CN111748526A - 一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其步骤为：（A）将GelMA粉末和光引发剂溶于PBS中，在40‑50℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为5‑15%的GelMA溶液；（B）将新鲜脂肪组织预处理后，捣碎处理，分别经0.25%胰蛋白酶‑0.1%EDTA处理和3%Triton‑X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理；（C）将步骤（B）脱细胞外基质溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4‑10℃搅拌，低速离心10min，配制最终浓度为5‑15 mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；（D）将步骤（A）制备的GelMA在适宜的温度下预热，涡旋震荡速度1500‑2500rpm的条件下，将步骤（C）溶液缓慢加入，其中GelMA与脱细胞外基质体积比为1‑4:1，经调节pH及灭菌后即可得。该方法制备的复合生物墨水具有优异的打印性、生物相容性和生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法。
背景技术
传统二维细胞培养由于不能仿照肿瘤的三维环境下细胞间的相互作用以及缺少相应的细胞外基质（ECM）而与真实肿瘤微环境差异较大；而动物模型与人体存在较大的种族差异难以反应人体真实的肿瘤环境，且存在伦理问题。因此导致临床上对肿瘤的发病，治疗和转移理解存在偏差，仿生的含有细胞外基质和多种活性细胞三维肿瘤模型可为体外直观研究肿瘤发展、转移、抗肿瘤药物研发和筛选提供可靠的平台。
3D生物打印是基于医学图像转换或者计算机辅助（CAD）设计的模型，然后在计算机精确控制下，将含有活细胞的生物打印墨水层层打印成型，体外构建仿生的三维肿瘤结构。近五年来，3D生物打印技术有具有较好的空间控制，较快的打印速度，较高精度的复制能力而被广泛应用在肿瘤模型的构建中。理想的生物墨水需要同时满足良好的打印性（快速固化能力），合适的力学支撑性，优良的生物相容性和优异的生物活性。虽然已经有部分研究尝试利用天然和合成的水凝胶材料（如海藻酸钠，明胶，透明质酸，纳米纤维素，聚乙二醇，聚乙烯醇）在体外构建三维肿瘤模型。在打印性方面，现有生物墨水仍然存在注射能力差，固化速度慢，力学强度低和降解性能不可控等缺点；在生物活性方面，现有生物墨水生物活性较低，缺乏促进细胞增殖，分化和特异性功能表达的ECM相关生物化学信号，难以概括真实细胞的培养条件。由于缺乏同时具有良好打印和仿细胞基质成分的生物墨水，导致3D生物打印构建体外仿生的三维肿瘤模型仍存在挑战。脱细胞外基质材料保持细胞生长的微环境，包括胶原、蛋白、多糖以及理化因子，但是其成型性较差难以被打印成型，因此需要与固化性能较好的材料进行复合，如具有优异生物相容性和快速光固化能力的明胶甲基丙烯酸酐（GelMA）。为解决上述难题，本发明制备了一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，该制备方法工艺简单、制备成本低；所制备的复合生物墨水能够仿肿瘤细胞外基质成分，具有优良的生物相容性和生物活性，三维细胞培养活性高具有正常的生物学功能；应用在3D生物打印领域，其打印性良好，保证打印后的仿生三维结构精度高，力学强度可控性强，能够精确的模拟肿瘤三维微环境。
本发明实现其发明目的所采用的技术方案是：
一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
（A）GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和光引发剂溶于PBS中，在40-50℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为5-15% (w/v)的GelMA溶液；
（B）脱脂肪细胞外基质制备：将新鲜脂肪组织预处理后，20000-30000rpm捣碎处理5-10min，分别经0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理和3% Triton-X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理1h和6h，即得；
（C）脱脂肪细胞外基质溶液制备：将步骤（B）脱脂肪细胞外基质制成细纤维状，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4-10℃条件下搅拌48h后，低速离心10min，配制最终浓度为5-15 mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；
（D）复合生物墨水配制：将（A）步制备的GelMA在适宜的温度下预热3-10min，在涡旋震荡速度1500-2500rpm的条件下，将（C）步中的脱脂肪细胞外基质溶液缓慢加入，震荡至溶液均匀混合，其中GelMA与脱细胞外基质的体积比为1-4:1，经过调节pH及过滤灭菌后，即可得仿细胞外基质可打印复合生物墨水。
作为优选的，在上述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法中：步骤A所述的光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP）或巴斯夫Irgacure2959，浓度为1-2% (w/v)。
作为优选的，在上述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法中：步骤（B）所述的新鲜组织来源于猪皮下脂肪或者人体腹部脂肪，组织预处理方法为-80℃和37℃冻融循环5次。
作为优选的，在上述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法中：步骤（C）所述的脱脂肪细胞外基质制成细纤维状的方法为捣碎机30000rpm处理3-5min；
作为优选的，在上述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法中：步骤（C）所述的低速为3000-5000rpm。
作为优选的，在上述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法中：步骤（D）所述的适宜温度为40-50℃，调节pH为6.8-7.5；pH调节方法为：将复合生物墨水置于冰上，边快速搅拌边逐滴滴加1M的NaOH溶液。
本发明的仿细胞外基质可打印复合生物墨水的使用方法是：
将制备的仿细胞外基质可打印复合生物墨水与肿瘤细胞悬液配制成载细胞的复合生物墨水，无菌注射器中吸取后，将其装载在挤出式3D生物打印机，进行无菌打印，实验环境为十万级超净实验室或万级超净台。打印后的三维仿生载肿瘤细胞模型用405 nm蓝光照射固化交联成型，无菌PBS清洗后放置于细胞培养基中，然后在37℃，5% CO2培养箱中培养，经细胞生长、增殖、相关基因和蛋白表达后，最终形成类实体肿瘤微环境的体外肿瘤模型。
