WO2010092224A1 - Biopolímero, implante que lo comprende y sus usos - Google Patents

Biopolímero, implante que lo comprende y sus usos Download PDF

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implant
amino acid
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José Carlos RODRÍGUEZ CABELLO
Matilde Alonso Rodrigo
Francisco Javier Arias Vallejo
Alessandra Girotti
Laura MARTÍN MAROTO
Ana María TESTERA GORGOJO
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Universidad De Valladolid
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Definitions

  • B is selected from the list comprising SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 26. B can also be the sequence SEQ ID NO: 27.
  • the peptide resulting from intercalating an amino acid Valine (V) between the amino acids Glycine (G) and Alanine (A) of the sequence SEQ ID NO: 4 acts as a protease target and modulates the biodegradability of the biopolymer and is very suitable for example for Ia release of drugs or regenerative medicine.
  • Non-bioactive elastin type domain Its function is to provide the material with adequate biocompatibility and mechanical properties.
  • a biopolymer that only includes such sequences without including bioactive sequences could also be designed as a non-stick system for applications such as adhesion prevention.
  • the term "cell” as understood in the present invention refers to a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the cell can be a bacterium capable of replicating a transformed foreign DNA such as any of the strains of the Escherichia coli species or a bacterium capable of transferring the DNA of interest into a plant such as Agrobacter ⁇ um tumefaciens.
  • the cell refers to a plant eukaryotic cell and within this group, more preferably, to those cells belonging to the Plantae kingdom.
  • the term cell comprises, at least, a parenchyma cell, meristematic cell or of any type, differentiated or undifferentiated.
  • a protoplast is also included in this definition.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the implant of the invention for the treatment of cartilage or bone.
  • defects that are not harmful can be treated.
  • the treatment can be preventive of damage or simply as an improvement of a condition that does not involve damage.
  • the implant is capable of repairing damage to the cartilage or bone or of maintaining fragmented cartilaginous or bone structures attached at any level, macroscopic or microscopic as well as allowing the release of pharmaceutically acceptable active substances that help the treatment of pain or recovery of the damage.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the biopolymer of the invention for the preparation of a medicament.
  • a preferred embodiment refers to the use of the biopolymer of the invention for the preparation of a medicament for the treatment of cartilage or bone, for the treatment of nervous tissue or spinal cord or for the treatment of varicose necrosations.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for the synthesis of the biopolymer of the invention comprising: a. insert the nucleic acid of the invention into an expression vector, b. transfect a cell with the expression vector obtained according to section (a), C. selecting the transfected cell according to section (b) comprising the nucleic acid of the invention, d. Express the nucleic acid in the cell according to section (c) and e. purify the biopolymer produced according to section (d).
  • nucleotide sequence that codes for the amino acid sequence of the biopolymer of the present invention is inserted into an expression vector defined above.
  • transfection of a cell is carried out with techniques known in the state of the art, for example but not limited, with electroporation, with biolistics, Agrobacterium tumefaciens or any other technique that allows the integration of any of the nucleic acids of the invention in the DNA of the host cell, either genomic, chloroplast or mitochondrial.
  • the expression of the nucleic acid in the cell of the invention gives rise to a biopolymer that can be purified by techniques known in the state of the art.
  • FIG 1. Shows the SDS-PAGE electrophoresis of biopolymer A.
  • the Delta scale refers to the offset angle, measured in degrees.
  • T In the axis of abscissa the temperature (T) is shown in 0 C.
  • FIG 5. Shows the dependence of the rheological properties of the polymer with the temperature for a sample of biopolymer B in PBS and for a concentration of 200 mg / ml.
  • FIG. 10 Shows images of fibroblasts seeded on BSA obtained after 2 hours from sowing.
  • FIG. 14 Shows the mass spectrum of one of the spots analyzed with the self-geliable Elastin-type Copolymer control.
  • the Seamless cloning method makes the design of the insert sequence that encodes the monomer of the sequences recognized by the endonucleases that generate it independent. This strategy is possible due to the existence of a restricted number of restriction enzymes of type Ns that recognize a specific non-palindromic sequence that does not coincide with the cutting site. This peculiar characteristic eliminates the disadvantages of the need to include sequences foreign to the polymer to allow the generation of cohesive ends that allow concatenation and also with a single digestion fragments are achieved that are joined in a uni-directional way.
  • nucleotide sequence coding for the entire biopolymer was created, the expression thereof was passed. For this, the nucleotide sequence was transferred from the corresponding cloning vector to the vector specialized in its expression through the use of conventional restriction enzymes. Once it was verified that the transfer was successful, a specific bacterial strain was transformed for the expression of said sequence by any of the valid techniques that are part of the common general knowledge.
  • Bacterial culture at 37 0 C was incubated with orbital shaking at 250 rpm, for about 11 hours, this culture broth as inoculum of fresh medium was used in a ratio of 1/30.
  • the volume of medium in the Erlenmeyers did not exceed 20-25% of its capacity to favor a good oxygenation of the culture and the growth of the bacteria was continued in the same conditions until the optical density at 600 nm was around 0, 6.
  • the expression of the recombinant biopolymer was induced by adding IPTG to a final concentration of 1mM, and the culture was re-incubated at the appropriate temperature and for the time required in each test.
  • an elastin A type copolymer with the ability to self-assemble is described as it contains alternating blocks with a hydrophobic and hydrophilic character so that when they exceed their reverse transition temperature, their mechanical properties change dramatically.
  • the hydrophobic blocks correspond to type B peptides where the amino acid sequence is SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence C includes a non-specific RGD bioactive sequence. That is, the biopolymer of this example has the structure: [(D2 - E - Ü2) io - B ⁇ ok - (G10 - H - Gio) 2 2.1. Synthesis of the synthetic nucleotide sequence encoding biopolymer A.
  • restriction enzyme recognition sequences were conveniently located at the ends of the same sequence which, when used, will leave only the GTA codon coding for the cohesive ends to be used. amino acid Valine. In this way, monomer chains can be formed without jumps in their reading frame and without the incorporation of codons outside the desired sequence.
  • the hydrophobic block In the synthesis of the hydrophobic block, it started from a larger fragment but was also synthesized from oligonucleotides of chemical synthesis.
  • the peptide monomer had the structure (B) 20 where B is SEQ ID NO: 3, encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 18.
  • sequence encoding the structure (G10-H-G10) is SEQ ID NO: 19.
  • the expression vector was used to transform an Escherichia coli strain suitable for the expression of exogenous genes by selecting the transforming colonies by means of the appropriate antibiotic.
  • the resulting cells were isolated by centrifugation and subjected to two washes with saline buffer. Subsequently they were resuspended in buffer with EDTA and PMSF was added in a final concentration of 1 mM. The cell suspension was disrupted by sonication maintaining its temperature at 0 C and 4 the extract is centrifuged to remove bacterial debris.
  • the bacterial extract supernatant was subjected to several cycles of heating at 60 0 C, centrifugation, sediment collection and solubilization at 4 0 C in EDTA buffer. Each step of the purification was verified by electrophoresis in poly-acrylamide in the presence of SDS. When the polymer was considered to be sufficiently pure, the solution was dialyzed against type I water and lyophilized, keeping the lyophilized polymer in a dry and cold place until it was used.
  • the physical characterization of the material was carried out through a rheological study. The tests were performed on an AR2000ex controlled effort rheometer (TA Instruments) using parallel plates with a gap of 250 ⁇ m. For gelation the solutions were placed on a thermostatted Peltier plate. The linear viscoelasticity range was determined at a frequency of 1 Hz, with a strain of 0.5% being selected within this range for time and temperature scans.
  • the elastic or storage module (G '), viscous or loss module (G ”) and the offset angle (delta) for the 200 mg / ml concentration sample are shown.
  • the delta offset angle indicates the relationship between The elasticity and the viscosity From this figure, a gelation temperature of 16 0 C is obtained, showing that the beginning of the restructuring begins at 10 0 C and the best mechanical properties are reached at 26 0 C. For the rest of the concentrations The gelation temperature is the same, so it can be concluded that once Introduced the product in the body reaches its best mechanical qualities.
  • Table 1 shows the values of the elastic modulus, viscous modulus and offset angle for the different concentrations.
  • Table 1 Rheological and Injectability Data of Egel Elastin Type biogel polymer solutions A in PBS at different concentrations.
  • an elastin B-type copolymer with the ability to self-assemble is described by containing alternating blocks with a hydrophobic and hydrophilic character so that when they exceed their reverse transition temperature their mechanical properties change dramatically.
  • the hydrophobic blocks correspond to type B peptides where the amino acid sequence is SEQ ID NO: 4 and the hydrophilic ones to type [(D) 2 (E) (D) 2 ] peptides.
  • the amino acid sequence C includes a non-specific RGD bioactive sequence. That is, the biopolymer of this example has the structure: [(D2 - E - Ü2) io - B2o] 2 - (G10 - H - Gio) 2
  • the hydrophobic block In the synthesis of the hydrophobic block, it started from a larger fragment but was also synthesized from oligonucleotides of chemical synthesis.
  • the peptide monomer had the structure (B) 2 or where B is SEQ ID NO: 4, encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 23.
  • sequence encoding the structure (do-H-G10) is SEQ ID NO: 19.
  • This sequence was incorporated into a previously modified expression vector to accept fragments from digestion with the appropriate restriction enzymes described incorporating the nucleotide sequence SEQ ID NO: 20 at the 5 'end of the 2772 base pair fragment and the GTATGA sequence at the 3 'end thereof.
  • the resulting plasmid comprises a nucleotide sequence with an open reading frame of 2796 base pairs, SEQ ID NO: 24, which codes for 931 amino acids, SEQ ID NO: 25.
  • the physical characterization of the material was carried out through a rheological study as in the previous case.
  • the tests were performed on an AR2000ex controlled effort rheometer (TA Instruments, Spain) using parallel plates with a gap of 250 ⁇ m.
  • For gelation the solutions were placed on a thermostatted Peltier plate.
  • the linear viscoelasticity range was determined at a frequency of 1 Hz, with a strain of 0.5% being selected within this range for time and temperature scans.
  • FIG. 5 represents the elastic or storage module (G '), viscous or loss module (G ”) and the offset angle (delta) for the dissolution of copolymer B with respect to the temperature.
  • G ' the elastic or storage module
  • G viscous or loss module
  • delta the offset angle
  • Table 2 also shows data about the injectability of the samples with needles of different diameters. It was tested with G20 and G26 needles, observing that the samples are easily injectable with both types of needles. Said result is reasonable since the viscosity of the solution of copolymer B for a concentration of 200 mg / ml is comparable to that of copolymer A for concentrations of 50 mg / ml and in turn is justifiable since the molecular weight of copolymer B is lower than that of copolymer A.
  • Table 2 Rheological and Injectability Data of the dissolution of the Autogelif Elastin Type B copolymer in PBS.
  • FIG. 7 images of self-gelling elastin biopolymers dissolved in a PBS solution below its transition temperature, at 4 0 C, where it is in a liquid state and above its transition temperature, at 37 0 C, where They find gelled.
  • EXAMPLE 4 Evaluation of the interaction of self-gelatable elastin copolymers with primary cells.
