KR20190054487A - 잉크젯 프린팅용 바이오 잉크 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트; 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염; 및 세포;를 포함하는 바이오 잉크에 관한 것으로서, 잉크젯 프린팅에 적용 가능한 바이오 잉크를 제조함으로써 기존에 낮은 농도의 바이오 잉크로 제작된 약한 하이드로겔 구조물의 강도를 비약적으로 증가시킬 수 있으며, 세포의 증식, 분화, 이동 등을 도와 생체 친화도가 높은 인공조직 및 생체 모방 조직의 제작을 가능하게 하는 고정밀 단백질 하이드로겔 구조물을 제조할 수 있다.

Description

잉크젯 프린팅용 바이오 잉크 및 그의 제조방법{INKJET PRINTABLE BIOINK AND METHOD OF PREPARING THE SAME}
본 발명은 잉크젯 프린팅용 바이오 잉크 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트, 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염 및 세포를 포함하는 바이오 잉크 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
잉크젯 프린팅 기술은 피코리터급의 초미세 잉크방울을 토출하는 기술로, 기존 사진 및 문서 인쇄뿐만 아니라 전자소자, 텍스타일, 금형 제형 등의 공정으로 점차 응용범위가 넓어지고 있으며, 최근에는 바이오 인공조직 및 인공 시험 조직 제작에도 응용되고 있다.
바이오 프린팅은 이러한 세포 함유 인공조직을 만들기 위한 획기적인 방법들 중 한가지로 많은 연구진들이 연구 중이고, 그 중에 잉크젯 바이오 프린팅은 높은 해상도로 각 개별 잉크액적을 드롭-온-디맨드(Drop-on-Demand, DOD) 방식으로 토출 및 패턴할 수 있는 장점을 가진다. 잉크젯 바이오 프린팅은, 잉크젯 프린터에 전용 잉크 대신 바이오 물질이 함유된 잉크를 토출하여 원하는 패턴을 형성하는 방식이다. 잉크젯 프린팅과 같은 기반을 사용하므로, 한번의 액츄에이션에 수-수십 피코리터의 액적을 토출할 수 있고, 그것을 수백-수십만 헤르츠의 속도로 토출이 가능하다. 사용되는 세포 외 기질 모방 바이오 물질은 주로 하이드로겔이다. 하이드로겔은 기본적으로 고분자 가교 결합이 된 망상구조의 분자 구조를 가지며, 그 안에 수분을 함유할 수 있는 물질이다. 하이드로겔은 세포에게 수분과 영양분을 공급할 수 있고, 인간의 조직과 비슷한 정도의 기계적 강도를 갖기 때문에 적합한 물질로 각광 받고 있다.
물을 제외한 인체의 구성성분 중 폴리펩타이드 및 단백질이 구성하는 분율이 50%가 넘는다. 그러므로 인공 조직 및 인공 시험 조직을 만드는데 하이드로겔 물질 내에 단백질 성분의 함유는 필수 불가결한 요소이다. 이러한 단백질 물질은 신체 내에서 체조직 및 혈장단백질을 구성하고, 다양한 효소, 호르몬 및 항체를 형성한다. 또한 조직을 형성함에 있어서 조직 세포의 대사를 조절하고, 세포의 증식, 분화 및 이동을 조절한다.
많은 연구 그룹이 상기 특장점을 고려하여 단백질을 바이오 프린팅하여 생체 조직 모델 등을 제작하였다. 하지만 상기 단백질의 바이오 프린팅은 주로 해상도가 낮은 압출방식인 익스트루젼 프린팅 방식에 국한되어 있고, 잉크젯 프린팅을 통한 인쇄에는 응용되지 않거나 낮은 농도로만 적용되는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 폴리펩타이드를 가수분해하여 점탄성 특성이 제어된 바이오 잉크를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 잉크를 잉크젯 바이오 프린팅에 적용하여 인공 조직 및 인공 시험 조직을 제작할 수 있는 하이드로겔 구조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트; 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염; 및 세포;를 포함하는 바이오 잉크가 제공된다.
또한 상기 폴리펩타이드 프래그먼트 100중량부를 기준으로, 상기 고분자 또는 그의 염 1내지 50중량부 및 상기 세포 0.01 내지 10중량부를 포함할 수 있다.
