BIOPOLÍMERO TERMOSENSIBLE Y BIOACTIVO Y MÉTODO DE RECOLECCIÓN CELULAR ASOCIADO
La presente invención pertenece al campo de la ingeniería de tejidos y se refiere a un biopolímero y a un soporte de recolección celular que lo comprende, y que permite la recolección celular de manera sencilla y eficaz. Las células adheridas al soporte se liberan mediante un simple cambio de temperatura preservando las proteínas de la superficie celular y manteniendo una elevada viabilidad celular. Además, la superficie puede presentar selectividad a diferentes líneas celulares de manera global o localizada y no libera restos en el tejido generado, debido a que el biopolímero termosensible está covalentemente unido al soporte.
ESTADO DE LA TÉCNICA
En el campo de la ingeniería de tejidos la combinación de diferentes materiales con células vivas proporciona una novedosa e interesante vía para llevar a cabo terapias regenerativas. Las superficies pueden ser funcionalizadas dotándolas con propiedades adherentes o antiadherentes, grupos específicos que promueven las interacciones entre el material y las células, comportamiento inteligente (sensibilidad a estímulos) o con micro o nanoestampados.
Tanto superficies inteligentes como sistemas de liberación de drogas, órganos artificiales y sistemas para medicina regenerativa se desarrollan normalmente a partir de nuevos materiales biofuncionales con propiedades de gran interés para el campo de la investigación biomédica y con sensibilidad a diferentes estímulos. Más concretamente, para estas aplicaciones, existen materiales que son sensibles frente a una amplia variedad de estímulos como luz, temperatura, pH, fuerza iónica o campos eléctricos. Un cierto estímulo puede modificar el estado o la configuración de diferentes biomoléculas alterando su afinidad por una determinada superficie y en consecuencia permitiendo
impidiendo su adsorción (Hyun, J. y colaboradores (cois.) 2004 Journal of the American Chemical Society. 126, 7330-7335). Es decir, estos sistemas responden a estímulos.
Las superficies sensibles a la temperatura obtenidas a partir de determinados materiales experimentan un cambio en su conformación molecular como respuesta a cambios de temperatura en el ambiente. Algunos polímeros muestran un comportamiento inverso en respuesta a la temperatura. Llegan a estar menos solvatados cuando se incrementa la temperatura y precipitan desde la solución a la temperatura llamada "lower critical solution temperature" (LCST). Entre los polímeros que responden a estas características, utilizados para bio-aplicaciones podemos encontrar las poliacrilamidas N-alquil sustituidas, polialcoholes, o polipéptidos. Estos últimos pueden ser tanto naturales como producidos a través de técnicas de ingeniería genética y, en consecuencia, poseer altos niveles de especificidad, contener grupos específicos para un gran número de aplicaciones e incluso ser biodegradables. De entre ellos, los polímeros tipo elastina (ELPs) son un excelente ejemplo (Colé, M. A. y cois. 2009 Biomaterials. 30, 1827-50).
Una de las aplicaciones biomédicas más estudiadas y de mayor interés en que se utilizan superficies inteligentes sensibles a la temperatura, consiste en el crecimiento y liberación de células, y más concretamente de láminas de células.
El modelo de sistema sensible a la temperatura más común y ampliamente estudiado ha sido el poli(N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) desarrollado por Okano. PIPAAm exhibe una LCST en medio acuoso de 32° C. Por debajo de esta temperatura en solución acuosa está completamente hidratado con una conformación extendida, mientras que por encima de la LCST esta deshidratado y compactado. Así, las superficies de PIPAAm permiten modular las interacciones moleculares en función de la temperatura y podemos encontrar trabajos de adhesión/desadhesión reversible de proteínas, células de
mamífero y bacterias dependientes de la temperatura (Colé, M. A. y cois. 2009 Biomaterials. 30, 1827-50).
Existen polímeros con propiedades de respuesta a la temperatura similares al PIPAAm que permiten el cultivo celular de una gran variedad de tipos de células, ya que adoptan un estado colapsado por encima de su temperatura de transición (37°C). La reducción de la temperatura por debajo de esta temperatura crítica del polímero provoca que este se despliegue y comience a liberar células vivas, o si éstas han alcanzado la confluencia, una lámina celular intacta. Así, es posible recolectar rápidamente células individuales o láminas celulares intactas usando sólo un descenso de la temperatura (Kikuchi, A y cois. 1998. Journal of Biomaterials Science-Polymer Edition. 9, 1331 -1348).
El despegue celular desde las superficies no solo involucra la reducción de las interacciones entre ellas y la superficie, por la hidratación espontánea de las cadenas poliméricas unidas a la misma, sino que también implica un cambio activo en la morfología celular y en la actividad metabólica de las células. Por tanto, este tipo de polímeros sensibles a la temperatura permiten mediante un simple cambio de temperatura recolectar cultivos confluentes de un gran número de tipos celulares como una capa de células, parecido a lo que puede ser un tejido, manteniendo las interacciones entre células y de las células con las proteínas de la matriz extracelular (Kushida, A., y cois. 1999. Journal of Biomedical Materials Research. 45, 355-362). La sustracción de células en un cultivo siempre ha requerido fuertes métodos enzimáticos o mecánicos que tienen efectos nocivos en la morfología de las células que se están recolectando. Estos cambios en la morfología han sido recientemente atribuidos a alteraciones de la membrana celular y el glicocálix, que a menudo conllevan una pérdida de actividad celular. Se ha comprobado que estos cambios también afectan a la matriz extracelular, la cual es vital para la adhesión, la proliferación y la diferenciación de las células, lo que tiene implicaciones importantes durante el cultivo celular. Se ha demostrado que el
método del despegue celular mediante un descenso en la temperatura es mucho menos destructivo para obtener una monocapa de células. Este método además provoca un efecto mucho menor sobre la matriz extracelular en comparación con los otros métodos y técnicas más tradicionales. De este modo, se pueden obtener láminas de células aparentemente sin ningún daño a la matriz extracelular (Canavan, H. E., y cois. 2005. J Biomed Mater Res A. 75, 1 -13). Esta técnica ha sido aplicada con éxito a una amplia variedad de tipos celulares incluyendo células del músculo liso, hepatocitos, células endoteliales, fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales, macrófagos, células de la microglia y células madre.
Usando láminas celulares recolectadas a partir de superficies funcionalizadas con PIPAAm, Okano y cois, han establecido lo que se conoce como ingeniería de láminas celulares para crear multicapas de tejido funcionales con el objeto de tratar un amplio rango de enfermedades como disfunción de la cornea, cáncer de esófago, resección traqueal, y problemas cardiacos. Más recientemente se ha desarrollado un tejido tridimensional compuesto por las células y su matriz extracelular depositada muy vascularizado obteniéndose sistemas parecidos a órganos como el corazón y el hígado (Yang, J. y cois. 2007 Biomaterials. 28, 5033-43).
Otro avance en este campo ha sido el cultivo conjunto de diferentes tipos de células sobre una misma superficie. Por ejemplo superficies cubiertas con dos polímeros sensibles a la temperatura, pero diferentes, con una temperatura de transición y una secuencia de adhesión celular distinta, permitiendo el control del sistema (Tsuda, Y. y cois. 2005 Biomaterials. 26, 1885-93).
Otras estrategias han consistido en la inmovilización de péptidos que promueven adhesión celular como RGD (Ozturk, N. y cois. 2009. Biomaterials. 30, 5417-26), factores de crecimiento como la insulina, factores de crecimiento epidérmicos o ELPs sensibles a temperatura con propiedades adhesivas (Hatakeyama, H. y cois. 2006 Biomaterials. 27, 5069-78) para promover la
unión celular y la comunicación de las células con el material sobre las superficies inteligentes (Ebara, M. y cois. 2008 Advanced Materials. 20, 3034- 3038; Mié, M. y cois. 2008 J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 86, 283-90). Esta aproximación muestra el potencial de estos sistemas en el campo de la ingeniería de tejidos, ya que no necesitan factores de crecimiento adicionales. Además se podrían seleccionar y separar diferentes tipos de células mediante la utilización de dominios específicos de adhesión celular, por ejemplo a células endoteliales mediante el dominio REDV (Girotti, A., y cois. 2004 J. Mater. Sci.: Mater. Med. 15, 479-484). De este modo, los polipéptidos, ya sean naturales o sintetizados mediante técnicas de ingeniería genética a través de la tecnología del ADN recombinante disponible para sintetizar genes repetitivos (Rodríguez- Cabello J.C. y cois. 2010 J. Mater. Sci.: Mater. Med. 15(4): 479-84, Macewan, S. R. y cois. 2010 Biopolymers 94(1 ): 60-77), muestran un gran potencial en aplicaciones biomédicas debido a que pueden ser producidos con altos niveles de especificidad, conteniendo grupos funcionales como dominios de adhesión celular, dominios de entrecruzamiento para unión covalente a la superficie y/o dominios que pueden ser reconocidos por proteasas más o menos específicas que los convierten en biodegradables. Así, un mismo polímero puede contener diferentes dominios conservando al mismo tiempo la respuesta inteligente a la temperatura. Los ELPs son uno de los mejores ejemplos de este tipo de polímeros. Por ejemplo, Na y cois, han creado biochips basados en células aprovechando la ventaja que proporciona la rápida respuesta de un material inteligente ante estímulos externos para crear superficies mediante adsorción de ELPs. La transición inteligente de los ELPs hace que al unirlos a una superficie de vidrio, dicha superficie cambie de un estado hidrofóbico a uno hidrofílico y viceversa, en función de la temperatura, lo que hace que se pueda controlar la adhesión reversible de células mediante la temperatura de incubación (Na, K. y cois. 2008 Langmuir. 24, 4917-23; Rodríguez-Cabello, J.C. y cois. 2010 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 1 -35).
Por otro lado, se ha demostrado que es posible despegar células individuales o láminas celulares utilizando membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF)
mediante un simple y pequeño descenso en la temperatura y traspasarlas a una nueva superficie para la creación de multicapas celulares, lo que sugiere el gran potencial de esta aproximación (Zhang, H. y cois. 2006 Tissue Eng. 12, 391 -401 ).
Continuando con esta idea, Mié y cois, han desarrollado, mediante técnicas genéticas, una nueva matriz extracelular que contiene dos ELPs con diferentes funcionalidades (cola de polihistidinas y secuencia RGD) para recolectar una lámina de células desde la placa de cultivo con una reducción de la temperatura (Mié, M. y cois. 2008 J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 86, 283-90).