  • biopolymers of the present example have the following structure:
  • the polymers to be tested were adsorbed onto polystyrene surfaces (standard material in cell cultures) using solutions of these in PBS buffer with concentrations of 1mg / ml. Subsequently, successive washes were also washed with PBS and the surface not saturated with the BSA protein was blocked.
  • Cytotoxicity or proliferation tests were also performed by spectrophotometry and using a "AlamarBIue TM" detection system by AbD Serotec.
  • FIG. 12 represents an estimate of the number of cells (metabolically active) for 24, 72 and 96 hours after planting. From these data it follows that the substrates are not cytotoxic, for the times tested, since the number of active cells is maintained during the time of the experiment. On the other hand, it was also observed that the differences already mentioned in terms of good adhesion to the Self-gelatable Elastin Copolymer With respect to the control polymer, were reflected in all the stages of the experiment since the number of cells at 24, 72 and 96 hours it was substantially higher in the substrate of copolymer A than in the control polymer.
  • the MALDI ToF analysis was carried out on a MALDI ToF Reflex IV spectrometer (Bruker, Bremen, Germany) equipped with a CovalX's HM2 detector for the mass range of 0 to 1500 kDa. To calibrate the instrument, an external calibration was applied with clusters of Insulin, BSA and IgG. For this sample, 3 spots (300 laser shots per spot) were analyzed. The data was analyzed using the Complex Tracker software.
  • the results of the amino acid composition correlate very well with the estimation of the expected amino acid composition taking into account the endogenous errors of the technique and the particular composition of the composition in the sample.

Abstract

La presente invención se refiere a un biopolímero, bioactivo y totalmente biocompatible, muy fluido a temperatura ambiente y con capacidad de gelificar de forma brusca a 37 ºC; formando un implante sólido estructuralmente integro, continuo y con altas prestaciones mecánicas. El biopolímero comprende al menos un dominio bioactivo capaz de dirigir de forma precisa la formación de un implante sólido o semi-sólido. Asimismo la invención se refiere a cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para la secuencia aminoacídica del biopolímero, implantes, vehículos farmacéuticamente aceptables, a sus usos y a un método de síntesis del mismo.

Description

BIOPOLIMERO, IMPLANTE QUE LO COMPRENDE Y SUS USOS.
La presente invención se refiere a un biopolímero, bioactivo y totalmente biocompatible, muy fluido a temperatura ambiente y con capacidad de gelificar de forma brusca a 37 0C; formando un implante sólido estructuralmente íntegro, continuo y con altas prestaciones mecánicas. El biopolímero comprende al menos un dominio bioactivo capaz de dirigir de forma precisa Ia formación de un implante sólido o semi-sólido. Asimismo Ia invención se refiere a cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para Ia secuencia aminoacídica del biopolímero, implantes, vehículos farmacéuticamente aceptables, a sus usos y a un método de síntesis del mismo.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los implantes de materiales biomédicos macroscópicos sólidos pueden clasificarse en 2 categorías: (1 ) implantes carentes de integridad estructural o no continuos y (2) materiales que forman un implante estructuralmente íntegro o continuo. La primera estrategia se basa en implantes de micro o nanopartículas suspendidas en un vehículo biocompatible (Gamisans et al., 1999. lnt J Pharm. 79: 37-48; Igartua et al., 1998. J Control ReI: 56: 63-73; Brannon-Peppas L, 1995. Controlled reléase of ©-estradiol from biodegradable microparticles within silicone matrix; In: Polymer Biomateríals in Solution, as Interíaces and as Solids. 1st ed. Utrech (The Netherlands): VSP-Utrecht; Kawaguchi H, 2000. Proq Polvm Sci, 25: 1171-1210). Debido a que no poseen propiedades mecánicas, estos implantes pueden migrar del sitio de inserción. Para superar esta desventaja, se han diseñado sistemas que combinan baja viscosidad y alta fluidez al momento de Ia inyección con un aumento pronunciado en las propiedades mecánicas a posteriori, que resulta en Ia formación de un implante sólido y con límites bien definidos.
Las familias de biomateriales inyectables existentes se pueden resumir en a) Pastas Termoplásticas, b) Precipitación In Situ, c) Sistemas Polimerizables o Entrecruzables In Situ, d) Materiales Inteligentes y e) Sistemas de Estrategia Combinada.
Las pastas termoplásticas que despliegan un aumento de viscosidad son materiales de bajo peso molecular caracterizados por una baja temperatura de transición vitrea (Tg) y una temperatura de fusión (Tm) entre 370C y 650C. Así, las pastas son inyectadas en estado fundido (en general a una temperatura por encima de Ia temperatura corporal) y Ia cristalización gradual en el cuerpo resulta en Ia solidificación y formación de un implante continuo (Hatefi et al. ,2002. J Control ReL 80: 9-28). Los polímeros más importantes para el desarrollo de estos implantes son policaprolactona (PCL), ácidos poliláctico (PLA), poliglicólico (PGA) y polidioxanona (PDO), poliortoésteres (POEs), entre otros.
Sosnik y Cohn diseñaron una modificación de esta estrategia mediante Ia síntesis de oligómeros segmentados de polietilenglicol y PCL que combinaron inyectabilidad mejorada y endurecimiento gradual a 370C a Io largo del tiempo (Sosnik et al., 2003. Polvmer, 44: 7033-7042).
Los materiales inteligentes son aquellos que despliegan un cambio abrupto en una de sus propiedades (por ejemplo viscosidad) ante un pequeño cambio en las condiciones del entorno. El estímulo puede ser físico (p.e. temperatura, fuerza iónica, campo magnético o eléctrico, estrés mecánico), químico (p.e. pH) o bioquímico (p.e. substrato de enzimas o ligandos específicos) (Hoffman et al., 2000. J Biomed Mater Res Part A. 52: 577-586).
Las soluciones acuosas de los materiales inteligentes tienen baja viscosidad a temperatura ambiente y exhiben un aumento con el calentamiento formando un gel semi-sólido o sólido cuando alcanzan Ia temperatura fisiológica. Esta transición se observa generalmente en un estrecho intervalo de temperatura. Existen varios polímeros que presentan este comportamiento. Entre ellos, cabe destacar Ia poli-N-sopropilacrilamida (PNIPAAm) (Peppas et al., 2000. Eur J Pharm Biopharm, 50: 27-46), copolímeros segmentados de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno) (PEO-PPO) (Bromberg et al., 1998. Adv Druq Del Rev, 31 : 197-221 ), copolímeros segmentados de poli(óxido de etileno)- poliésteres (PEO-PLA, PEO-PCL) (Jeong et al., 1999. J Control ReI. 62: 109- 114) y otras moléculas anfifílicas diseñadas alternando segmentos hidrofílicos e hidrofóbicos (Lee et al., 2002. Macromolecules, 35: 3876-3879). Una de las desventajas presentada por los polímeros comerciales de PEO y PPO es Ia no degradabilidad de Ia cadena polietérica en el medio biológico.
La combinación de las técnicas anteriores ha dado lugar a implantes que presentan propiedades de dos grupos de materiales anteriormente descritos: (1 ) aumento de Ia viscosidad con el incremento de Ia temperatura y (2) entrecruzamiento covalente para obtener propiedades mecánicas robustas y mayor estabilidad estructural. Así, el implante puede ser insertado en forma líquida, gelar a 370C para formar un gel semi-sólido y finalmente ser estabilizado por entrecruzamiento covalente. En muchos casos estos polímeros van acompañados de disolventes y reactivos orgánicos. Las limitaciones más importantes de los Poli-N-isopropilacrilamida (PoIiNIPAAm) que son algunos de los polímeros termosensibles inversos más populares son Ia no degradabilidad de las matrices puras y Ia pérdida de volumen o contracción durante el calentamiento.
Es conocido que las proteínas recombinantes tipo elastina (ELR) que se usan como polímeros biocompatibles, son altamente versátiles, puesto que estas características se pueden modificar y ampliar insertando los aminoácidos de dominios funcionales extraídos de otras proteínas o diseños naturales de novo
(Rodríguez-Cabello JC, Prieto S, Reguera J, Arias FJ y Ribeiro A. (2007). J1
Biomater. Sci. Polymer Edn, 18(3): 269-286). En dicha revisión también se comenta que recientemente, el potencial demostrado de los polímeros ELR ha sido amplificado por el uso de las tecnologías de ADN recombinantes. Esta revisión explora el actual desarrollo de los polímeros ELR, con un énfasis particular en las aplicaciones biomédicas.
También es conocido que en Ia cadena del biopolímero se pueden insertar péptidos que contengan dominios bioactivos como por ejemplo RGD (R = L- arginina, G = glicina y D = ácido L-aspártico) o REDV (E = ácido L-glutámico y V = L-valina) que dotan a los biopolímeros de una alta capacidad de unión a diversos tipos celulares.
Otra familia de materiales de suma importancia son los polímeros segmentados de PEO y PPO, comercialmente conocidos como Pluronic (lineales y bifuncionales) y Tetronic (ramificados y tetrafuncionales) que no presentan contracción de volumen como los PoIiNIPAAm, pero que, como contrapartida, aun en casos donde los materiales comerciales presentan Ia transición sol-gel, los niveles de viscosidad alcanzados no son Io suficientemente elevados para Ia mayoría de las aplicaciones clínicas. Es decir, las propiedades mecánicas de los polímeros PEO y PPO son insatisfactorias y los geles muestran excesiva permeabilidad al agua y consecuentemente tiempos de residencia sumamente cortos en el sitio del implante. Por este motivo y para situaciones semejantes se recurre a estrategias combinadas con el objeto de prevenir Ia reabsorción del implante inmediatamente después de Ia inserción, mediante el aumento pronunciado de Ia viscosidad, y un posterior entrecruzamiento covalente para alcanzar propiedades mecánicas robustas y de mayor estabilidad. De esta manera se obtienen hidrogeles con módulos de 415 kPa pero con el consecuente aumento del tiempo necesario para alcanzar Ia consistencia deseada ya que en este caso se debe producir una reacción de entrecruzamiento en condiciones fisiológicas que serán superiores a Ia hora.
A pesar de que se han venido ensayando mediante diferentes estructuras basadas en proteínas ELR, no se ha conseguido sintetizar un bipolímero que no presente una dilución apreciable del implante. Este hecho es debido a que Ia gelificación de este tipo de polímeros todavía es demasiado lenta. Esta dilución del implante disminuye Ia eficacia del mismo.
Por tanto se hace necesario resolver Ia dificultad de conseguir una gelificación Io suficientemente rápida y selectiva para producir un implante sólido eficaz.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un biopolímero, bioactivo y biocompatible, muy fluido a temperatura ambiente y con capacidad de gelificar de forma brusca a 37 0C formando un implante sólido estructuralmente íntegro, continuo y con altas prestaciones mecánicas. El biopolímero comprende al menos un dominio bioactivo capaz de dirigir de forma precisa Ia formación de un implante sólido o semi-sólido de manera que además de formar el implante presenta biofuncionalidades como interactuar con células en el organismo, o introducirlas actuando como sistema de terapia celular (medicina regenerativa); también puede actuar como sistema de liberación controlada de fármacos, inducir nucleación inorgánica, etc. Asimismo Ia invención se refiere a cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para Ia secuencia aminoacídica del biopolímero, implantes, vehículos farmacéuticamente aceptables, a sus usos y a un método de síntesis del mismo.