또한 상기 폴리펩타이드 프래그먼트가 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 가수분해하여 제조할 수 있다.
또한 상기 폴리펩타이드 프래그먼트가 10 내지 1,000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한 상기 가수분해가 염기 및 효소 중에서 선택된 1종 이상에 의해 수행될 수 있다.
또한 상기 공유결합하는 기능기가 아크릴레이션 및 메타크릴레이션 중에서 선택된 1종 이상에 의해 생성될 수 있다.
또한 상기 폴리펩타이드가 겔라틴, 콜라겐, 피브리노겐, 엘라스틴, 탈세포화 세포 외 기질 및 실크 피브로인 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 이온은 양이온 및 음이온 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 양이온은 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 음이온은 삼인산기 (P3O10) 및 디설파이트 (S2O5) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 이온결합하는 기능기가 카르복실기(-COOH), 삼산화황 (-SO3), 아민기(-NH3) 및 인산기 (-PO4) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 고분자가 알긴산, 히알루론산, 셀룰로오스 및 키토산 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 세포가 포유류 유래, 조류 유래, 파충류 유래, 양서류 유래, 어류 유래 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 바이오 잉크가 광개시제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 상기 바이오 잉크로 제조된 하이드로겔 구조물이 제공된다.
또한 본 발명의 다른 일 측면에 따르면,
(a) 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 가수분해하여 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트를 제조하는 단계; 및
(b) 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염, 세포, 상기 폴리펩타이드 프래그먼트 및 물을 포함하는 바이오 잉크를 제조하는 단계;를 포함하는 바이오 잉크의 제조방법이 제공된다.
또한 단계 (a)가
(a-1) 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 수용액을 제조하는 단계; 및
(a-2) 상기 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 염기 또는 효소를 이용하여 가수분해하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면,
(a') 기판을 제공하는 단계;
(b') 제1항의 바이오 잉크를 상기 기판 상에 토출하는 단계; 및
(c') 상기 기판 상에 형성된 바이오 잉크 상에 분사액을 분사하여 상기 바이오 잉크의 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염이 이온결합성 가교된 구조물을 제조하는 단계;를 포함하는 하이드로겔 구조물의 제조방법이 제공된다.
또한 상기 하이드로겔 구조물의 제조방법이
단계 (c') 후에 상기 이온결합성 가교된 구조물에 광을 조사하여 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트에 의해 공유결합성 가교가 추가된 구조물을 제조하는 단계(d');를 추가로 포함할 수 있다.
또한 상기 하이드로겔 구조물의 제조방법이
단계 (d') 후에 상기 구조물의 상기 세포를 배양하는 단계(e');를 추가로 포함할 수 있다.
또한 단계 (c')에서, 상기 분사액이 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra 이온 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 수용액일 수 있다.
본 발명은 기존에 낮은 농도의 잉크젯 프린팅용 바이오 잉크로 제작된 약한 하이드로겔 구조물의 강도를 비약적으로 증가시킬 수 있는 바이오 잉크를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 세포의 증식, 분화, 이동 등을 도와 생체 친화도가 높은 인공조직 및 생체 모방 조직의 제작을 가능하게 하는 고정밀 단백질 하이드로겔 구조물을 제공할 수 있다.
도 1의 실시예 1에 따라 제조된 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA) 수용액이 수산화나트륨을 통해 가수분해되는 것을 묘사한 개략도이다.
도 2는 실시예 1에 따라 제조된 가수분해된 GelMA 포함 바이오 잉크와 대조예 1에 따라 제조된 GelMA 포함 바이오 잉크 사이의 점도 차이를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1에 따라 제조된 가수분해된 GelMA 포함 바이오 잉크와 대조예 1에 따라 제조된 GelMA 포함 바이오 잉크 사이의 잉크젯 프린팅 젯팅 형성 과정을 묘사한 이미지이다.
도 4는 실시예 2에 따라 제조된 가수분해된 GelMA 포함 바이오 잉크를 이용해 제작한 하이드로겔 구조물과 대조예 2에 따라 제조된 GelMA 성분을 제외한 바이오 잉크를 이용해 제작한 하이드로겔 구조물의 압축강도를 분석한 자료이다.