Por tanto, los ELPs son excelentes candidatos para llevar a cabo la recolección celular o "cell harvesting" debido a su carácter inteligente frente a la temperatura, biocompatibilidad y capacidad para incorporar dominios de adhesión celular, de entrecruzamiento o biodegradabilidad en su secuencia; proporcionando un alto potencial en aplicaciones biomédicas. Además, son sistemas apropiados para la recolección celular no mecánica y sin tripsinización, evitando de esta manera los inconvenientes que estos procedimientos conllevan como la necesidad de unas manos expertas y el daño ocasionado en las proteínas de la superficie celular y consecuente disminución de la viabilidad celular.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a unos biopolímeros, a las superficies termosensibles y bioactivas que los comprenden y a su uso para recolección celular. La naturaleza termosensible de los biopolímeros de la invención permite una recolección celular rápida y eficaz por un simple cambio de temperatura consiguiendo una viabilidad superior a la de los otros procedimientos descritos
en el estado de la técnica. Por otro lado, debido a que es posible diseñar los biopolímeros con secuencias específicas de unión celular a uno o a varios tipos celulares, es posible construir sustratos selectivos para ingeniería de tejidos. Los sistemas descritos en el estado de la técnica presentan algunas carencias ya que, por ejemplo, parte del polímero depositado en la superficie se va a introducir en las láminas o células recolectadas a modo de contaminante y se va a arrastrar en las etapas sucesivas con los riesgos que esto conlleva y, por otro lado, todavía no es posible disponer o agrupar de forma eficaz diferentes tipos de células de manera ordenada o estructurada en una lámina. En este sentido, el polímero de la invención presenta una gran ventaja, ya que en lugar de depositarse sobre la superficie de manera indiscriminada, es injertado mediante un enlace covalente de forma controlada y de manera que el sistema sigue siendo termosensible y eficaz para la recolección celular.
Los autores de la presente invención han descrito un sistema para cultivos celulares en superficie que permite la recolección celular de manera sencilla y eficaz. La superficie donde se cultivan las células se encuentra modificada de manera que une covalentemente unos biopolímeros termosensibles que a su vez unen selectivamente diferentes tipos celulares. Las células adheridas pueden liberarse de la superficie mediante un simple cambio de temperatura, preservando las proteínas de la superficie celular y manteniendo una elevada viabilidad celular. Además, la superficie de cultivo puede unir las células en toda su extensión o de manera localizada.
Debido a que los biopolímeros termosensibles utilizados se injertan mediante enlace covalente en la superficie, la liberación del tejido generado se produce sin arrastrar restos del biopolímero. El biopolímero de la presente invención se basa en general en repeticiones de dominios presentes en la elastina natural, que no son tóxicos y por tanto adecuados para la interacción con las células. Además, presenta un dominio
central bioactivo basado en una secuencia de unión celular, y un dominio con grupos reactivos, como por ejemplo el grupo amino de la lisina, para la unión covalente a la superficie de cultivo. El biopolímero de la presente invención ha sido producido mediante la tecnología del ADN recombinante.
Asimismo, la presente invención se refiere a cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para la secuencia aminoacídica de los biopolímeros de la invención, a sus usos y a un método de síntesis del mismo.
En la presente invención se producen superficies bioactivadas con polímeros injertados mediante química "c//c/ ". Dichas superficies que inducen adhesión celular selectiva, proliferación celular y desarrollo de tejidos sobre ellas responden a la temperatura como sistema para conmutar y controlar su bioactividad. De esta forma, una vez cultivadas las células, o formado el tejido o capas celulares, estas se desadhieren de la superficie sin dañarse ni contaminarse, demostrando que el sistema de recolección celular es rápido, sencillo de manejar y eficaz. Por otro lado, es posible predefinir un patrón sobre la superficie para que las células tengan mayor afinidad por diferentes zonas de la superficie e incluso se estructuren en la monocapa siguiendo ese mismo patrón.
Por tanto, esta invención se fundamenta en tres pilares. El primero de ellos consiste en la posibilidad de anular la capacidad de adhesión celular del soporte debido a la termosensibilidad del biopolímero. El segundo consiste en la posibilidad de diseñar biopolímeros con diferentes bioactividades o secuencias de unión celular específicas. Y el tercero consiste en la capacidad de injertar los polímeros permanentemente y de manera controlada y eficaz sobre la superficie sin que pierdan sus anteriores cualidades.
Los biopolímeros se han obtenido con un alto grado de eficiencia, complejidad, control y robustez. Estas cualidades se deben a que se han considerado las fuerzas hidrofóbicas de los aminoácidos. De este modo, se puede disponer de un control preciso y cuantitativo del fenómeno de transición inversa que se da en estos materiales, y por tanto de la temperatura (Tt) a la que estos polímeros pasan de ser bioactivos a convertirse en no bioactivos.
Los biopolímeros se han obtenido empleando la tecnología de ADN recombinante, mediante la clonación de una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia aminoacídica del biopolímero de la invención en un vector capaz de expresar dicha secuencia. Mediante esta tecnología se aprovecha la maquinaria de replicación, transcripción y traducción de los organismos capaces de producir los biopolímeros. Los biopolímeros de la invención contienen dominios laterales tipo elastina para dotarlos de la necesaria respuesta térmica. Además, contienen un dominio central bioactivo con una secuencia de unión celular (RGD, REDV, etc.). Por último, contienen un dominio reactivo químicamente en su extremo, como son por ejemplo los grupos amino de la lisina (Figura 1 ).
El injerto del polímero sobre la superficie consiste en la activación de la superficie, y su biofuncionalización mediante enlace covalente por reacción química de ciclación tipo "c//c/ ". Una vez biofuncionalizada la superficie, se procede al sembrado y cultivo de las células hasta conseguir el desarrollo tisular. En este momento se disminuye la temperatura a valores inferiores a la temperatura de transición del polímero bioactivo y, de esta manera, se consigue la modificación en la conformación de dicho polímero, que da lugar a un sustrato no adherente del que la capa celular se separa espontáneamente. La explicación a nivel molecular del fenómeno adhesión-desadhesión se fundamenta en un fenómeno de auto-organización de las cadenas moleculares en la nanoescala que se produce como consecuencia de los cambios de
temperatura del sistema. En este proceso, a la temperatura del cultivo y en presencia de agua las cadenas se encuentran en una conformación plegada en que los dominios de unión celular polares tienden a estar expuestos hacia el exterior. Al disminuir la temperatura, las cadenas se despliegan dejando los dominios de unión celular inaccesibles a las células, convirtiéndose en una superficie no adherente de la que se despegan las células (Figura 2).
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un biopolímero que comprende los péptidos A, B y D, con la estructura [(D-Bn-Am- Bs)], donde
A tiene la estructura (Fti-G-Ft2), donde
F tiene la estructura X1-X2-X3-X4-X5, donde X1 y X4 pueden ser cualquier aminoácido excepto los aminoácidos prolina, lisina, serina y cisteína, X2 es el aminoácido prolina, X3 puede ser el aminoácido glicina o el aminoácido alanina y X5 es el aminoácido glicina,
G es una secuencia de unión celular, t1 y t2 tienen valores de entre 8 y 12,
B tiene la estructura Y1-Y2-Y3-Y4-Y5, donde Y1 e Y4 pueden ser cualquier aminoácido excepto los aminoácidos prolina, lisina, serina y cisteína, Y2 es el aminoácido prolina, Y3 puede ser el aminoácido glicina o el aminoácido alanina y Y5 es el aminoácido glicina,
D comprende un péptido de 2 a 10 aminoácidos iguales o diferentes que se seleccionan de la lista que comprende: lisina, cisteína, serina, asparragina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico, n tiene un valor de entre 10 y 18,
m tiene un valor de entre 1 y 3, y
s tiene un valor de entre 10 y 18.
El péptido A es la secuencia aminoacídica bioactiva que comprende la secuencia de unión celular. El péptido B es un dominio de tipo elastina, al igual que el péptido F. El péptido D es el dominio reactivo, pues contiene los aminoácidos polares que van a permitir el injerto del biopolímero en la superficie de manera covalente mediante los grupos reactivos de sus cadenas laterales.
Las secuencias aminoacídicas (se puede usar el término "péptidos" indistintamente para referirse a las secuencias aminoacídicas) A, B, D, F y G de
acuerdo con las estructuras descritas que dan lugar a los biopolímeros de la invención, pueden estar unidos por enlace covalente o cualquier otro tipo de enlace que de lugar a una estructura que mantenga las propiedades de los biopolímeros de la presente invención. El enlace se selecciona, aunque sin limitarse, de la lista que comprende puentes de hidrógeno, apareamiento iónico, asociación hidrofóbica o formación de complejos de inclusión.
En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, G es una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que se selecciona de la lista que comprende RGD, LDT, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, o un dominio de unión a heparina o un dominio de unión a azúcares derivado de lectina y aglutinina.. Preferiblemente, G comprende el dominio RGD. Más preferiblemente, G es SEQ ID NO: 1 .
El dominio RGD es bien conocido y consiste, como su nombre indica, en los aminoácidos arginina, glicina y ácido aspártico. Este dominio es reconocido por proteínas de la superficie celular de diversos tipos celulares y funciona como un dominio de adhesión celular. SEQ ID NO: 16 es el dominio REDV, también bien conocido, y que consiste, como su nombre indica, en los aminoácidos arginina,
ácido glutámico, ácido aspártico y valina; también funciona como un dominio de adhesión celular y es reconocido por células endoteliales. Un dominio de unión a heparina funciona como dominio de unión celular puesto que es un dominio de unión a glicosaminoglicanos de la superficie celular. Igualmente, un dominio de unión a azúcares permite la unión a las células a través de los azúcares que presentan las glicoproteínas de membrana. La lectina y la aglutinina tienen dominios bien conocidos de unión a azúcares. SEQ ID NO: 18 está presente en la laminina y es reconocida por diversos tipos celulares, SEQ ID NO: 19 es reconocida por neuritas, es decir, cualquier expansión del soma de una neurona, ya sea una dendrita o un axón. Estas secuencias, que forman parte del biopolímero de la invención, son reconocidas por sus respectivos tipos celulares y propician su unión. Los biopolímeros que contengan SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 19 se pueden emplear en la generación de tejidos vasculares o tejidos nerviosos, respectivamente.
El dominio G ha de presentar una secuencia eficaz de unión celular para que el biopolímero de la invención funcione adecuadamente en un sistema de recolección celular, como muestran los ejemplos de la presente invención. En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, Xi es el aminoácido valina, leucina o isoleucina. Preferiblemente, F es SEQ ID NO: 2.
En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, Yi es el aminoácido valina, leucina o isoleucina. Preferiblemente, B es SEQ ID NO: 3.
En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, D comprende un péptido de 3 a 5 aminoácidos iguales o diferentes que se seleccionan de la lista que comprende: lisina, cisteína, serina, asparragina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico.
En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, los aminoácidos iguales o diferentes del péptido que comprende D se seleccionan de la lista que comprende: lisina, cisteína, serina, asparragina y glutamina.. Preferiblemente, los aminoácidos del péptido que comprende D son iguales y son el aminoácido lisina.
