンパク質系高分子では１００残基あたり２個未満のカルボキシラートで３分の２の水和を失わせる。こうして、荷電種とＶａｌ及びＰｈｅ残基の疎水性側鎖の間の水和をめぐる競合関係が直接立証された。この種の競合関係は水和の無極性−極性反発自由エネルギーとして説明されよう。
【００３２】
Ｆ． Ｔｔ値を決定する疎水性水和量
以上で明らかなのは疎水性水和の増大とＴｔ値低下の関係である。（ＧＶＧＩＰ）２６１［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ−２６１］の濃度を４０ｍｇ／ｍｌから１０００ｍｇ／ ｍｌへと高めながらＴｔ値と水和量を比較すると、ＤＳＣで求められるＴｔ値とマイクロ波領域の誘電緩和で測定される疎水性水和量の間に線形に近い関係が見い出された。従って、疎水的フォールディング及び集成転移と両親媒性高分子の機能とは疎水性水和量で制御されるとの見通しが強まる。
【００３３】
天然弾性タンパク質と合成バイオエラストマーに関する、ＡＦＭで求めた単一鎖Ｆ−Ｅデータ
Ａ． タイチン及びタイチン成分に関する単一鎖研究
単一鎖の３００万Ｄａタンパク質であるタイチン（コネクチン）について、ＡＦＭを用いて応力−ひずみ曲線を求めた。このタンパク質は大部分が９０〜１００残基の繰返し配列であるが、骨格筋の２０００超残基配列に相当する２２〜２６残基の繰返し配列をも含む。要するにタイチンはタンパク質系高分子であり、既知結晶構造の繰返しペプチド配列からなる。タイチンは、リシーディングメニスカス（ｒｅｃｅｄｉｎｇ ｍｅｎｉｓｃｕｓ）で生じる張力を用いて分子コーミングすると、幅４ｎｍ、長さ１０００ｎｍ超の線状分子を形成する（Ｔｓｋｈｏｖｒｅｂｏａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６５：１００−１０６， １９９７を参照）。
【００３４】
このＡＦＭ実験では、単一鎖の一端をカンチレバー探針（チップ）に、多端を基板表面に結合する。張力は鎖長の関数として測定するが、数ｐＮ／鎖の張力がすでにエントロピー弾性域にわたって求められている（Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ＡｖＨ−Ｍａｇａｚｉｎ， ７１：１１−１８， １９９８を参照）。従って、今日ではエントロピー弾性はランダム鎖網や端間鎖長のランダム又はガウス分布を伴うことなく起りうることが立証されている。これは過去半世紀にわたってエントロピー弾性に関する教示を支配してきた古典的なゴム弾性理論を否定するものである。
【００３５】
前記の９０〜１００残基配列には一般に２タイプがある。いわゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインとフィブロネクチンＩＩＩ （Ｆｎ３）ドメインであり、それぞれ疎水的にフォールディングした類似のβバレルを形成する。これらの類似βバレルは個別にアンフォールディングさせることができ、またこれらの相同球状タンパク質の組成の小さな差異に由来する異なる臨界アンフォールディング力を示す。Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（ＡｖＨ−Ｍａｇａｚｉｎ， ７１：１１−１８， １９９８）及びＲｉｅｆ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７５：３００８−３０１４，１９９８）はそれぞれ一連のＩＧ βバレル及びＣｏｎＦｎ βバレルのアンフォールディングを示す曲線を提供しているが、いずれの曲線でも長さとアンフォールディング力の特徴的な増大が見られる。これらの臨界アンフォールディング力は延伸速度と共に変化し、ごく低速の延伸では基本弾性力にまで低下する。重要なことに、ＣｏｎＩｇ構築体とＴｅｎＦｎ （テネイシンフィブロネクチン）ドメインに関する同等実験条件下のアンフォールディング力は２３７ｐＮ （ＣｏｎＩｇ）〜１１３ｐＮ （ＴｅｎＦｎ）であり、ドメインのアンフォールディングに伴い長さの特徴的な増大が見られる。
【００３６】
相同球状タンパク質のアンフォールディングに際してのアンフォールディング力の小さな差異と長さの変化に関するＡＦＭの検出能は本発明に関わる。アンフォールディング力の検出感度は±１０ｐＮであるが、９０残基球状ドメインの小さな組成差異はずっと大きなアンフォールディング力差異（±１００ｐＮ）を招く。本発明は、結合部位を有する単一の疎水的にフォールディングした球状タンパク質を弾性タンパク質系高分子鎖と直列にして提供するが、該結合部位は結合相手に占有されるとアンフォールディング状態とフォールディング状態との均衡を、及び／又は適切な延伸速度で実施したときに長さの増大を伴うアンフォールディングが起る力を、変化させる。
【００３７】
Ｂ． バイオエラストマーに関する予備的な単一鎖研究
バイオエラストマーの｛（ＧＶＧＶＰ）ｎ｝ｍ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１； ｍ≧２］及び｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０； ｍ≧２］を次の要領で調製した。タンパク質系高分子の（ＧＶＧＶＰ）２５１と（ＧＶＧＩＰ）３２０を各形質転換Ｅ． ｃｏｌｉの発酵で産生させ分離した。得られた遺伝子産物を高レベルに精製し、繰返し配列を１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲで、また鎖長をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で、それぞれ検証した。発現した２５１量体を、ＥＤＣＩを用いて重合させ、生成物が２５１量体の多量体となるようにし、また３２０量体も同様に重合させた。実質的にすべての分子がさらに大きな高分子と化したことをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。２５１量体と３２０量体に対応するバンドはもはや見られず、さらに大きな分子量の高分子が得られたが、それらの高分子は２５１量体と３２０量体の分離に使用されるゲルにはほとんど浸透できなかった。次に、こうして得られた多量体すなわち（ＧＶＧＶＰ）ｎ｝ｍ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１； ｍ≧２］及び｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０； ｍ≧２］の両端にシステイン残基を付加した。要するに、２５１量体又は３２０量体のランダム化学重合で得られた高分子鎖の両端にシステイン残基を付加した。
【００３８】
第２Ａ−２Ｃ図に関する実験条件は水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）から金めっきガラススライド上への物理吸着とＰＢＳ中での金めっき標準窒化ケイ素カンチレバー探針の使用によるその測定であった。高分子は、複数の分子鎖がピックアップされるのを防ぐために、短鎖（≦５０００ＭＷ）のチオール化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で希釈した。これによりバイオエラストマー鎖を表面に分散させ、単一鎖がカンチレバー探針でピックアップされる可能性を高めることができた。第２Ａ及び２Ｂ図に示したのは、Ｃｙｓ（ＧＶＧＶＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１； ｍ≧２］及びＣｙｓ｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０； ｍ≧２］に関する単一鎖Ｆ−Ｅ曲線である。Ｆ−Ｅ曲線の「長さ」は高分子全体の外形の長さではなく延伸部分の長さを反映するものの、観測された７００ｎｍ程度の破断長さはｎ値が２の場合なら適切であろう。
【００３９】
第２Ａ及び２Ｂ図の曲線は、Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（ＡｖＨ−Ｍａｇａｚｉｎ， ７１：１１−１８， １９９８）及びＲｉｅｆ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７５：３００８−３０１４， １９９８） でタイチン・ドメインの弾性挙動の適合に使用されたのと同様のワームライク鎖（ｗｏｒｍ−ｌｉｋｅ ｃｈａｉｎ， ＷＬＣ）モデルに適合した。ＷＬＣモデルは数百ｎＰまでの範囲でうまく機能した。その適合度はタイチンに関する先行研究結果とよく合致したが、適合した持続長はＧＶＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）では０．９ｎｍ、ＧＶＧＩＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）では１．０ｎｍであり、Ｉｇ又はタイチンの場合より長いので、単一鎖としてのバイオエラストマーはタイチンよりも「柔らかい」ことがうかがえる。
【００４０】
より疎水性の高いＣｙｓ｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０； ｍ≧２］に関する第２Ｃ図のデータはヒステリシスを示したが、これは超希釈条件下では観測されなかった。このヒステリシスは、一見延伸で強いられた疎水的なアンフォールディングに起因するが、一本鎖の折り返りよりもむしろ分子間凝集に起因していたのかもしれない。本発明では規則的な多ストランド・ツイストフィラメントの共有結合構築体を用いるが、そこでは延伸で強いられた疎水的アンフォールディングはもっと一様な、再現性の高いＦ−Ｅ曲線を示すものと見込まれる。本発明はまた、折り返り部分を好ましい長さに形成させるような溶媒中での（たとえば分子内イオン対合などを目的とした）配列周期性制御及び成分制御下に単一鎖の折り返りを制御して３−ストランドのセグメントを形成させることを見込む。
【００４１】
本発明のナノマシンは、ＧＶＧＶＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）タイプの五量体ファミリーを基礎にしたバイオエラストマーの分子構造を利用して設計される。この五量体ファミリーでは、第１Ａ及び１Ｂ表に示したような分子構造と逆温度（相）転移の基本的性質を保持したままで２個のＶａｌ残基の置換が可能である。相分離の凝集及びその結果としての分子構造の形成は濃度に依存するため、分子内及び分子間疎水性相互作用を基礎に形成される基本的機能単位すなわちツイストナノフィラメント（後述）をナノレベルで実現することが課題となる。これを用いれば、ミリメートル・スケールで既に立証されている機械仕事の遂行を目的とした諸々のエネルギー変換をナノメートル・スケールで捕えることができる。従って、これを用いて鎖あたり一球状タンパク質をツイストナノフィラメント中に組み込めば、酵素並みの特異性と選択性をそっくり発揮させることができる。従ってナノフィラメント上の官能基の状態の変化又は分析物と球状タンパク質との選択的相互作用を基礎とする変化を伴うＦ−Ｅ曲線の変化から分子事象が検出されることになる。
