CN113117147A - 骨组织修复材料及组织工程支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物材料技术领域，公开了一种骨组织修复材料及组织工程支架的制备方法。所述骨组织修复材料，按照重量份数计，包括以下组分：油溶性高分子材料10～40份，生物陶瓷粉体10～50份，油性溶剂50～100份，水溶性骨组织修复药物0.1～1份，水2～30份，乳化剂大于0小于1份，种子细胞大于0份且不大于10份，以及培养基50～100份。

Description

骨组织修复材料及组织工程支架的制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种骨组织修复材料及组织工程支架的制备方法。
背景技术
目前，骨组织缺损给人类的健康和生活质量带来巨大危害，而缺损骨组织的修复与再生在临床治疗中仍然是一个巨大的挑战，因为缺损部位的成骨和血管生成非常困难，且经常涉及感染，故而一般较大骨缺损需要介入治疗才能恢复。在所有临床上应用的移植物中，尽管自体骨移植被作为骨替代的金标准，但其可用性差、供体部位并发症多和手术时间延长等弊端使其难以作为常规治疗方法。同种异体移植或异种移植的应用也受到限制，因为存在包括免疫反应并发症、疾病传播风险和生物学行为表现欠佳等明显的缺陷，这可能导致骨吸收、骨不连和移植失败。所以对于大面积骨缺损的治疗策略亟待设计和开发，以满足越来越多的临床需求。组织工程技术近年来已成为修复骨缺损的有效潜在选择之一。
许多修复材料(包括单相、多层或具有梯度结构)已经被用来引导骨组织再生。成体组织细胞与祖细胞(包括干细胞)也被种植于支架中进行骨组织方面的体内、体外研究。同时，多种生长因子也被用于诱导细胞定向分化，加速骨组织再生。尽管如此，因骨组织具有相当的复杂性，有效的骨组织再生策略仍未建立。因此，采用先进的材料制备工艺、选择恰当的骨组织修复药物和开发有效的生长因子递送方式并进一步优化支架结构/力学特性、细胞分化以及骨修复药物缓释三者之间的相互关系，对建立能有效修复骨组织损伤、诱导骨组织再生的组织工程模型具有十分重要的理论意义，可为解释骨缺损治疗的生物学本质提出新的思路，这对最终临床转化治疗骨缺损也有至关重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：现有的骨组织修复材料无法实现有效的骨组织再生。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种骨组织修复材料，按照重量份数计，包括以下组分：油溶性高分子材料10～40份，生物陶瓷粉体10～50份，油性溶剂50～100份，水溶性骨组织修复药物0.1～1份，水2～30份，乳化剂大于0小于1份，种子细胞0～10份，培养基50～100份。
优选的，所述的油溶性高分子材料为乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
优选的，所述油性溶剂具体为二氯甲烷；所述生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙(β-TCP)；水为去离子水；乳化剂为聚乙烯醇(PVA)，所述培养基为DMEM/F-12高糖培养基。
优选的，所述水溶性骨组织修复药物为PTEN抑制剂bisperoxovanadium[bpV(pic)]。
优选的，所述的种子细胞为大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)。
本发明还提供一种组织工程支架的制备方法，按照如下步骤进行：
S1、支架原料混合：先将油溶性高分子材料溶于油性溶剂中制得油溶性高分子材料/油性溶剂溶液，再将生物陶瓷粉体溶于该油溶性高分子材料/油性溶剂溶液中，制得油溶性高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液；
S2、水溶性骨组织修复药物溶液制备：将水溶性骨组织修复药物溶于水中形成水溶性成骨溶液；
S3、成型墨水的制备：将步骤S1制得的油溶性高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液和步骤S2制得的水溶性成骨溶液，以及乳化剂混合至均匀，制得组织工程支架的成型墨水；
S4、组织工程支架打印：将所述成型墨水在低温下通过打印设备得到组织工程支架；
S5、将组织工程支架进行冷冻干燥，使组织工程支架风干除去溶剂，得到组织工程支架半成品；
S6、在所述骨组织工程支架半成品上灌注含有种子细胞的DMEM/F-12高糖培养基，实现干细胞在组织工程支架上的黏附，得到组织工程支架成品。