El biopolímero de Ia presente invención es un copolímero ya que está formado por varios monómeros. El término copolímero es un sinónimo de heteropolímero. Los monómeros son péptidos de 5 aminoácidos (pentapéptidos) que se pueden unir de diferentes formas por medio de enlaces químicos.
En Ia presente invención se han obtenido sistemas autogelificables a partir de polímeros proteicos tipo elastina con un alto grado de eficiencia, complejidad, control y robustez. Los biopolímeros de Ia presente invención se han conseguido empleando las siguientes herramientas: - Conocimiento sobre las fuerzas hidrofóbicas y elásticas de los aminoácidos. De este modo se puede disponer de un control preciso y cuantitativo de cuánto de hidrofóbico o hidrofílico ha de ser cada pentapéptido en el biopolímero. Partiendo de este conocimiento y del fenómeno de transición inversa (Tt) que se da en estos materiales, se construyeron biopolímeros tipo elastina autogelificables mediante estructuras que alternan pentapéptidos hidrofílicos y pentapéptidos hidrofóbicos de manera que las interacciones entre los pentapéptidos hidrófobos, en disoluciones acuosas, son vitales para producir el fenómeno de autogelificación deseado por encima de una temperatura determinada.
- Uso de Ia tecnología de ADN recombinante mediante Ia clonación de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para Ia secuencia aminoacídica del biopolímero de Ia presente invención en un vector capaz de expresar dicha secuencia. Mediante esta tecnología se aprovecha Ia maquinaria de replicación, transcripción y traducción de los organismos para producir los biopolímeros.
- Biocompatibilidad de los biopolímeros basados en secuencias de polipéptidos ELP (Elastin-Like Polypeptide). Ésta es una característica útil en el desarrollo de sistemas que funcionen en contacto con tejidos vivos o fluidos específico. Los ELPs no pueden ser distinguidos de Ia elastina natural por el sistema inmune por Io que su biocompatibilidad puede considerarse extrema.
Por tanto, aprovechando estas herramientas, los biopolímeros recombinantes (producidos por medio de Ia tecnología de ADN recombinante), adquieren Ia capacidad de autoensamblado y permiten el desarrollo de sistemas nanométricos. Con esta nueva estrategia se consiguen sistemas y propiedades de autoensamblado con características claramente superiores a los descritos en Ia actualidad. Los biopolímeros de Ia presente invención presentan varias ventajas respecto de otros copolímeros conocidos del estado de Ia técnica:
- Tiene al menos una secuencia con un dominio bioactivo de modo que de esta manera el biopolímero se adhiere a las células específicas para el que se ha diseñado y se produce Ia gelificación, obteniendo un material con un módulo elástico de compresión orden de 105 Pa.
- El tiempo de gelificación desde que se administra el biopolímero (normalmente por inyección) es de entre 1 y 3 minutos a 37 0C para un biopolímero con una concentración de entre 150 y 200 mg/ml.
La gelificación rápida es muy importante para evitar una dilución apreciable del implante en el entorno biológico, Io que puede disminuir Ia eficacia del implante. Puesto que Ia gelificación se produce en un intervalo de tiempo tan corto, es muy importante dirigir el biopolímero al tejido específico de interés, consiguiendo de este modo un implante sólido selectivo.
Los biopolímeros pueden formar un implante sólido, estructuralmente íntegro y con altas prestaciones mecánicas en unos minutos sin necesidad de entrecruzamiento. Los polímeros se pueden aplicar en terapias para el daño en tejido nervioso y médula espinal, en terapias para el daño en cartílagos y hueso (incluyendo secuencias capaces de inducir nucleación inorgánica), en Ia prevención de cicatrices (incluyendo secuencias antiadherentes como por ejemplo SEQ ID NO: 1 ), en el tratamiento de necrosación de varices, en aumento de tejidos, en tratamiento de enfermedades mediante Ia liberación controlada de fármacos (incluidos en dicho biopolímero). En definitiva, los biopolímeros de Ia invención pueden ser capaces de incluir múltiples funcionalidades simultáneamente en un único biopolímero que puede tener ventajas obvias debido a Ia biocompatibilidad del mismo.
En este sentido, el primer aspecto de Ia presente invención es un biopolímero que comprende las secuencias aminoacídicas A, B y C con Ia estructura: (An - Bm)s - Cp, donde,
A tiene Ia estructura (Dti - Evi - Dt2) o Ia estructura (Dti - EV2), donde D es SEQ ID NO: 1 ; E es SEQ ID NO: 2; t1 y t2 tienen valores de entre 2 y 4; y v1 y v2 tienen valores de entre 1 y 5,
B se selecciona de Ia lista que comprende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 26. B también puede ser Ia secuencia SEQ ID NO: 27.
C tiene Ia estructura (Gwi - Hxi - Gw2) O Hx2, donde G es SEQ ID NO: 5; H es una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que se selecciona de Ia lista que comprende RGD, LDT, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16; w1 y w2 tienen valores de entre 5 y 15; y x1 y x2 tienen valores de entre 1 y 5,
n tiene un valor de entre 5 y 15, m tiene un valor de entre 10 y 70, s tiene un valor de entre 2 y 4, y p tiene un valor de entre 1 y 5.
La secuencia aminoacídica A es el bloque hidrofóbico, Ia secuencia aminoacídica B es el bloque hidrofílico y Ia secuencia aminoacídica C es el bloque bioactivo. Este último bloque comprende dominios que son capaces de reconocer secuencias específicas e interaccionar con ellas de modo que permiten Ia proximidad del biopolímero de Ia invención a Ia diana celular deseada.
t1 y t2 pueden tener valores iguales o diferentes. v1 y v2 pueden tener valores iguales o diferentes. w1 y w2 pueden tener valores iguales o diferentes. x1 y x2 pueden tener valores iguales o diferentes. La secuencia RGD es reconocida por diversos tipos celulares, Ia secuencia SEQ ID NO: 7 es reconocida por células endoteliales, LDT, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 está presente en laminina y es reconocida por diversos tipos celulares, SEQ ID NO: 10 es reconocida por neuritas, es decir, cualquier expansión del soma de una neurona, ya sea una dendrita o un axón. Estas secuencias, que forman parte del biopolímero de Ia invención, son reconocidas por sus respectivos tipos celulares y propician su unión. Los biopolímeros que contengan SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 se pueden emplear en terapias de daños vasculares, tejidos nerviosos o de médula espinal respectivamente.
La secuencia SEQ ID NO: 11 tiene afinidad por fosfato de calcio, SEQ ID NO: 12 tiene afinidad por el oro, SEQ ID NO: 13 tiene afinidad por Ia plata, SEQ ID NO: 14 tiene afinidad por el platino, SEQ ID NO: 15 tiene afinidad por el silicio (SiO2), SEQ ID NO: 16 tiene afinidad por el carbonato calcico (CaCO3). Estas secuencias permiten Ia integración en el biopolímero de capacidades como, unión a Ia parte mineral del hueso, introducción de elementos de detección, capacidad bactericida y otras.
La secuencia aminoacídica H puede comprender un péptido que pertenezca a una secuencia de un factor de crecimiento, una secuencia inductora de nucleación inorgánica, una secuencia antiadherente como por ejemplo, pero sin limitarse, SEQ ID NO: 1. La secuencia H puede codificar para un agente activo o agente terapéutico o agente quimioterapéutico o un anticuerpo terapéutico o un fragmento de anticuerpo terapéutico.
Un factor de crecimiento es una sustancia, normalmente de naturaleza proteica, pero sin limitarse. La función principal de un factor de crecimiento es estimular Ia proliferación celular, entre otras funciones. La secuencia del factor de crecimiento se selecciona de Ia lista que comprende los factores; factor de crecimiento transformante beta TGF-beta (para Ia regeneración de hueso), factor de crecimiento de los fibroblastos FGF o KGF, factor de crecimiento epidérmico EGF o TGF-alfa, factor de crecimiento endotelial vascular VEGF, factor de tipo insulina ILGF, factor como BMPs para hueso o factor TGF-β de Ia familia Sonic hedgehog gene.
La secuencia inductora de Ia nucleación inorgánica es un péptido que tiene Ia función, pero sin limitarse, de promover de forma activa y eficaz Ia nucleación y crecimiento de cristales inorgánicos en condiciones en las que éstos no aparecerían o aparecerían con otra estructura en ausencia de esta secuencia.
La secuencia antiadherente es una secuencia peptídica que inhibe Ia interacción específica entre el biopolímero que Ia contiene y al menos un tipo celular.
En este sentido, los biopolímeros de Ia presente invención presentan una gelificación que en algunos casos es instantánea y en todos muy corta; de entre 1 y 12 minutos para el biopolímero A y 21 minutos para el biopolímero B. Este tiempo es mucho menor al de los biopolímeros descritos en el estado de Ia técnica que suele ser de varias horas, en los que se aumenta Ia viscosidad y se lleva a cabo un entrecruzamiento covalente in situ para que alcancen propiedades mecánicas robustas y de mayor estabilidad. De esta manera no existe dilución apreciable del implante en el entorno biológico como ocurre con los sistemas exclusivamente entrecruzables. Y además se alcanzan propiedades mecánicas con valores de módulos en compresión del orden de 105 Pa (tanto para el biopolímero A como para el biopolímero B) y por tanto no es necesario recurrir a estrategias combinadas que tienen el inconveniente de presentar un aumento de los tiempos necesarios para alcanzar las propiedades óptimas así como Ia introducción de otros agentes que pueden afectar a Ia biocompatibilidad del implante.
Una realización preferida de Ia invención se refiere al biopolímero donde A tiene Ia estructura (Dti - Evi - Dt2). En otra realización preferida del biopolímero, C tiene Ia estructura (Gwi — Hxi — GW2). Según otra realización preferida del biopolímero, Ia secuencia aminoacídica de H contiene el péptido RGD. En otra realización preferida del biopolímero, Ia secuencia aminoacídica de H que contiene el péptido RGD es SEQ ID NO: 6.
En otra realización preferida, Ia secuencia aminoacídica B es SEQ ID NO: 3.
Según una realización aún más preferida del biopolímero, m tiene un valor de entre 55 y 65. Una realización más preferida es el biopolímero que comprende los péptidos B, D, E, G, D y H con Ia estructura [(D2 - E - D2)-ιo - Bεok -
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Otra realización preferida se refiere al biopolímero donde Ia secuencia aminoacídica B es SEQ ID NO: 4. Según una realización más preferida del biopolímero, m tiene un valor de entre 15 y 25. Otra realización aún más preferida se refiere al biopolímero que comprende los péptidos B, D, E, G, D y H con Ia estructura [(D2 - E - D2)10 - B20]2 - (G1 O - H - G-Io)2. El péptido resultante de intercalar un aminoácido Valina (V) entre los aminoácidos Glicina (G) y Alanina (A) de Ia secuencia SEQ ID NO: 4 actúa como diana de proteasas y modula Ia biodegradabilidad del biopolímero y es muy adecuado por ejemplo para Ia liberación de fármacos o medicina regenerativa.