【００４２】
本発明の方法と組成物の説明に戻る前に、バイオエラストマーを一般的に理解しておくことが重要である。
【００４３】
材料
バイオエラストマーは後述の多数の特許で既に特性記述され開示されている。バイオエラストマーを定義する１つの方法はペプチド配列群について説明することである。これらの材料はイオン性アミノ酸残基（後述の目的に使用）を含む場合も含まない場合もある。特にこれらの材料は式αＰρΩＧ又はαＰθδで示される繰返し単位を含むものとして説明されよう： 式中Ｐはペプチド形成Ｌ−プロリン残基である； Ｇはペプチド形成グリシン残基である； αはペプチド形成Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン残基、又はイオン性ペプチド形成残基（Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ残基及び他のイオン性ペプチド形成Ｌ−アミノ酸からなる群より選択される）である； ρはペプチド形成グリシン残基又はペプチド形成Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｔｙｒ残基又は（随意に）弾性重合体繰返し単位用の他のイオン性ペプチド形成Ｄ−アミノ酸もしくは弾性形成繰返し単位用の任意のＬ−アミノ酸である； Ωはペプチド形成Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン残基又は（随意に）イオン性ペプチド形成Ｌ−アミノ酸もしくは他の任意の天然アミノ酸残基である； δはペプチド形成グリシン残基又はペプチド形成Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｔｙｒ残基又は（随意に）別のイオン性ペプチド形成Ｄ−アミノ酸である； またｄはペプチド形成グリシン残基又はペプチド形成Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒ残基又は（随意に）別のイオン性ペプチド形成Ｌ−アミノ酸もしくは他の任意の天然アミノ酸残基である。
【００４４】
これらの人工又は合成バイオエラストマーの例はたとえば次の特許で開示されている：米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．）第４，１３２， ７４６号（ＶＰＧＶＧ及び変異体）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５］；米国特許（Ｕｒｒｙ）第４，５００，７００号、４，８９８，９２６号、５，５２７，６１０号及び５，３３６，２５６号（いずれもテトラペプチド及びペタンペプチド繰返し単位を開示）；米国特許（Ｕｒｒｙ）第４，５８９，８８２号（架橋）；米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．）第４，７８３，５２３号（ＩＰＧＶＧ及び変異体）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６］；米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．）第４，８７０，０５５号（六量体の包含）； 米国特許 （Ｕｒｒｙ） 第５，０６４，４３０号（ノナペプチド繰返し単位）； 米国特許（Ｕｒｒｙ）第５，２５０，５１６号（逆温度転移）； 米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．） 第５，８５４，３８７号（精製）； 及び米国特許（Ｕｒｒｙ）第５，９００，４０５号。以上の特許はすべて参照指示により本書に組み込まれる。
【００４５】
米国出願（Ｕｒｒｙ）Ｎｏ．０９／７４６，３７１， “Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ”では、これらの人工又は合成バイオエラストマーの追加例が、ある種のナノマシン応用分野に関連する特殊な吸音特性を有するものとして開示されている。これも参照指示により本書に組み込まれる。
本書に組み込まれる前記特許では、多数のバイオエラストマーが開示されている。それらの特許はナノマシンに関するものではないが、本書で開示する使用にとって有益な構造的特徴を実現するうえで重要なバイオエラストマー製造に関する指針を与えてくれる。
【００４６】
本発明の方法への使用に好適なバイオエラストマーを説明するもう１つの方法は、疎水性アミノ酸残基及びグリシン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基を含む生体弾性テトラペプチド、ペンタペプチド及びノナペプチド単位からなる群より選択される繰返しエラストマーペプチド単量体単位を含む高分子としてバイオエラストマーを定義することである。これらの単量体単位は一連のβターンを形成し一連のβターンは該βターン間に吊り下がった動的架橋セグメントで仕切られる。すなわち該単量体は次の式で示されるβターンをもつコンフォメーションで存在する：
【００４７】
【化１】
ノナペプチド繰返し単位は一般に一連のテトラペプチド及びペンタペプチドからなり、しばしばテトラペプチドの位置がグリシンで置き換わる。好ましい疎水性アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びメチオニンからなる群より選択される。多くの場合、繰返し単位の１番目のアミノ酸残基はバリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニン残基であり、２番目のアミノ酸残基はプロリン残基であり、３番目のアミノ酸残基はグリシン残基であり、４番目のアミノ酸残基はグリシン又は疎水性がきわめて強い残基たとえばトリプトファン、フェニルアラン又はチロシン、もしくは他の任意の天然アミノ酸残基であり、また５番目のアミノ酸残基は最も一般的にはグリシンである。
【００４８】
バイオエラストマーは、本発明の方法にふさわしい所望の性質を実現するよう、合理的に設計することができる。エラストマー単位及びその後のポリペプチドの合成原料となる個別アミノ酸の選択は次の条件が満たされる限りで無制限である。すなわち結果として得られる構造は、たとえば本書に組み込まれる米国特許第４，５００，７００及び５，０６４，４３０号で開示されている特徴を備えたエラストマー構造を、特に前述のβターン構成を含み、また結果として得られるバイオエラストマーは本発明の実施態様で意図されている目的に役立つ属性を維持しなければならない。さらに、βターンが折りたたまれてβヘリックスを形成すると、たとえば前掲米国出願（Ｕｒｒｙ） Ｎｏ．０９／７４６，３７１で開示されている特徴を備えたアミノ酸組成に依存して吸音が増大し、結果として得られるバイオエラストマーが本発明の実施態様で意図されている目的に役立つ吸音属性を維持しなければならない。
【００４９】
ポリ（ＧＶＧＶＰ）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］の分子構造は第３図のように一連のβターンとして示される。このβターンは、Ｐｒｏ残基に先立つＶａｌ残基のＣ＝Ｏ基と２個のＧｌｙ残基にはさまれたＶａｌ残基のＮ−Ｈ基が絡む１０原子水素結合環である（第３Ａ及び３Ｂ図）。基本的な問題は逆温度転移点の下と上におけるβターンの相対的配向である。転移点の下では、βターン相互の関係は本質的にランダムである。転移点の上では、βターンは疎水的に折りたたまれ、一巻きあたり約３個の五量体からなるβスパイラルというらせん状配列を形成する（第３Ｄ及び３Ｅ図）。さて分子間疎水会合に由来するこの逆温度転移は濃度に依存するため、βスパイラルは従来しばしば単純化して大まかに示されてきたのとは異なり、単独では存在しないと思われる。βスパイラルは実際は、ネガティブ染色した初期集合体の電子顕微鏡写真に見られるように、また第３Ｆ図及び第４図に示すように、会合した状態で多ストランド・ツイストフィラメントを構成しているはずである。
【００５０】
バイオエラストマーは多数の利点をもつように設計することができる。これは、それ自体が多様な構造や化学的性質を有し、修飾も容易である、容易に得られ結合される単量体単位たとえばアミノ酸などからなる高分子を用意することで実現しうる。従ってバイオエラストマーは、四量体、五量体又は他の単量体単位の混合物を含有する共重合体としても提供することができる。さらに、組換えペプチド工学的な手法を有利に用いて、個別ペプチド主鎖を生体弾性単位又は非弾性二官能セグメントとして生成することもできる。
【００５１】
バイオエラストマーは単量体単位の様々な位置にふさわしい様々なアミノ酸を選択することにより、また最終産物の形成に用いる架橋法（化学法、酵素法、放射線法など）を変えることにより、多様な含水組成、広範囲の疎水性、ほぼ任意所望の弾性率、多彩な物理的形態（シート、ゲル、フォーム、パウダーなど）及び可変的な架橋度に調製することができる。ポリマー設計のこうした様々な側面を考慮した多様なバイオエラストマーの調製については既に、たとえば前記特許で開示されており、ここでは簡単に触れるにとどめる。
【００５２】
本発明の方法に有用な好ましいバイオエラストマーは繰返しテトラペプチド、ペンタペプチド及び／又はノナペプチド単量体単位を含む高分子、すなわちポリテトラペプチド、ポリペンタペプチド及びポリノナペプチドである。本発明に有用なバイオエラストマーは一般に５以上、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上の単量体を、さらにもっと好ましくは１００以上の単量体を含む。バイオエラストマーはまた随意に、単量体単位間へのたとえば単一アミノ酸の挿入、時折出現する単量体中の一アミノ酸の他アミノ酸への置換、又は弾性率の向上や他の所望特性の付与を目的として並列又は直列に付加することのできる異なる配列のテトラペプチド、ペンタペプチド又はノナペプチドの包含も可能である。米国特許第４，５００，７００及び５，０４６，４３０号参照。従って、得られるバイオエラストマーは異なる単量体単位から形成されるため当然にも共重合体と称される。代表的な共重合体は好ましくはテトラペプチド及びペンタペプチド単量体単位の混合物であろうが、それらの単位は同じでも異なってもよい、すなわちすべての四量体が同じでも異なってもよいし、またすべての五量体が同じでも異なってもよい。さらに、バイオエラストマーは前述の単量体単位のうちの１つと１〜１００個のアミノ酸、より一般的には１〜２０個のアミノ酸を含む第２のペプチド単位から形成される共重合体でもよい。その種の第２ペプチドはたとえば米国特許（Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．）第４，８７０，０５５号で開示されている六量体の−ＡＰＧＶＧＶ− ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７］であり、弾性率の変更を目的とした導入など多くの用途があろう。