도 5는 실시예 2에 따라 제조된 하이드로겔 구조물을 나타낸 이미지이다.
도 6는 본 발명에서 제시하는 잉크젯 프린팅 과정을 나타낸 개략도이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
또한, 이하에서 사용될 제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또한, 어떤 구성요소가 "다른 구성요소 상에", "다른 구성요소 상에 형성되어" 또는 "다른 구성요소 상에 적층되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소의 표면 상의 전면 또는 일면에 직접 부착되어 형성되어 있거나 적층되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 더 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
먼저, 본 발명의 바이오 잉크에 대해서 설명하도록 한다.
본 발명은 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트; 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염; 및 세포;를 포함하는 바이오 잉크를 제공한다.
폴리펩타이드 프래그먼트
상기 바이오 잉크는 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트를 포함할 수 있다.
상기 폴리펩타이드 프래그먼트는 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 가수분해하여 제조할 수 있다. 상기 가수분해는 염기 및 효소 중에서 선택된 1종 이상에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 염기에 의해 수행될 수 있다. 또한 상기 폴리펩타이드 프래그먼트는 10 내지 1,000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한 상기 폴리펩타이드는 겔라틴, 콜라겐, 피브리노겐, 엘라스틴, 탈세포화 세포 외 기질 및 실크 피브로인 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 겔라틴을 포함할 수 있다.
이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염
상기 바이오 잉크는 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염을 포함할 수 있다.
여기서 상기 공유결합하는 기능기는 아크릴레이션 및 메타크릴레이션 중에서 선택된 1종 이상에 의해 생성될 수 있으며, 바람직하게는 메타크릴레이션에 의해 생성될 수 있다.
또한 상기 이온은 양이온 및 음이온 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 양이온은 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 음이온은 삼인산기 (P3O10) 및 디설파이트 (S2O5) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 이온결합하는 기능기가 카르복실기(-COOH), 삼산화황 (-SO3), 아민기(-NH3) 및 인산기 (-PO4) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 고분자는 알긴산, 히알루론산, 셀룰로오스 및 키토산 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 알긴산을 포함할 수 있다.
상기 고분자 또는 그의 염은 상기 폴리펩타이드 프래그먼트 100중량부를 기준으로 1 내지 50중량부를 포함할 수 있고, 상기 고분자 또는 그의 염이 폴리펩타이드 프래그먼트 100중량부를 기준으로 1중량부 미만이면 하이드로겔이 뚜렷히 형성되지 않아 바람직하지 않고, 50중량부를 초과하면 유체 점성이 과도하게 높아지기 때문에 프린팅에 적용하지 못하므로 바람직하지 못하다.
세포
상기 바이오 잉크는 세포를 포함할 수 있다.
또한 상기 세포는 포유류 유래, 조류 유래, 파충류 유래, 양서류 유래, 어류 유래 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 포유류 유래 세포를 포함할 수 있다.
상기 세포는 상기 폴리펩타이드 프래그먼트 100중량부를 기준으로 상기 세포 0.01 내지 10중량부를 포함할 수 있다. 여기서 상기 세포가 폴리펩타이드 프래그먼트 100중량부를 기준으로 0.01중량부 미만이면 세포의 생존이 이루어지지 않아서 바람직하지 않고, 10중량부를 초과하면 세포의 고밀도화로 인한 세포 괴사가 일어나므로 바람직하지 못하다.
상기 바이오 잉크는 광개시제를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 이가큐어 2959 광개시제를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 바이오 잉크로 제조된 하이드로겔 구조물을 제공한다.
이하, 본 발명의 바이오 잉크의 제조방법에 대해서 설명하도록 한다.
단계 (a): 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트 제조
먼저, 본 발명의 바이오 잉크의 제조방법은 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 가수분해하여 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트를 제조하는 단계 (a)를 포함할 수 있다.
구체적으로, 단계 (a)는 두 단계를 포함할 수 있다.
먼저, 폴리펩타이드를 포함하는 수용액을 제조하는 단계 (a-1)을 포함할 수 있다.