Con el fin de introducir las funcionalidades que se necesita para cada aplicación, los biopolímeros proteicos recombinantes tipo elastina se diseñan y construyen a medida mediante Ia conjunción de diferentes péptidos que contengan dominios que se introducen para incluir cada una de las características requeridas. Así pues, los dominios son:
- Dominios con funciones biomiméticas. Se incluyen aquellos dominios capaces de introducir funciones de autoensamblado y autoorganización en Ia nano y microescala, necesarios para inducir un cambio en sus propiedades físicas muy acusado al aumentar Ia temperatura. Esta característica del biopolímero se denomina Gelación Térmica Inversa (Reverse Thermal Gelation, RTG). Las soluciones acuosas de estos biopolímeros tienen baja viscosidad a temperatura ambiente y exhiben una mayor viscosidad con el aumento de Ia temperatura, llegando a formar un gel semisólido o sólido cuando alcanzan Ia temperatura fisiológica (entorno a los 37 0C). Dicha característica además de ser Ia responsable de Ia autogelificación permite Ia utilización de estos biopolímeros como sistemas de dosificación de fármacos ya que el mismo proceso de gelificación va a servir para encapsular fármacos y principios activos presentes en Ia disolución que posteriormente se pueden liberar de forma controlada. Otro tipo de aplicación sería el de aumento de volumen de tejido.
- Dominio no bioactivo tipo elastina. Su función es dotar al material de Ia adecuada biocompatibilidad y propiedades mecánicas. Un biopolímero que sólo incluyera este tipo de secuencias sin incluir secuencias bioactivas podría diseñarse además como sistema antiadherente para aplicaciones como Ia prevención de adherencias.
- Dominios bioactivos. Estos dominios dotan al biopolímero de propiedades específicas de adhesión celular a través de péptidos conocidos de las proteínas de Ia matriz extracelular. Como se ha indicado anteriormente, entre secuencias con dominios de este tipo están SEQ ID NO: 7 que es reconocida por las células endoteliales, LDT, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 procede de Ia laminina o SEQ ID NO: 10 que es reconocida por neuritas.
- Otros dominios para inducir Ia biodegradabilidad del biopolímero, muy adecuado para que se produzca una liberación controlada de fármacos.
En adelante, se hará referencia a cualquiera de los biopolímeros anteriores como "biopolímeros de Ia invención" o "biopolímeros de Ia presente invención".
Las secuencias aminoacídicas (se puede usar el término "péptidos" indistintamente para referirse a las secuencias aminoacídicas) B, D, E, G y H de acuerdo con las estructuras descritas que dan lugar a los biopolímeros de Ia invención, pueden estar unidos por enlace covalente o cualquier otro tipo de enlace que de lugar a una estructura que mantenga las propiedades de los biopolímeros de Ia presente invención. El enlace se selecciona, aunque sin limitarse, de Ia lista que comprende puentes de hidrógeno, apareamiento iónico, asociación hidrofóbica o formación de complejos de inclusión.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para Ia secuencia aminoacídica de cualquier biopolímero de Ia invención.
El ácido nucleico (en adelante, ácido nucleico de Ia invención o ácido nucleico de Ia presente invención) incluye secuencias de ácido nucleico cuyo producto de Ia transcripción, el ARN mensajero (ARNm) codifica para Ia misma secuencia de aminoácidos (en adelante, secuencia de aminoácidos de Ia presente invención o secuencia de aminoácidos de Ia invención). También se incluyen secuencias variantes degeneradas de las secuencias nucleotídicas de Ia invención, cuyo producto es un biopolímero con las mismas características que el biopolímero de Ia invención. También se incluyen secuencias de nucleótidos que codifiquen para secuencias aminoacídicas que tengan modificaciones en su extremo N-terminal, C-terminal y/o en alguna posición aminoacídica interna de modo que Ia función del biopolímero resultante sea Ia misma que Ia que resulta de Ia traducción de Ia secuencia de ARNm transcrita a partir de Ia secuencia de nucleótidos de Ia invención. La secuencia de aminoácidos puede estar codificada por cualquier secuencia nucleotídica que de lugar a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de Ia invención. Debido a que el código genético es degenerado, un mismo aminoácido puede ser codificado por diferentes codones (tripletes), por ello, Ia misma secuencia de aminoácidos puede ser codificada por distintas secuencias de nucleótidos.
El ácido nucleico de Ia presente invención puede tener unido a su extremo 5' una secuencia nucleotídica que sirva de secuencia iniciadora de Ia transcripción. La secuencia puede ser, pero sin limitarse, Ia secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 20. Asimismo, el ácido nucleico de Ia presente invención puede tener unido a su extremo 3' una secuencia de terminación de Ia transcripción como por ejemplo, pero sin limitarse, Ia secuencia GTATGA.
Un aspecto más de Ia presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de Ia invención.
El término "vector de expresión" (en adelante, vector de Ia invención o vector de Ia presente invención) se refiere a un fragmento de ADN que tiene Ia capacidad de replicarse en un determinado huésped y, como el término indica, puede servir de vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en el caso de Ia presente invención, el vector puede comprender cualquiera de las secuencias nucleotídicas que codifican para cualquiera de los biopolímeros de Ia invención, fusionadas al mismo, que puede replicarse en el huésped adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o vectores virales, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con Ia definición realizada de vector.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una célula aislada transfectada con el vector de Ia invención. En adelante, se hará referencia a las células anteriores como las células de Ia invención o las células de Ia presente invención.
El término "célula" tal como se entiende en Ia presente invención hace referencia a una célula procariótica o eucariótica. La célula puede ser una bacteria capaz de replicar un ADN ajeno transformado como por ejemplo cualquiera de las cepas de Ia especie Escherichia coli o una bacteria capaz de transferir el ADN de interés al interior de una planta como por ejemplo Agrobacteríum tumefaciens. Preferiblemente, Ia célula hace referencia a una célula eucariótica vegetal y dentro de este grupo, más preferiblemente, a aquellas células pertenecientes al reino Plantae. Así pues, en el caso de que Ia célula sea vegetal, el término célula comprende, al menos, una célula del parénquima, célula meristemática o de cualquier tipo, diferenciada o indiferenciada. Asimismo, también se incluye en esta definición un protoplasto (célula de una planta que carece de pared celular).
El término "transfección" hace referencia a Ia introducción de material genético externo en células mediante plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de transducción) u otras herramientas para Ia transferencia. El término transfección para métodos no-virales es usado en referencia a células eucarióticas de mamífero, mientras que el término transformación se prefiere para describir las transferencias no-virales de material genético en bacterias y células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del biopolímero de Ia invención para preparar Ia preparación de un implante. El término "implante" tal como se entiende en Ia presente invención es una sustancia en estado sólido o semi-sólido que puede colocarse en el cuerpo para mejorar alguna de sus funciones, o con fines estéticos.
Otro aspecto de Ia presente invención es un implante que comprende cualquiera de los biopolímeros de Ia invención. Una realización preferida de Ia presente invención es un implante donde el biopolímero tiene una concentración de entre 30 y 300 mg/ml. Preferiblemente el implante tiene una concentración de biopolímero de entre 50 y 200 mg/ml. Otra realización preferida de Ia invención es un implante que se presenta en una forma adaptada a Ia administración parenteral. La forma adaptada a Ia administración parenteral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración inyectable, es decir, preferiblemente en estado líquido, y para ello se requiere que el biopolímero esté a una temperatura inferior a su temperatura de gelificación. La administración parenteral puede ser por vía de administración intramuscular, intradérmica, subcutánea o intraósea pero sin limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración parenteral. Otra posibilidad es que el implante se presente en una forma adaptada a Ia administración seleccionada del grupo que comprende, pero sin limitarse, oral, rectal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal, intra-articular, intra-arterial, sub-aracnoideo, bronquial, linfática, vaginal o intra-uterina.
Según otra realización preferida, el implante incluye además una sustancia activa. Preferiblemente Ia citada sustancia activa es una sustancia farmacéuticamente aceptable usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en animales. Preferiblemente el animal es un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano. El implante puede mezclarse con células de uno o varios tipos, previamente a Ia implantación del mismo.
En adelante se hará referencia al implante como el implante de Ia invención o el implante de Ia presente invención.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del implante de Ia invención para el tratamiento de cartílago o hueso. Mediante el uso del implante pueden tratarse defectos que no sean dañinos. El tratamiento puede ser preventivo de daños o simplemente como mejora de un estado que no implique un daño. El implante es capaz de reparar un daño en el cartílago o hueso o de mantener unidas estructuras cartilaginosas u óseas fragmentadas a cualquier nivel, macroscópico o microscópico así como permitir Ia liberación de sustancias activas farmacéuticamente aceptables que ayuden al tratamiento del dolor o a Ia recuperación de los daños.
Un aspecto más de Ia presente invención es el uso del implante de Ia invención para el tratamiento del tejido nervioso o médula espinal. Mediante el uso del implante pueden tratarse defectos que no sean dañinos. El tratamiento puede ser preventivo de daños o simplemente como mejora de un estado que no implique un daño. El implante es capaz de permitir Ia liberación de sustancias activas farmacéuticamente aceptables que ayuden al tratamiento del dolor o a Ia recuperación de un daño en el tejido nervioso o médula espinal. Para llevar a cabo este tipo de tratamiento, el biopolímero puede contener Ia secuencia SEQ ID NO: 10 con células incorporadas. Las células incorporadas pueden ser células madre, mesenquimales, o cualquier célula diferenciada.
Otro aspecto de Ia presente invención es el uso del implante para el tratamiento de necrosaciones de varices. El biopolímero de Ia invención actúa taponando varices y causando su necrosación. El implante puede contener agentes farmacológicos.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del biopolímero de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento. Una realización preferida se refiere al uso del biopolímero de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de cartílago o hueso, para el tratamiento del tejido nervioso o médula espinal o para el tratamiento de necrosaciones de varices.
Un aspecto más de Ia presente invención se refiere a un vehículo farmacéuticamente aceptable que comprende cualquiera de los biopolímeros de Ia invención.
Tal como se entiende en Ia presente invención, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en Ia elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc. El vehículo farmacéuticamente aceptable de Ia presente invención permite una dosificación o administración específica y dirigida además de dar consistencia y forma a Ia preparación farmacéutica.
Además, el vehículo debe ser farmacéuticamente adecuado, es decir, que permita Ia actividad del biopolímero de Ia invención. Una realización preferida es el vehículo farmacéuticamente aceptable donde el biopolímero de Ia invención tiene una concentración de entre 30 y 300 mg/ml. Preferiblemente el vehículo tiene una concentración de biopolímero de entre 50 y 200 mg/ml. Según otra realización preferida el vehículo farmacéuticamente aceptable se presenta en una forma adaptada a Ia administración parenteral. Además, el tipo de administración se puede seleccionar de entre los que se han citado en un apartado anterior.