El dominio D ha de comprender al menos dos aminoácidos cuya cadena lateral presente un grupo reactivo, necesario para la reacción que permitirá injertar la molécula de biopolímero por uno de sus extremos a la superficie de cultivo, mediante enlaces covalentes. Por tanto, D comprende entre 2 y 10 aminoácidos polares con un grupo reactivo en su cadena lateral (como lisina, cisteína, serina, asparragina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico), preferiblemente entre 3 y 5 de estos aminoácidos. Los aminoácidos lisina, cisteína, serina, asparragina y glutamina son preferidos para llevar a cabo la unión covalente entre el biopolímero y la superficie mediante una modificación a azida de los grupos amina de las cadenas laterales de estos aminoácidos. Cuando se emplean estos aminoácidos en el dominio D, este se sitúa en el extremo N-terminal del biopolímero. La lisina es el aminoácido preferido para formar los enlaces covalentes entre el dominio D del biopolímero y la superficie de cultivo debido a la facilidad que presenta el grupo amino de su cadena lateral para dar la reacción de sustitución nucleófila con la azida reactiva, como se muestra en los ejemplos de la presente invención.
Los aminoácidos con un grupo carboxilo en su cadena lateral, como ácido aspártico y ácido glutámico, también pueden ser empleados para unir covalentemente el biopolímero por su extremo a la superficie, aunque mediante otras reacciones bien conocidas por el experto en la materia. Cuando se emplean estos aminoácidos en el dominio D, este se sitúa en el extremo C- terminal del biopolímero, ya que el grupo carboxilo terminal del propio
biopolímero podrá participar también en la formación del enlace covalente con al superficie.
La lisina es el aminoácido preferido para formar los enlaces covalentes entre el dominio D del biopolímero y la superficie de cultivo debido a la facilidad que presenta el grupo amino de su cadena lateral para dar la reacción de sustitución nucleófila con la azida reactiva, como se muestra en los ejemplos de la presente invención. En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, t1 y t2 tienen valores de entre 9 y 1 1 .
En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, n tiene un valor de entre 12 y 16.
En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, m tiene un valor de entre 1 y 2.
En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, s tiene un valor de entre 12 y 16.
En una realización preferida del biopolímero del primer aspecto de la presente invención, D es el péptido SEQ ID NO: 4, B es el péptido SEQ ID NO: 3, n y s tienen el valor de 14, F es el péptido SEQ ID NO: 2, t1 y t2 tienen el valor de 10, G es el péptido SEQ ID NO: 1 y m tiene el valor de 2.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia aminoacídica del biopolímero del primer aspecto de la invención. Preferiblemente, dicho ácido nucleico es un vector de expresión.
El término "vector de expresión" (en adelante, vector de la invención o vector de la presente invención) se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado huésped y, como el término indica, puede servir de vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en el caso de la presente invención, el vector puede comprender cualquiera de las secuencias nucleotídicas que codifican para cualquiera de los biopolímeros de la invención, fusionadas al mismo, que puede replicarse en el huésped adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o vectores virales, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con la definición realizada de vector.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una célula aislada transfectada con el ácido nucleico del segundo aspecto de la invención.
El término "célula" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a una célula procariótica o eucariótica. La célula puede ser una bacteria capaz de replicar un ADN ajeno transformado como por ejemplo cualquiera de las cepas de la especie Escherichia coli o una bacteria capaz de transferir el ADN de interés al interior de una planta como por ejemplo Agrobacterium tumefaciens. Preferiblemente, la célula hace referencia a una célula eucariótica vegetal y dentro de este grupo, más preferiblemente, a aquellas células pertenecientes al reino Plantae. Así pues, en el caso de que la célula sea vegetal, el término célula comprende, al menos, una célula del parénquima, célula meristemática o de cualquier tipo, diferenciada o indiferenciada. Asimismo, también se incluye en esta definición un protoplasto (célula de una planta que carece de pared celular).
El término "transfección" hace referencia a la introducción de material genético externo en células mediante plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de transduccion) u otras herramientas para la transferencia. El término transfección para métodos no-virales es usado en referencia a células
eucarióticas de mamífero, mientras que el término transformación se prefiere para describir las transferencias no-virales de material genético en bacterias y células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas. Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso del biopolímero del primer aspecto de la invención, del ácido nucleico del segundo aspecto de la invención, o de la célula del tercer aspecto de la invención, para la preparación de un soporte de recolección celular. El término "soporte" para la recolección celular, es una superficie de cualquier tipo sobre la cual pueden adherirse células. Se conocen multitud de soportes para el cultivo celular, como placas, partículas, frascos, cubetas, superficies porosas, membranas, y demás, que pueden estar compuestas por distintos materiales, plásticos preparados para cultivo celular, vidrio, y otros, que a su vez pueden estar pretratados con distintas moléculas que permiten y favorecen dicho cultivo celular, como fibronectina, colágeno, laminina, polilisina, poliornitina, etc. El soporte se refiere únicamente a la superficie sobre la cual se siembran las células, y no incluye otros accesorios como tapones, tapas, etc. Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un soporte de recolección celular que comprende el biopolímero del primer aspecto de la invención. Preferiblemente, la unión entre el biopolímero y el soporte se lleva a cabo mediante al menos dos enlaces covalentes por molécula de biopolímero, más preferiblemente, por tres enlaces covalentes por molécula de biopolímero. Preferiblemente, en los enlaces covalentes reaccionan los grupos amino o los grupos carboxilo de las cadenas laterales de al menos dos de los aminoácidos del péptido D. Preferiblemente, la superficie del soporte es lisa o curva. Más preferiblemente, el soporte consiste en micropartículas. Preferiblemente, las micropartículas son esféricas o pseudoesféricas.
En el caso de biorreactores, el cultivo celular puede ser más interesante realizarlo sobre micropartículas que sobre una superficie lisa o una superficie mayor. Un sexto aspecto de la presente invención se refiere al uso del soporte del quinto aspecto de la invención para la recolección celular.
Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo de cultivo y recolección celular que comprende el soporte del quinto aspecto de la invención.
El término "dispositivo" para la recolección celular se refiere al equipo necesario para dicho cultivo celular, y puede ser una placa, que incluye el soporte y la tapa, o una cámara de cultivo dentro de la cual se localiza el soporte que comprende el biopolímero de la invención, y que permite regular las condiciones de temperatura y de presión de CO2 y O2, por ejemplo.
Un octavo aspecto de la presente invención se refiere al uso del dispositivo de recolección celular del séptimo aspecto de la invención para el cultivo y la recolección celular. Preferiblemente, se usa para el cultivo celular en un biorreactor.
Un noveno aspecto de la presente invención se refiere a un método para la recolección celular que comprende las siguientes etapas:
(a) funcionalizar un soporte de cultivo celular,
(b) unir covalentemente el soporte funcionalizado en la etapa (a) a al menos dos de los aminoácidos del péptido D del biopolímero del primer aspecto de la invención,
(c) poner en contacto una suspensión celular con el soporte obtenido en (b), y
(d) recolectar las células adheridas a dicho soporte.
El término "funcionalizar" se refiere a la adición de grupos funcionales.
En una realización preferida del método del noveno aspecto de la presente invención, la funcionalización del soporte se lleva a cabo con grupos alquinilo, con grupos alqueno, con grupos nitrilo, con grupos carbonilo o con grupos ¡mina. Preferiblemente, la funcionalización del soporte se lleva a cabo con grupos alquinilo.
En una realización preferida del método del noveno aspecto de la presente invención, la recolección de las células adheridas al soporte se lleva a cabo mediante una disminución de la temperatura del cultivo celular de 10 a 37° C.
En una realización preferida del método del noveno aspecto de la presente invención, entre las etapas (c) y (d) se lleva a cabo la siguiente etapa:
(c') cultivar las células de (c) hasta que proliferen y formen una monocapa.
Las células en cultivo pueden dividirse, de forma que cuando se siembran, no cubren toda la superficie de cultivo y, a medida que se van dividiendo, van formando una capa de una sola célula de grosor que cubre toda la superficie de cultivo. Esto se llama formar una monocapa y alcanzar la confluencia.
En una realización preferida del método del noveno aspecto de la presente invención, antes de la etapa (b) se transforman los grupos reactivos de las cadenas laterales de al menos dos de los aminoácidos del péptido D del biopolímero del primer aspecto de la invención, en grupos azida.
En una realización preferida del método del noveno aspecto de la presente invención, la unión covalente de la etapa (b) se realiza mediante cicloadición.
La cicloadición mediante la cual se une el biopolímero de la invención al soporte de recolección celular se basa en una estrategia sintética denominada
"click-chemistry". Esta estrategia está basada en reacciones que permiten el acoplamiento de bloques modulares de una manera selectiva y eficiente tanto en aplicaciones a pequeña escala como en procesos a gran escala. Las reacciones que pueden considerarse dentro de esta estrategia "click" deben cumplir una serie de requisitos bien definidos, como son los siguientes: debe ser modular, aplicable en un rango amplio de situaciones, de elevado rendimiento, generar como subproductos sustancias no tóxicas y debe ser estereoespecífica (no necesariamente enantioselectiva). Además, estas reacciones se deben poder llevar a cabo en condiciones suaves, a partir de productos de partida fácilmente disponibles y en ausencia de disolventes orgánicos o en pequeñas cantidades de los mismos y los productos finales deben ser fáciles de aislar.
Existen varios tipos de transformaciones que podrían incluirse dentro de la categoría de "click chemistry", pero sin duda la reacción de cicloadición de Hüisgen 1 ,3-dipolar de alquinos y azidas catalizada por Cu(l), para dar lugar a 1 ,2,3 triazoles es el ejemplo más característico y utilizado de todas ellas. Ello se debe a la facilidad de síntesis de derivados alquino y azida, junto a su estabilidad cinética y su tolerancia a una gran variedad de grupos funcionales y condiciones de reacción. Esta reacción se puede llevar a cabo en presencia de grupos funcionales y en rendimientos prácticamente cuantitativos.
Un décimo aspecto de la presente invención se refiere a un método para la obtención del biopolímero del primer aspecto de la invención que comprende las siguientes etapas:
(a) cultivar la célula del tercer aspecto de la invención en las condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico del segundo aspecto de la invención.
(b) purificar el biopolímero codificado por dicho ácido nucleico.
El grado de complejidad composicional impuesto por las necesidades del diseño multifuncional no puede ser alcanzado por técnicas estándar de síntesis
macromolecular. El biopolímero se obtiene como proteína recombinante, mediante técnicas adaptadas de biología molecular y biotecnológica, en microorganismos o plantas modificados genéticamente. La secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia aminoacídica del biopolímero de la presente invención, se inserta en un vector de expresión definido anteriormente.