【００５３】
単一多ストランド・ナノフィラメントの設計
ナノスケールでの基本機能単位はツイストフィラメントである。相分離は濃度に依存するため、凝集段階でナノフィラメントを単離するのは、またすべての鎖を同時に開始、停止させて単離するのももちろん、困難である。ツイストフィラメントの形成方法はたくさんあり、その一例を次に示す。機能単位に関するＦ−Ｅ曲線が得られるようにするには機能単位を化学合成で調製する必要があり、システイン残基の−ＳＨ基を両末端に配して、カンチレバー探針と基板表の金めっき層にしっかりと固定するようにする。タンパク質系高分子のアミノ末端には２ストランド・フィラメントの場合にはアジピン酸を、３ストランド・フィラメントの場合にはケンプ三酸を、また４ストランド・フィラメントの場合にはＥＤＴＡを配する。バイオエラストマーのカルボキシル末端にはこれらのジアミン誘導体を使用し、また閉合固定は超希釈条件下で行う。これにより、側鎖官能基を使用しない熱駆動及び塩駆動ナノマシンが得られよう。使用される高分子は（ＧＶＧＶＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１］及び（ＧＶＧＩＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝３２０］であろう。（ＧＶＧＶＰ）２５１を使用して構築されることになる３ストランド・ナノフィラメントの略図を第４Ａ及び４Ｂ図に示す。長さ約６０ｎｍのこの構築体は約５倍に伸びる力をもとう。
【００５４】
単一ナノフィラメントからなる酸−塩基駆動及びレドックス駆動ナノマシンの設計
ｐＨ駆動及びレドックス駆動ナノマシンでは側鎖官能基が使用されよう。繰返し基本単量体配列中にカルボキシル基を含む高分子では、やはりアミノ末端に多酸を導入し、他末端の閉合は組換えＤＮＡ産生高分子のカルボキシル末端に過剰システイン残基を使用してジスルヒド結合を形成させることによって行う。アミノ基を含む高分子では、カルボキシル末端を使用して初期多量体を形成させ、また組換えＤＮＡ産生高分子のアミノ末端の閉合には過剰システイン残基を使用する。形成された多ストランド・フィラメントの側鎖アミノ基にレドックス官能基を付加すればナノエレクトロメカニカル系が作製されよう。酸−塩基駆動及びレドックス駆動ナノマシンの場合には、第４Ａ又は４Ｂ図の構築体の各ストランドの外部は周期性繰返し官能基で装飾されよう。
【００５５】
アミノ酸の選定
前述のように、本発明の方法に使用されるバイオエラストマーの性能にとって決定的に重要なある種の特性が存在する。しかし、当業者には自明であろうが、所望の特性を発揮させるように調整することができる他の物性も多数存在する。たとえば粘性、粘弾性、コンシステンシー、弾性率、安定性、靭性、含水組成、疎水性度、物理的形態、及び架橋度などであり、そのうちのいくつかについては後述する。従って、特定単量体単位中のアミノ酸の選定及び単量体単位の所望比率の選定は経験的な手続きで行うことができる。この手続きは、既知バイオエラストマーの物性測定（又は検索）に始まり、類似するが異なるバイオエラストマーの製造、及び本書でも前記特許でも述べているような物性の測定へと進む。そこから、選定手続きを合理的に修正して所望の物性を備えたバイオエラストマーを探し出すことができる。
【００５６】
特に興味深い四量体又はテトラペプチド単量体単位はＶＰＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）及びＧＧＸ２Ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９； 式中Ｘ２はバリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はアラニン（Ａ）である］などである。
好適な五量体又はペンタペプチド単量体単位は、説明のため非限定的に例示すると、式ＧＸ３ＧＸ４Ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０； 式中Ｘ３はバリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、リシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）及びアラニン（Ａ）からなる群より選択され、またＸ４はＶ、Ｅ、Ｆ及びＩからなる群より選択される］で示される単位、具体的にはＧＶＧＶＰ、ＧＶＧＩＰ、ＧＶＧＦＰ、ＧＦＧＦＰ、ＧＦＧＥＰ、ＧＦＧＩＰ、ＧＥＧＦＰ、ＧＥＧＶＰ、ＧＫＧＦＰ、ＧＫＧＶＰ、ＧＥＧＩＰ、ＧＫＧＩＰ及びＧＹＧＩＰなどである。他の特に好ましい個別単量体単位及びバイオエラストマーについてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１２、１６及び１７、それに参照指示により本書に組み込まれる任意の特許を参照。
【００５７】
特に好ましい生体弾性材料は、式ＧＸ３ＧＸ４Ｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）の繰返しペンタペプチドを少なくとも１個、より好ましくはＧＶＧＶＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はＧＶＧＩＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のペンタペプチドを少なくとも１個含む材料であり、これはａ−（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ｂ又はａ−（ＧＶＧＩＰ）ｎ−ｂバイオエラストマーともいえる（式中ｎは１〜１０，０００好ましくは３〜７００の整数であり、ａとｂはポリテトラペプチド、ポリペンタペプチド、ノナペプチド又はそれらの共重合体である）。
【００５８】
特に、酸−塩基駆動及びレドックス駆動ナノマシンを含むバイオエラストマーの個別配列は、多ストランド・ナノフィラメントの形成を増進し鎖のいっそうの凝集を制限するように選択されよう。本発明の一実施態様では、基本単量体単位は（ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ ＧＸ５ＧＶＰ）ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１； 式中Ｘ５はグルタミン酸（Ｅ）又はリシン（Ｋ）であり、またｐは１〜６００の整数である］の形をとろう。第５図に示すように、この配列はより疎水性の高いＰｈｅ （Ｆ）残基をツイストフィラメントの内側に配する。他方、カルボキシル基又はアミノ基はレドクッス基が結合した又は結合しない状態でナノフィラメントの外側に位置するため、その荷電又は酸化状態により鎖のさらなる会合を制限することができる。
【００５９】
弾性
バイオエラストマーの弾性率を制御する一手段は転移点（Ｔｔ）という特性に関連する。一部のバイオエラストマーに見られる独特の性質は、それらが逆温度転移を起こし、その際に典型的なゴムに見られるランダム網目構造とは異なる規則的な構造が発現することである。これは米国特許（Ｕｒｒｙ）第５，２５０，５１６号で詳しく説明している。バイオエラストマーはそのＴｔを超える温度では、可逆的に会合してコアセルベートと呼ばれる濃密な含水粘弾性相を形成し、またコアセルベートの上の溶液は平衡溶液と呼ばれる。ゴム弾性状態を形成するこの温度上昇過程は規則構造のβスパイラルを出現させる結果となる。これはゆるい含水らせん構造であり、らせん巻き間にはスペーサーとしてのβターンが存在し、この構造によりらせん巻き間の、及びβターン間に吊り下がったペプチドセグメントとの、疎水性接触が実現する。従って、これらのバイオエラストマーのゴム弾性力は規則構造の発現に伴って発現する。成分繰返し単位のモル量を種々変化させた生体弾性材料を合成することにより、またこの初期粘弾性相を支持するための特定の溶媒を選択することにより、得られるバイオエラストマーが弾性力を発現する温度を厳密に制御することが可能となる。極大弾性力は約７５℃を上限とする比較的狭い温度帯で発現する。
【００６０】
従って、特定単量体単位中のアミノ酸の選定及び単量体単位の所望比率の選定は、本書でも前記特許でも述べているように、既知バイオエラストマーの物性測定（又は検索）に始まり、類似するが異なるバイオエラストマーの製造、及びＴｔ及び物性の測定へと進む経験的な手続きで行うことができる。たとえば転移点Ｔｔの値に対するアミノ酸組成変更の効果は疎水性尺度を用いてバイオエラストマーの単量体単位中の個別アミノ酸残基の平均疎水性の総和を求め、その結果をＴｔが既に判明しているバイオエラストマーに関して得られた総和と比較することで、見込まれるＴｔの大まかな推定値が得られるようにして割り出すことができる。一般に、疎水性がより高い残基（Ｉｌｅ、Ｐｈｅなど）はＴｔを低くし、疎水性がより低い残基（Ａｓｐ、Ｌｙｓなど）はＴｔを高くする。ほぼどの変数も、バイオエラストマーの適切な組成と共に、Ｔｔ値を変化させることができる。そうした変数の例は（１）高分子の濃度、（２）高分子の長さ、（３）アミノ酸組成、（４）塩濃度たとえばＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ （離液）系列、（５）有機の溶質及び溶媒、（６）高分子側鎖のイオン化、（７）高分子側鎖の化学修飾たとえばリン酸化、硫酸化及び窒化、（８）圧力（芳香族残基に及ぼすものなど）、（９）高分子に結合した化学基のレドックス状態、（１０）高分子に結合した化学基による光の吸収、及び（１１）イオン対合による側鎖電荷の中性化、たとえば陰イオン側鎖の陽イオン中性化、陽イオン側鎖の陰イオン中性化及び鎖内又は鎖間のイオン対合などである。
【００６１】
主鎖の修飾
バイオエラストマーはマトリックスを形成するペプチド単位で構成されるが、多様な方法で修飾を加え追加の物性をもたせることができる。たとえば１以上のペプチド結合を随意に、還元又は脱離によって得られる置換結合で取って代えることができる。こうして、技術上周知の方法により１以上の−ＣＯＮＨ−ペプチド結合を他タイプの結合たとえば−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓ及びｔｒａｎｓ）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＳＯ−で取って代えることができる。そうした方法の概論としては、たとえば “Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ” （Ｂ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） ｐ．２６７所収のＳｐａｔｏｌａ， Ａ．Ｆ． （１９８３） を参照。アミノ酸残はこれらの高分子主鎖の好ましい成分である。もちろん、エラストマー単位レベルで主鎖に修飾を加える場合には、高分子の弾性と逆温度転移が維持されるようにするのが好適な主鎖修飾である。