En adelante se hará referencia al vehículo farmacéuticamente aceptable como el vehículo de Ia invención o vehículo de Ia presente invención.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del vehículo de Ia invención para Ia liberación controlada de fármacos. El vehículo es capaz de dosificar un fármaco de una manera sostenida y/o localizada en un tejido o entorno de células específico. El vehículo de Ia presente invención puede comprender una sustancia activa. Tal como se ha descrito en Ia presente invención el biopolímero comprendido en el vehículo de Ia invención puede tener secuencias de reconocimiento celular que proporcionan una localización específica. El vehículo de Ia invención puede ser, pero sin limitarse, del tipo nanopartícula, micropartícula, microesfera o microcápsula. El uso del vehículo de Ia invención para Ia liberación controlada de fármacos se puede llevar a cabo en animales. Preferiblemente los animales son mamíferos. Preferiblemente los mamíferos son humanos.
El vehículo de Ia presente invención capaz de liberar fármacos de forma controlada, puede emplearse, pero sin limitarse, para el tratamiento de varices.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método para Ia síntesis del biopolímero de Ia invención que comprende: a. insertar el ácido nucleico de Ia invención en un vector de expresión, b. transfectar una célula con el vector de expresión obtenido según el apartado (a), c. seleccionar la célula transfectada según el apartado (b) que comprende el ácido nucleico de Ia invención, d. expresar el ácido nucleico en Ia célula según el apartado (c) y e. purificar el biopolímero producido según el apartado (d).
El grado de complejidad composicional impuesto por las necesidades del diseño multifuncional no puede ser alcanzado por técnicas estándar de síntesis macromolecular. El biopolímero se obtiene como proteína recombinante, mediante técnicas adaptadas de biología molecular y biotecnológica, en microorganismos o plantas modificados genéticamente.
La secuencia nucleotídica que codifica para Ia secuencia aminoacídica del biopolímero de Ia presente invención, se inserta en un vector de expresión definido anteriormente.
La transfección de una célula, definida en un párrafo anterior, se lleva a cabo con técnicas conocidas en el estado de Ia técnica, por ejemplo pero sin limitarse, con electroporación, con biolística, Agrobacterium tumefaciens o cualquier otra técnica que permita Ia integración de cualquiera de los ácidos nucleicos de Ia invención en el ADN de Ia célula huésped, ya sea genómico, cloroplástico o mitocondrial.
La expresión del ácido nucleico en Ia célula de Ia invención da lugar a un biopolímero que puede ser purificado mediante técnicas conocidas en el estado de Ia técnica.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG 1. Muestra Ia electroforesis SDS-PAGE del biopolímero A.
FIG 2. Muestra Ia dependencia de las propiedades reológicas del polímero con Ia temperatura para una muestra del biopolímero A en PBS y para una concentración de 200 mg/ml.
En el eje de ordenadas izquierdo se muestran los valores correspondientes a G' (círculos blancos) y en el eje derecho los valores correspondientes a G" (círculos negros), los valores están en Pascales (Pa).
La escala Delta hace referencia al ángulo de desfase, medido en grados.
En el eje de abcisas se muestra Ia temperatura (T) en 0C.
FIG 3. Muestra Ia variación de las propiedades reológicas a 37 0C para una muestra del biopolímero A en PBS y para una concentración de 200 mg/ml.
En el eje de ordenadas izquierdo se muestran los valores correspondientes a G' (círculos blancos) y en el eje derecho los valores correspondientes a G" (círculos negros), los valores están en Pascales (Pa).
La escala Delta hace referencia al ángulo de desfase, medido en grados.
En el eje de abcisas se muestra el tiempo (t) en minutos. FIG 4. Muestra Ia electroforesis SDS-PAGE del biopolímero B.
FIG 5. Muestra Ia dependencia de las propiedades reológicas del polímero con Ia temperatura para una muestra del biopolímero B en PBS y para una concentración de 200 mg/ml.
En el eje de ordenadas izquierdo se muestran los valores correspondientes a G' (círculos blancos) y en el eje derecho los valores correspondientes a G" (círculos negros), los valores están en Pascales (Pa).
La escala Delta hace referencia al ángulo de desfase, medido en grados.
En el eje de abcisas se muestra Ia temperatura (T) en 0C.
FIG 6. Muestra Ia variación de las propiedades reológicas a 37 0C para una muestra del biopolímero B en PBS y para una concentración de 200 mg/ml.
En el eje de ordenadas izquierdo se muestran los valores correspondientes a G' (círculos blancos) y en el eje derecho los valores correspondientes a G" (círculos negros), los valores están en Pascales (Pa).
La escala Delta hace referencia al ángulo de desfase, medido en grados.
En el eje de abcisas se muestra el tiempo (t) en minutos.
FIG 7. Muestra los biopolímeros de Ia invención disueltos en PBS por debajo (4°C) y por encima (37°C) de su temperatura de transición.
FIG. 8. Muestra imágenes de fibroblastos sembrados sobre fibronectina obtenidas pasadas 2 horas desde Ia siembra. FIG. 9: Muestra imágenes de fibroblastos sembrados sobre el Copolímero Tipo Elastina Autogelificable A obtenidas pasadas 2 horas desde Ia siembra.
FIG. 10: Muestra imágenes de fibroblastos sembrados sobre BSA obtenidas pasadas 2 horas desde Ia siembra.
FIG. 11 : Muestra imágenes de fibroblastos sembrados sobre el Copolímero Tipo Elastina Autogelificable control obtenidas pasadas 2 horas desde Ia siembra.
FIG. 12. Muestra el porcentaje de células del medio de cultivo crecidas sobre diferentes substratos durante 24, 72 y 96 horas. FN corresponde a fibronectina mientras que BSA corresponde a albúmina de suero bovino.
FIG. 13. Muestra el espectro de masa de uno de los spots analizados con el Copolímero Tipo Elastina Autogelificable A.
FIG. 14. Muestra el espectro de masa de uno de los spots analizados con el Copolímero Tipo Elastina Autogelificable control.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen Ia síntesis del biopolímero de Ia presente invención así como sus características reológicas. Los ejemplos se proporcionan para poder comprender Ia descripción, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención. EJEMPLO 1. Obtención de polímeros proteicos recombinantes tipo elastina.
1.1 Diseño y obtención de Ia secuencia nucleotídica sintética que codifica Ia secuencia aminoacídica del biopolímero de Ia invención.
Desde el diseño del gen se tuvo que intentar obviar Ia contradicción existente entre el uso de los codones más frecuentes y oportunos que identifiquen aminoácidos muy repetidos y Ia necesidad de no sobrecargar o incluso, empobrecer hasta el colapso el sistema de traducción celular. Si se usan sistemas heterólogos procariontes, se debe considerar el problema derivado del limitado uso que hacen del código genético y que varía con Ia especie. También se consideró el problema que reside en Ia creación de un gen que está formado por una larga secuencia codificante por múltiples y/o pequeños fragmentos artificiales. Por último se debe soslayar Ia alta frecuencia de recombinación que suele ocurrir cuando el ADN exógeno contiene repeticiones de dominios con alta semejanza.
Esta etapa incluye Ia utilización de sintetizadores automáticos de ADN junto con técnicos de ADN recombinante. La obtención de polímeros con múltiples repeticiones pasa por Ia obtención del gen que Io codifica, que según sea Ia longitud de Ia secuencia puede hacer necesaria Ia síntesis previa de un monómero polinucleotídico que se pueda interconectar linealmente y en Ia dirección correcta.
La obtención de Ia cantidad suficiente del gen monomérico con Ia secuencia correcta para producir las secuencias nucleotídicas repetitivas que codifiquen los distintos polipéptidos ha requerido el cultivo de los clones adecuados y de Ia digestión de sus plásmidos. De esta forma se generó fácilmente Ia gran cantidad de monómero necesaria para Ia reacción de ligación controlada, concatenación o concatenamerización .
Aunque este tipo de estrategia parezca ser más dispendiosa en términos de tiempo, Ia síntesis in vivo garantiza Ia producción de Ia secuencia correcta en gran cantidad y además ofrece ulteriores ventajas: permite controlar el gen monomérico antes de Ia oligomerización, posibilita ulteriores modificaciones de Ia secuencia sea por mutagénesis dirigida sea por Ia creación de co-polímeros antes de Ia oligomerización.
La polimerización de las secuencias nucleotídicas monoméricas se puede llevar a cabo, pero sin limitarse, por medio de Ia concatenación, es decir, Ia ligación aleatoria de las piezas monoméricas; por medio del método iterativo y recursivo, una técnica de preparación paso a paso de olígomeros desde monómeros; o por medio del método de clonaje Seamless que se trata de un método de clonaje sin costuras, definición que se refiere a Ia posibilidad de elegir una secuencia específica que se traduzca en el deseado aminoácido en el punto de corte.
La concatenación permite sintetizar polímeros de oligómeros mediante Ia unión lineal unidireccional, cabeza-cola, de los segmentos de ADN que forman el monómero, esta unión solo es posible si los extremos de los segmentos son de hebra única, protuberantes y cohesivos entre ellos pero no consigo mismos. De esta forma el extremo a una hebra de Ia cabeza del monómero será complementario y se hibridará exclusivamente con el extremo de cola de otro monómero idéntico. Estos extremos, por tanto, no pueden ser palindrómicos, como corrientemente ocurre cuando son generados por las endonucleasas de restricción empleadas rutinariamente en ingeniería genética, donde el sitio de reconocimiento y corte coinciden secuencialmente, sino que deben ser diferentes.
Se han ido desarrollando distintas modificaciones a Ia técnica de Ia concatenación adaptándose a las exigencias específicas. Los monómeros con extremos cohesivos de única hebra se han obtenido por hibridación de oligómeros, por unión de oligonucleótidos cortos (linkers) o también por digestión con endonucleasas específicas.
El método iterativo y recursivo es una técnica de preparación paso a paso de olígomeros desde monómeros, que permite controlar tanto el orden de adición como el número de bloques que se unirán en cada etapa de su crecimiento, permitiendo confeccionar polímeros ad hoc. Para realizar tal método es necesario crear unas secuencias en las extremidades del segmento que codifiquen el monómero proteico que sean reconocidas por dos diferentes endonucleasas y cuyos cortes produzcan extremidades complementarias pero no palindrómicas. Esta secuencia monomérica es clonada en un plásmido que sirve de vector de amplificación génica y que proporciona tanto el siguiente vector de clonaje cuando se digiere con un único enzima; como el inserto de Ia clonación cortando con ambos enzimas.
El método de clonaje Seamless independiza el diseño de Ia secuencia del inserto que codifica el monómero de las secuencias reconocidas por las endonucleasas que Io generan. Esta estrategia es posible por Ia existencia de un restringido número de enzimas de restricción de tipo Ns que reconocen una secuencia específica no palindrómica que no coincide con el sitio de corte. Esta característica peculiar elimina los inconvenientes de Ia necesidad de incluir secuencias extrañas al polímero para permitir Ia generación de extremos cohesivos que permitan Ia concatenación y además con una única digestión se logran fragmentos que se unen de forma uni-direccional.
1.2. Expresión y purificación del polímero.
Una vez creada Ia secuencia nucleotídica que codificaba el biopolímero completo se pasó a Ia expresión del mismo. Para ello se transfirió Ia secuencia nucleotídica desde el correspondiente vector de clonación al vector especializado en su expresión mediante el uso de enzimas de restricción convencionales. Una vez comprobada que Ia transferencia se ha producido correctamente se transformó una cepa bacteriana específica para Ia expresión de dicha secuencia mediante cualquiera de las técnicas válidas que forman parte del conocimiento general común.