La transfección de una célula, definida en un párrafo anterior, se lleva a cabo con técnicas conocidas en el estado de la técnica, por ejemplo pero sin limitarse, con electroporación, con biolística, Agrobacterium tumefaciens o cualquier otra técnica que permita la integración de cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención en el ADN de la célula huésped, ya sea genómico, cloroplástico o mitocondrial.
La expresión del ácido nucleico en la célula de la invención da lugar a un biopolímero que puede ser purificado mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Esquema del biopolímero de la invención anclado a la superficie de cultivo. Los puntos negros representan los dominios reactivos para la unión
covalente al sustrato y los puntos estrellados en medio de la molécula del biopolímero representan el dominio de reconocimiento celular.
Figura 2. Esquema del cultivo celular sobre el biopolímero y de cómo las células se separan cuando la temperatura baja de 37° C a 4° C, al no quedar accesible el dominio de reconocimiento celular.
Figura 3. Electroforesis en gel de acrilamida del biopolímero 1 con el marcador de peso molecular en el carril de la izquierda y el biopolímero 1 en el carril de la derecha. Los pesos moleculares se indican en kilodaltons (kDa).
Figura 4. Análisis de espectroscopia de masas (MALDI-ToF, del ingles "Matrix- assisted láser desorption/ionization- time of fligh ) del biopolímero 1 en el cual se muestra el valor de su Masa Molecular experimental de 31 .246 Da, siendo el teórico 31 .371 Da y la diferencia entre ambos atribuible al error de medida. También se observa el carácter monodisperso de la molécula, apareciendo solo un estrecho pico.
Figura 5. Análisis de espectroscopia de infrarrojos (FTIR-ATR, del inglés "Fourier Transform Infrared - Attenuated Total Reflectance") del biopolímerol en el cual se muestran las señales características de los grupos amida (-1700 cm"1) presentes en los polímeros proteicos diseñados.
Figura 6. Análisis de calorimetría diferencial de barrido, (DSC, del inglés "Differential scanning calorimetry") del biopolímero 1 en el que se muestra su temperatura de Transición Inversa (24.2°C).
Figura 7. Reacción de funcionalización de los polímeros con grupos azida. En primer lugar (1 ) se genera "in situ" la azida tríflica TfN3, a partir de la correspondiente azida de sodio menos reactiva. En una segunda etapa (2) la azida tríflica actúa como reactivo nucleófilo dando una reacción de sustitución sobre el grupo amino.
Figura 8. Análisis de espectroscopia de masas (MALDI-ToF) del biopolímero 1 ' donde se muestra el aumento en 46 unidades de su peso molecular, respecto al biopolímero 1 precursor, debido a la introducción de los grupos azida de 24 unidades de masa mayor que los grupos amino.
Figura 9. Análisis de espectroscopia de infrarrojos FTIR-ATR del biopolímerol ' que muestra la presencia de las señales de absorción características de los grupos amida de los polímeros proteicos (-1700 cm"1 ) junto con la señal característica del nuevo grupo azida a 2100 cm"1.
Figura 10. Análisis de DSC del biopolímero 1 ' muestra la disminución en 1 ,3° C de la temperatura de transición inversa de este biopolímero (22,8° C), respecto a su precursor (24,2° C), debido a la introducción de grupos menos polares como los grupos azida en la estructura.
Figura 11 . Esquema de las etapas de funcionalización de las superficies. En la primera etapa se activa la superficie con grupos hidroxilo por medio de un reactivo como la piraña. En la etapa posterior se genera la superficie funcionalizada por grupos amino por enlace covalente entre el silanol generado "in situ" y los grupos hidroxilo. En la tercera etapa se modifican los grupos amino por reacción de amidación para dar la superficie activada por los grupos alquinilos presentes en el extremo de la molécula de reactivo utilizada.
Figura 12. Esquema de la reacción tipo "click" de biofuncionalización de la superficie con polímeros tipo elastina. La reacción de cicloadición 1 ,3-dipolar entre un grupo azida y un grupo alquinilo genera el correspondiente 1 ,2,3- triazol-1 ,4-disustituido en una reacción en medio acuoso catalizada por el ión Cu(l) generado "in situ" por reducción del ión Cu(ll) en presencia de ión ascorbato. Figura 13. Análisis comparativo de espectrometría de fotoelectrones de Rayos X (XPS) para el vidrio y para las superficies funcionalizadas con grupos amino, grupos alquinilo y polímero 1 '. Se deduce un mayor recubrimiento en la
superficie que posee el polímero unido covalentemente debido a que se observa una menor proporción de silicio que en las otras tres muestras restantes. Además, se observa que aumenta la proporción en nitrógeno para las superficies tratadas respecto a la original de vidrio. Esto es razonable debido al contenido en nitrógeno en los grupos amino y amidas de las muestras funcionalizadas tanto con grupos amino, alquino como en las biofuncionalizadas.
Figura 14. Espectroscopia de masas de iones secundarios (ToF-SIMS, del inglés "Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry") de la superficie funcionalizada con el polímero 1 '. Se observan los iones de masa 68 (C4H6N+) y 72 (C4Hi0N+), típicos de la presencia de un recubrimiento de aminoácidos valina; aparece un ión de masa 70 (C H8N+), típico de la presencia de un recubrimiento de aminoácido prolina y la aparición de un ión de masa 86 (C5Hi2N+) muestra la presencia de un recubrimiento de aminoácido isoleucina.
Figura 15. Imágenes fotográficas de microscopía óptica por contraste de fases (objetivo x10) del mismo campo a los tiempos 24h, 25h, 26h y 27h para las 8 superficies diferentes: A) vidrio, B) polímero 1 ', C) Polímero 2', D) Polímero 3', E) Polímeros 3'+ 4, F) Polímero 4', G) Polímero 5', H) Polímero 6'. La barra de escala corresponde a 100 mieras.
Figura 16. Evaluación del porcentaje de células adheridas frente al total a lo largo del tiempo en 9 campos aleatorios de tres muestras replicadas en 4 experimentos independientes para las diferentes superficies.
Figura 17. Evaluación del número total de células adheridas y no adheridas a lo largo del tiempo en 9 campos aleatorios de tres muestras replicadas en 4 experimentos independientes para las diferentes superficies.
Figura 18. Evaluación de la viabilidad celular de las células despegadas de las superficies biofuncionalizadas (polímero 1 ') y de células recién tripsinizadas
(control) a diferentes tiempos de incubación de las células sobre poliestireno mediante la técnica colorimétrica "Alamar Blue" (p<0,05).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante ensayos realizados por los inventores que describen la síntesis del biopolímero de la presente invención así como sus características. Los ejemplos se proporcionan para poder comprender la descripción, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLO 1. Obtención de polímeros proteicos recombinantes tipo elastina. El diseño y la obtención de las secuencias nucleotídicas sintéticas que codifican para las secuencias aminoacídicas de los distintos biopolímeros empleados, incluyendo el biopolímero de la invención se realizaron como está descrito en WO/2010/092224. Igualmente, la expresión, purificación y caracterización de los biopolímeros se llevó a cabo como está descrito en WO/2010/092224.
Se diseñaron los siguientes biopolímeros o polímeros:
Biopolímero 1 (371 aminoácidos)
Estructura: D - BM - A2-Bi4.
Secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7:
MGKKKP-(VPGVG)i4-((VPGIG)inAVTGRGDSPASS(VPGIG)in VPGVG)i4- V
Codificado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 8.
La composición de aminoácidos teórica y la obtenida mediante HPLC (del inglés "High-performance liquid chromatography") con detección UV (luz ultravioleta) se presentan en la Tabla 1 .
Tabla 1 . Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 1 . n.d.: no detectado.
El rendimiento de la producción fue de 75 mg/L.
El Peso Molecular teórico para el polímero 1 es de 31 .371 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida (Figura 3) y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star resultando ser 31 .250 Da (Figura 4). La figura 5 representa a modo de ejemplo un espectro de infrarrojos (IR) obtenido para el biopolímero 1 . La Temperatura de transición obtenida mediante DSC en tampón fosfato salino (PBS) fue de 24,2° C (Figura 6).
El biopolímero 1 es un polímero tipo elastina con secuencia de adhesión celular y con capacidad de funcionar como sistema de recolección celular. Debido a su carácter inteligente, al superar su temperatura de transición inversa cambia drásticamente su conformación de manera que se anula su capacidad de adhesión celular, produciéndose el despegue de las células de la superficie, una vez conseguido un cultivo eficaz de dichas células.
La secuencia aminoacídica A incluye una secuencia bioactiva RGD no específica, que induce la adhesión celular a la superficie bioactiva a temperaturas superiores a la de la transición inversa y coincidentes con la del cultivo celular.
La secuencia aminoacídica B se incluye como portadora de las propiedades inteligentes del polímero, produciendo una diferente conformación del polímero en función de la temperatura del entorno, y la que impide la adhesión celular
por debajo de la temperatura de transición inversa anulando el efecto de la secuencia A de adhesión celular.
La secuencia aminoacídica D incluye tres aminoácidos lisina portadores de los grupos amino necesarios para unir el polímero a la superficie mediante enlace químico covalente, es decir, para obtener las superficies biofuncionalizadas.
Biopolímero 2 de 371 aminoácidos
Estructura: D - BM - C2-BH
Secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9:
MGKKKP-(VPGVG)i4-((VPGIG)inAVTGRDGSPASS(VPGIG)in)?-(VPGVG)i4- V
Codificado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 10.
La composición de aminoácidos teórica y la obtenida mediante HPLC con detección UV se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2. Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 2.
El rendimiento de la producción fue de 70 mg/L.
El Peso Molecular teórico para el polímero 2 es de 31 .371 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star resultando ser 31 .265 Da. La Temperatura de transición obtenida mediante DSC en PBS fue de 23,5° C. El polímero 2 puede tener capacidad de funcionar como sistema de recolección celular. Debido a su carácter inteligente, al superar su temperatura de transición inversa, su conformación cambia drásticamente y la adhesión celular
disminuye, produciéndose el despegue de las células de la superficie, una vez conseguido un cultivo eficaz de las células.
El polímero 2 posee las secuencias aminoacídicas B y D como las del polímero 1 . La secuencia aminoacídica C incluye una secuencia no bioactiva polar RDG.
Biopolímero 3 de 427 aminoácidos:
Estructura: D - B84
Secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 1 :
MGKKKP-(VPGVG)8 -V
Codificado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 12.
La composición de aminoácidos teórica y la obtenida mediante HPLC con detección UV se presentan en la Tabla 3. Tabla 3. Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 3.
El rendimiento de la producción fue de 35 mg/L.
El Peso Molecular teórico para el polímero 3 es de 35.191 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star resultando ser 35.152 Da. La Temperatura de transición obtenida mediante DSC en PBS fue de 29,4° C.