【００６２】
架橋
架橋度は、単量体単位の異なる位置に対応した異なるアミノ酸を選定することで、また最終産物を形成するために用いる架橋法（化学法、酵素法、放射線法など）を変更することで、制御することができる。たとえばバイオエラストマーの特性は多様な架橋法のうちの任意の方法（化学法、酵素法、放射線法など）を用いる架橋により左右することができる。架橋はバイオエラストマーに機械的強度と剛性をもたらすが、要求剛性の増大に応じて架橋量を増大させるのが適切である。一般に許容されるのは２００〜５００繰返し単位につき１架橋結合を実現する架橋であるが、より低い粘性のバイオエラストマーでは架橋量をもっと多くすることやその逆も許容される。バイオエラストマーの架橋方法は、酵素的架橋性単位をもつブロック重合体を合成することによる酵素的架橋法を教示している米国特許（Ｕｒｒｙ）第４，５８９，８８２号などで公知である。たとえばバイオエラストマーにシステインを導入すれば、ジスルヒド架橋を介した表面との結合が可能になるし、またリシンを導入すればコラーゲンやエラスチンなどを架橋する酵素を用いて表面との酵素的結合を実現することができる。別の例はリシン（Ｋ）残基をもつ１以上の単量体たとえばＧＸ３ＧＸ４Ｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）のＸ３がＫ、Ｘ４がＶであるＧＫＧＶＰなどを含むバイオエラストマーであり、これは既に架橋酵素リシルオキシダーゼの基質であることが示されている。
【００６３】
水溶性カルボジイミドを使用して、ある鎖上のグルタミン酸（Ｇｌｕ， Ｅ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）のカルボキシル基を他鎖上のリシン残基（Ｌｙｓ， Ｋ）のアミノ基に架橋結合しアミドを形成させる架橋法もある。これはカルボキシル基又はＧｌｕを含む配列とアミノ基又はＬｙｓを含む配列との結合に関連する。水溶性カルボジイミドを使用するこの化学架橋法は次の要領で行う。Ｇｌｕを含むバイオエラストマーの水溶液（４０ｍｇ／ｍＬ， ｐＨ ７．５）とＬｙｓを含むバイオエラストマーの水溶液（４０ｍｇ／ｍＬ， ｐＨ ７．５）とを混合する。この混合溶液をその転移点の２〜３℃上で平衡させる。計算量のＥＤＣｌとＨＯＢｔを加える。Ｎ−メチルモルホリンでｐＨを７．５に調整し上記温度を維持しながら２日間振とうする。
【００６４】
さらに放射線による架橋も本書で参照指示したほぼすべての特許に詳しく記載されている。たとえば（ＧＶＧＶＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］はｎをおよそ２００として２０Ｍｒａｄのγ線照射で架橋すると、弾性率１０５Ｎ／ｍ２程度の弾性マトリックスを形成するが、この弾性率は組成と条件を変えることにより１０４〜１０８Ｎ／ｍ２の範囲内で加減することができる。Ｘ２０−ポリ（ＧＶＧＶＰ） ［Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍ． ６：２６３−２８２ （１９９１）］もまた放射線架橋バイオエラストマーの例である。放射線架橋法で調製されるバイオエラストマーは「Ｘ２０−ポリＧＶＧＶＰ」などと表記して識別するが、それは線量２０Ｍｒａｄのコバルト６０照射で架橋し不溶性マトリックスとした、ＰＧＰＧＶペプチド単位からなるバイオエラストマーを表わす。架橋コアセルベートもまた、ずっと大きな及び小さな線量で、すなわち５０Ｍｒａｄもの線量で、だが通常は２０Ｍｒａｄ未満、しばしば１０Ｍｒａｄ未満、さらには５Ｍｒａｄ未満の線量で得ることができる。
【００６５】
総括アミノ酸組成
得られるバイオエラストマーの様々な位置に存在するアミノ酸を大幅に変化させることもまた、吊り下がった架橋セグメントを間に挟む多重βターンが維持されることにより弾性が保持される限り、可能である。この理由から、好ましくはポリペプチドの５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにもっと好ましくは９０％以上が繰返し単量体単位で構成されるようにする。それにもかかわらず、他の目的のために設計されたペプチド・セグメントを含むより大きなポリペプチド全体にこれらの単量体単位を分散させたポリペプチドを調製することも可能である。そうした配列は所望の機能を実現するために共有的かつ直列的に又は側鎖として付加することができる。これら他配列の単量体残余に対する比は１：２〜１：５０００の範囲としうるが、好ましくは１：１０〜１：１００である。置換基の数と種類に対する上限は、バイオエラストマーの、緩和状態でβスパイラルを形成するための適正なフォールディング／集成能にも左右される。
【００６６】
総括疎水性
全バイオエラストマーの疎水性（従ってまたバイオエラストマー中の官能基の平均疎水性）は、種々の単量体単位の比率を変えることで加減することができる。これらは一官能基を含み転移を起こす単量体単位でも、バイオエラストマー中の他単量体単位でもよい。たとえば基本単量体単位がＧＶＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であり、転移を起こす単位がＧＸ６ＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２； 式Ｘ６中は電気応答性側鎖をもつよう修飾されたアミノ酸残基である）であるとすれば、適切な転移点が実現されるまで、ＧＶＧＶＰ単位のＧＸ６ＧＶＰ単位に対する比を変化させていくか、又は異なる構造単位たとえばＧＶＧＩＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を、量を変えながら加えていくことができる。さらに、バイオエラストマーの配列は厳密に指定しうるため、構造成分の最適配置が可能になる。たとえば、カップリングした残基を主鎖上に互いに隣接し合うように（すなわち一次配列に基づいて）配置することにより、さらにまたらせん巻き間近接性を持たせるよう配置することにより、最適の空間近接性を実現することができる。
【００６７】
生体弾性ポリペプチドの大きな利点は、疎水性／極性度の微調整及びその結果として得られる逆温度転移シフトを実現しうる度合いにある。Ｔｔを変化させるには、前述のアミノ酸組成の変化に加えて、バイオエラストマーの平均疎水性を変化させる任意の化学的手段たとえば脱リン酸とリン酸化、レドックス・カップルの酸化と還元、イオン化と脱イオン、プロトン化と脱プロトン、開裂とライゲーション、アミド化と脱アミド、立体構造又は構成の変化（ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化など）、電気化学的変化（ｐＫａシフトなど）、発光／吸光又は他の物理的変化（熱エネルギー放射／吸収など）、圧力（米国特許第５，２２６，２９２号を参照）、光応答又は電気応答効果、もしくはそれらの組み合わせ用いることができる。
【００６８】
疎水性の設計はアミノ酸残基を適切に選定すれば容易である。この選定手続きについてはバイオエラストマー一般の疎水特性に関わるので、後で取り上げる。本発明の方法への具体的な使用には、バイオエラストマーを構成する１以上の単量体単位に現れる３つの好ましい残基すなわちフェニルアラン、チロシン及びイソロイシンが存在する。従って、本発明の好ましい一実施態様ではバイオエラストマーはフェニルアラニン又はイソロイシン残基をもつ１以上の単量体単位を含む。特に興味深い五量体はＧＶＧＶＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＧＶＧＩＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）ペンタペプチドを基礎とするバイオエラストマーの、荷電した、かつ疎水的に多様な類縁体である。従って、本発明の一実施態様では、好ましいバイオエラストマーは式ＧＸ３ＧＸ４Ｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０； 式中Ｘ３はＶ、Ｅ、Ｆ、Ｙ又はＫであり、Ｘ４はＶ、Ｅ、Ｆ又はＩである）で示されるその種の五量体の類縁体を１以上含む。
【００６９】
好ましいＸ３残基はＦ （五量体ＧＦＧＦＰ、ＧＦＧＥＰ、ＧＦＧＶＰ及びＧＦＧＩＰなどの場合）、Ａ （五量体ＧＡＧＶＰ及びＧＡＧＩＰなどの場合）、Ｙ （五量体ＧＹＧＶＰ、ＧＹＧＩＰなどの場合）、Ｅ （五量体ＧＥＧＩＰ、ＧＥＧＶＰなどの場合）及びＫ （五量体ＧＫＧＩＰ、ＧＫＧＶＰなどの場合）などである。好ましいＸ４残基はＦ及びＩからなる群より選択され、五量体はＧＡＧＩＰ、ＧＡＧＦＰ、ＧＶＧＩＰ、ＧＦＧＩＰ、ＧＶＧＦＰ、ＧＦＧＦＰ、ＧＥＧＦＰ及びＧＫＧＦＰなどとなる。特に好ましい生体弾性材料は１以上のＧＶＧＩＰ単量体を含む材料である。というのは、その種の単量体が１以上存在するとマトリックスがより強靭になり、また疎水性度が高まると判明しているからである。
【００７０】
これらの好ましい単量体単位を１以上含むバイオエラストマーの例を以下、説明を目的に、非限定的に列挙する：
（ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ ＧＸ５ＧＶＰ）ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１； 式中Ｘ５はＥであり、ｐは１〜６００の整数である。］
（ＧＡＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＩＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＫＧＶＰ）ｑ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３； 式中ｑは１〜６００の整数である。］
上記の例では式中の整数ｐ及びｑの値を与えているが、その趣旨はあくまでも本発明のバイオエラストマーの例示であって限定ではない。
【００７１】
合成
高分子量のバイオエラストマーを高収率で得るためのアプローチは多数ある。生体弾性繰返し単位の合成は簡単であり、ペプチド化学者にも、又は組換えＤＮＡ技術や微生物発酵の標準方法によっても、楽に行える。バイオエラストマーの有機合成はたとえば参照指示により本書に組み込まれる種々の特許に記載されている。具体的にはポリ（ＧＶＧＶＰ）の合成と架橋は米国特許第４，７８３，５２３号に、ポリ（ＩＰＧＧ）の合成は米国特許第５，２５０，５１６号に、またポリ（ＧＧＡＰ）の合成は米国特許第５，５２７，６１０号に、それぞれ記載されている。従ってこれらの特許の教示は種々の単量体単位をもつバイオエラストマーの合成に応用することができる。バイオエラストマーを化学合成で生産するときは、不純物を避けるよう注意する必要がある。低濃度の不純物でも、重合過程を終了させたり、得られるバイオエラストマーの物性を変化させかねないラセミ化を招いたりするおそれがあるためだが、それ以外、格別の合成問題は存在しない。ペプチド単位の純度は好適な物性を備えた材料を得るうえで重要である。というのは、たとえばバイオエラストマー合成のわずかな変化でもＴｔを１５℃も変化させる結果となりうるからである。この潜在的な問題への対策はペプチド合成に使用する単位成分の精製に尽きる。