优选的，所述组织工程支架成品的孔隙率为49～90％，一级孔径为220～400μm，次级孔孔径为130～220μm。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明的骨组织修复材料，其制作原料均为常用原料，易于获取且资源丰富，为骨组织工程支架的推广应用提供了便利条件；本发明的骨组织修复材料通过油溶性高分子材料和生物陶瓷粉体的相互配合，形成骨组织工程支架的基材，以便为打印的骨组织工程支架提供足够的结构/力学性能；本发明的材料制备骨组织工程支架方便，利用3D打印设备即可制备个性化的骨组织工程支架，且能够根据设计的方案，制备需要的个性化大小、形状的骨组织工程支架，具有良好的生物力学强度和仿骨组织结构以及各向异性力学特性及宏-微观结构；通过水溶性骨组织修复药物的作用促进成骨细胞成骨分化，使得骨组织在骨组织工程支架的基础上使骨细胞分化形成完善的骨组织结构，使缺损的骨组织得到相当于原骨组织的强度和形状，使骨组织有效再生；
2、本发明的组织工程支架的制备方法，组织工程支架的成型墨水配制简单，可原位负载水溶性骨组织修复药物，通过次序低温打印，实现促成骨的水溶性骨组织修复药物的负载即可控缓释，在-10～-40℃条件下进行打印成型并冷冻干燥即可制得定型的组织工程支架；采用本发明的制备方法能够制备个性化的组织工程支架，具有各向异性力学特性及宏-微观结构，能够适应体内不同形状需求的组织要求，所述组织工程支架中的孔隙和促成骨活性药物(即水溶性骨组织修复药物)有利于促进负载干细胞的黏附和成骨分化。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的组织工程支架的影像示意图。
图2是本发明实施例1制备的组织工程支架在扫描电子显微镜100μm放大倍数下的放大图。
图3是本发明实施例1制备的组织工程支架在扫描电子显微镜100μm放大倍数下的放大图。
图4是本发明实施例1制备的组织工程支架在经过3天培养的种子细胞的倒置荧光显微镜放大1000倍的观测结果图，通过观察圆形点状物白色荧光表达量，明确种子细胞的存活情况，由于图4是彩色附图转换的灰度图，图中箭头所指的圆形点状白色荧光即种子细胞。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明充分发挥3D打印在一体化构建梯度结构方面的优势，根据天然骨组织成分、宏微结构和力学特性差异，选用适当的基材墨水、促成骨活性药物以及干细胞负载技术，通过次序低温3D打印和后处理构建成分、宏微结构和力学性能均可精确仿生骨组织的一体化修复材料，并藉由不同区位原位负载的促成骨活性药物诱导在支架附近的活性组织，形成具有梯度成分结构和力学性能且界面强度优良的骨组织修复材料。以下实施例所采用的低温3D生物打印设备为多喷头打印机，且打印环境温度可降低为0～-100℃。在低温3D打印机内部的原始打印台上安装了一个定制的低温基板(-30℃)，以提供一个低温环境。
实施例1：本实施例提供一种骨组织修复材料，油溶性高分子材料10份、生物陶瓷粉体10份、油性溶剂50份、水溶性骨组织修复药物0.1份、水2份、乳化剂0.2份，种子细胞1份以及培养基50份，所述培养基为DMEM/F-12高糖培养基。
所述油溶性高分子材料为乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)；所述油性溶剂为二氯甲烷；所述生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙(β-TCP)；水为去离子水；乳化剂为聚乙烯醇PVA。所述水溶性骨组织修复药物为PTEN抑制剂[bpV(pic)]。
利用本发明的组织工程支架的制备方法制备组织工程支架，包括以下步骤：
S1、支架原料混合：配制10mL、30％浓度的乳酸-羟基乙酸共聚物/二氯甲烷溶液。
S2、水溶性骨组织修复药物溶液制备：加入2mL bpV(pic)水溶液，该bpV(pic)与水的配比为1:100000。
S3、成型墨水的制备：将上述配制好的10mL乳酸-羟基乙酸共聚物/二氯甲烷溶液、2mL bpV(pic)水溶液与6克β-磷酸三钙(β-TCP)及具有生物相容性的乳化剂PVA混合得到乳膏状组织工程支架的成型墨水；其中，乳化剂质量与bpV(pic)水溶液质量的配比大于0小于5％。
S4、组织工程支架打印：将所述组织工程支架的成型墨水注入低温3D打印机，并在低温打印台(-10摄氏度)上根据CAD模型通过喷头打印成型骨组织结构支架。
S5、干燥成型：待骨组织结构支架打印完成后通过4℃低温、无菌、避光8h，去除油性溶剂。
S6、种子细胞灌注：在所述骨组织工程支架半成品上灌注0.1～0.9毫升的含有种子细胞(即大鼠骨髓间充质细胞)的溶液培养基，即DMEM/F-12高糖培养基，所述种子细胞为大鼠骨髓间充质干细胞，种子细胞溶液中细胞的浓度为5×107个种子细胞/毫升，实现干细胞在组织工程支架上的黏附，得到组织工程支架成品。