本发明制备得到的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水打印性良好，交联后结构稳定性高，且材料来源于广泛，生物安全性和生物相容性高，制备方法简单，成本低廉。与现有材料和技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明制备的仿细胞外基质可打印复合生物墨水所使用的材料来源均为动物或者人体，制备条件温和，制备过程无毒无害，且复合生物墨水保留了组织细胞真实细胞外基质成分、结构、性能和相关理化因子，具有较好的生物降解性、生物相容性和生物活性；
2、打印后的生物墨水能够在405nm蓝光照射下，10秒内快速交联成型，打印性能较好，且蓝光对细胞的伤害较小，满足载细胞3D生物打印要求；
3、通过调配脱细胞外基质的比例，不影响复合生物墨的打印性，可以有效的调节打印后三位载细胞模型的力学强度和生物活性，满足不同性能组织的模型构建。
具体实施方式
实施例1：
一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
（A）GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和1% (w/v)的LAP引发剂溶于PBS中，在50℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为10% (w/v)的GelMA溶液；
（B）脱脂肪细胞外基质制备：将猪皮下脂肪-80℃和37℃冻融循环5次后，20000rpm捣碎处理10min，分别经0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理和3% Triton-X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理1h和6h，即得；
（C）脱脂肪细胞外基质溶液制备：将步骤（B）脱细胞外基质材料制成细纤维状，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4℃条件下搅拌48h后，5000rpm离心10min，配制最终浓度为10 mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；
（D）复合生物墨水配制：将步骤（A）制备的GelMA在适宜的温度下预热10min，在涡旋震荡速度2500rpm的条件下，将步骤（C）中的脱脂肪细胞外基质溶液缓慢加入，震荡至溶液均匀混合，其中GelMA与脱细胞外基质的体积比为3:1，调节pH为6.8及过滤灭菌后，即可得仿细胞外基质可打印复合生物墨水。
实施例2：
一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
（A）GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和2% (w/v)的巴斯夫Irgacure2959引发剂溶于PBS中，在40℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为15% (w/v)的GelMA溶液；
（B）脱脂肪细胞外基质制备：将人腹部脂肪-80℃和37℃冻融循环5次后，30000rpm捣碎处理5min，分别经0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理和3% Triton-X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理1h和6h，即得；
（C）脱脂肪细胞外基质溶液制备：将步骤（B）脱细胞外基质材料制成细纤维状，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4℃条件下搅拌48h后，3000rpm离心10min，配制最终浓度为15 mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；
（D）复合生物墨水配制：将步骤（A）制备的GelMA在适宜的温度下预热3min，在涡旋震荡速度1500rpm的条件下，将步骤（C）中的脱脂肪细胞外基质溶液缓慢加入，震荡至溶液均匀混合，其中GelMA与脱细胞外基质的体积比为4:1，调节pH为7.5及过滤灭菌后，即可得仿细胞外基质可打印复合生物墨水。
实施例3：
一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
（A）GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和1.5% (w/v)的巴斯夫Irgacure2959引发剂溶于PBS中，在45℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为5% (w/v)的GelMA溶液；
（B）脱脂肪细胞外基质制备：将人腹部脂肪-80℃和37℃冻融循环5次后，25000rpm捣碎处理8min，分别经0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理和3% Triton-X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理1h和6h，既得；
（C）脱脂肪细胞外基质溶液制备：将步骤（B）脱细胞外基质材料制成细纤维状，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4℃条件下搅拌48h后，4000rpm离心10min，配制最终浓度为5 mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；
（D）复合生物墨水配制：将步骤（A）制备的GelMA在适宜的温度下预热5min，在涡旋震荡速度2000rpm的条件下，将步骤（C）中的脱脂肪细胞外基质溶液缓慢加入，震荡至溶液均匀混合，其中GelMA与脱细胞外基质的体积比为1:1，调节pH为7.0及过滤灭菌后，即可得仿细胞外基质可打印复合生物墨水。
实施例4：
一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
（A）GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和1 % (w/v)的LAP引发剂溶于PBS中，在50℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为8% (w/v)的GelMA溶液；
（B）脱脂肪细胞外基质制备：将猪皮下脂肪-80℃和37℃冻融循环5次后，28000rpm捣碎处理8min，分别经0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理和3% Triton-X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理1h和6h，即得；
（C）脱脂肪细胞外基质溶液制备：将步骤（B）脱细胞外基质材料制成细纤维状，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4℃条件下搅拌48h后，3500rpm离心10min，配制最终浓度为8 mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；