La expresión de las polipéptidos recombinantes se inició inoculando una colonia aislada que contenía el vector recombinante correspondiente en medio líquido LB con el eventual antibiótico de resistencia de Ia cepa y el antibiótico de resistencia adquirida con el vector de expresión.
Se incubó el cultivo bacteriano a 370C, con agitación orbital a 250 rpm, durante 11 horas aproximadamente, se utilizó este caldo de cultivo como inoculo de un medio fresco en una relación de 1/30. El volumen de medio en los Erlenmeyers no superó el 20-25% de su capacidad para favorecer una buena oxigenación del cultivo y se continuó el crecimiento de las bacterias en las mismas condiciones hasta que Ia densidad óptica a 600 nm estaba en torno a 0,6. En ese momento se indujo Ia expresión del biopolímero recombinante añadiendo IPTG a una concentración final de 1mM, y se volvió a incubar el cultivo a Ia temperatura adecuada y durante el tiempo requerido en cada ensayo.
Una vez terminada Ia inducción, se inhibió el crecimiento y el metabolismo de las bacterias enfriándolas a 40C. Posteriormente, se sedimentaron las células centrifugando a 5000xg durante 10 minutos a 40C, se decantó el sobrenadante y se secaron las paredes de los tubos de centrífuga para retirar los restos de medio de cultivo.
Se lavó el cultivo sedimentado con 100 mL/L de cultivo en tampón salino TBS (Tris- base 2OmM, NaC1 150 mM pH=8) resuspendiendo las bacterias mediante agitación fuerte y/o pipeteo, y se volvió a centrifugar a 5000xg durante 10 minutos a 40C. A continuación se decantó el sobrenadante, y se resuspendió el sedimento con 25 mL/L de cultivo con Ia solución TE (Tris-base 2OmM, EDTA 1mM pH=8) mediante agitación fuerte y/o pipeteo. Se mantuvo a 40C y se Ie añadió 10 μg/mL del inhibidor de proteasa PMSF.
Las bacterias se usaron sonicando con un aparato Sonicator 3000 de Misonix (New York) se realizaron 6 ciclos de 3,5 minutos con pulsos de 2 segundos cada 5 segundos a unos 100 W de potencia. Durante este proceso, Ia muestra se mantuvo en hielo para evitar Ia desnaturalización y precipitación por calor de las proteínas. Por último, se centrifugó a 15000xg durante 60 minutos a 40C: el sobrenadante constituye la fracción soluble total, y el sedimento, Ia fracción insoluble total. La fracción soluble total de las bacterias se acidificó hasta un pH=3,5 con ácido clorhídrico diluido en agua manteniendo Ia muestra en hielo y en agitación. A continuación, el material precipitado (fundamentalmente proteínas acidas y ADN) se retiró por centrifugación a 15000xg durante 20 minutos a 40C. Según el polímero en cuestión se modificó o no Ia concentración salina y el valor de pH del sobrenadante.
La purificación de los polímeros se realizó aprovechando Ia naturaleza inteligente de los polímeros tipo elastina, y su transición inversa. La purificación de los polímeros recombinantes a partir de Ia fracción soluble de E. coli consta de etapas sucesivas de calentamiento-precipitación y enfriamiento-resuspensión. La precipitación selectiva se realizó mediante el calentamiento de Ia muestra a 70 0C durante dos horas. A continuación se separó el precipitado centrifugando a 15000xg durante 20 minutos a 40 0C y se solubilizó el precipitado a 2 mL/L de agua tipo I a 4 0C en agitación durante 12 horas. Se repitió Ia operación dos veces más. Tras Ia última solubilización, el polímero disuelto se dializó frente a agua de tipo I a 40C, posteriormente se liofilizó y se conservó a -2O0C.
EJEMPLO 2. Obtención de biopolímeros proteicos recombinantes tipo elastina A.
Como primer ejemplo se describe un copolímero tipo elastina A con capacidad de autoensamblarse por contener bloques alternantes con carácter hidrofóbicos e hidrofílicos de forma que al superar su temperatura de transición inversa cambian drásticamente sus propiedades mecánicas. En este caso los bloques hidrofóbicos corresponden con péptidos tipo B donde Ia secuencia aminoacídica es SEQ ID NO:
3 y los hidrofílicos a péptidos tipo [(D)2(E)(D)2]. Además, Ia secuencia aminoacídica C incluye una secuencia bioactiva RGD no específica. Es decir, el biopolímero de este ejemplo tiene Ia estructura: [(D2 - E - Ü2)io - Bεok - (G10 - H - Gio)2 2.1. Síntesis de Ia secuencia nucleotídica sintética que codifica el biopolímero A.
La síntesis del polímero se realizó tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Para sintetizar el bloque hidrofílico de 25 aminoácidos (D2 - E - D2) se generó una secuencia nucleotídica artificial por hibridación de dos oligonucleóticos complementarios con Ia secuencia SEQ ID NO: 17.
Con el objeto de que Ia secuencia monomérica anterior pudiera concatenarse para formar Ia secuencia completa, se situaron convenientemente en los extremos del mismo sendas secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción que, al ser utilizadas, dejarán como extremos cohesivos únicamente el codón GTA codificante para el aminoácido Valina. De esta forma se pueden formar cadenas del monómero sin saltos en su marco de lectura y sin Ia incorporación de codones ajenos a Ia secuencia deseada.
Siguiendo Ia técnica de concatenación se obtuvo una secuencia nucleotídica formada por 10 repeticiones de Ia secuencia inicial, con una longitud de zona codificante de 750 pares de bases y flanqueado también por las secuencias de restricción y sendos codones GTA de enlace.
En Ia síntesis del bloque hidrofóbico se partió de un fragmento de mayor tamaño pero que también fue sintetizado a partir de oligonucleótidos de síntesis química. En este caso el monómero peptídico tenía Ia estructura (B)20 donde B es SEQ ID NO: 3, codificado por Ia secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 18.
También esta vez se usaron las mismas enzimas de restricción y por tanto las mismas secuencias flanqueantes del gen codificante, si bien en este caso se utilizó Ia técnica recursiva iterativa para repetir tres veces el gen descrito y formar un gen de 900 pares de bases que codifica 60 repeticiones del pentabloque tipo B. La secuencia nucleotídica del bloque hidrofílico descrito (D2 - E - D2)io y el correspondiente al bloque hidrofóbico (B)6o donde B es SEQ ID NO: 3, se fusionaron utilizando las secuencias de restricción citadas situando en el extremo 5' el gen que codifica para el bloque hidrofílico. Posteriormente Ia secuencia resultante, con una longitud de 1650 pares de bases, se duplicó por Ia técnica recursiva dando lugar a Ia secuencia de 3300 pares de bases que codifica el polipéptido (D2 - E - D2)io - (B)6o
La incorporación de Ia secuencia bioactiva se realizó por Ia misma técnica descrita.
En este caso, Ia secuencia que codifica Ia estructura (G10 - H - G10) es SEQ ID NO: 19.
En este caso, también se duplicó el fragmento por las mismas técnicas descritas antes de unirlo al tetrabloque de 1650 pares de bases. El producto de Ia duplicación tenía una longitud de 672 pares de bases codificando un polipéptido de 224 aminoácidos. La incorporación del fragmento con las dos secuencias bioactivas RGD al extremo 3' del fragmento de 3330 pares de bases se realizó por Ia técnica iterativa recursiva usando las enzimas de restricción ya mencionadas.
Como resultado de Ia incorporación de los fragmentos se obtuvo una secuencia de
3972 pares de bases que codifica el polipéptido abreviado:
[D2 - E - D2]Io-[B]6O-I D2 - E - D2]1o-[B]6O-[(G)io-H-(G)io] -[(G)io-H-(G)io]
Esta secuencia se incorporó a un vector de expresión previamente modificado para aceptar fragmentos procedentes de Ia digestión con las enzimas de restricción adecuadas descritas incorporando Ia secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 20 en el extremo 5' del fragmento de 3972 pares de bases y Ia secuencia GTATGA en el extremo 3' del mismo. El plásmido resultante comprende una secuencia nucleotídica con un marco abierto de lectura de 3996 pares de bases, SEQ ID NO: 21 , que codifica para 1331 aminoácidos, SEQ ID NO: 22. 2.2 Expresión del biopolímero A recombinante.
El vector de expresión se usó para transformar una cepa de Escherichia coli adecuada a Ia expresión de genes exógenos seleccionando las colonias transformantes mediante el apropiado antibiótico.
Se usó una de las colonias resultantes de Ia transformación para inocular un volumen de medio LB con el mismo antibiótico y un 1% de glucosa. Tras Ia incubación a 37 0C con agitación orbital a 250rpm durante toda Ia noche, el cultivo bacteriano se utilizó para inocular un volumen 100 veces superior de medio TB con el mismo antibiótico utilizado y una concentración de 0,8 % (v/v) de glicerol, un 0,2 % (p/v) de alfa-lactosa y un 0,05 % (p/v) de glucosa.
Tras incubación en las mismas condiciones anteriores se aislaron por centrifugación las células resultantes y se sometieron a dos lavados con tampón salino. Posteriormente se resuspendieron en tampón con EDTA y se añadió PMSF en una concentración final de 1 mM. La suspensión celular se rompieron por sonicación manteniendo su temperatura a 4 0C y el extracto se centrifugó para retirar los restos bacterianos.
El sobrenadante del extracto bacteriano se sometió a varios ciclos de calentamiento a 60 0C, centrifugación, recolección del sedimento y solubilización a 4 0C en tampón con EDTA. Cada paso de Ia purificación se verificó por electroforesis en poli-acrilamida en presencia de SDS. Cuando se consideró que el polímero estaba suficientemente puro se dializó Ia solución frente a agua tipo I y se liofilizó, manteniendo el polímero liofilizado en lugar seco y frío hasta su utilización.
2.3. Caracterización del biopolímero tipo elastina A
Para caracterizar el biopolímero A se realizó una electroforesis en gel de acrilamida (PAGE) en presencia de SDS que permitió estimar de forma aproximada el Peso Molecular del polímero además de verificar su pureza. En Ia FIG. 1 , Ia calle de Ia izquierda corresponde a Ia muestra y Ia de Ia derecha a los marcadores (Fermentas SM0431 ). En dicha figura se observa una buena producción del polímero además de poderlo identificar como electroforéticamente puro. La posición de Ia banda del polímero coincidió con el marcador de 116 kDa por Io que el biopolímero A tiene este peso molecular aparente.
También se realizó una espectrometría de masas MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star para calcular exactamente el peso molecular del polímero. De dicho análisis se dedujo que el peso molecular es de 112292 Da.
La caracterización física del material se llevó a cabo mediante un estudio reológico. Los ensayos se realizaron en reómetro de esfuerzo controlado AR2000ex (TA Instruments) utilizando platos paralelos con un gap de 250 μm. Para Ia gelificación las soluciones fueron colocadas sobre un plato Peltier termostatizado. El rango de viscoelasticidad lineal se determinó a 1 Hz de frecuencia seleccionándose dentro de este rango una deformación del 0.5% para los barridos de tiempo y temperatura.
