CN105380728A - 一种人用高仿真胶原脊髓支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人用高仿真胶原脊髓支架,包括支架本体,所述支架本体内部设有用于生长脊髓灰质、薄束、楔束、皮质脊髓侧束、红核脊髓及网状脊髓束、脊髓丘脑侧束、脊髓顶盖束、网状脊髓束、皮质脊髓前束及中央管的空心区域;所述支架本体垂直直径为1.2-1.8cm,横径为1.4-1.8cm,高度为2.0mm-8cm,所述支架本体的材料为胶原。本发明构建人胸腰段水平脊髓节段白、灰质主要解剖结构及空间关系,用于改善脊髓损伤后神经定向有序联接,促进人脊髓损伤后快速修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于人脊髓损伤后快速修复的高仿真胶原脊髓支架及其制备方法。
背景技术
脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)后的神经再生问题仍是临床医师和科研人员面临的难题。由于损伤部位急性期局部抑制性生物微环境及物理环境的阻碍,导致神经网络的无序生长和有限的神经再生。近年来,随着神经组织工程学的发展,脊髓神经再生已经取得了一定进展,其主要策略是调整和控制SCI后局部抑制性微环境,同时促进和引导局部神经网络的定向有序联接。但是,即使是结合当前的组织工程学技术和生物学方法,在修复的轴突数量、长度、髓鞘化程度和电生理功能等远达不到临床功能的恢复。神经元轴突的远距离再生和修复仍是当前SCI治疗中急需解决的问题。
在人体脊髓神经细胞发生、生长及成熟的过程中,由于结构的差异和生长速度的不同,存在脊柱和脊髓不平行生长。通过脊柱椎间孔的神经根与脊髓之间持续的牵拉,使得脊髓神经细胞的生长始终处于缓慢延伸生长的低张力环境中。另外,脑脊液循环、血流及周围组织等物理因素的存在也使得神经细胞处于相对复杂的环境中。因此,从神经发育的角度考虑,要实现神经元轴突的远距离功能再生,不仅要对局部抑制性分子进行合理调控,创造神经再生或替代治疗较佳的生物微环境;同时,在空间上需要为受损神经提供适合其定向有序远距离生长的物理微环境。
在哺乳动物的CNS发育过程中,在胚胎发育约2~3周时,逐渐形成神经板、神经沟及神经管。神经管逐渐发育成熟形成侧脑室、第三、第四脑室及脊髓中央管,其末端1/3形成脊髓。未成熟的神经元在时间和空间上精确迁移,最终到达行使功能的目的地。由于存在脑脊液循环形成的流体剪切力及周围血管内皮细胞产生的脉压作用,室管膜下区及脊髓中央管周围存在的神经细胞始终处于一个相对密闭又复杂的环境中。同时,到达功能部位的脊髓神经元伴随着椎管和神经根的发育和牵引,其轴突形态结构和功能才逐渐完善成熟。可以说,随着神经组织的生长、发育、成熟,其空间结构也发生一定的迁移变化。因此,脊髓的空间结构和解剖对神经细胞定向迁移、分化和成熟,以及细胞间相互作用很可能产生重要的影响。
但是,目前已有的神经支架其空间构架与在体脊髓有很大差距,这也必然影响脊髓损伤的神经修复。因此,我们建立了脊髓的空间结构,模拟其神经电生理解剖结构设计出以白、灰质主要解剖结构及空间关系构架的脊髓支架,通过低温快速成型三维打印技术控制支架复杂外形及内部精细结构,期望能在脊髓损伤修复方面获得突破。
三维细胞培养需将分离获得的细胞接种于三维支架材料。常用的三维培养的生物支架材料主要分为人工合成和天然两大类。其中人工合成材料如聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸乙醇酸共聚物等,可以大量生产,易于控制材料的物理强度,但人工合成材料并不是生物体本身所固有的成份,其细胞相容性及表面特性与体内细胞外基质完全不同,降解后形成的酸性环境可能会对细胞存活和生长有所限制与影响。天然材料来源于细胞外基质,如胶原蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白等。高等动物细胞外基质成份胶原是机体内细胞所处三维环境中的主要成份,占哺乳动物蛋白总量的25%-35%。胶原蛋白作为细胞外基质的主要成份且有很好的生物相容性而被认为是理想的细胞三维支架材料之一。