实施例2：本实施例提供一种骨组织修复材料，油溶性高分子材料25份、生物陶瓷粉体30份、油性溶剂80份、水溶性骨组织修复药物0.6份、水20份、乳化剂0.6份，种子细胞6份以及培养基70份，所述培养基为DMEM/F-12高糖培养基；
所述油溶性高分子材料为乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)；所述油性溶剂具体为二氯甲烷；所述生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙(β-TCP)；水为去离子水；乳化剂为聚乙烯醇PVA，所述水溶性骨组织修复药物为PTEN抑制剂[bpV(pic)]。
利用本发明的组织工程支架的制备方法制备组织工程支架，包括以下步骤：
S1、支架原料混合：配制10mL、20％浓度的乳酸-羟基乙酸共聚物/二氯甲烷溶液。
S2、水溶性骨组织修复药物溶液制备：加入2mL bpV(pic)水溶液，该bpV(pic)与水的配比为1:100000。
S3、成型墨水的制备：将上述配制好的10mL乳酸-羟基乙酸共聚物/二氯甲烷溶溶液、2mL bpV(pic)水溶液与4克β-磷酸三钙及具有生物相容性的乳化剂PVA混合得到乳膏状组织工程支架的成型墨水；其中，乳化剂质量与bpV(pic)水溶液质量的配比大于0小于5％；
S4、组织工程支架打印：将所述组织工程支架的成型墨水注入低温3D打印机，并在低温打印台(-10摄氏度)上根据CAD模型通过喷头打印成型骨组织结构支架。
S5、干燥成型：待骨组织结构支架打印完成后通过4℃低温、无菌、避光8h，去除油性溶剂。
S6、种子细胞灌注：在所述骨组织工程支架半成品上灌注0.1～0.9毫升的含有种子细胞(即大鼠骨髓间充质细胞)的溶液培养基，即DMEM-高糖培养基，所述种子细胞为大鼠骨髓间充质干细胞，种子细胞溶液中细胞的浓度为5×107个种子细胞/毫升，实现干细胞在组织工程支架上的黏附，得到组织工程支架成品。
实施例3：本实施例提供一种骨组织修复材料，油溶性高分子材料:40份、生物陶瓷粉体50份、油性溶剂100份、水溶性骨组织修复药物1份、水30份、乳化剂1份，种子细胞10份以及培养基100份，所述培养基为DMEM/F-12高糖培养基。
所述油溶性高分子材料为乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)；所述油性溶剂具体为二氯甲烷；所述生物陶瓷为β-磷酸三钙(β-TCP)；水为去离子水；乳化剂为聚乙烯醇PVA，所述水溶性骨组织修复药物为PTEN抑制剂[bpV(pic)]。
利用本发明的组织工程支架的制备方法制备组织工程支架，包括以下步骤：
S1、支架原料混合：配制10mL、20％浓度的乳酸-羟基乙酸共聚物/二氯甲烷溶液。
S2、水溶性骨组织修复药物溶液制备：加入2mL bpV(pic)水溶液，该bpV(pic)与水的配比为1:100000。
S3、成型墨水的制备：将上述配制好的10mL乳酸-羟基乙酸共聚物/二氯甲烷溶溶液、2mL bpV(pic)水溶液与5克β-磷酸三钙及具有生物相容性的乳化剂PVA混合得到乳膏状组织工程支架的成型墨水；其中，乳化剂质量与bpV(pic)水溶液质量的配比大于0小于5％。
S4、组织工程支架打印：将所述组织工程支架的成型墨水注入低温3D打印机，并在低温打印台(-10摄氏度)上根据CAD模型通过喷头打印成型骨组织结构支架。
S5、干燥成型：待骨组织结构支架打印完成后通过4℃低温、无菌、避光8h，去除油性溶剂。
S6、种子细胞灌注：在所述骨组织工程支架半成品上灌注0.1～0.9毫升的含有种子细胞(即大鼠骨髓间充质细胞)的溶液培养基，即DMEM-高糖培养基，所述种子细胞为大鼠骨髓间充质干细胞，种子细胞溶液中细胞的浓度为5×107个种子细胞/毫升，实现干细胞在组织工程支架上的黏附，得到组织工程支架成品。
以上实施例制备得到的组织工程支架，如附图1和2所示，孔隙率为40～95％，一级孔径为100～2000μm，次级孔孔径为1～100μm。
生物活性测试
将制备得到的组织工程支架培养三天，在37℃、5％二氧化碳培养箱内培养后进行细胞活性检测。在检测过程中，先用磷酸盐缓冲液冲洗细胞-材料复合体表面，然后采用死活细胞检测试剂盒，将细胞-材料复合体放置于含有工作浓度(试剂盒储存浓度在DMEM培养基中吸湿1000倍)的死活细胞荧光染料的培养基中，在37℃的细胞培养箱中孵育半小时，然后用倒置荧光显微镜观测死活细胞。