도 1은 상기 폴리펩타이드가 수산화나트륨에 의해 가수분해되는 것을 묘사한 개략도이다. 도 1을 참조하면, 단계 (a)는 상기 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 염기 또는 효소를 이용하여 가수분해하는 단계 (a-2)를 포함할 수 있다.
상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화리튬 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 수산화나트륨을 포함할 수 있다.
또한 상기 효소는 Metalloproteinases, Papain, bromelain, cathepsin K, calpain, Caspase-1, separase, Adenain, Pyroglutamyl-peptidase, Sortase A, Subtilisin, prolyloligopeptidase, Signal peptidase, D-Ala-D-Ala peptidase C, Clp protease, Lactoferrin, Rhomboid-1, Dipeptidase, Pepsin, Trypsin, Chimotripsin Elastase, Thermolysin, Glutamyl endopeptidase 및 Neprilysin 중에서 선택된 1종 이상을 포함 할 수 있다.
단계 (b): 바이오 잉크 제조
다음으로, 본 발명의 바이오 잉크의 제조방법은 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염, 세포, 상기 폴리펩타이드 프래그먼트 및 물을 포함하는 바이오 잉크를 제조하는 단계 (b)를 포함할 수 있다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에 따라 제조된 하이드로겔 구조물을 나타낸 이미지이며, 도 6는 본 발명에서 제시하는 잉크젯 프린팅 과정을 나타낸 개략도이다.
이하, 도 5 내지 6를 참조하여 본 발명의 잉크젯 프린팅 과정을 통한 하이드로겔 구조물의 제조방법을 설명하도록 한다.
먼저, 기판을 제공한다(단계 a').
다음으로, 상기 바이오 잉크를 상기 기판 상에 토출한다(단계 b').
다음으로, 상기 기판 상에 형성된 바이오 잉크 상에 분사액을 분사하여 상기 바이오 잉크의 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염이 이온결합성 가교된 구조물을 제조한다(단계 c').
상기 분사액이 상기 분사액이 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra 이온 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 수용액일 수 있으며, 바람직하게는 Ca 이온을 포함하는 수용액일 수 있다.
단계 (c') 후에 상기 이온결합성 가교된 구조물에 광을 조사하여 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트에 의해 공유결합성 가교가 추가된 구조물을 제조한다(단계 d').
단계 (d') 후에 상기 구조물의 상기 세포를 배양한다(단계 e').
잉크젯 프린팅 기술은 피에조 방식 또는 열적 방식을 특징으로 한다.
[실시예]
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 설명하도록 한다. 그러나 이는 예시를 위한 것으로서 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 가수분해된 GelMA 포함 바이오 잉크 제조
동결 건조시킨 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA)를 0.05w/v% 이가큐어 2959 광 개시재, 10w/v% 소유래 혈청 단백질, 1w/v% 스트렙토마이신 및 페니실린을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM) 배양액에 녹여서, 12wt% 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA) 수용액을 제조하였다.
상기 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA) 수용액에 염기인 10N 수산화 나트륨 용액을 소량 첨가하여, 37℃로 보온되고 있는 항온수조에서 30분 동안 가수분해 시켰다. 이후, 10w/v% 아세트산을 첨가하여 pH 7로 중화하였다.
10w/v% 소유래 혈청 단백질, 1w/v% 스트렙토마이신 및 페니실린을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM) 배양액에 알긴산 나트륨(NaAlg) 파우더를 녹여서, 2wt% 알긴산 나트륨(NaAlg) 수용액을 제조하였다.
상기 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA) 수용액과 상기 알긴산 나트륨(NaAlg) 수용액을 1:1 부피비로 혼합하여 6% 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA), 1% 알긴산 나트륨(NaAlg) 용액을 제조한 후, 0.45㎛ 나일론 다공성 시린지 필터를 통해 필터링하였다. 이후, 배양 접시에서 트립신화한 섬유아세포를 상기 6% 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA), 1% 알긴산 나트륨(NaAlg) 용액에 50만 개/㎖의 농도로 첨가하여 바이오 잉크를 제조하였다.