【００７２】
バイオエラストマーは単独重合体又は共重合体として合成することができる。２以上の単量体単位から合成されるランダム又はブロック共重合体は本発明の方法に有用であるが、同等の単独重合体が所望の物性を備えるときはあまり好ましくない。その訳は合成がより複雑であることに尽きる。バイオエラストマーはその合成方法とは無関係に、必要ならさらに誘導体化することができる。たとえば米国特許（Ｕｒｒｙ）第５，９００，４０５号（電気的暴露）に記載されているように電気応答性側鎖をバイオエラストマーに組み込むこともできる。
【００７３】
バイオエラストマーはまた遺伝子工学的手法で合成することもできる。このアプローチでは、所望のペプチド配列をコードする遺伝子を構築し、宿主生物に人工的に導入し、そこで発現させる。宿主生物は細菌などのような原核生物でも酵母や植物などのような真核生物でもよい。適切な宿主生物中で効果的に遺伝子を発現させるための遺伝子情報（ＤＮＡ配列など）操作技術は分子生物学の世界では周知であり［たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）を参照］、ポリヌクレオチドの開裂、結合、複写又は他の組換えを行いうる酵素の使用などが含まれる。さらに、この情報を宿主細胞に、発現に好適な仕方で導入しうるようにするベクターも公知である。ポリＶＰＧＶＧの詳しい合成例は本発明者の研究所に由来する出版物ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ８：３４７−３５２ （１９９２）及びＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７：５１−５７ （１９９６）に記載されており、これらの出版物は本発明に使用される材料の遺伝子工学的調製のための手引きとして利用できる。既に２０００ものアミノ酸残基をもつバイオエラストマーを適切なＥ． ｃｏｌｉ株で効率的に発現させている。たとえば（ＧＶＧＶＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝１２１］の発現が既にＥ． ｃｏｌｉ細胞容積の８０％のレベルで起きている。従って、本発明の方法への使用に好適なバイオエラストマーは、（ＧＶＧＩＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； 式中ｎ＝２６０］を産生するよう形質転換したＥ． ｃｏｌｉ及び測定が容易な発現産物を同時発現するよう組み換えた発現ベクターの使用により低コストで合成しうるものも多い。
【００７４】
一般に、所望エラストマーの特定部分をコードする一本鎖オリゴヌクレオチドは商業的供給元により化学合成される。これらのオリゴヌクレオチドを次にその３’末端相補領域全体にわたってアニールし、ハイフィデリティ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで完全長の二本鎖基本遺伝子断片へと伸張する。得られた遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、クローニングベクターｐＵＣ１１８へとライゲーションにより挿入する。クローニング用宿主Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ａＦ’の形質転換後、選択プレートからポジティブクローンを回収し、各クローンからプラスミドＤＮＡを単離しスクリーニングにかける。得られたプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、アガロースゲル上で分離する。次の配列確認に回す候補クローンを選別する。配列が確認されクローンを、後続の遺伝子構築のための所望バイオエラストマー供給源として使用する。コンカテマー（多量体）遺伝子を構築するために、単量体遺伝子を含むプラスミドを前記制限酵素で消化し大量の単量体遺伝子断片を調製する。得られた単量体遺伝子断片を次に、後続操作のためのクローニング部位を種々のベクターにもたらすＮ−及びＣ−末端アダプターの存在下に、鎖状に連結（ライゲート）する。得られた鎖状連結産物は多様な鎖長の多量体遺伝子からなるが、それらをｐＵＣ１１８中にライゲートし、ベクターごとＥ． ｃｏｌｉに導入する。選択プレート上の有力クローンをスクリーニングし、種々の酵素による一連の消化を経てポジティブクローンを特定する。
【００７５】
組換えＤＮＡ技術の使用によるバイオエラストマーは生産コスト面で合成有機高分子やかなりの精製を必要とする天然材料に対し競争力をもちうる。工業用タンパク質メーカーはバイオ工学で生産されるタンパク質のコストを大幅に低減しうることを既に立証している。吸音体用のバイオエラストマーは大量に必要とされるため、その生産コストは特に重要である。
【００７６】
生体弾性ポリペプチドはたとえば発酵槽で増殖させた菌株から、又は有機合成から、その逆温度転移能を利用して精製することができる。微生物系で発現させた遺伝子工学的高分子では、タンパク質系高分子の逆温度転移特性を利用した精製が好ましい。この方法を用いるとエンドトキシン濃度でさえも格別に引き下げられることが立証済みだからである。Ｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ． ９：１０１５−１０４８ （１９９８）を参照。
【００７７】
使用方法
以下の実施例では当業者向けの本発明の例示と説明を目的に、本発明の特定の態様を説明する。実施例は本発明の理解と実施にとって有益な特定の方法論を示すにすぎず、本発明を限定するものではない。
【００７８】
実施例
バイオエラストマーの調製では、以下の個別実施例で説明するような遺伝子構築、発現系の開発、発酵及び精製を利用する。遺伝子構築に関しては、 （発現に使用されることになるベクターに存在する制限部位の考察など標準的な手法を用いて選択された）適切な制限部位配列を含む適切な付着端をもつように基本単量体遺伝子を設計した。基本遺伝子の合成は制限エンドヌクレアーゼによる消化による付着末端の生成、それに続くＤＮＡリガーゼを使用したライゲーションによる基本遺伝子の多量体の形成によって行った。このプロトコールを使用して各単量体遺伝子配列を首尾よく生成した。次に単量体遺伝子をコンカテマー化（重合）して繰返し単位数が種々異なる多量体遺伝子を形成し、以下簡潔に報告するように数多くの多量体遺伝子を高レベルで発現させた。
【００７９】
実施例１
ナノマシンの調製
Ａ． 組換えＤＮＡ技術によるバイオエラストマーの調製
組換えＤＮＡ技術を用いて、基本単量体遺伝子の調製、そのコンカテマー化による多量体遺伝子の調製、Ｅ． ｃｏｌｉへの導入、高レベルでの発現によりバイオエラストマーを調製する。一般的なアプローチはＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７：５１−５７， １９９６に記載されている。
【００８０】
Ｂ． 遺伝子配列
（ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ ＧＸ５ＧＶＰ）ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１； 式中Ｘ５はＥ、ｐは５０である］及び（ＧＡＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＩＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＫＧＶＰ）ｑ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３； 式中ｑは４５である］に対応する個別遺伝子の設計が必要である。
（ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ ＧＥＧＶＰ）ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１； 式中ｐは２である］に対応するヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を一例として次に掲げる。
【００８１】
【化２】
Ｃ． 一連の長いバイオエラストマーの間への球状モジュールの挿入
ＧＲＧＤＳＰを含むＦｎ３球状ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を用いて一連の長いバイオエラストマーの間に球状ドメインを挿入することができるが、その目的はＧＲＧＤＳＰ細胞接着部位をＲＧＹＳＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）などのようなキナーゼ認識部位に置き換えることに尽きる。あるいは、ＲＧＹＳＬＧキナーゼ認識部位をもつ小さな球状タンパク質のリゾチームを用いることもできる。ＲＧＹＳＬＧキナーゼ認識部位をもつＦｎ３ドメインすなわちＦｎ３：ＲＧＹＳＬＧのアミノ酸配列は次のとおりである。
【００８３】
【化３】
この球状Ｆｎ３ドメインをコードする遺伝子は、バイオエラストマーたとえば（ＧＶＧＩＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝１０］をコードする遺伝子との鎖状連結が可能なように構築した。さらに、該遺伝子はそれ自体との鎖状連結によりＦｎ３：ＲＧＹＳＬＧの多量体の生成も可能なようにした。単量体Ｆｎ３：ＲＧＹＳＬＧ遺伝子は次に示す合成ヌクレオチドを用いて２個の「半」遺伝子として構築した（Ｎはアミノ末端側の半分を示し、Ｃはカルボキシル末端側の半分を示す）。
【００８５】
【化４】
具体的には、各「半」遺伝子について２個のオリゴヌクレオチドをその３’末端相同領域にわたってアニールした。これらの末端をサーマルサイクラー中で熱安定ＤＮＡポリメラーゼと遊離デオキシヌクレオチドにより伸張して、二本鎖ＤＮＡ断片を得た。この反応生成物を分取して、最初の２オリゴヌクレオチドの二本鎖断片の３’末端と相同の３’末端をもつ別の２オリゴヌクレオチドを含む類似の反応混合液と混ぜた。これらの反応の二本鎖生成物を次に、それらがコードするアミノ酸配列と併せて示す。Ｆｎ３：ＲＧＹＳＬＧをコードするＤＮＡ配列は大文字で示す。
【００８７】
【化５】
【化６】