El polímero tipo elastina llamado polímero 3 tiene capacidad de funcionar como sistema de recolección celular debido a su carácter inteligente, si bien el número de células adheridas es inferior debido a la ausencia de una secuencia bioactiva de adhesión celular. Las secuencias aminoacídicas B y D son como las de los polímeros 1 y 2.
Biopolímero 4 de 371 aminoácidos
Estructura: B14- A2 - B1
Secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 13:
MESLLP-(VPGVG)i4-((VPGIG)inAVTGRGDSPASS(VPGIG)in VPGVG)i4-V Codificado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 14.
La composición de aminoácidos teórica y la obtenida mediante HPLC con detección UV se presentan en la Tabla 4. Tabla 4. Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 4.
El rendimiento de la producción fue de 42 mg/L.
El Peso Molecular teórico para el polímero 4 es de 31 .371 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star resultando ser 31 .388 Da. La Temperatura de transición obtenida mediante DSC en PBS fue de 23,8° C.
El polímero 4 se utiliza en un sistema compuesto por dos biopolímeros, el primero de ellos con capacidad de injertarse en la superficie, polímero 3, y el segundo, polímero 4, con capacidad de inducir adhesión celular de manera que el sistema resulta eficaz como sistema de recolección celular por la sinergia del efecto de los polímeros.
En otra experiencia realizada, el polímero 4 se utiliza injertado en la superficie una vez modificado su grupo amino terminal en grupo azida y sin contener la secuencia D rica en lisinas en el extremo amino terminal.
Las secuencias aminoacídicas A y B son como las del polímero 1 .
Biopolímero 5 de 699 aminoácidos
Estructura: H-l6
Secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15:
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-MESLLP-{[(VPGIG)2(VPGKG)(VPGIG)2]2 A GRGDSPASS [(VPG I G)2(VPGKG)(VPG IG)2]2]}6-V
Codificado por la nucleotídica SEQ ID NO: 20.
La composición de aminoácidos teórica y la obtenida mediante HPLC con detección UV se presentan en la Tabla 5.
Tabla 5. Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 5.
El rendimiento de la producción fue de 51 mg/L.
El Peso Molecular teórico para el polímero 5 es de 60.661 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star resultando ser 60.556 Da. La Temperatura de transición obtenida mediante DSC en PBS fue de 32,2° C.
La secuencia aminoacídica I es similar a la secuencia A, portadora de la secuencia de adhesión celular RGD, pero con la particularidad de que un aminoácido isoleucina del pentapéptido en posición 3 y del pentapéptido en posición 8 de la serie de 10 pentapéptidos que flanquean a la secuencia de adhesión RGD, ha sido cambiado por otro de lisina, portador de grupos amino
capaces de ser transformados en grupos azida. De esta manera, cuando se injerta en la superficie, lo hará a través de múltiples enlaces covalentes, repartidos a lo largo de la cadena del biopolímero 5, impidiendo que cambie sustancialmente su conformación con la temperatura, y por tanto no resultando un sistema eficaz de recolección celular.
Biopolímero 6 de 343aminoácidos
Estructura: D-A3
Secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 21 :
MGKKKP-((VPGIG)inAVTGRGDSPASS(VPGIG)in^-V
Codificado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 22.
La composición de aminoácidos teórica y la obtenida mediante HPLC con detección UV se presentan en la Tabla 6. Tabla 6. Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 6.
El rendimiento de la producción fue de 83 mg/L.
El Peso Molecular teórico para el polímero 6 es de 29461 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star resultando ser 29.269 Da. La Temperatura de transición obtenida mediante DSC en PBS fue de 23,0° C.
El polímero tipo elastina llamado polímero 6 posee la secuencia aminoacídica A, portadora de la secuencia de adhesión celular RGD repetida tres veces a lo largo de la cadena polipeptídica y posee la secuencia D como la de los polímeros 1 -3, lo que le permite unirse al soporte mediante enlace covalente.
EJEMPLO 2. Modificación de polímeros 1 -6.
Modificación del pie-polímero 1 para obtener el pie-polímero 1 '. La obtención del biopolímero 1 ' se lleva a cabo por transformación de la secuencia del péptido D, que porta aminoácidos lisina que poseen grupos amino en la posición gamma. Estos grupos amino se transforman para posteriormente llevar a cabo la reacción de ciclación tipo "c//c/ ". El péptido D transformado se denomina péptido E.
En el péptido E se han transformado los grupos amino de las lisinas en grupos azida, por reacción de sustitución utilizando azida tríflica generada "in sitü" como reactivo nucleófilo (Figura 7), obteniéndose un rendimiento de la reacción del 89%. De esta manera, obtenemos un polímero inteligente, que presenta una secuencia de adhesión celular bioactiva y que puede ser injertado por vía química a la superficie.
Para caracterizar el biopolímero 1 ' se realizó una espectrometría MALDI-TOF y de dicho análisis se dedujo que el peso molecular del polímero es de 31 .296 Da (masa molar teórica 31 .475 Da, figura 8), observándose un lógico aumento de 46 g/mol al sustituir los grupos amino pertenecientes a sus lisinas por grupos azida.
El biopolímero V obtenido muestra un espectro de infrarrojo (FTIR-ATR) que presenta la señal característica de los grupos azida a frecuencias de 2.100 cm"1 (Figura 9), mientras que en el espectro de IR del biopolímero precursor 1 (Figura 5) se observa la ausencia de dicha señal.
Se corrobora el éxito y alcance de la reacción de modificación del polímero 1 examinando el ensayo de análisis de aminoácidos realizado al biopolímero 1 ', donde se observa una importante disminución del número de aminoácidos de lisina mientras que el resto de los aminoácidos permanecen inalterados. De
esta manera, deducimos que se han modificado los grupos amino de dichas lisinas, transformándose en grupos azida, estimando que se han transformado un 46% de las lisinas (Tabla 7).
Tabla 7.- Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 1 '
La respuesta inteligente del biopolímero 1 ' ocurre a una temperatura de 22,8° C e inferior a la del biopolímero 1 de 24,2°C en 1 ,3° C. Este comportamiento es debido a la introducción de un grupo fuertemente apolar, como es el grupo azida, frente al grupo amino de partida (Figura 6).
Modificación de los biopolímero 2-6 para obtener los biopolímero 2'-6'.
Los biopolímeros 2-6 han sido modificados como se ha descrito para el biopolímero 1 , dando lugar a los biopolímeros 2'-6', respectivamente.
Los polímeros modificados han sido caracterizados de manera similar al V. Se ha realizado su análisis de aminoácidos, se han determinado sus pesos moleculares por MALDI-TOF, su temperatura de la transición inversa por DSC, y se ha realizado el análisis de su espectro de infrarrojo (FTIR-ATR) llegándose a conclusiones semejantes a las anteriores. Todos estos datos se detallan a continuación.
Biopolímero 2' modificado
Tabla 8. Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 2'.
Rendimiento de la reacción: 94%
Masa molar teórica: 31 .475 Da
Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 31 .291 Da
Temperatura de transición (DSC) en PBS: 21 ,8o C
Tasa de transformación de lisinas: 46 %
Biopolímero 3' modificado
Tabla 9. Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 3
'.
Rendimiento de la reacción: 80 %
Masa molar teórica: 35.295 Da
Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 35.185 Da
Temperatura de transición (DSC) en PBS: 27,7 °C
Tasa de transformación de lisinas: 50%
Biopolímero 4' modificado
Tabla 10. Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 4'.
Asp Ser Glu Gly Arg Thr
Teórico 2 7 1 140 2 2
Análisis
aminoácidos Experimental 2,35 6,83 1 ,25 145,53 2,64 2,1 1
Ala Pro Val Met Lys Me Leu
Teórico 4 71 99 1 0 40 2
Análisis
aminoácidos Experimental 4,22 70, 15 97,78 n.d. 0,00 39,40 2, 14
Rendimiento de la reacción: 90 %
Masa molar teórica: 31398 Da
Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 31 .327 Da
Temperatura de transición (DSC) en PBS: 24,2° C
Biopolímero 5' modificado
Tabla 1 1 . Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 5'.
Rendimiento de la reacción: 85 %
Masa molar teórica: 61 .285 Da
Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 60.900 Da
Temperatura de transición (DSC) en PBS: 22,2 °C
Tasa de transformación de lisinas: 54%
Biopolímero 6' modificado
Tabla 12. Análisis de la composición de aminoácidos del biopolímero 6'
Rendimiento de la reacción: 50 %
Masa molar teórica: 29.565 Da
Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 29.302 Da
Temperatura de transición (DSC) en PBS: 21 ,5° C
Tasa de transformación de lisinas: 83%
EJEMPLO 3. Obtención de superficies biofuncionalizadas con los polímeros.
Una vez modificados los biopolímeros con grupos azida, la obtención de las superficies biofuncionalizadas se lleva a cabo en dos etapas: la primera consiste en la activación de la superficie de vidrio con grupos alquinilo y la segunda en el injerto de los polímeros en las mismas a través de un enlace químico covalente.
Activación de la superficie
En primer lugar se lleva a cabo el activado de la superficie con "piraña", mezcla 7:3 en volumen de ácido sulfúrico (H2SO4) y peróxido de hidrógeno (H2O2) capaz de eliminar la capa de óxido de silicio presente en la superficie del vidrio dejando grupos hidroxilo libres (-OH) expuestos en la superficie. En la figura 1 1 se representa el proceso de activación llevado a cabo en la superficie del vidrio. El seguimiento de las reacciones en la superficie se efectúa, entre otras técnicas, mediante la medida del ángulo de contacto de una gota de agua sobre la superficie obtenida en cada uno de los pasos. El cambio en su hidrofobicidad se manifiesta en la variación de su ángulo de contacto, pasando de 48,1 ° para la superficie no activada a 27,3° para la superficie activada, al aumentar su hidrofilia
por la presencia de los grupos hidroxilo expuestos en la superficie.
Cada etapa de modificación de la superficie se caracteriza también mediante el análisis por espectrometría de fotoelectrones de Rayos X (XPS), que nos permite obtener la concentración atómica de los elementos presentes en la superficie con una profundidad de análisis de aproximadamente 5 nm. La presente técnica también es capaz de darnos información relativa al estado químico de los elementos presentes. En las superficies de vidrio se observa una elevada proporción de Si y O junto con una pequeña proporción de C y de
otros elementos que se encuentran como contaminantes. La proporción de Si disminuye ligeramente y la de O aumenta para la superficie activada, junto con una pequeña disminución del C ambiental (Tabla 13). Tabla 13. Resultado de la XPS de las superficies de vidrio, vidrio activado con disolución "piraña" y superficies amino y alquino silanizadas.
