CN105342731A - 一种比格犬脊髓定向通道支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种比格犬脊髓定向通道支架，包括支架本体，所述支架本体内部设有用于生长薄束、楔束、脊髓丘脑束、皮质脊髓侧束、脊髓小脑后束、脊髓丘脑侧束、脊髓顶盖束、脊髓丘脑前束、皮质脊髓前束和灰质的空心区域；所述支架本体垂直直径为8-15mm，横径为6-10mm，壁厚为0.1-1.0mm。本发明基于三维打印技术克服目前技术的精度及结构问题，可用于脊髓损伤的治疗及研究。

Description

一种比格犬脊髓定向通道支架及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种基于三维打印技术比格犬脊髓定向通道支架及其制备方法。

背景技术

脊髓损伤后导致的感觉、运动功能障碍，是医学界尚未解决的一个重大难题。脊髓再生难以解决，一方面由于脊髓内神经细胞的再生能力有限，不能通过神经细胞增殖来补充死亡的细胞；另一方面是损伤部位形成抑制神经再生的微环境，主要包括以下几个方面：受损细胞产生大量抑制轴突生长的因子；损伤部位缺乏促进细胞生长的神经营养因子；缺乏相关胶质细胞支持引导神经元轴突生长；缺损部位形成瘢痕组织，阻碍神经纤维再生。其治疗策略是消除抑制因素和促进再生能力。组织工程技术为解决脊髓再生障碍提供了极具希望的前途。组织工程支架可以填充组织缺损，有利于内源性和外源性细胞粘附、迁移、增殖，也可以通过修饰各种活性物质来调控损伤灶周边微环境，例如释放神经营养因子，中和再生抑制因子，诱导轴突生长等，建立一个适宜神经再生的微环境，从而达到神经再生的目的。

组织工程支架能桥接断端，防止过多的结缔组织在两断端间生长，但非定向结构支架内部的非定向性、无规律性不利于引导再生神经的定向生长。具有定向结构的组织工程支架有利于神经元粘附，引导轴突延伸以及轴突的生长方向。Bozkurt等用定向多通道的胶原支架培养雪旺氏细胞，发现雪旺氏细胞粘附和增殖并形成类似于“Bungner”带的结构，表明定向通道支架在神经修复中具有较大潜力(BozkurtA,DeumensR,BeckmannC.InvitrocellalignmentobtainedwithaSchwanncellenrichedmicrostructurednerveguidewithlongitudinalguidancechannels.Biomaterials,2009,30:169-179)。

但是，目前工艺制备的组织工程支架其空间结构与在体脊髓有较大差距。3D打印技术在上世纪末期诞生，该技术集机械工程、CAD、分层制造技术、数控技术、材料科学、激光技术于一体，能快速精确地打印出预先的设计模型。而低温快速成型技术是根据所设计或扫描物件的三维信息,在计算机软件及电机精确调控下，迅速打印出特定三维结构，利用材料低温成型特性在低温下迅速凝固,逐层堆积最终形成目标物价。我们设计出以神经传导束为基础构架的比格犬脊髓定向通道支架，用3D打印技术打印出具有特定定向通道的支架，该方法能在脊髓损伤修复方面获得突破。

发明内容

本发明要解决的问题是，提供一种可用于脊髓损伤的治疗和研究的比格犬脊髓定向通道支架及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明创造采用的技术方案是：一种比格犬脊髓定向通道支架，其特征在于：包括支架本体，所述支架本体内部设有用于生长薄束、楔束、脊髓丘脑束、皮质脊髓侧束、脊髓小脑后束、脊髓丘脑侧束、脊髓顶盖束、脊髓丘脑前束、皮质脊髓前束和灰质的空心区域；用于生长薄束、楔束的空心区域位于所述支架本体的上部；用于生长灰质的空心区域位于所述支架本体的中央；用于生长脊髓小脑后束、用于生长脊髓丘脑侧束、用于生长皮质脊髓侧束、用于生长脊髓顶盖束、用于生长脊髓丘脑前束的空心区域均为两个，对称分布在所述支架本体的两侧；用于生长脊髓小脑后束、用于生长脊髓丘脑侧束、用于生长脊髓丘脑前束的看空心区域位于外侧；用于生长皮质脊髓侧束、用于生长脊髓顶盖束的空心区域位于内侧；用于生长皮质脊髓前束的空心区域有两个，对称分布在所述支架本体的下部；所述支架本体垂直直径为8-15mm，横径为6-10mm，壁厚为0.1-1.0mm。