これらＦｎ３：ＲＧＹＳＬＧ「半」遺伝子を各々、末端ＢａｍＨＩ部位を利用して多目的クローニングベクターたとえばｐＣＵ１１８中にクローニングし、ＤＮＡ配列解析で確認した。次いでそれらを各々Ｐｆ１ＭＩでの開裂によりクローニングベクターから遊離させることで、各々独立にＰｆ１ＭＩ消化単量体バイオエラストマー遺伝子と鎖状連結することができた。各「半」遺伝子はリガーゼと共にバイオエラストマー遺伝子と、半遺伝子繰返し配列数あたりの所望バイオエラストマー繰返し配列数に有利となる比率で混合することができた。
【００９０】
たとえばＦｎ３Ｄｏｍ−Ｎ単量体遺伝子と（ＧＶＧＩＰ）１０単量体遺伝子とを含む鎖状連結ライゲーション反応液から、両端を１以上のＦｎ３Ｄｏｍ−Ｎ遺伝子繰返し配列にはさまれた１以上の（ＧＶＧＩＰ）１０遺伝子繰返し配列からなるコンカテマーを生成することができる。このコンカテマー遺伝子（Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｎ）ｘ｛（ＧＶＧＶＩＰ）１０｝ｙ（Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｎ）ｚ ［式中ｘ、ｙ及びｚは１以上である］をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化すると、ｙコピーの（ＧＶＧＶＰ）１０遺伝子を５’末端に付加されたＦｎ３Ｄｏｍ−Ｎ半遺伝子が得られよう。同様にＦｎ３Ｄｏｍ−Ｃ半分遺伝子と（ＧＶＧＩＰ）１０単量体遺伝子の鎖状連結ライゲーション反応により（Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｃ）ｑ｛（ＧＶＧＶＩＰ）１０｝ｒ（Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｃ）ｓ ［式中ｑ、ｒ及びｓは１以上である］が得られ、この生成物をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ で消化すると、ｒコピーの（ＧＶＧＩＰ）１０遺伝子を３’末端に付加されたＦｎ３Ｄｏｍ−Ｃ半遺伝子が得られよう。これら２つの鎖状連結生成物をそれらのＥｃｏＲＩ末端を介してライゲートすると、その５’末端、３’末端にそれぞれｙコピー、ｒコピーの（ＧＶＧＩＰ）１０を付加された完全なＦｎ３：ＲＧＹＳＬＧ遺伝子配列が得られよう。さらに、Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｎ、Ｆｎ３Ｄｏｍ−Ｃの各「半」遺伝子はそれぞれ、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ 末端のＧＶＧＩＰコード配列並びにこれらの末端の開始及び終止コドンに寄与する。得られる遺伝子はＧＶＧＩＰ｛（ＧＶＧＩＰ）１０｝ｙＦｎ３： ＲＧＹＳＬＧ｛（ＧＶＧＩＰ）１０｝ｒＧＶＧＩＰをコードしており、またＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ 末端を介してたとえば発現ベクター中にクローニングすることができる。
【００９１】
Ｄ． 多ストランド・ツイストフィラメントの化学的調製
以下は可能なアプローチの１つである。側鎖カルボキシル基をもつバイオエラストマーでは、たとえばトリシステイン誘導体化ケンプ三酸をアミノ基によるストランドの結合に使用する。バイオエラストマー鎖の他末端は、鎖状連結に際して使用したアダプター・オリゴヌクレオチドにより付加されたシステイン残基に由来するジスルフィド結合により架橋する。このカルボキシル末端のシステイン残基の数と位置は、未反応−ＳＨ基をもたせて分子間ジスルフィド架橋と金表面への結合の両方を実現するように選択する。同様に、側鎖アミノ基をもつバイオエラストマーでは、たとえばトリエチレンジアミンすなわちケンプ三酸のトリシステイン誘導体をカルボキシル基によるストランドの固定に使用する。同様に、アミノ末端で求められる鎖間ジスルフィド架橋のためのシステイン残基の挿入にはアダプター・オリゴヌクレオチド配列を使用し、残ったシステイン残基は保持し、その−ＳＨ基を金めっき表面への結合に当てる。
【００９２】
実施例２
ナノマシンのＡＦＭによる特性決定
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は、液体環境で使用することができる高解像度の走査型プローブ顕微鏡である。ＡＦＭは最も一般的な画像化装置としての用途に次いで、単一分子鎖による機械的実験の実施に使用できるｎｍ、ｐＮスケールのフォースセンサーとして浮上してきた。ツイストフィラメント・ナノマシンの特性決定にはこうした最新ＡＦＭ技術の両面を使用する。
【００９３】
Ａ． 単一フィラメント張力−伸び（Ｆ−Ｅ）曲線
単一フィラメントの弾性特性の決定では、ＡＦＭを基礎とした単一分子力分光法を用いてそのＦ−Ｅ曲線を調べる。これには、ＡＦＭ探針／基板表面間の個別高分子鎖の最適スパニング及び伸張を可能にするような専門の装置が使用される。試料の左右走査をやめるときのピエゾ変換器のｚ軸レンジは８（ｍであり、ピエゾ伸張は内蔵ひずみ計で制御する。この装置を用いると、数Åの精密さでカンチレバー位置の制御が可能であり、その場合の力分解能はｐＮオーダーである（カンチレバー振動に起因する熱雑音は１０ｐＮ未満であり、フィルター処理により
【数１】
【００９４】
一般に、実験は室温で、液体環境たとえば純ＭｉｌｌｉＱ水又は水性電解質緩衝液中で行う。装置の試料セルは液体交換を可能にして、高分子鎖をＡＦＭ探針と基板の間に保持した状態で塩又はｐＨ条件を変えられようにしてある。さらに、金めっきした探針と基板は導電性であり、従って分子レベルで起るレドックス過程を刺激するための電極として使用することができる。最後に、外部光刺激（レーザー光）の系へのカップリングを可能にするようにして実験を行うこともできる。実験のさらなる詳細はＯｅｓｔｅｒｈｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ １：６．１−６．１１， １９９９及びＣｌａｕｓｅｎ−Ｓｃｈａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７８：１９９７−２００７， ２０００に記載されている。
【００９５】
バイオエラストマー試料のＡＦＭ探針と基板への結合には特異的リガンド−レセプター結合、共有結合、金表面へのチオールの特異的吸着、又は非特異的吸着などを用いることができる。予備作業としてバイオエラストマーＣｙｓ｛（ＧＶＧＶＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１； ｍ≧２］及びＣｙｓ｛（ＧＶＧＩＰ）ｎ｝ｍＣｙｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝３２０； ｍ ≧２］の個別ストランドを４℃（バイオエラストマーの転移点Ｔｔを下回る温度）の希釈水溶液から金めっきガラススライド上に吸着させた。表面でのバイオエラストマーの希釈分散を実現するために、低平均分子量（ＭＷ が約５０００ｇ／ｍｏｌすなわち平均外形長３０ｎｍ）のチオールを末端基とするポリエチレングリコール（ＰＥＧ， Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を共吸着剤を使用した。
【００９６】
ＡＦＭ実験では、手動制御で金めっきＳｉ３Ｎ４カンチレバー探針（Ｍｉｃｒｏｌｅｖｅｒ， Ｐａｒｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を界面高分子層と１０〜３０秒間、密接触させた。カンチレバーを戻すと、１本又は数本の高分子ストランドが探針に接着したので、光てこ検出法を用いてカンチレバーばねのたわみから、得られる張力−距離プロフィールを測定した。共吸着ＰＥＧの使用により、ＡＦＭ探針と金めっき基板の間の非特異的接着は界面高分子層に由来する立体反発のために完全に抑制される。さらに、共吸着ＰＥＧの平均外形長は試料バイオエラストマー・ストランド長よりも桁違いに短いため、この戦略は実験で単一バイオエラストマー・ストランドをピックアップする公算を大きくしてくれる。このずっと短いＰＥＧ鎖はその特徴的なＦ−Ｅ曲線からすぐに判別される。最後に、バイオエラストマーのチオール末端基と金めっき探針の間の特異的結合は１本の個別バイオエラストマー・ストランドの弾性特性をナノニュートン張力まで繰返し測定することを可能にする。
【００９７】
第２図に示すような個別バイオエラストマー・ストランドの予備試験は、単一多ストランド・ツイストフィラメントの制御された機械的操作の基礎となるＡＦＭによるバイオエラストマー特性決定計画の実現性を証明している。
Ｂ． ツイストフィラメント・ナノマシンの画像化
多ストランド・ツイストフィラメントの弾性特性決定はＡＦＭによる画像化で補足されよう。これは基板表面でのバイオエラストマー・ナノマシン構造の研究と制御の改善とを可能にしよう。
【００９８】
ツイストフィラメント・ナノマシンの画像化は室温（２５℃）で、市販装置（Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＩＩ ａ， Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行われよう。試料の画像化は空気中でも適当な緩衝液中でも可能である。緩衝液中で画像化では、長時間の研究に際して緩衝液が蒸発するのを防ぐために密封性の液体セルに試料をセットすることになろう。最大レンジ１５（ｍのピエゾスキャナーと酸化物探針を一体化した窒化ケイ素カンチレバー（やはりＤｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｔｓ製で、公称ばね定数は３０ｍＮ／ｍ）を使用することになろう。タッピングモードは探針／基板間横力の最小化を可能にしよう（Ｈａｎｓｍａ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６４：１７３８， １９９４及びＰｕｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６４：２４５４， １９９４を参照）。
【００９９】
Ｃ． これら生体弾性高分子の吸音特性の利用
タッピングモードの顕著な進歩は、これら生体弾性高分子の吸音周波数レンジにわたって振動するようにＡＦＭカンチレバーを製作することが可能になったことである（Ｔａｍａｙｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ７７ （４） ：５８２−５８４， ２０００を参照）。基板に平行な振動のＡＦＭ走査モードで使用すると、これは貯蔵剪断弾性率Ｇ’と損失剪断弾性率Ｇ”の周波数依存（第７図の単位体積あたり吸音に相当）をもたらす（Ａｎｔｏｇｎｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ８６：２２３−２３２， ２００１を参照）。これは疎水的フォールディング及び集成の逆温度転移を通過することに由来する構造的変化をモニターする手段をもたらす。もし振動が基板に対して垂直であって、かつＡＦＭが張力−伸びモードで作動するとしたら、これはツイストフィラメント軸に平行な機械的共振成分の特性決定を可能にしよう。本発明の一実施態様では、エネルギー入力の導入に伴う検出対象の構造状態の変化が機械的共振の強度と周波数の変化によって検知しうるように生体弾性ツイストフィラメントを設計する。