La siguiente etapa consiste en la obtención de una superficie funcionalizada con grupos amino, por reacción de los grupos hidroxilo libres expuestos en la superficie recién activada con 3-aminopropilsilanol, generado "in situ" a partir de 3-aminopropiltrimetoxisiloxano (APTS) (Figura 1 1 ). La técnica de rutina para determinar la modificación de la superficie es la medida del ángulo de contacto de una gota sobre la superficie, observándose un razonable aumento de la hidrofobicidad (ángulo de contacto que varía desde 27,3° para la superficie activada con grupos hidroxilo libres hasta un ángulo de 78,1 ° para la superficie funcionalizada con grupos aminopropilsiloxano). La superficie también se caracteriza mediante el análisis por XPS. En dicho análisis se confirma la presencia del grupo aminopropil, ya que se registra la presencia de un pico de N 1 s a 397 eV (Tabla 13) que no está presente en la superficie de vidrio de partida, ni en la superficie activada por la disolución de piraña, y un aumento en la proporción de C que supera la posible contaminación ambiental.
Por último, la formación de la superficie funcionalizada con grupos alquinilo se efectúa por reacción de amidación, catalizada por una base como la
trietilamina, de los grupos amino presentes en la superficie con anhídrido pentinoico, portador de grupos alquinilo terminales (Figura 1 1 ).
En la figura 1 1 , donde se representan las etapas de reacción realizadas, puede verse también que se realizaron medidas del ángulo de contacto de una gota de agua sobre las superficies obtenidas en cada una de las etapas. Dichas medidas nos permitieron estudiar los cambios de hidrofobicidad de las superficies y por tanto sirvieron como primer método de control o seguimiento de cada etapa de reacción. Así, la superficie funcionalizada con grupos alquinilo presenta una pequeña disminución en su hidrofobicidad respecto a la superficie aminofuncionalizada, lo cual se corrobora con su medida de su ángulo de contacto que disminuye a 64,5°.
La superficie alquinilo funcionalizada presenta un mayor recubrimiento que la superficie amino funcionalizada, lo cual queda reflejado en su análisis de XPS por la disminución de la proporción de Si 2p. Asimismo, se observa una disminución en la proporción de O y una mayor proporción relativa de C y de N, lo que permite confirmar la adición del grupo alquinilo (Tabla 13). Se obtiene información adicional sobre la estructura molecular del injerto a partir de la comparación de los espectros de alta resolución de las distintas regiones de interés. Es posible identificar los diferentes estados de oxidación de los elementos a estudiar, mediante la deconvolución de sus correspondientes espectros. En el espectro de alta resolución de la región N 1 s de la superficie aminosilanizada se aprecia un solo pico a 399,5 eV correspondiente al grupo amino. En el espectro de la superficie aquinilosilanizada se muestra la aparición de un segundo pico de nitrógeno a 401 ,7 eV correspondiente al nitrógeno de mayor estado de oxidación de la amida, lo cual prueba la formación de un enlace covalente tipo amida. La proporción observada de los dos picos de N de diferente estado de oxidación nos permite deducir por deconvolución que se ha formado un 30% de
acoplamiento de grupos alquinilo, proporción suficiente sin ser excesiva para la posterior funcionalización de la superficie con polímeros proteicos.
Los análisis de espectroscopia ToF-SIMS para las superficies amino y alquinilo funcionalizadas muestran un espectro similar entre ellas que difiere del observado para la superficie sin funcionalizar fundamentalmente en los iones de masa 23 (Na+), 30 (CH4N+) y 45 (CH3NO+) (Tabla 14). La menor intensidad del ión Na+ permite deducir nuevamente un mayor recubrimiento en las superficies amino y alquinilo funcionalizadas. Por otro lado, en las superficies funcionalizadas se observan dos nuevos iones ausentes en las superficies no funcionalizadas, como son: el ión de masa 30 (CH4N+), que aparece con mayor intensidad para la muestra alquinilo que para la muestra amino y el ión de masa 45 (CH3NO+), con intensidad similar en ambas superficies, lo que permite deducir una composición orgánica en el recubrimiento.
Tabla 14. ToF-SIMS de las superficies de vidrio y de las superficies amino y alquinilosilanizadas. Inten. es intensidad.
Biofuncionalización de las superficies mediante cicloadición tipo "c//'c/ ". Los biopolímeros modificado 1 '-6' se han enlazado covalentemente a la superficie funcionalizada con grupos alquinilo por reacción de cicloadición tipo "c//c/ ", entre
los grupos azida contenidos en los polímeros y los grupos alquinilo expuestos en la superficie (Figura 12).
La formación de un 1 ,2,3-triazol-1 ,4-disustituido se produce por cicloadición 1 ,3- dipolar tipo Hüisgen en medio acuoso, catalizada por el ión Cu(l) generado "in situ" por reducción del ión Cu(ll) en presencia de ascorbato. Este tipo de reacción transcurre en condiciones suaves de reacción, presenta una gran tolerancia al agua, al oxígeno y a otros grupos funcionales presentes y se puede llevar a cabo en una gran variedad de disolventes, tanto próticos como apróticos proporcionando elevados rendimientos (Figura 12).
Las superficies con los biopolímeros injertados 1 '-6' se han caracterizado por XPS. En el caso de la superficie funcionalizada con el biopolímero 1 ' se ha apreciado un mayor espesor de capa y un mayor recubrimiento que en las superficies obtenidas previamente con funciones amino y alquinilo, debido a una menor proporción de Si 2p presente (4,21 %) y una mayor proporción de C 1 s (59,15 % de concentración atómica) (Tabla 15), en comparación con las superficies amino y alquinilosilanizadas, lo cual indica que la reacción ha sido eficaz y hay una presencia importante del biopolímero 1 ' injertado, ya que la proporción 59:23:1 1 está de acuerdo con la proporción porcentual de estos elementos en dicho polímero. Este comportamiento es similar para el resto de las superficies biofuncionalizadas con los polímeros 2'-6'analizadas como se observa en la tabla 14. A modo de ejemplo en la figura 13 se muestra el análisis de XPS de las distintas etapas de funcionalización de la superficie hasta la obtención de la superficie funcionalizada con el biopolímero 1 '.
Tabla 15.- XPS de las superficies funcionalizadas con polímero 1 ', polímero 2', polímero 3', polímero 4 adsorbido sobre polímero 3' injertado (3'+ 4), polímero 4', polímero 5' y polímero 6'.
POL r POL 2' POL 3'
Conc. (eV) Conc. Conc.
Atom. Atom. Atom.
Pico (eV) (%) (%) (eV) (%)
C 1 s 284 59,15 284 69,99 284 64,24
01 s 529 23,19 529 15,29 529 18,18
N1 s 398 1 1 ,16 398 8,65 398 9,1
Si 2p 101 4,21 101 5,18 101 6,59
Los análisis de espectroscopia ToF-SIMS para las superficies injertadas con los polímeros modificados 1 '-6' muestran un espectro que difiere del observado para las superficies amino y alquinilo funcionalizadas y que permite deducir que existe un recubrimiento de tipo proteico debido a la aparición de los iones típicos a los que dan lugar los aminoácidos valina, prolina, isoleucina y glicina. A modo de ejemplo, en la figura 14 se muestra el análisis de ToF-SIMS de la superficie funcionalizada con el polímero 1 '. En ella se observan los iones de masa 68 (C4H6N+) y 72 (C H10N+), típicos de la presencia de un recubrimiento de aminoácidos valina; aparece un ión de masa 70 (C4H8N+), típico de la presencia de un recubrimiento de aminoácido prolina y la aparición de un ión de masa 86 (CsH^N"1") muestra la presencia de un recubrimiento de aminoácido isoleucina. Todos estos picos no están presentes en la superficie funcionalizada con grupos alquinilo, lo que permite corroborar un recubrimiento de tipo proteico en las nuevas superficies injertadas con el polímero 1 '. Este comportamiento es similar en todas las superficies estudiadas a excepción de la superficie biofuncionalizada con el polímero 3', para el cual la ausencia de aminoácidos isoleucinas se manifiesta en una menor proporción del ión de
masa molecular 86 (Tabla 16). Hay que destacar que la presencia del ión de masa 86 en el sistema 3'+4 demuestra la eficaz adsorción del polímero 4 sobre la superficie injertada con el polímero 3'. Tabla 16. of-SIMS de las de las superficies funcionalizadas con polímero 1 ', 2',
3', 4, 3'+ 4, 4', 5'y 6'. I es intensidad.
El análisis de la superficie con el biopolímero injertado 4' por XPS (Tabla 15) y ToF-SIMS (Tabla 16) indica que la reacción no es eficaz con un único grupo amino terminal y que la superficie no muestra un recubrimiento adecuado del biopolímero 4' injertado, como se deduce de los resultados obtenidos por estas técnicas, los cuales muestran una proporción elevada de Si 2p presente (16,17 %) en la superficie, junto con una menor proporción de C 1 s (50,75 %).
El análisis de la superficie con los biopolímeros injertados 5' y 6' por XPS (Tabla 15) y ToF-SIMS (Tabla 16) indica que la reacción ha sido eficaz, que hay una presencia importante de biopolímero en la superficie y que el recubrimiento ha sido adecuado tanto con el biopolímero 5' como con el 6'. Para comprobar si el comportamiento inteligente de los biopolímeros se mantiene cuando éstos se han injertado en las superficies, y por tanto que estos sistemas son viables como sistemas de recolección celular, se han llevado a cabo medidas de ángulos de contacto en muestras tratadas térmicamente. Se hicieron medidas por encima (a 37° C) y por debajo de la temperatura de transición (a 10° C) obteniéndose los valores a las dos temperaturas escogidas que se muestran en la tabla 17.
Para la superficie funcionalizada con el biopolímero 1 ' se observan valores diferentes del ángulo de contacto a 10°C y 37°C de 76.8±1 .2° y 65.2±0.8°, respectivamente, como consecuencia del diferente plegamiento en la estructura del biopolímero 1 '. Se observa cómo la hidrofobicidad de la superficie es mayor al superar la temperatura de transición del biopolímero. Esto es debido a que el polímero pasa de un estado hidratado a uno no hidratado cuando supera su temperatura de transición (Tt), es decir que disminuye su carácter hidrofílico con la temperatura. Los resultados se muestran en la tabla 17.
Tabla 17. Ángulos de contacto de las superficies funcionalizadas con polímeros 1 '-6' a diferentes temperaturas.