如附图4所示，图4为经过3天培养细胞的倒置荧光显微镜观测结果，图中箭头所指的圆形点状白色荧光即为部分活的种子细胞，图中活的种子细胞数量较多，未完全指出。说明带有促成骨细胞活性药物和生物陶瓷粉体的组织工程支架可以更好的为细胞黏附增殖、扩展提供帮助。
综上，本发明的骨组织修复材料，其制作原料均为常用原料，易于获取且资源丰富，为骨组织工程支架的推广应用提供了便利条件；本发明的骨组织修复材料通过油溶性高分子材料和生物陶瓷粉体的相互配合，形成骨组织工程支架的基材，以便为打印的骨组织工程支架提供足够的结构/力学性能；本发明的材料制备骨组织工程支架方便，利用3D打印设备即可制备个性化的骨组织工程支架，且能够根据设计的方案，制备需要的个性化大小、形状的骨组织工程支架，具有良好的生物力学强度和仿骨组织结构以及各向异性力学特性及宏-微观结构；通过水溶性骨组织修复药物的作用促进成骨细胞成骨分化，使得骨组织在骨组织工程支架的基础上使骨细胞分化形成完善的骨组织结构，使缺损的骨组织得到相当于原骨组织的强度和形状，使骨组织有效再生；本发明的组织工程支架的制备方法，组织工程支架的成型墨水配制简单，可原位负载水溶性骨组织修复药物，通过次序低温打印，实现促成骨的水溶性骨组织修复药物的负载即可控缓释，在-10～-40℃条件下进行打印成型并冷冻干燥即可制得定型的组织工程支架；采用本发明的制备方法能够制备个性化的组织工程支架，具有各向异性力学特性及宏-微观结构，能够适应体内不同形状需求的组织要求，所述组织工程支架中的孔隙和促成骨活性药物(即水溶性骨组织修复药物)有利于促进负载干细胞的黏附和成骨分化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.骨组织修复材料，其特征在于：按照重量份数计，包括以下组分：油溶性高分子材料10～40份，生物陶瓷粉体10～50份，油性溶剂50～100份，水溶性骨组织修复药物0.1～1份，水2～30份，乳化剂大于0小于1份，种子细胞0～10份，培养基50～100份。
2.根据权利要求1所述的骨组织修复材料，其特征在于：所述的油溶性高分子材料为乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
3.根据权利要求1所述的骨组织修复材料，其特征在于：所述油性溶剂具体为二氯甲烷；水为去离子水；乳化剂为聚乙烯醇(PVA)，所述培养基为DMEM/F-12高糖培养基。
4.根据权利要求1所述的骨组织修复材料，其特征在于：所述生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙(β-TCP)。
5.根据权利要求1所述的骨组织修复材料，其特征在于：所述水溶性骨组织修复药物为PTEN抑制剂bisperoxovanadium[bpV(pic)]。
6.根据权利要求1所述的骨组织修复材料，其特征在于：所述的种子细胞为大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)。
7.一种组织工程支架的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
S1、支架原料混合：先将油溶性高分子材料溶于油性溶剂中制得油溶性高分子材料/油性溶剂溶液，再将生物陶瓷粉体溶于该油溶性高分子材料/油性溶剂溶液中，制得油溶性高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液；
S2、水溶性骨组织修复药物溶液制备：将水溶性骨组织修复药物溶于水中形成水溶性成骨溶液；
S3、成型墨水的制备：将步骤S1制得的油溶性高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液和步骤S2制得的水溶性成骨溶液，以及乳化剂混合至均匀，制得组织工程支架的成型墨水；
S4、组织工程支架打印：将所述成型墨水在低温下通过打印设备得到组织工程支架；
S5、干燥成型：将组织工程支架进行冷冻干燥，使组织工程支架风干除去溶剂，得到组织工程支架半成品；
S6、种子细胞灌注：在所述骨组织工程支架半成品上灌注含有种子细胞的培养基，实现干细胞在组织工程支架上的黏附，得到组织工程支架成品。
8.根据权利要求7所述的组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述组织工程支架成品的孔隙率为49～90％，一级孔径为220～400μm，次级孔孔径为130～220μm。
9.根据权利要求7所述的组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述乳化剂质量与bpV(pic)水溶液质量的配比大于0小于5％。
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