Se prepararon muestras en PBS de 50, 100, 150 y 200 mg/ml de concentración del biopolímero A y se sometieron a un calentamiento entre 4 y 60 0C y a una velocidad de 1°C/min, con el fin de obtener sus propiedades reológicas. Se identificó Ia temperatura de gelificación con el "punto gel" (Ta geι), que se define como el punto en que G' es igual a G" (Pilosof 2000).
A modo de ejemplo, en Ia FIG. 2 se muestran el módulo elástico o de almacenamiento (G'), módulo viscoso o de pérdida (G") y el ángulo de desfase (delta) para Ia muestra de 200mg/ml de concentración. El ángulo de desfase delta indica Ia relación entre Ia elasticidad y Ia viscosidad. De dicha figura se obtiene una temperatura de gelificación de 16 0C, visualizándose que el inicio de Ia reestructuración comienza a 10 0C y alcanzándose las mejores propiedades mecánicas a los 26 0C. Para el resto de las concentraciones Ia temperatura de gelificación es Ia misma. De esta manera se puede concluir que una vez introducido el producto en el organismo alcanza sus mejores cualidades mecánicas. Además en Ia Tabla 1 pueden observarse los valores alcanzados del módulo elástico, módulo viscoso y ángulo de desfase para las distintas concentraciones. De dichos valores se deduce que las propiedades mecánicas del material disminuyen de Ia muestra de mayor concentración a Ia de menor concentración. Para Ia muestra de 200 mg/ml el valor de G' es de 3.0x105 Pa y para Ia de 50 mg/ml de 5.7x104.
Otra característica de vital importancia como ya se ha mencionado es el tiempo que el sistema una vez inyectado tarda en gelificar a Ia temperatura corporal, es decir a producirse su autoensamblado y el cambio de sus propiedades mecánicas y en especial de su viscosidad para que no se produzca su dispersión en el interior del organismo. En este sentido y para conocer Ia cinética de gelificación se realizaron ensayos reológicos en modo isotermo y a 37 0C, de manera que se estudiaron las variaciones de las propiedades reológicas, respecto al tiempo, de las disoluciones del copolímero A en solución PBS. La FIG. 3 muestra los resultados obtenidos para Ia muestra de concentración de 200 mg/ml. Como se observa en dicha figura, tiempos de calentamiento superiores a 4 minutos no afectan significativamente a los valores de los módulos de pérdida y almacenamiento, observándose Ia formación del gel transcurridos 2 minutos de someter Ia muestra a
37 0C.
En Ia Tabla 1 también se reflejan datos acerca de Ia inyectabilidad de las muestras con agujas de diferentes diámetros. Se ensayó con agujas G20 y G26, observándose que hasta una concentración de 150 mg/ml las muestras son fácilmente inyectables con agujas de diámetros de hasta G26 mientras que las de 200 mg/ml se inyectaban con cierta dificultad con agujas de dicho diámetro y con agujas tipo G20 se inyectaban con facilidad.
Tabla 1 : Datos Reológicos y de Inyectabilidad de disoluciones del biopolímero Tipo Elastina Autogelif ¡cable A en PBS y a diferentes concentraciones.
Figure imgf000034_0001
EJEMPLO 3. Obtención de biopolímeros proteicos recombinantes tipo elastina B.
Como primer ejemplo se describe un copolímero tipo elastina B con capacidad de autoensamblarse por contener bloques alternantes con carácter hidrofóbicos e hidrofílicos de forma que al superar su temperatura de transición inversa cambian drásticamente sus propiedades mecánicas. En este caso los bloques hidrofóbicos corresponden péptidos tipo B donde Ia secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 4 y los hidrofílicos a péptidos tipo [(D)2(E)(D)2]. Además, Ia secuencia aminoacídica C incluye una secuencia bioactiva RGD no específica. Es decir, el biopolímero de este ejemplo tiene Ia estructura: [(D2 - E - Ü2)io - B2o]2 - (G10 - H - Gio)2
3.1. Síntesis de Ia secuencia nucleotídica sintética que codifica el biopolímero B.
La síntesis del polímero se realizó tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Para sintetizar el bloque hidrofílico de 25 aminoácidos (D2 - E - D2) se generó una secuencia nucleotídica artificial por hibridación de dos oligonucleóticos complementarios con Ia secuencia SEQ ID NO: 17.
Con el objeto de que Ia secuencia monomérica anterior pudiera concatenarse para formar Ia secuencia completa, se situaron convenientemente en los extremos del mismo sendas secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción que, al ser utilizadas, dejarán como extremos cohesivos únicamente el codón GTA codificante para el aminoácido Valina. De esta forma se pueden formar cadenas del monómero sin saltos en su marco de lectura y sin Ia incorporación de codones ajenos a Ia secuencia deseada.
Siguiendo Ia técnica de concatenación se obtuvo una secuencia nucleotídica formada por 10 repeticiones de Ia secuencia inicial, con una longitud de zona codificante de 750 pares de bases y flanqueado también por las secuencias de restricción y sendos codones GTA de enlace.
En Ia síntesis del bloque hidrofóbico se partió de un fragmento de mayor tamaño pero que también fue sintetizado a partir de oligonucleótidos de síntesis química. En este caso el monómero peptídico tenía Ia estructura (B)2o donde B es SEQ ID NO: 4, codificado por Ia secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 23.
También esta vez se usaron las mismas enzimas de restricción y por tanto las mismas secuencias flanqueantes del gen codificante. La secuencia nucleotídica del bloque hidrofílico descrito (D2 - E - D2)io y el correspondiente al bloque hidrofóbico (B)2o , donde C es SEQ ID NO: 4, se fusionaron utilizando las secuencias de restricción citadas situando en el extremo 5' el gen que codifica para el bloque hidrofílico. Posteriormente Ia secuencia resultante, con una longitud de 1050 pares de bases, se duplicó por Ia técnica recursiva dando lugar a Ia secuencia de 2100 pares de bases que codifica el polipéptido [(D2 - E - D2)i0 - (B)20]2
La incorporación de Ia secuencia bioactiva se realizó por Ia misma técnica descrita.
La secuencia que codifica Ia estructura (do - H - G10) es SEQ ID NO: 19.
En este caso, también se duplicó el fragmento por las mismas técnicas descritas antes de unirlo al tetrabloque de 2100 pares de bases. El producto de Ia duplicación tenía una longitud de 672 pares de bases codificando un polipéptido de 224 aminoácidos. La incorporación del fragmento con las dos secuencias bioactivas RGD al extremo 3' del fragmento de 2100 pares de bases se realizó por Ia técnica iterativa recursiva usando las enzimas de restricción ya mencionadas.
Como resultado de Ia incorporación de los fragmentos se obtuvo una secuencia de 2772 pares de bases que codifica el polipéptido abreviado:
[D2 - E - D2]IO-[B]20-. D2 - E - D2]1o-[B]2O-[(G)io-H-(G)io] -[(G)io-H-(G)«,] donde B es SEQ ID NO: 4.
Esta secuencia se incorporó a un vector de expresión previamente modificado para aceptar fragmentos procedentes de Ia digestión con las enzimas de restricción adecuadas descritas incorporando Ia secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 20 en el extremo 5' del fragmento de 2772 pares de bases y Ia secuencia GTATGA en el extremo 3' del mismo. El plásmido resultante comprende una secuencia nucleotídica con un marco abierto de lectura de 2796 pares de bases, SEQ ID NO: 24, que codifica para 931 aminoácidos, SEQ ID NO: 25.
3.2 Caracterización del biopolímero tipo elastina B
La expresión del biopolímero recombinante B se llevó a cabo del mismo modo que se ha descrito en el ejemplo 2.2.
De Ia misma forma que en el ejemplo 2 se realizó una electroforesis en gel de acrilamida (PAGE) en presencia de SDS. En Ia FIG. 4, Ia calle de Ia derecha corresponde a Ia muestra y Ia de Ia izquierda a los marcadores (Fermentas
SM0431 ). En dicha figura se observa una buena producción del biopolímero además de poderlo identificar como electroforéticamente puro. La posición de Ia banda del biopolímero nos permite estimar que el peso molecular aparente del polímero está entre 75 y 85 kDa. También se realizó una espectrometría de masas MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star para calcular exactamente el peso molecular del polímero. De dicho análisis se dedujo un valor de 78379 Da.
La caracterización física del material se llevó a cabo mediante un estudio reológico como en el caso anterior. Los ensayos se realizaron en reómetro de esfuerzo controlado AR2000ex (TA Instruments, España) usando platos paralelos con un gap de 250 μm. Para Ia gelificación las soluciones fueron colocadas sobre un plato Peltier termostatizado. El rango de viscoelasticidad lineal se determino a 1 Hz de frecuencia seleccionándose dentro de este rango una deformación del 0.5 % para los barridos de tiempo y temperatura.
Se prepararon muestras en PBS de 200 mg/ml de concentración y se sometieron a un calentamiento entre 4 y 60 0C y a una velocidad de 1°C/min, con el fin de obtener sus propiedades reológicas. Se identificó Ia temperatura de gelificación con el "punto gel" (Ta geι), que se define como el punto en que G' es igual a G" (Pilosof 2000).
En Ia FIG. 5 se representa el módulo elástico o de almacenamiento (G'), módulo viscoso o de pérdida (G") y el ángulo de desfase (delta) para Ia disolución del copolímero B respecto de Ia temperatura. De dicha figura se obtiene una temperatura de gelificación de 290C, visualizándose que el inicio de Ia reestructuración comienza a 25°C y alcanzándose las mejores propiedades mecánicas a los 330C. Aunque dicha temperatura es inferior a Ia corporal es una temperatura muy próxima a ella y por Io tanto podrían surgir problemas en zonas corporales en que por algún motivo se produzcan descensos de Ia temperatura. Además, en Ia Tabla 2 pueden observarse los valores alcanzados del módulo elástico, módulo viscoso y ángulo de desfase. El valor de G' es de 2.5x105 Pa muy parecido a los 3.0x105 Pa del copolímero A. En Ia FIG. 6 se observa Ia formación del gel pasados 21 minutos (tgeι) de someter Ia muestra a 370C y que tarda unos 37 minutos en alcanzar las propiedades óptimas es decir, presenta una cinética sensiblemente más lenta que Ia del biopolímero A.
En Ia Tabla 2 también se reflejan datos acerca de Ia inyectabilidad de las muestras con agujas de diferentes diámetros. Se ensayó con agujas G20 y G26, observándose que las muestras son fácilmente inyectables con ambos tipos de agujas. Dicho resultado es razonable ya que Ia viscosidad de Ia disolución del copolímero B para una concentración de 200 mg/ml es comparable a Ia del copolímero A para concentraciones de 50 mg/ml y a su vez es justificable ya que el peso molecular del copolímero B es inferior al del copolímero A.
Tabla 2: Datos Reológicos y de Inyectabilidad de Ia disolución del Copolímero Tipo Elastina Autogelif ¡cable B en PBS.
Figure imgf000038_0001
Por tanto de los resultados de los dos ejemplos se concluye que las propiedades del copolímero B son ligeramente inferiores a las del copolímero A presentado en el ejemplo 2. Aunque los módulos elásticos que se alcanzan para los dos copolímeros son muy parecidos, el tiempo y Ia temperatura de gelificación son sensiblemente mayores para el copolímero B del ejemplo 3.