실시예 2: 하이드로겔 구조물 제조
상기 바이오 잉크를 잉크젯 프린터 카트리지에 장착시켜 4℃로 유지되는 기판 상에 80V 전압 및 500㎐ 속도로 분사하였다. 이후, 미세분사 스프레이를 이용해 염화칼슘 수용액을 분사하여 이온적으로 겔화시켜 하이드로겔 구조물을 제조하였다. 이후 365 나노미터 피크 파장을 가지는 자외선 램프 하에서 5.8 mW/cm2 의 에너지로 상기 하이드로겔 구조물을 광 경화 시켰다. 이후, 상기 하이드로겔 구조물을 10w/v% 소유래 혈청 단백질, 1w/v% 스트렙토마이신 및 페니실린을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM) 배양액에 넣고, 인큐베이터에서 배양시켰다.
[대조예]
대조예 1: GelMA 포함 바이오 잉크 제조
동결 건조시킨 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA)를 0.05w/v% 이가큐어 2959 광 개시재, 10w/v% 소유래 혈청 단백질, 1w/v% 스트렙토마이신 및 페니실린을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM) 배양액에 녹여서, 12wt% 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA) 수용액을 제조하였다.
10w/v% 소유래 혈청 단백질, 1w/v% 스트렙토마이신 및 페니실린을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM) 배양액에 알긴산 나트륨(NaAlg) 파우더를 녹여서, 2wt% 알긴산 나트륨(NaAlg) 수용액을 제조하였다.
상기 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA) 수용액과 상기 알긴산 나트륨(NaAlg) 수용액을 1:1 부피비로 혼합하여 6% 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA), 1% 알긴산 나트륨(NaAlg) 용액을 제조한 후, 0.45㎛ 나일론 다공성 시린지 필터를 통해 필터링하였다. 이후, 배양 접시에서 트립신화한 섬유아세포를 상기 6% 겔라틴 메타크릴레이트(GelMA), 1% 알긴산 나트륨(NaAlg) 용액에 50만 개/㎖의 농도로 첨가하여 바이오 잉크를 제조하였다.
대조예 2: GelMA 성분을 제외한 바이오 잉크 제조 및 이를 사용한 하이드로겔 구조물 제조
대조예 1에 따라 제조된 GelMA 포함 바이오 잉크는 프린팅이 되지 않아 하이드로겔 구조물의 제작이 불가능하다.
따라서 불가피하게 대조예 1에서 GelMA 성분을 제외한 바이오 잉크를 새로 제작하였다.
10w/v% 소유래 혈청 단백질, 1w/v% 스트렙토마이신 및 페니실린을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM) 배양액에 알긴산 나트륨(NaAlg) 파우더를 녹여서, 2wt% 알긴산 나트륨(NaAlg) 수용액을 제조한 후, 0.45㎛ 나일론 다공성 시린지 필터를 통해 필터링하였다. 이후, 배양 접시에서 트립신화한 섬유아세포를 1% 알긴산 나트륨(NaAlg) 용액에 50만 개/㎖의 농도로 첨가하여 GelMA 성분을 제외한 바이오 잉크를 제조하였다.
상기 GelMA 성분을 제외한 바이오 잉크를 잉크젯 프린터 카트리지에 장착시켜 기판 상에 80V 전압 및 500㎐ 속도로 분사하였다. 이후, 미세분사 스프레이를 이용해 염화칼슘 수용액을 분사하여 이온적으로 겔화시켜 하이드로겔 구조물을 제조하였다. 이후, 상기 하이드로겔 구조물을 10w/v% 소유래 혈청 단백질, 1w/v% 스트렙토마이신 및 페니실린을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM) 배양액에 넣고, 인큐베이터에서 배양시켰다.
[시험예]
시험예 1: 점도 분석
도 2는 실시예 1에 따라 제조된 가수분해된 GelMA 포함 바이오 잉크와 대조예 1에 따라 제조된 GelMA 포함 바이오 잉크 사이의 점도 차이를 나타낸 그래프이다. 도 2를 참조하면, 가수분해된 폴리펩타이드 프래그먼트를 포함하는 바이오 잉크의 점도가 더 낮아 잉크젯 프린팅에 적합한 것을 확인할 수 있었다.