（D）复合生物墨水配制：将步骤（A）制备的GelMA在适宜的温度下预热7min，在涡旋震荡速度2300rpm的条件下，将步骤（C）中的脱脂肪细胞外基质溶液缓慢加入，震荡至溶液均匀混合，其中GelMA与脱细胞外基质的体积比为2:1，调节pH为7.4及过滤灭菌后，即可得仿细胞外基质可打印复合生物墨水。
实施例5：
一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
（A）GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和2 % (w/v) 的LAP引发剂溶于PBS中，在40℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为12% (w/v)的GelMA溶液；
（B）脱脂肪细胞外基质制备：将猪皮下脂肪-80℃和37℃冻融循环5次后，22000rpm捣碎处理6min，分别经0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理和3% Triton-X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理1h和6h，即得；
（C）脱脂肪细胞外基质溶液制备：将步骤（B）脱细胞外基质材料制成细纤维状，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4℃条件下搅拌48h后，4500rpm离心10min，配制最终浓度为10 mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；
（D）复合生物墨水配制：将步骤（A）制备的GelMA在适宜的温度下预热10min，在涡旋震荡速度1800rpm的条件下，将步骤（C）中的脱脂肪细胞外基质溶液缓慢加入，震荡至溶液均匀混合，其中GelMA与脱细胞外基质的体积比为1:1，调节pH为7.2及过滤灭菌后，即可得仿细胞外基质可打印复合生物墨水。
实施例6：
一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
（A）GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和2 % (w/v) 的LAP引发剂溶于PBS中，在43℃搅拌至均匀，配成浓度为10% (w/v)的GelMA溶液；
（B）脱脂肪细胞外基质制备：将猪皮下脂肪-80℃和37℃冻融循环5次后，22000rpm捣碎处理10min，分别经0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理和3% Triton-X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理1h和6h，即得；
（C）脱脂肪细胞外基质溶液制备：将步骤（B）脱细胞外基质材料制成细纤维状，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4℃条件下搅拌48h后，3200rpm离心10min，配制最终浓度为10 mg/mL的脱脂肪细胞外基质溶液；
（D）复合生物墨水配制：将步骤（A）制备的GelMA在适宜的温度下预热10min，在涡旋震荡速度2000rpm的条件下，将步骤（C）中的脱脂肪细胞外基质溶液缓慢加入，震荡至溶液均匀混合，其中GelMA与脱细胞外基质的体积比为3:1，调节pH为7.4及过滤灭菌后，即可得仿细胞外基质可打印复合生物墨水。
Claims (8)
1.一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（A）GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和光引发剂溶于PBS中，在40-50℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为5-15%的GelMA溶液；
（B）脱脂肪细胞外基质制备：将新鲜脂肪组织预处理后，20000-30000rpm捣碎处理5-10min，分别经0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理和3% Triton-X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理1h和6h，即得；
（C）脱脂肪细胞外基质溶液制备：将步骤（B）的脱脂肪细胞外基质制成细纤维状，溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4-10℃条件下搅拌48h后，低速离心10min，配制最终浓度为5-15 mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；
（D）复合生物墨水配制：将步骤（A）制备的GelMA在适宜的温度下预热3-10min，在涡旋震荡速度1500-2500rpm的条件下，将步骤（C）中的脱脂肪细胞外基质溶液缓慢加入，震荡至溶液均匀混合，其中GelMA与脱细胞外基质的体积比为1-4:1，经过调节pH及过滤灭菌后，即可得仿细胞外基质可打印复合生物墨水。
2.根据权利要求1所述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤A所述的光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或巴斯夫Irgacure2959，浓度为1-2%。
3.根据权利要求1所述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤（B）所述的新鲜组织来源于猪皮下脂肪或者人体腹部脂肪，组织预处理方法为-80℃和37℃冻融循环5次。
4.根据权利要求1所述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤（C）所述的将脱脂肪细胞外基质制成细纤维状的方法为捣碎机30000rpm处理3-5min。
5.根据权利要求1所述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤（C）所述的低速为3000-5000rpm。
6.根据权利要求1所述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于：步骤（D）所述的适宜温度为40-50℃，调节pH为6.8-7.5。
7.根据权利要求6所述的一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其特征在于所述pH调节方法为：将复合生物墨水置于冰上，边快速搅拌边逐滴滴加1M的NaOH溶液。
8.权利要求1所述仿细胞外基质可打印复合生物墨水的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
将制备的仿细胞外基质可打印复合生物墨水与肿瘤细胞悬液配制成载细胞的复合生物墨水，无菌注射器中吸取后，将其装载在挤出式3D生物打印机，进行无菌打印；打印后的三维仿生载肿瘤细胞模型用405 nm蓝光照射固化交联成型，无菌PBS清洗后放置于细胞培养基中，然后在37℃，5% CO2培养箱中培养，经细胞生长、增殖、相关基因和蛋白表达后，最终形成类实体肿瘤微环境的体外肿瘤模型。
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