进一步，所述脊髓定向通道支架内外可用于贴服或融合细胞或生长因子。

优选的，所述细胞包括神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、血管内皮细胞、脐带间充质干细胞中的一种或几种。

优选的，所述生长因子包括神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子BDNF)、表皮细胞生长因子(EGF)、神经营养因子-3(NT-3)和血小板源性神经营养因子(PDGF)中的一种或几种。

进一步，所述脊髓定向通道支架内的细胞种植密度为1×10⁶—1×10⁸/ml。

进一步，所述脊髓定向通道支架内表面生长因子的浓度为10μg/g—20mg/g。

进一步，所述脊髓定向通道支架的生物材料为胶原、丝素蛋白、羟基磷灰石、壳聚糖、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、海藻酸钠、明胶、水凝胶中的一种或几种的复合物。

本发明还提供一种脊髓定向通道支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据比格犬脊髓神经结构设计比格犬脊髓定向通道支架3D模型，将脊髓定向通道支架3D模型导入3D生物打印机中；

(2)将液态生物材料置于打印机材料储存筒中；

(3)设置打印机参数，先确定针头直径范围在60—200μm，再调整挤压速度和打印速度，打印速度5-10mm/秒，挤压速度0.1-1mm/秒，材料成型温度为-30℃—5℃。

(4)用3D打印机快速低温成型形成脊髓定向通道支架，将制备的脊髓定向通道置于-20℃低温冷冻干燥成型；

(5)培养细胞、配制生长因子和培养基；将成型的脊髓定向通道常规消毒，置入含有细胞或生长因子的培养液培养4-12天。

本发明创造具有的优点和积极效果是：

(1)本发明根据比格犬脊髓实际情况，用3D打印技术设计打印出的脊髓定向通道支架，高度仿生比格犬脊髓结构，有利于神经定向生长，促进神经再生，可用于脊髓损伤的治疗和研究。

(2)本发明所用材料为生物可降解材料，无细胞毒性和免疫排斥，在体内一定时间内可降解为人体可吸收的无毒无害物质，不阻碍神经生长，压迫再生组织。

(3)本发明种子细胞为神经干细胞、少突胶质细胞、骨髓间充质干细胞等，都具有较强的自我更新和增殖能力，效果明确，是脊髓神经组织工程的理想种子细胞。

附图说明

图1是本发明格犬脊髓定向通道支架的立体结构示意图

图2是本发明格犬脊髓定向通道支架的主视结构示意图

图中：

具体实施方式

实施例一比格犬脊髓定向通道支架

如图1、2所示，一种比格犬脊髓定向通道支架，包括支架本体1，一种比格犬脊髓定向通道支架，包括支架本体1，支架本体1内部设有用于生长薄束、楔束、脊髓丘脑束、皮质脊髓侧束、脊髓小脑后束、脊髓丘脑侧束、脊髓顶盖束、脊髓丘脑前束、皮质脊髓前束和灰质的空心区域；用于生长薄束、楔束的空心区域2位于所述支架本体1的上部；用于生长灰质的空心区域3位于所述支架本体1的中央；用于生长脊髓小脑后束的空心区域4、用于生长脊髓丘脑侧束的空心区域5、用于生长皮质脊髓侧束的空心区域7、用于生长脊髓顶盖束的空心区域8、用于生长脊髓丘脑前束的空心区域6均为两个，对称分布在所述支架本体1的两侧；用于生长脊髓小脑后束的空心区域4、用于生长脊髓丘脑侧束的空心区域5、用于生长脊髓丘脑前束的空心区域6由上至下依次位于外侧；用于生长皮质脊髓侧束的空心区域7、用于生长脊髓顶盖束的空心区域8由上至下依次位于内侧；用于生长皮质脊髓前束的空心区域9有两个，对称分布在支架本体1的下部；支架本体1垂直直径为8-15mm，横径为6-10mm，壁厚为0.1-1.0mm。支架本体1垂直直径为8-15mm，横径为6-10mm，壁厚为0.1-1.0mm。

本发明脊髓定向通道支架的生物材料为胶原、丝素蛋白、羟基磷灰石、壳聚糖、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、海藻酸钠、明胶、水凝胶中的一种或几种的复合物。