En Ia FIG. 7 pueden verse unas imágenes de biopolímeros tipo elastina autogelificables disueltos en una solución PBS por debajo de su temperatura de transición, a 4 0C, donde se encuentra en estado líquido y por encima de su temperatura de transición, a 370C, donde se encuentran gelificados.
EJEMPLO 4. Evaluación de Ia interacción de los copolímeros tipo elastina autogelificables con células primarias. La Bioactividad introducida en el Copolímero Tipo Elastina Autogelificable A mediante inserción de motivos RGD de adhesión celular, fue evaluada analizando Ia interacción entre células y el material, en un cultivo de células primarias humanas (fibroblastos).
Se realizaron ensayos de adhesión celular en substratos obtenidos con el Copolímero Tipo Elastina Autogelificable A, con un Copolímero Tipo Elastina control de composición similar pero que no contiene el bloque con Ia secuencia bioactiva y en substratos proteicos estándar utilizándose como control positivo fibronectina, es decir una proteína estructural de Ia matriz extracelular que incluye los motivos de adhesión celular mediada por integrinas y como control negativo Ia proteína inespecífica BSA (albúmina de suero bovino) que no induce adhesión celular.
Por tanto los biopolímeros del presente ejemplo tienen Ia siguiente estructura:
Copolímero Tipo Elastina Autogelificable A: [(D2 - E - D2)10 - B6o]2 - (Gi0 - H - do)2 del ejemplo 2. La secuencia aminoacídica A tiene Ia estructura (D2 - E - D2)io, y Ia secuencia aminoacídica C tiene Ia estructura (do - H - Gio)2- La secuencia aminoacídica C incluye una secuencia bioactiva RGD no específica.
Copolímero Tipo Elastina Autogelificable control: [(D2 - E - D2)i0 - B6o]2- Este tipo de copolímero carece del dominio de adhesión celular que caracteriza este tipo de biopolímeros tal como se han definido en el ejemplo 2 de Ia presente invención.
Los polímeros a ensayar fueron adsorbidos sobre superficies de poliestireno (material estándar en cultivos celulares) utilizando disoluciones de éstos en tampón PBS con concentraciones de 1mg/ml. A continuación se realizaron sucesivos lavados también con PBS y se bloqueó Ia superficie no saturada con Ia proteína BSA.
Tras su levantamiento mediante débil tratamiento enzimático y mecánico, se sembraron los fibroblastos (104células/cm2), se incubaron durante 2 horas a 37°C en atmosfera controlada y se estudió su adhesión cualitativa y cuantativamente. Se observó cómo las células tras dos horas desde Ia siembra interaccionaban de forma distinta con los diferentes substratos. Las células depositadas sobre el control positivo, fibronectina (FIG. 8) y sobre el Copolímero Tipo Elastina Autogelificable A (FIG. 9) adquirieron una morfología parecida, ya que en ambos casos las células se anclan y extienden su citoplasma. Por otro lado, las células sembradas sobre el control negativo BSA (FIG. 10) y sobre el Copolímero Tipo Elastina Autogelificable control (FIG. 11 ) sin motivos bioactivos, casi no interaccionaron con el material, manteniendo Ia forma esferoidal de las células en suspensión en ambos casos. También se observó que el lavado de las superficies con tampón fisiológico, provocó Ia eliminación de gran parte de las células adsorbidas a las superficies de BSA y del copolímero Tipo Elastina Autogelificable control, sin embargo no se apreció este efecto en el caso del substrato con copolímero Tipo Elastina Autogelificable A con dominios bioactivos que inducen una interacción más fuerte y mediada por integrinas.
También se realizaron ensayos de citotoxicidad o proliferación por espectrofotometría y utilizando un sistema de detección mediante "AlamarBIue™" de AbD Serotec. En Ia FIG. 12 se representa una estimación del número de células (metabólicamente activas) para 24, 72 y 96 horas desde Ia siembra. De dichos datos se deduce que los substratos no son citotóxicos, para los tiempos ensayados, ya que el número de células activas se mantiene durante el tiempo del experimento. Por otro lado, también se observó que las diferencias ya mencionadas en cuanto a Ia buena adhesión al Copolímero Tipo Elastina Autogelificable A respecto al polímero control, se reflejaron en todas las etapas del experimento ya que Ia cantidad de células a 24, 72 y 96 horas fue sustancialmente mayor en el substrato del copolímero A que en el polímero control. Igualmente hay que destacar que el substrato con copolímero A bioactivo fue el que presentó un comportamiento más próximo al del control positivo o fibronectina ya que el número de células activas estimadas sobre él fue sensiblemente superior al de los substratos con copolímero control y BSA. Se llevó a cabo también el control del desarrollo del cultivo celular mediante observación al microscopio invertido, verificando que los cultivos de fibroblastos alcanzaban Ia confluencia en todos los substratos aunque para tiempos diferentes y dependiendo del número de células adheridas en las primeras horas desde Ia siembra. El tiempo de confluencia para los substratos con fibronectina y Copolímero Tipo Elastina Autogelificable A fue menor que para las muestras con BSA y Copolímero Tipo Elastina Autogelificable control.
4.1. Análisis MALDI ToF.
El análisis MALDI ToF se llevó a cabo en un espectrómetro Reflex IV MALDI ToF (Bruker, Bremen, Alemania) equipado con un detector CovalX's HM2 para el rango de masas de 0 a 1500 kDa. Para calibrar el instrumento se aplicó una calibración externa con clusters de Insulina, BSA e IgG. Para esta muestra, fueron analizados 3 spots (300 disparos de láser por spot). Los datos fueron analizados usando el software Complex Tracker.
En el copolímero Tipo Elastina Autogelificable A, Ia principal proteína detectada en los 3 spots correspondió a un peso molecular (PM)= 112253Da±18 mientras que el resultado previsto de su PM fue de 112292Da, resultando en una variación de 0.03% que es perfectamente asumible por esta técnica.
En el copolímero Tipo Elastina Autogelificable control, Ia principal proteína detectada en los 3 spots correspondió a un peso molecular (PM)= 92897 Da±19 mientras que el resultado previsto de su PM fue de 93176 Da, resultando en una variación de 0.3% que es perfectamente asumible por esta técnica.
La composición de aminoácidos de los Copolímeros Tipo Elastina Autogelificable A y Copolímeros control se presenta en Ia tabla 3.
El análisis de Ia composición de aminoácidos se llevó a cabo por el método AccQ- Tag Waters. Los aminoácidos derivatizados fueron analizados mediante HPLC {High Performance Liquid Chromatograpriy) con detección de UV usando un sistema de gradiente WATERS600 HPLC con un detector WATERS2487. La cuantificación de los aminoácidos más representados se llevó a cabo en una disolución 1/10.
Los resultados de Ia composición de aminoácidos se correlacionan muy bien con Ia estimación de Ia composición de aminoácidos prevista teniendo en cuenta los errores endógenos de Ia técnica y Ia composición particular de Ia composición en Ia muestra.
Tabla 3. Estimación y medida de las composiciones de aminoácidos de los Copolímeros Tipo Elastina Autogelificable A (copolímero A) y Copolímeros Tipo Elastina Autogelificable control (Copolímero control).
Figure imgf000042_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1. Biopolímero que comprende las secuencias aminoacídicas A, B y C con
Ia estructura (An - Bm)s - Cp, donde,
A tiene Ia estructura (Dti — Evi — Dt2) o Ia estructura (Dti — EV2), donde D es SEQ ID NO: 1 ; E es SEQ ID NO: 2; t1 y t2 tienen valores de entre 2 y 4; y v1 y v2 tienen valores de entre 1 y 5,
B se selecciona de Ia lista que comprende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o
SEQ ID NO: 26 (VPAIG),
C tiene Ia estructura (Gwi - Hxi - GW2) O HX2, donde G es SEQ ID NO: 5; H es una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que se selecciona de Ia lista que comprende RGD, LDT, SEQ ID NO: 7, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16; w1 y w2 tienen valores de entre 5 y 15; y x1 y x2 tienen valores de entre 1 y 5,
n tiene un valor de entre 5 y 15, m tiene un valor de entre 10 y 70, s tiene un valor de entre 2 y 4, y p tiene un valor de entre 1 y 5.
2. Biopolímero según Ia reivindicación 1 donde A tiene Ia estructura (Dti -
Figure imgf000043_0001
3. Biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde C tiene Ia estructura (Gwi - Hxi - GW2).
4. Biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde Ia secuencia aminoacídica de H contiene el péptido RGD.
5. Biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde Ia secuencia aminoacídica de H que contiene el péptido RGD es SEQ ID
NO: 6.
6. Biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde Ia secuencia aminoacídica B es SEQ ID NO: 3.
7. Biopolímero según Ia reivindicación 6, donde m tiene un valor de entre 55 y 65.
8. Biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7 que comprende los péptidos B, D, E, G, D y H con Ia estructura [(D2 - E -
D2)Io - Bεok - (G-io - H - G-ιo)2-
9. Biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el péptido C es SEQ ID NO: 4.
10. Biopolímero según Ia reivindicación 9, donde m tiene un valor de entre 15 y 25.
11. Biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10 que comprende los péptidos B, D, E, G, D y H con Ia estructura [(D2 — E —
D2)io - B2o]2 - (G-io - H - G-ιo)2-
12. Ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para Ia secuencia aminoacídica del biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Vector de expresión que comprende el ácido nucleico según Ia reivindicación 12.
14.CeIuIa aislada transfectada con el vector según Ia reivindicación 13.
15. Uso del biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , para Ia preparación de un implante.
16. Implante que comprende el biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
17. Implante según Ia reivindicación 16, donde el biopolímero tiene una concentración de entre 30 y 300 mg/ml.
18. Implante según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, donde se presenta en una forma adaptada a Ia administración parenteral.
19. Implante según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 donde incluye además una sustancia activa.
20. Uso del biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para Ia elaboración de un medicamento.
21. Uso del biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para Ia elaboración de un medicamento, para el tratamiento de cartílago o hueso.
22. Uso del biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , para el tratamiento del tejido nervioso o médula espinal.
23. Uso del biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , para el tratamiento de necrosaciones de varices.
24. Vehículo farmacéuticamente aceptable que comprende el biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
25. Vehículo farmacéuticamente aceptable según Ia reivindicación 24, donde el biopolímero tiene una concentración de entre 30 y 300 mg/ml
26. Vehículo farmacéuticamente aceptable según cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, donde se presenta en una forma adaptada a Ia administración parenteral.
27. Uso del vehículo farmacéuticamente aceptable según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, para Ia liberación controlada de fármacos.
28. Método para Ia obtención del biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que comprende: a. insertar el ácido nucleico de Ia reivindicación 12 en un vector de expresión, b. transfectar una célula con el vector de expresión obtenido según el apartado (a), c. seleccionar Ia célula transfectada según el apartado (b) que comprende el ácido nucleico de Ia reivindicación 12, d. expresar el ácido nucleico en Ia célula según el apartado (c) y e. purificar el biopolímero producido según el apartado (d).
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