【０１００】
米国出願 （Ｕｒｒｙ） Ｎｏ． ０９／７４６，３７１（前掲）で開示されている以下の生体弾性高分子は周波数レンジと吸音強度の制御を実現するうえで特に好適である。
【０１０１】
【化７】
このリストでは整数ｎの値を与えているが、それは本発明の高分子を例示するのが目的であって、限定するものではない。１〜５０００の範囲内のｎ値で、高分子Ｉ〜ＸＶに関して記載したような繰返し単位をもつ高分子を設計することができる。以下の高分子もまた有用である（ｎは約１〜５０００の整数）。
【０１０３】
【化８】
実施例３
多ストランド・ナノフィラメント及びナノケモメカニカル系の構築及び特性決定
２ストランド、３ストランド及び４ストランドのツイストフィラメントを調製し、その特性決定をＡＦＭで行うことができる。さらに、Ｐｈｅ及びＧｌｕ残基配列を利用して凝集を制御しながらナノフィラメント形成へと導くようにし、ナノケモメカニカル系（ＮＣＭＳ）を調製することも可能である。第５Ａ−５Ｃ図に模式的に示すような配列すなわち（ＧＥＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＦＧＦＰ ＧＩＧＶＰ）ｒ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７； 式中ｒは１〜５００の整数］にし、収縮／緩和の駆動にはカルボキシル基を用いることになろう。
【０１０５】
発生力と長さ変化のｐＨ依存を決定する際には、一般的な特性決定に加えてＡＦＭ研究からも（∂ｆ／∂μ）ｌ及び（∂ｌ／∂μ）ｆを評価し、ナノフィラメントによるケモメカニカル変換を可能にする最も好適な実験条件を求めることができる。
【０１０６】
実施例４
ナノケモメカニカル系用多ストランド・ナノフィラメントの構築と特性決定
第５Ａ−５Ｃ図に示したものと類似の、ただしより極性の高い（酢様）残基Ｌｙｓをもつ配列 （ＧＫＧＶＰ ＧＡＧＦＰ ＧＦＧＶＰ ＧＡＧＶＰ ＧＩＧＦＰ ＧＦＧＶＰ）ｓ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８； 式中ｓは１〜５００の整数］を用い、収縮／緩和の駆動にはアミノ基と付加レドックス基を結合させて用いることができる。発生力と長さ変化のｐＨ依存はＬｙｓ含有官能基で決定し、また発生力と長さ変化に対するレドックス官能基の酸化体の効果はレドックス含有官能基で決定することになろう。第１Ｂ表に示す任意のレドックス・カップルたとえばＮ−メチルニコチンアミド（ＮＭｅＮ）を使用することができる。
【０１０７】
実施例５
疎水的にフォールディングした球状タンパク質の組み込み
疎水的にフォールディングした球状タンパク質をバイオエラストマーに直列に組み込むための遺伝子を作る。疎水的にフォールディングした球状タンパク質を直列に組み込んだバイオエラストマーはたとえば疎水的にフォールディングした球状タンパク質の緩和（アンフォールディング）を促す駆動力となる毒ガス、ＤＮＴ及びＴＮＴとの相互作用を検知する機能的センサーのモデルとなる。このアプローチの物理的原理は水和の無極性−極性反発自由エネルギーであり、これは高分子鎖に沿って共存するよう強いられた極性部分と疎水性部分の水和をめぐる競合関係にほかならない。疎水的にフォールディングした球状タンパク質モジュールに極性種が結合すると、フォールディングした状態に対応する疎水性水和の一部が構造破壊され、それによってアンフォールディング状態の側へ平衡がシフトする。一般に、この原理を用いれば球状タンパク質の全体又は一部のアンフォールディングを検出することができる。ナノフィラメントを含む球状モジュールの外形長さはＦ−Ｅ曲線で測定すると、アンフォールディング鎖の追加長さ分だけ増大することになるからである。
【０１０８】
たとえば、正確な使用温度範囲に合わせて設計した場合、ＧＶＧＩＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の３００残基につき１個のリン酸基が結合するだけで完全な疎水性アンフォールディングを起こすことが既に示されている。タイチン様βバレル中の正しく配置されたキナーゼ認識部位はリン酸化に伴い、βバレルのアンフォールディングとタイチンの球状単位に見られるような球状単位に特有の幅だけ外形長さの増大をもたらす。そこに、疎水的にフォールディングした球状タンパク質上のある部位に位置する極性種の相互作用を、又は疎水性ドメインの強度変数を変化させるような分子の付加を検出する見通しが生まれる。さらに、ＡＦＭの利用によるその種の観測もまた、そうした見通しから開けてくる諸々の可能性を秘めた自由エネルギー変換機構を立証することになる。
【０１０９】
チロシン残基の窒化はＴｔ値を著しく高める（第１Ｂ表を参照）。従って、球状単位たとえばタイチン様βバレルの好適部位にＤＮＴが結合すれば、疎水的にフォールディングした球状単位が不安定化し、それに伴いナノフィラメントＦ−Ｅ曲線に変化が生じると見込まれる。あるいは、ＤＮＴを還元する酵素すなわち球状タンパク質はそのレドックス補欠分子族を酸化させよう。補欠分子族の酸化はＴｔ値を変化させるので、この効果を利用すれば目的の分析物をＡＦＭで検出することが可能になる。
【０１１０】
最も単純な試験構築体にバイオエラストマー（ＢＥ）−球状タンパク質（ＧＰ）−バイオエラストマー（ＢＥ）がある。２個の同じバイオエラストマー部分は第２Ａ及び２Ｂ図のような単純単調な曲線を示し、１個の球状タンパク質は特有の鋸歯パターンを示すであろうが、この鋸歯パターンは歯が１個だけの場合も、もっと複雑なパターンを示す（１以上のドメインが別々に折りたたまれている）場合もあろう。この種の構築体がセンサーとして使用できるのは、分析物の結合により遊離球状タンパク質の特徴として認められるパターンが変化するからである。最初に立証されそうなのはキナーゼ認識部位である。
【０１１１】
２つのアプローチが考えられよう。１つは本来的にキナーゼ認識部位を含む小さな球状タンパク質たとえば配列ＲＧＹＳＬＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）をもつリゾチームの使用であろう。別のアプローチは細胞接着部位たとえばＧＲＧＤＳＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）細胞接着部位をキナーゼ認識部位たとえばＲＧＹＳＬＧに置き換えることであろう。前述のように、ポリ（ＧＶＧＩＰ） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２］配列中のＲＧＹＳＬＧ配列はＴｔ値を劇的にシフトさせ、疎水的アンフォールディングを促すが、その除去は疎水的フォールディングを促す（Ｐａｔｔａｎａｉｋ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １７８：５３９−５４５， １９９１）。
【０１１２】
第６図はＦ−Ｅ曲線の模式図であり、曲線Ａは第２Ａ及び２Ｂ図のバイオエラストマー（ＢＥ）の単一ストランドに対応する。第６図の曲線ＢはＢＥ−ＧＰ−ＢＥのＦ−Ｅ曲線であり、ＧＰは小アンフォールディング力と大アンフォールディング力の２個のフォールディングドメインをもつリゾチームなどのような球状タンパク質である。曲線Ｃは仮想例であり、分析物の結合たとえばリゾチームの場合にはリン酸化により、弱いドメインは完全にアンフォールディングし、また強いドメインのアンフォールディング力は低下する。
【０１１３】
本書で言及した諸々の公報及び特許出願は参照指示により本書に組み込まれ、その効果は各個別公報又は出願が引用の場に明確かつ個別に参照指示により組み込まれる旨を記したのと同じとする。本発明を説明し尽くした今、その精神又は範囲から逸脱することなく数多くの変更や修正を加えうることが当業者には明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＴｔベースの分子マシンがなしうる種々のペアワイズ・エネルギー変換の図解である。これはタンパク質のフォールディングと機能のためのＴｔ疎水性変化系列を表わす。
【図２】第２Ａ−２Ｃ図は単一鎖Ｆ−Ｅ曲線である。第２Ａ図は２５１ステップの（最も合理的な特定鎖長は５０２ステップ）の希釈及び超希釈Ｃ（ＧＶＧＶＰ）ｎＣに関するＦ−Ｅ曲線である。（ＧＶＧＶＰ）ｎはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、式中ｎは２５１〜１００４の整数、Ｃは単一鎖両末端のシステイン残基である。第２Ｂ図は超希釈（ＧＶＧＩＰ）ｎ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； 式中ｎは２６０〜１２８０の整数）に関するＦ−Ｅ曲線であり、第２Ｃ図は疎水性鎖間相互作用が存在する場合の希釈（ＧＶＧＩＰ）ｎに関するＦ−Ｅ曲線である。
【図３】第３Ａ−３Ｇ図はＮＭＲ、電子顕微鏡、計算処理及び結晶構造データを基礎とするポリ（ＧＶＧＶＰ） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］の分子構造を示す。その基本単位は第３Ｇ図に示すβスパイラルのツイストフィラメントであると考えられる。第３Ａ図はＰｒｏ−Ｇｌｙ挿入βターンをもつ延伸鎖の略図である。第３Ｂ図は、環状類縁体のシクロ（ＧＶＧＶＰ）３ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝３］の結晶構造によって確認されたβターンの詳細である。第３Ｃ図は、ポリペンタペプチド・バイオエラストマーβスパイラルと同じ大きさのらせんの模式図である。第３Ｄ図は該βスパイラルの帯模式図であり、βターンがらせん巻き間のスペーサーとなっている。第３Ｅ及び３Ｆ図は結合の詳細を示すステレオ図であり、βターンとβターン間に吊り下がったセグメント、それにβスパイラル内の水占有空間とを示す。第３Ｅ図は側面ステレオ図であり、第３Ｆ図は軸ステレオ図である。
【図４】第４Ａ及び４Ｂ図は（ＧＶＧＶＰ）ｎ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ｎ＝２５１］の３ストランド・ツイストフィラメントの模式図である。第４Ａ図： フィラメントの各末端でケンプ三酸が３本のストランドを保持しており、また各ストランドの両末端にはシステイン残基を付加し原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）実験で用いる金めっき表面に結合しうるようにしてある。第４Ｂ図： Ｒは一連のリシン残基などに見られるアミノ基又は一連のグルタミン酸残基などなどに見られるカルボキシル基を表わす。