本发明脊髓定向通道支架内外可用于贴服或融合细胞或生长因子。细胞包括神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、血管内皮细胞、脐带间充质干细胞中的一种或几种。生长因子包括神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子BDNF)、表皮细胞生长因子(EGF)、神经营养因子-3(NT-3)和血小板源性神经营养因子(PDGF)中的一种或几种。

脊髓定向通道支架内的细胞种植密度为1×10⁶—1×10⁸/ml。

脊髓定向通道支架内表面生长因子的浓度为10μg/g—20mg/g。

实施例二比格犬脊髓定向通道支架的制备

(1)根据比格犬脊髓实际情况，了解薄束、楔束、皮质脊髓束、脊髓丘脑束、脊髓小脑束的直径及走行，设计比格犬脊髓定向通道支架3D模型，文件为STL格式；将脊髓定向通道支架设计模型导入3D生物打印机电脑中，打印机软件自行对模型进行数据转换；

(2)本实施例中采用丝素蛋白作为脊髓定向通道支架的生物材料，丝素蛋白以蚕茧丝为原材料，用脱胶、溶解、透析和浓缩方法进行制备，将蚕茧丝放入80-120℃的Na₂CO₃的溶液中进行脱胶，在CaCL₂、乙醇、水的溶液中进行2-5h的溶解，流水冲洗下在透析袋中透析，最后浓缩成材料溶液。

(3)将液态生物材料置于打印机材料储存筒中；先确定生物打印机针头大小，针头直径范围在60—200μm，再调整挤压速度和打印速度，打印速度5-10mm/秒，挤压速度0.1-1mm/秒，材料成型温度为-30℃—5℃。

(4)用3D打印机快速低温成型形成脊髓定向通道支架，将制备的脊髓支架置于-20℃低温冷冻干燥成型。

(5)培养神经干细胞，放入B27、bFGF无血清培养基及Neurobasal培养基，加NT-3和BDNF生长因子；将成型的脊髓支架常规消毒，把10⁸/ml密度的细胞种入支架内，细胞溶液内含生长因子，培养4-12天。这就形成用于修复脊髓损伤的定向通道支架。

实施例三比格犬脊髓定向通道支架的制备

(1)根据比格犬脊髓实际情况，了解薄束、楔束、皮质脊髓束、脊髓丘脑束、脊髓小脑束的直径及走行，设计比格犬脊髓定向通道支架3D模型，文件为STL格式；将脊髓定向通道支架设计模型导入3D生物打印机电脑中，打印机软件自行对模型进行数据转换；

(2)本实施例中采用丝素蛋和羟基磷灰石作为脊髓定向通道支架的生物材料，用脱胶、溶解、透析和浓缩方法进行制备，将蚕茧丝放入80-120℃的Na₂CO₃的溶液中进行脱胶，在CaCL₂、乙醇、水(1：2：8)的溶液中进行2-5h溶解，流水冲洗下在透析袋中透析，加羟基磷灰石混合溶液以1:1或1:2或1：3或1:4或1:5浓度进行配比，进行透析加热及超滤，最后浓缩成材料溶液。

(3)将液态生物材料置于打印机材料储存筒中；先确定生物打印机针头大小，针头直径范围在60—200μm，再调整挤压速度和打印速度，打印速度5-10mm/秒，挤压速度0.1-1mm/秒，材料成型温度为-30℃—5℃。

(4)用3D打印机快速低温成型形成脊髓定向通道支架，将制备的脊髓支架置于-20℃低温冷冻干燥成型。

(5)培养神经干细胞，放入B27、bFGF无血清培养基及Neurobasal培养基，加NT-3和BDNF生长因子；将成型的脊髓支架常规消毒，把108/ml密度的细胞种入支架内，细胞溶液内含生长因子，培养4-12天。这就形成用于修复脊髓损伤的定向通道支架。

实施例四

比格犬脊髓定向通道支架的制备

(1)根据比格犬脊髓实际情况，了解薄束、楔束、皮质脊髓束、脊髓丘脑束、脊髓小脑束的直径及走行，设计比格犬脊髓定向通道支架3D模型，文件为STL格式；将脊髓定向通道支架设计模型导入3D生物打印机电脑中，打印机软件自行对模型进行数据转换；