SUPERFICIE ÁNGULO a 10°C ÁNGULO a 37 °C ΔΤ
Polímero 1 ' 65,2 ± 0,8° 76,8 ± 1 ,2° 1 1 ,6°
Polímero 2' 65,9 ± 1 ,0° 74,9 ± 0,7° 9,0°
Polímero 3' 59,7 ± 2,1 ° 64,8 ± 1 ,1 ° 5,1 °
Polímero 3'+4 49,0 ± 1 ,9° 53,2 ± 4,2° 4,2°
Polímero 4' 60,3 ± 0,5° 64,1 ± 1 ,5° 3,8°
Polímero 5' 67,5 ± 0,7° 65,3 ± 0,6° 2,4°
Polímero 6' 43,5 ± 1 ,2° 49,1 ± 2,0° 5,6°
El escaso recubrimiento de la superficie con el polímero 4' se observa de nuevo en la pequeña disminución que presenta el ángulo de contacto de la superficie funcionalizada con dicho polímero 4', el cual sólo varía 3,8° para la superficie a 10° C (60,3 ± 0,5°) y 37° C (64,1 ± 1 ,5°), respectivamente. Puesto que la estructura del polímero 4' es totalmente análoga a la del polímero 1 ', la pequeña variación observada denota la escasa presencia de polímero en la superficie, por lo cual se observan valores similares a los encontrados en la superficie no injertada recubierta de grupos alquinilo (64,5°, figura 1 1 ). Las medidas de ángulos de contacto llevadas a cabo en la superficie biofuncionalizada con el biopolímero 5' (Tabla 17) nos muestran que la hidrofobicidad de la superficie varía apreciablemente con la temperatura, observándose valores de 65,3 ± 0,6 a 37° C y de 67,5 ± 0,7 a 10° C. Estos valores muestran cómo el polímero 5', al estar unido covalentemente a la superficie por varios puntos a lo largo de su cadena, no presenta la libertad de movimiento necesaria para cambiar su conformación con la temperatura y, por tanto, puede perder su capacidad como sistema de recolección celular.
Si bien se mantiene el comportamiento inteligente del biopolímero 6' en la superficie como se deduce de las medidas de ángulos de contacto llevadas a cabo en la superficie (Tabla 17), observándose de nuevo una disminución en la hidrofobicidad de la superficie al bajar la temperatura por debajo de la de transición, de 49,1 ± 1 ,2 a 37° C a 43,5 ± 2,0 a 10° C, los valores observados corroboran la mayor hidrofilia del polímero injertado 4' por la presencia de las tres secuencias polares de adhesión celular RGD.
Biofuncionalización de las superficies mediante cicloadición tipo "c//'c/ " del polímero 3' y posterior adsorción del polímero 4.
Se utilizó también un sistema compuesto por dos biopolímeros, el primero de ellos con capacidad de injertarse en la superficie (polímero 3') y el segundo (polímero 4),
con capacidad de inducir adhesión celular de manera que el sistema resulta eficaz como sistema de recolección celular por la sinergia del efecto de ambos polímeros.
En el polímero 4, la secuencia bioactiva RGD induce la adhesión celular a la superficie bioactiva a temperaturas superiores a la de la transición inversa y coincidentes con la del cultivo celular.
En el polímero 4, el péptido B se incluye como portador de las propiedades inteligentes del polímero, que impide la adhesión celular por debajo de la temperatura de transición inversa, anulando el efecto de las zonas más polares y que favorecen la adhesión celular.
El biopolímero modificado 3' se ha enlazado covalentemente por reacción química mediante reacción de cicloadición tipo "c//c/ ", entre los grupos azida contenidos en el polímero y los grupos alquinilo presentes en la superficie. El procedimiento ha sido el mismo que el descrito para los polímeros 1 ' y 2'.
Una vez obtenidas las superficies biofuncionalizadas con el polímero 3' injertado vía química se produce la adsorción del polímero 4, por medio de la inmersión de las superficies previamente preparadas en una disolución acuosa del biopolímero 4. La superficie con el sistema de biopolímeros 3' y 4 se ha caracterizado por XPS y se ha apreciado un mayor espesor de capa y un mayor recubrimiento que en las superficies funcionalizadas con grupos amino y/o alquinilo, lo que se deduce de la menor proporción de Si 2p y de la mayor proporción de C 1 s (Tabla 15) presente en las superficies biofuncionalizadas con polímero 4, en comparación con las superficies amino y alquinilosilanizadas; lo cual indica una presencia importante de biopolímeros sobre la superficie. EJEMPLO 4. Ensayos de adhesión celular.
Estudio del proceso de recolección celular mediante las superficies bioactivas.
El estudio del proceso de recolección celular mediante este tipo de superficies se dividió en dos partes. Primero, la recolección de células individuales y segundo, la recolección de una lámina celular mediante membranas de PVDF (fluoruro de polivinilideno).
Recolección de células individuales.
Las superficies biofuncionalizadas con el biopolímero tipo elastina son esterilizadas mediante luz UV durante 30 minutos por cada lado. Por otra parte, los pocilios de las placas multipocillos de poliestireno de 24 pocilios son tratados con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % en PBS y mantenidas toda la noche a 4o C para evitar que posteriormente las células se unan de manera inespecífica. A continuación son lavados tres veces con PBS y las superficies biofuncionalizadas estériles son colocadas en los pocilios correspondientes. Por otro lado, se procede al sembrado celular con fibroblastos humanos (línea celular HFF-1 ). Los fibroblastos son cultivados en frascos de 250 mi con medio DMEM ("Dulbecco's Modified Eagle Médium") suplementado con 15% suero fetal bovino (FBS) y penicilina-estreptomicina al 1 % a 37° C bajo una concentración del 5 % de CO2 en aire. Cuando las células llegan a confluencia son recolectadas mediante el tratamiento con 0,25% Tripsina y 0,02% EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) en PBS. Tras la centrifugación de la suspensión celular resultante se resuspenden en DMEM suplementado con penicilina-estreptomicina al 1 %. La suspensión celular es diluida hasta tener 2x104 células/pocilio y alícuotas de 500 μΙ son distribuidas en cada pocilio sobre cada una de las superficies biofuncionalizadas e incubadas a 37° C bajo una concentración del 5% de CO2 en el aire. La morfología de las células es evaluada y fotografiada a los 30 minutos, 4, 8 y 24 horas (h) (Figura 15), a partir de la siembra, por contraste de fases mediante un microscopio óptico equipado con un sistema de cámara digital. El experimento es repetido cuatro veces, bajo las mismas condiciones, evaluando tres réplicas en cada uno de ellos y analizando las células de las fotos generadas en 9 campos elegidos al azar en cada superficie.
A las 24 h de cultivo las placas multipocillos que contienen las superficies con las células adheridas son transferidas a 4o C. Después de 1 h (25 h desde el inicio del experimento), 2 h (26 h desde el inicio del experimento) y 3 h (27 h desde el inicio del experimento) de incubación, la morfología celular es observada y fotografiada como se indicó anteriormente, considerando las células redondeadas como no adheridas y las células extendidas como adheridas (Figura 16 y 17).
El porcentaje de células adheridas y el número total de células adheridas es representado como el valor medio (n=4) con su desviación estándar. Superficies de vidrio no biofuncionalizadas, sin ningún tipo de recubrimiento son usadas como controles de adhesión y de recolección.
En la figura 15B la superficie funcionalizada con el biopolímero modificado 1 ', el cual contiene la secuencia peptídica bioactiva RGD, muestra una muy buena adhesión a los 30 minutos, semejante a la del vidrio (Figuras 16 y 17). A las 24h esta adhesión tanto en porcentaje como en número de células sigue siendo comparable a la de la superficie de vidrio como se puede comprobar en las imágenes tanto en su extensión como en la morfología celular (Figura 15B).
Sin embargo, se observa que cuando disminuimos la temperatura, por debajo de la Tt del polímero, con clara diferencia respecto a las superficies de vidrio sin recubrimiento, las células comienzan a despegarse, apareciendo grandes huecos entre ellas, y comienzan a adquirir una morfología más redondeada (Figura 15B).
Así, a partir de las 24 h el número de células adheridas disminuye mientras que se produce un gran aumento en el número de células no adheridas, que corresponden a las células de morfología más redondeada, que no interaccionan con la superficie pero mantienen las interacciones entre ellas y con su matriz extracelular. Las células muestran por tanto una alta capacidad de adhesión y una respuesta al cambio de temperatura que hace que se despeguen. En consecuencia, para la constitución de un sistema de recolección celular efectivo, es tan importante la presencia de una secuencia
bioactiva de adhesión celular por la cual las células se adhieren eficazmente, como la capacidad que muestra este polímero injertado en la superficie para cambiar de conformación en función de la temperatura y pasar a comportarse como no adherente.
La Figura 15C muestra la superficie funcionalizada con el biopolímero modificado 2', el cual contiene la secuencia peptídica RDG, que es la versión desordenada ("scrambled") del RGD, y donde la capacidad de adhesión del péptido RGD queda anulada. El número de células que consiguen adherirse en esta superficie es significativamente menor con respecto a la superficie de vidrio y a la superficie del polímero V (Figura 15A, B). Además, esta adhesión es claramente más débil.
La morfología de las células a las 24 h de incubación nos demuestra que pocas células consiguen unirse de forma efectiva a la superficie injertada con el biopolímero modificado 2'. Esto provoca un rápido despegue en cuanto se produce el cambio de temperatura (Figura 17) como puede observarse en la fotografía correspondiente a las 25 h de incubación (Figura 15C). Esta superficie por tanto muestra baja capacidad de adhesión pero mantienen la respuesta inteligente al cambio de temperatura propia de los polímeros tipo elastina siendo insuficiente para constituir un sistema efectivo de recolección celular (Figura 16).
La superficie de la figura 15D corresponde a una superficie funcionalizada con el biopolímero modificado 3', el cual no contiene ninguna secuencia peptídica bioactiva. El número de células que consiguen adherirse es significativamente menor con respecto a la superficie de vidrio y a superficie injertada con el biopolímero modificado V. Además, la adhesión celular a la superficie funcionalizada con el biopolímero modificado 3' es lábil. La morfología de las células a las 24 h de incubación nos indica que el número de células que consiguen unirse de forma efectiva a la superficie es pequeño (Figura 16). Esta baja e ineficaz adhesión provoca un rápido despegue de las células sobre la superficie en cuanto se produce el cambio de temperatura, como puede observarse en la fotografía correspondiente a las 25 h de incubación de la figura 15D y en la figura 17. Por tanto muestra baja capacidad de adhesión celular, lo que hace que no sea un sistema efectivo para llevar a cabo la
recolección celular, a pesar de que mantiene la respuesta inteligente al cambio de temperatura propia de los polímeros tipo elastina.