시험예 2: 잉크젯 프린팅 젯팅 형성 과정 분석
도 3은 실시예 1에 따라 제조된 가수분해된 GelMA 포함 바이오 잉크와 대조예 1에 따라 제조된 GelMA 포함 바이오 잉크를 잉크젯 프린터 카트리지에 장착시켜 4℃로 유지되는 기판 상에 80V 전압 및 500㎐ 속도로 분사를 시도한 그림이다. 가수분해된 폴리펩타이드 프래그먼트를 포함하는 바이오 잉크의 점도가 더 낮아 잉크젯 프린팅이 가능한 반면, 대조예 1에 따라 제조된 GelMA 포함 바이오 잉크는 프린팅이 불가능한 것을 확인할 수 있었다.
시험예 3: 압축강도 분석
도 4는 실시예 2에 따라 제조된 가수분해된 GelMA 포함 바이오 잉크를 이용해 제작한 하이드로겔 구조물과 대조예 2에 따라 제조된 GelMA 성분을 제외한 바이오 잉크를 이용해 제작한 하이드로겔 구조물의 압축강도를 분석한 자료이다. 대조예 2의 GelMA 성분을 제외한 하이드로겔 구조물의 경우 매우 낮은 압축강도를 보였지만, 실시예 2에 따라 제조된 하이드로겔의 경우 GelMA 성분의 광가교에 의해 크게 증가된 하이드로겔의 압축강도를 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 구현예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (21)

  1. 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트;
    이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염; 및
    세포;를
    포함하는 바이오 잉크.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 프래그먼트 100중량부를 기준으로,
    상기 고분자 또는 그의 염 1 내지 50중량부; 및
    상기 세포 0.01 내지 10중량부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 프래그먼트가 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 가수분해하여 제조한 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 프래그먼트가 10 내지 1,000개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 가수분해가 염기 및 효소 중에서 선택된 1종 이상에 의해 수행된 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 공유결합하는 기능기가 아크릴레이션 및 메타크릴레이션 중에서 선택된 1종 이상에 의해 생성된 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 겔라틴, 콜라겐, 피브리노겐, 엘라스틴, 탈세포화 세포 외 기질 및 실크 피브로인 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 이온이 양이온 및 음이온 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 바이오 잉크.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 양이온이 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 바이오 잉크.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 음이온이 삼인산기 (P3O10) 및 디설파이트 (S2O5) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 바이오 잉크.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 이온결합하는 기능기가 카르복실기(-COOH), 삼산화황 (-SO3), 아민기(-NH3) 및 인산기 (-PO4) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 고분자가 알긴산, 히알루론산, 셀룰로오스 및 키토산 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 세포가 포유류 유래, 조류 유래, 파충류 유래, 양서류 유래, 어류 유래 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 잉크가 광개시제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크.
  15. 제1항의 바이오 잉크로 제조된 하이드로겔 구조물.
  16. (a) 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 가수분해하여 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트를 제조하는 단계; 및
    (b) 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염, 세포, 상기 폴리펩타이드 프래그먼트 및 물을 포함하는 바이오 잉크를 제조하는 단계;를
    포함하는 바이오 잉크의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    단계 (a)가
    (a-1) 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 수용액을 제조하는 단계; 및
    (a-2) 상기 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드를 염기 또는 효소를 이용하여 가수분해하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크의 제조방법.
  18. (a') 기판을 제공하는 단계;
    (b') 제1항의 바이오 잉크를 상기 기판 상에 토출하는 단계; 및
    (c') 상기 기판 상에 형성된 바이오 잉크 상에 분사액을 분사하여 상기 바이오 잉크의 이온과 이온결합하는 기능기를 갖는 고분자 또는 그의 염이 이온결합성 가교된 구조물을 제조하는 단계;를
    포함하는 하이드로겔 구조물의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 하이드로겔 구조물의 제조방법이
    단계 (c') 후에 상기 이온결합성 가교된 구조물에 광을 조사하여 공유결합하는 기능기를 갖는 폴리펩타이드 프래그먼트에 의해 공유결합성 가교가 추가된 구조물을 제조하는 단계(d');를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 구조물의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 하이드로겔 구조물의 제조방법이
    단계 (d') 후에 상기 구조물의 상기 세포를 배양하는 단계(e');를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 구조물의 제조방법.
  21. 제18항에 있어서,
    단계 (c')에서, 상기 분사액이 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra 이온 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 수용액인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 구조물의 제조방법.
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