(2)本实施例中采用以胶原、丝素蛋白和羟基磷灰石为原材料，将富含胶原蛋白的牛腱或幼猪皮等动物组织去除筋膜、脂肪、肌肉和血管等组织，反复清洗后用NAOH(pH8.0-12)溶液浸泡脱脂；用脱胶、溶解、透析和浓缩方法进行制备，将蚕茧丝放入80-120℃的Na₂CO₃的溶液中进行脱胶，在CaCL₂、乙醇、水(1：2：8)的溶液中进行2-5h溶解，流水冲洗下在透析袋中透析，加羟基磷灰石混合溶液以3:2:1或6:3:1或1:1:1浓度进行配比，进行透析加热及超滤，最后浓缩成材料溶液。

(3)将液态生物材料置于打印机材料储存筒中；先确定生物打印机针头大小，针头直径范围在60—200μm，再调整挤压速度和打印速度，打印速度5-10mm/秒，挤压速度0.1-1mm/秒，材料成型温度为-30℃—5℃。

(4)用3D打印机快速低温成型形成脊髓定向通道支架，将制备的脊髓支架置于-20℃低温冷冻干燥成型。

(5)培养神经干细胞，放入B27、bFGF无血清培养基及Neurobasal培养基，加NT-3和BDNF生长因子；将成型的脊髓支架常规消毒，把10⁸/ml密度的细胞种入支架内，细胞溶液内含生长因子，培养4-12天。这就形成用于修复脊髓损伤的定向通道支架。

以上对本发明创造的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明创造的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明创造范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (8)

1.一种比格犬脊髓定向通道支架，其特征在于：包括支架本体，所述支架本体内部设有用于生长薄束、楔束、脊髓丘脑束、皮质脊髓侧束、脊髓小脑后束、脊髓丘脑侧束、脊髓顶盖束、脊髓丘脑前束、皮质脊髓前束和灰质的空心区域；用于生长薄束、楔束的空心区域位于所述支架本体的上部；用于生长灰质的空心区域位于所述支架本体的中央；用于生长脊髓小脑后束、用于生长脊髓丘脑侧束、用于生长皮质脊髓侧束、用于生长脊髓顶盖束、用于生长脊髓丘脑前束的空心区域均为两个，对称分布在所述支架本体的两侧；用于生长脊髓小脑后束、用于生长脊髓丘脑侧束、用于生长脊髓丘脑前束的看空心区域位于外侧；用于生长皮质脊髓侧束、用于生长脊髓顶盖束的空心区域位于内侧；用于生长皮质脊髓前束的空心区域有两个，对称分布在所述支架本体的下部；所述支架本体垂直直径为8-15mm，横径为6-10mm，壁厚为0.1-1.0mm。

2.根据权利要求1所述的脊髓定向通道支架，其特征在于：所述脊髓定向通道支架内外可用于贴服或融合细胞或生长因子。

3.根据权利要求2所述的脊髓定向通道支架，其特征在于：所述细胞包括神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、血管内皮细胞、脐带间充质干细胞中的一种或几种。

4.根据权利要求2所述的脊髓定向通道支架，其特征在于：所述生长因子包括神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子BDNF)、表皮细胞生长因子(EGF)、神经营养因子-3(NT-3)和血小板源性神经营养因子(PDGF)中的一种或几种。

5.根据权利要求2所述的脊髓定向通道支架，其特征在于：所述脊髓定向通道支架内的细胞种植密度为1×10⁶—1×10⁸/ml。

6.根据权利要求2所述的脊髓定向通道支架，其特征在于：所述脊髓定向通道支架内表面生长因子的浓度为10μg/g—20mg/g。

7.根据权利要求1所述的脊髓定向通道支架，其特征在于：所述脊髓定向通道支架的生物材料为胶原、丝素蛋白、羟基磷灰石、壳聚糖、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、海藻酸钠、明胶、水凝胶中的一种或几种的复合物。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的脊髓定向通道支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据比格犬脊髓神经结构设计比格犬脊髓定向通道支架3D模型，将脊髓定向通道支架3D模型导入3D生物打印机中；

(2)将液态生物材料置于打印机材料储存筒中；

(3)设置打印机参数，先确定针头直径范围在60—200μm，再调整挤压速度和打印速度，打印速度5-10mm/秒，挤压速度0.1-1mm/秒，材料成型温度为-30℃—5℃。

(4)用3D打印机快速低温成型形成脊髓定向通道支架，将制备的脊髓定向通道置于-20℃低温冷冻干燥成型；

(5)培养细胞、配制生长因子和培养基；将成型的脊髓定向通道常规消毒，置入含有细胞或生长因子的培养液培养4-12天。