En la figura 15E se muestran las superficies funcionalizadas con el biopolímero modificado 3' sobre el que se adsorbe el biopolímero 4, el cual contiene la secuencia peptídica bioactiva RGD. Este sistema de dos polímeros muestra muy buena adhesión celular a los 30 minutos, aunque dicha adhesión es inferior a la del vidrio y a la de la superficie funcionalizada con el polímero 1 ', como muestran las figuras 16 y 17. La adhesión celular a la superficie funcionalizada con el biopolímero modificado 3' sobre el que se adsorbe el biopolímero 4 sigue siendo significativamente menor a las 24 h, aunque las células conservan una morfología similar (Figuras 15E y 17). Cuando disminuimos la temperatura por debajo de la Tt del polímero, observamos con clara diferencia respecto a la superficie de vidrio, que las células comienzan a despegarse adquiriendo una morfología más redondeada. Así, a partir de las 24 h, las células adheridas disminuyen mientras que se produce un gran aumento en el número de células no adheridas, de morfología redondeada. Las células permanecen interactuando entre ellas y con su matriz extracelular, pero no con la superficie. Las células muestran por tanto, a la vista de las imágenes y de las gráficas, una alta capacidad de adhesión y una respuesta al cambio de temperatura que hace que se despeguen. Este podría ser un sistema efectivo para llevar a cabo la recolección celular, aunque no tanto como el constituido por el polímero 1 ', que además de ser más eficaz tanto en la adhesión como en la desadhesión mediante tratamiento térmico (Figuras 15B y 16) solo requiere la presencia de un único polímero injertado en la superficie. Además, hay que considerar que la recolección de las células provenientes de esta superficie arrastraría consigo restos del polímero 4, a diferencia del ejemplo con el polímero 1 ', en el cual no se arrastran restos debido a la unión covalente del biopolímero a la superficie. Otra desventaja del sistema formado por el biopolímero 3' injertado y el biopolímero 4 adsorbido es el hecho de que el polímero 4 esté tan solo adsorbido, lo cual puede provocar su liberación inespecífica al medio durante el cultivo celular.
En la figura 15F la superficie funcionalizada con el biopolímero modificado 4', el cual contiene la secuencia peptídica bioactiva RGD y no presenta residuos de lisinas en el extremo. Dicho polímero 4' posee capacidad de injertarse en la
superficie una vez modificado su grupo amino terminal, si bien se observa que la modificación únicamente del grupo amino terminal del biopolímero no es suficiente para conseguir un recubrimiento completo de la superficie tratada. Esta superficie muestra una escasa adhesión celular a los 30 minutos debido a que el insuficiente recubrimiento de la superficie de vidrio hace que las células se tengan que adherir a las partes expuestas del vidrio funcionalizado con grupos alquinilo, donde la adhesión no es efectiva. Así, la posterior desadhesión de las células por el tratamiento térmico no resulta efectiva y estas permanecen adheridas a la superficie (Figuras 16 y 17). La poca eficiencia de la reacción de acoplamiento del biopolímero 4' a la superficie hace inviable el uso de este biopolímero para la obtención de un sistema de recolección celular.
Este resultado demuestra que la unión entre el biopolímero y el soporte se debe llevar a cabo mediante al menos dos enlaces covalentes por molécula de biopolímero, más preferiblemente, por tres enlaces covalentes por molécula de biopolímero. Por lo tanto, estos resultados corroboran los obtenidos anteriormente para esta superficie con la medida de los ángulos de contacto (Tabla 17), que indicaban un recubrimiento menor de la superficie cuando se empleaba el biopolímero 4', puesto que no se observaba un cambio importante con la temperatura.
En la figura 15G la superficie funcionalizada con el biopolímero modificado 5', el cual contiene 24 residuos de lisina y seis repeticiones de la secuencia peptídica bioactiva RGD repartidas a lo largo de toda la cadena aminoacídica, muestra una adhesión celular muy buena a los 30 minutos, semejante a la del vidrio y a la del biopolímero V. A las 24 h esta adhesión sigue siendo comparable a la de la superficie de vidrio, como se puede comprobar en las imágenes, tanto en el nivel de recubrimiento de la superficie como en la morfología celular (Figura 15G).
Sin embargo, se observa que cuando disminuimos la temperatura, por debajo de la Tt del biopolímero 5', las células no se despegan de la superficie del sustrato. Esto implica que la unión del biopolímero a través de residuos situados a lo largo de toda la molécula no permite el cambio conformacional
con la bajada de temperatura como se corroboró en la invariabilidad del ángulo de contacto sobre dicha superficie (Tabla 17). El biopolímero 5' no es por tanto útil para la constitución de un sistema de recolección celular efectivo, volviéndose a demostrar que es tan importante la presencia de una secuencia bioactiva de adhesión celular por la cual las células se adhieren eficazmente, como la capacidad que debe conservar el biopolímero injertado en la superficie para cambiar su conformación en función de la temperatura. La unión por varios puntos del esqueleto peptídico del biopolímero 5' a la superficie no permite el cambio de conformación necesario en el biopolímero para que las células puedan desadherirse. En conclusión, el biopolímero 5' tampoco sería útil para la obtención de un sistema de recolección celular.
En la figura 15H la superficie funcionalizada con el biopolímero modificado 6', el cual contiene la secuencia peptídica bioactiva RGD repetida tres veces a lo largo de la cadena aminoacídica y también tres residuos de lisina en su extremo amino terminal, muestra una adhesión semejante a la del vidrio a los 30 minutos de incubación. A las 24 h esta adhesión sigue siendo comparable tanto en el área recubierta como en la morfología celular (Figuras 15H y 17). Sin embargo, se observa que cuando disminuimos la temperatura por debajo de la Tt del biopolímero, las células no se despegan de la superficie del sustrato (Figura 17). Esto implica que la presencia de varias secuencias bioactivas RGD a lo largo de la cadena peptídica no permite el cambio de conformación adecuado en la molécula capaz de provocar el despegue masivo de las células, quedando probablemente en la nueva conformación algún resto de la secuencia RGD expuesto, suficiente para que las células permanezcan adheridas a él. Este resultado concuerda con la escasa variación con la temperatura de los ángulos de contacto de esta superficie (Tabla 17). El biopolímero 6' no es por tanto útil para la recolección celular ni para la constitución de un sistema de recolección celular efectivo. Se vuelve a demostrar por tanto que es tan importante la presencia de una secuencia bioactiva de adhesión celular por la cual las células se adhieren eficazmente, como la capacidad del biopolímero injertado en la superficie para cambiar su conformación en la manera adecuada, exponiendo o no la secuencia bioactiva a las células, en función de la temperatura.
Pasadas las 3 horas a 4o C (27 h desde el inicio del experimento) evaluamos la viabilidad de las células presentes sobre las superficies mediante la técnica fluorescente de "Live-Dead cell staining kit" (Abcam). Las células vivas o de coloración verde y las células muertas o teñidas de rojo fueron contadas a partir de 9 fotografías correspondientes a diferentes campos aleatorios de cada superficie. El porcentaje de células vivas es calculado con su desviación estándar correspondiente (n=4). En este experimento se comprobó que las células presentes en las superficies biofuncionalizadas con los polímeros modificados 1 ', 2', 3', 3'+4, 5'y 6' después del tratamiento térmico muestran unos porcentajes de viabilidad superiores al 90 % (Tabla 18) en todos los casos, con lo que se demuestra que ni el cultivo sobre los biopolímeros ni el tratamiento térmico provocan un efecto adverso sobre la viabilidad de las células.
Tabla 18. Viabilidad celular evaluada a través de la técnica fluorescente de "Live-Dead cell staining ki .
Se evalúa también la vitalidad de los fibroblastos despegados tras las 27 h de cultivo sobre las superficies funcionalizadas con el polímero modificado 1 '. Así, los fibroblastos despegados son analizados mediante su cultivo en placas de poliestireno TC durante 1 , 3, 10 y 14 días a 37° C bajo una concentración del 5% de CO
2 en el aire usando la técnica colorimétrica "Alamar Blue". Como control se utilizó el mismo número de fibroblastos obtenidos mediante la técnica
de tripsinización cultivados en las mismas placas de poliestireno TC durante 1 , 3, 10 y 14 días a 37° C bajo una concentración del 5% de CO2. El experimento es repetido cuatro veces, bajo las mismas condiciones, evaluando tres réplicas en cada uno de ellos.
El resultado obtenido es un aumento constante en la actividad metabólica a lo largo del tiempo sin encontrar diferencias significativas con los controles (P<0,05), por lo que las células son viables y capaces de proliferar (Figura18) alcanzando a los fibroblastos tripsinizados a lo largo del tiempo. Así, se pone de manifiesto que el uso del biopolímero 1 ' es un método más eficaz para la recolección celular que no afecta a las proteínas de la membrana celular y por tanto mantiene intactas las interacciones entre célula-célula y célula-matriz extracelular. Además, esta prueba nos demuestra nuevamente que el tratamiento térmico no tiene ningún efecto adverso sobre la viabilidad celular.
Recolección de una lámina celular mediante membranas de PVDF.
Las superficies de vidrio funcionalizadas e injertadas con el biopolímero V son esterilizadas mediante luz UV durante 30 minutos por cada lado. Al mismo tiempo los pocilios de las placas multipocillos de poliestireno de 24 pocilios son tratados con BSA al 0,1 % en PBS y mantenidas toda la noche a 4o C para evitar que posteriormente las células se unan de manera inespecífica. A continuación, los pocilios son lavados tres veces con PBS y las superficies de vidrio funcionalizadas e injertadas con el biopolímero V ya estériles son colocadas en los pocilios correspondientes.
Posteriormente se procede al sembrado celular. Fibroblastos HFF-1 son usados durante todo el experimento. Los fibroblastos son cultivados en frascos de 250 mi con DMEM suplementado con 10% FBS y penicilina-estreptomicina al 1 % a 37° C bajo una concentración del 5 % CO2 en el aire. Cuando las células llegan a confluencia son recolectadas mediante el tratamiento con 0,25% Tripsina y 0,02% EDTA en PBS. Esta digestión enzimática es suspendida mediante la adición de DMEM suplementado con penicilina-
estreptomicina al 1 %. La suspensión celular es ajustada a 2x104 células/pocilio. Alícuotas de 500 μΙ son distribuidas en cada pocilio sobre las superficies de vidrio funcionalizadas e injertadas con el biopolímero V e incubadas a 37° C bajo una concentración de 5% CO2 en el aire hasta que las células alcanzan la confluencia. Una vez alcanzada la confluencia del cultivo, se disminuye la temperatura del cultivo a 4° C. Después de 1 hora a 4° C, la membrana de PVDF es colocada dentro de los pocilios. El medio de cultivo es aspirado de forma que la membrana de PVDF se adhiere a la lámina de células. Las placas son incubadas durante 0,5 h de nuevo a 4° C. Transcurrido este tiempo y con ayuda de unas pinzas, la membrana de PVDF adherida a la lámina de células es transferida a una nueva placa de poliestireno. Al añadir medio de cultivo frío, la membrana de PVDF flota y es recogida mediante unas pinzas, quedando únicamente la lámina celular en el pocilio. Se confirmó una buena viabilidad de las células que forman la lámina estudiando su proliferación de forma cualitativa una vez transferida a una nueva placa de cultivo.