【図５】第５Ａ−５Ｃ図はアミノ酸配列の制御が３ストランド・ツイストフィラメントの形成を導く仕組みを示す。第５Ａ及び５Ｂ図は、油様Ｒ基を酢様Ｒ基から分け隔てるフォールディングβスパイラル構造を示す。第５Ａ図は両側に分かれた油様残基と酢様残基を示し、また第５Ｂ図はツイストフィラメントの油様側を示す。第５Ｃ図は油様残基を疎水的に埋め込んでいる会合フォールディング鎖の軸方向断面であり、中央の油様Ｒ基がその周辺の酢様残基と水から隔離されている。
【図６】第６図は、分析物と単一球状タンパク質（ＧＰ）の相互作用の効果を示す仮想Ｆ−Ｈプロフィールである。曲線Ａはバイオエラストマー（ＢＥ）の単一ストランドに対応する。曲線Ｂは、間に２個の疎水的にフォールディングしたドメインからなる球状タンパク質を挟んだＢＥ−ＧＰ−ＢＥに対応する。曲線Ｃは、「曲線Ｂ」プラス「ＧＰの２個の疎水的にフォールディングしたドメインのうちの１個をアンフォールディングさせる結果となる、該ドメインと既に結合し分析物」に対応する。
【図７】第７図は２０Ｍｒａｄ γ線架橋（ＧＶＧＩＰ）２６０［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ｎ＝２６０］の吸音データであり、疎水的フォールディング及び集成の逆温度転移の始点の下から上へと温度が上昇すると周波数レンジに限定された機械的共振が増大することを示す。２つの重なりピークが観察されるが、それらはらせん構造の光吸収から類推すると、らせん（βスパイラル）軸に平行及び垂直な、機械的共振の分解成分であるかもしれない。この機械的共振は、高分子の別の機能性に作用する別の自由エネルギー強度変数により誘発された（フォールディング、又はアンフォールディング）状態の変化をモニターする手段をもたらす。
Claims (56)
- ノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰返しペプチド単量体単位をもつバイオエラストマーを含むナノマシンであって、該単量体単位が一連のβ−ターンを形成し、一連のβ−ターンはβ−ターン間に吊り下がった動的架橋セグメントで仕切られるナノマシン。
- バイオエラストマーがナノパーティクルの形をとる請求項１のナノマシン。
- バイオエラストマーが多ストランド・ナノフィラメントの形をとる請求項１のナノマシン。
- 各ナノフィラメントが各末端に二酸、三酸又は四酸をもつ請求項３のナノマシン。
- 酸がアジピン酸、ケンプ三酸及びエチレンジアミン四酢酸からなる群より選択される請求項４のナノマシン。
- 折り返した単一バイオエラストマー鎖で形成されるナノマシンであって、強制的なアンフォールディングで張力−伸びプロフィールの張力のピーク到達又は増大をもたらすようにした請求項１のナノマシン。
- 単一鎖が各末端に二酸、三酸又は四酸をもつ請求項６のナノマシン。
- 酸がアジピン酸、ケンプ三酸及びエチレンジアミン四酢酸からなる群より選択される請求項７のナノマシン。
- ナノケモメカニカル系である請求項１のナノマシン。
- ナノエレクトロメカニカル系である請求項１のナノマシン。
- ナノバロメカニカル系である請求項１のナノマシン。
- ナノサーモメカニカル系である請求項１のナノマシン。
- ナノホトメカニカル系である請求項１のナノマシン。
- バイオセンサーである請求項１のナノマシン。
- バイオエラストマーの長さが１０，０００アミノ酸残基未満である請求項１のナノマシン。
- バイオエラストマーが各末端に二酸、三酸又は四酸をもち、かつカンチレバーと基板の間に吊られる請求項１のナノマシン。
- カンチレバーの探針と基板の表面にシステインの硫黄が酸末端において結合する請求項１６のナノマシン。
- カンチレバーの探針と基板の表面に、酸末端のシステイン残基硫黄に取って代わったアミノ基又はカルボキシル基が結合する請求項１６のナノマシン。
- カンチレバーがバイオエラストマーによって吸収される振動エネルギーを検知する請求項１６のナノマシン。
- バイオエラストマー中の３０〜５００アミノ酸残基につきセリン残基１個がリン酸化される請求項１のナノマシン。
- バイオエラストマー中の２０〜２００アミノ酸残基につき２アミノ酸残基の側鎖カルボキシル基がイオン化される請求項１のナノマシン。
- バイオエラストマー中の２０〜２００アミノ酸残基につき２アミノ酸残基にレドックス官能基が結合している請求項１のナノマシン。
- バイオエラストマーがゴム弾性ポリペンタペプチドを含む請求項１のナノマシン。
- バイオエラストマーが式ＧＸ３ＧＸ４Ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０； 式中Ｘ３はバリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、リシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）及びアラニン（Ａ）からなる群より選択され、またＸ４はＶ、Ｅ、Ｆ及びイソロイシン（Ｉ）からなる群より選択される］で示される１以上のペンタペプチドを含む請求項２３のナノマシン。
- １以上のペンタペプチド単量体単位がＧＶＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はＧＶＧＩＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である請求項２４のナノマシン。
- バイオエラストマーが架橋結合体である請求項１のナノマシン。
- バイオエラストマーが２以上の単量体単位を含むブロック又はランダム共重合体を含む請求項１のナノマシン。
- バイオエラストマーが１以上の細胞接着部位を更に含む請求項１のバイオセンサー。
- 細胞接着部位が式ＧＲＧＤＳＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で示される請求項２８のバイオセンサー。
- バイオエラストマーが１以上のキナーゼ認識部位を更に含む請求項１のバイオセンサー。
- キナーゼ認識部位が式ＲＧＹＳＬＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）で示される請求項３０のバイオセンサー。
- バイオエラストマーがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８からなる群より選択される請求項１のナノマシン。
- 約１０〜１０１５サイクル毎秒の周波数レンジにわたるエネルギー入力の検知又はエネルギー出力の供給が可能である請求項１のナノマシン。
- 周波数レンジが約１０〜１０５サイクル毎秒である請求項３３のナノマシン。
- バイオエラストマーがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされる請求項３４のナノマシン。
- 周波数レンジが約１０２〜１０４サイクル毎秒である請求項３３のナノマシン。
- ノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰返しペプチド単量体単位をもつバイオエラストマーを含むバイオセンサーであって、該単量体単位が一連のβ−ターンを形成し、一連のβ−ターンはβ−ターン間に吊り下がった動的架橋セグメントで仕切られるバイオセンサー。
- バイオエラストマーがナノパーティクルの形をとる請求項３７のバイオセンサー。
- バイオエラストマーが多ストランド・ナノフィラメントの形をとる請求項３７のバイオセンサー。
- 折り返した単一バイオエラストマー鎖でナノマシンが形成され、強制的アンフォールディングで張力−伸びプロフィールの張力のピーク到達又は増大をもたらすようにした請求項３７のナノマシン。
- 化学種の存在の検出に有効である請求項３７のバイオセンサー。
- バイオエラストマー中の３０〜５００アミノ酸残基につきセリン残基１個がリン酸化される請求項３７のバイオセンサー。
- バイオエラストマー中の２０〜２００アミノ酸残基につき２アミノ酸残基の側鎖カルボキシル基がイオン化される請求項３７のバイオセンサー。
- バイオエラストマー中の２０〜２００アミノ酸残基につき２アミノ酸残基にレドックス官能基が結合している請求項３７のバイオセンサー。
- バイオエラストマーが弾性ポリペンタペプチドを含む請求項３７のバイオセンサー。
- バイオエラストマーが式ＧＸ３ＧＸ４Ｐ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０； 式中Ｘ３はバリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、リシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）及びアラニン（Ａ）からなる群より選択され、またＸ４はＶ、Ｅ、Ｆ及びイソロイシン（Ｉ）からなる群より選択される］で示される１以上のペンタペプチドを含む請求項４５のバイオセンサー。
- １以上のペンタペプチド単量体単位がＧＶＧＶＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はＧＶＧＩＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である請求項４６のバイオセンサー。
- バイオエラストマーが架橋結合体である請求項３７のバイオセンサー。
- バイオエラストマーが２以上の単量体単位を含むブロック又はランダム共重合体を含む請求項３７のバイオセンサー。
- バイオエラストマーが１以上の細胞接着部位を更に含む請求項３７のバイオセンサー。
- 細胞接着部位が式ＧＲＧＤＳＰ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）で示される請求項５０のバイオセンサー。
- バイオエラストマーが１以上のキナーゼ認識部位を更に含む請求項３７のバイオセンサー。
- キナーゼ認識部位が式ＲＧＹＳＬＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）で示される請求項３０のバイオセンサー。
- バイオエラストマー鎖と直列をなし、結合部位をもつ単一球状ドメインであって、該結合部位への分析物の結合が疎水的にフォールディングした該球状ドメインを異なるレベルの力でアンフォールディングさせる単一球状ドメインを更に含む請求項３７のバイオセンサー。
- 球状ドメインが酵素認識部位を含み、該酵素認識部位がリン酸化に伴い、疎水的にフォールディングした該球状ドメインをより低レベルの力でアンフォールディングさせる請求項５４のバイオセンサー。
- バイオエラストマーがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８からなる群より選択される請求項３７のバイオマシン。
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