发明内容
本发明创造要解决的问题是,提供一种用于改善脊髓损伤后神经定向有序联接,促进人脊髓损伤后快速修复的高仿真胶原脊髓支架及其制备方法。
为解决上述技术问题,本发明创造采用的技术方案是:所述支架本体内部设有用于生长脊髓灰质、薄束、楔束、皮质脊髓侧束、红核脊髓及网状脊髓束、脊髓丘脑侧束、脊髓顶盖束、网状脊髓束、皮质脊髓前束及中央管的空心区域;所述用于生长薄束、楔束的空心区域位于支架本体上半部;用于生长脊髓灰质和中央管的空心区域位于支架本体中央部位;所述用于生长皮质脊髓侧束的空心区域、红核脊髓及网状脊髓束的空心区域、脊髓丘脑侧束的空心区域、脊髓顶盖束的空心区域均为两个,分别对称设置在支架本体的两侧部位;所述用于生长网状脊髓束的空心区域和用于生长皮质脊髓前束的空心区域均为两个,分别对称设置在支架本体下半部;用于生长网状脊髓束的空心区域在外,用于生长皮质脊髓前束的空心区域在内;所述支架本体垂直外径为1.2-1.8cm,横向外径为1.4-1.8cm,高度为2.0mm-8cm,所述支架本体的材料为胶原。上述直径及高度的精确度50-100μm。
进一步,所述支架材料模拟及仿真脊髓神经电生理空间结构,可配合细胞或神经生长因子进行神经修复。
优选的,所述细胞包括自体骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞。
优选的,所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子-3、脑源性生长因子、表皮细胞生长因子、类胰岛素生长因子、神经生长因子和血小板源性神经营养因子中的一种或几种。
进一步,所述细胞种植在支架材料表面的密度为1×105—1×108cell/ml。
进一步,所述支架的胶原材料的制备方法包括以下步骤:
(1)将富含胶原蛋白的牛腱或幼猪皮动物组织去除筋膜、脂肪、肌肉和血管等组织,反复清洗后用pH8.0-12的NaOH溶液浸泡脱脂;
(2)将脱脂后材料溶解于pH5.0-6.5的乙酸溶液,搅拌混匀后按质量比混合物:复合蛋白酶=500-1000:1加入复合蛋白酶,反复搅拌24h;
(3)取上述混合溶解液100g离心10min后收集上清液,加入Nacl搅拌,收集沉淀物,再次加入乙酸搅拌均匀,重复步骤(3)操作3-4次后将沉淀物溶解于0.01-0.1mmol/L乙酸溶液中,获得1-3%胶原溶液。
优选的,所述细胞或神经生长因子采用缓释技术与胶原材料混合,或通过直接的局部注射方式与胶原材料混合。
本发明还提供一种高仿真胶原脊髓支架的制备方法,包括如下步骤:
(1)根据文献和神经电生理数据,精确测量人胸腰段水平脊髓主要参数数据,进行统计学处理分析;
(2)根据人天然神经电生理解剖结构,结合所测量数据优化设计支架空间的结构,制作3D打印Solidwork模型;
(3)将胶原材料置于三维打印机储存器中,将设置编程的Solidwork模型导入打印机;打印机针头直径为60—100μm,打印速度5-10mm/秒,打印间隙为50μm—100μm,温度设置为-20℃—5℃,打印范围在5cm×5cm之间。
(4)按照设置程序快速打印人脊髓支架。
(5)按照常规技术制备含有细胞溶液和生长因子;将打印的脊髓支架常规消毒净化,置入含有108/ml细胞的培养液中,内含一种或多种细胞和多种生长因子,培养4-12天。
本发明提供的另一种方法在于,在步骤(2)中使用预先混有细胞或神经生长因子的胶原材料。即可省略步骤(5)。
本支架用于治疗时,严格脊髓损伤入组患者,按照伦理道德委员会要求优选脊髓损伤全横断患者;将脊髓支架置入脊髓横断损伤处,观察1年时间,形成神经网络联接并促进神经功能恢复。
本发明创造具有的优点和积极效果是:
(1)本发明采用仿生技术,根据脊髓天然神经电生理结构和精细位置,设计模型的大小尺寸和精微结构,采用低温快速成型打印技术,将患者精细结构精确打印,可用于脊髓损伤的治疗和研究。
(2)本发明采用的低温快速成型技术科在低温情况下迅速使得材料凝固并堆积成型,精确度高,成型效果好,不破坏材料本身的性质。
(3)本发明所用材料为生物可降解的材料,无细胞毒性、免疫排斥,在体内一定时间内可降解为人体可吸收的无毒无害物质,可促进神经纤维有序定向生长,且不阻碍后期神经纤维生长。
(4)本发明种子细胞为目前技术比较成熟的细胞,包括神经干细胞、少突胶质细胞、骨髓间充质干细胞等,都具有自我更新和增殖等特点,为神经系统常见的细胞类型,来源丰富,技术成熟,效果明确,是脊髓神经组织工程的理想种子细胞。
(5)本发明的脊髓微导管低温快速成型技术总体技术含量高,但成本较低,具有高附加值,后期产品化后市场前景可观。
附图说明
图1是本发明人用高仿真胶原脊髓支架的立体结构示意图
图2是本发明人用高仿真胶原脊髓支架的主视结构示意图
图中:
具体实施方式
实施例一人用高仿真胶原脊髓支架
如图1、2所示,人用高仿真胶原脊髓支架,包括支架本体1,支架本体1内部设有用于生长脊髓灰质、薄束、楔束、皮质脊髓侧束、红核脊髓及网状脊髓束、脊髓丘脑侧束、脊髓顶盖束、网状脊髓束、皮质脊髓前束及中央管的空心区域;用于生长薄束、楔束的空心区域2位于支架本体1上半部;用于生长脊髓灰质和中央管的空心区域3位于支架本体1中央部位;
用于生长皮质脊髓侧束的空心区域4、用于生长红核脊髓及网状脊髓束的空心区域5、用于生长脊髓丘脑侧束的空心区域6、用于生长脊髓顶盖束的空心区域7均为两个,分别对称设置在支架本体1的两侧部位;从上到下依次为用于生长皮质脊髓侧束的空心区域4、用于生长红核脊髓及网状脊髓束的空心区域5、用于生长脊髓丘脑侧束的空心区域6、用于生长脊髓顶盖束的空心区域7。
用于生长网状脊髓束的空心区域8和用于生长皮质脊髓前束的空心区域9均为两个,分别对称设置在支架本体1下半部;用于生长网状脊髓束的空心区域8在外,用于生长皮质脊髓前束的空心区域9在内;支架本体1垂直外径为1.2-1.8cm,横向外径为1.4-1.8cm,高度为2.0mm-8cm,支架本体1的材料为胶原。上述直径及高度的精确度50-100μm。
本发明支架材料可配合细胞或神经生长因子进行神经修复。细胞包括自体骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞。生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子-3、脑源性生长因子、表皮细胞生长因子、类胰岛素生长因子、神经生长因子和血小板源性神经营养因子中的一种或几种。
细胞种植在支架材料表面的密度为1×105—1×108cell/ml。
实施例二人用高仿真胶原脊髓支架的制备
(1)将富含胶原蛋白的牛腱或幼猪皮等动物组织去除筋膜、脂肪、肌肉和血管等组织,反复清洗后用NAOH(pH8.0)溶液浸泡脱脂;
(2)将脱脂后材料溶解于pH5.0乙酸溶液,搅拌混匀后按质量比500:1加入复合蛋白酶,反复搅拌24h;
(3)100g离心10min后收集上清液,加入Nacl搅拌,收集沉淀物,再次加入乙酸搅拌均匀,重复上述操作3次后将胶原溶解于0.01-0.1乙酸溶液中,获得1-3%胶原溶液。
(4)根据文献和神经电生理数据,精确测量人胸腰段水平脊髓主要参数数据,进行统计学处理分析;
(5)根据人天然神经电生理解剖结构,结合所测量数据优化设计支架空间的结构,制作3D打印Solidwork模型;
(6)将制备好的胶原材料置于三维打印机储存器中,将设置编程的Solidwork模型导入打印机;打印机针头直径为60—100μm,打印速度5-10mm/秒,打印间隙为50μm—100μm,温度设置为-20℃—5℃,打印范围在5cm×5cm之间。按照设置程序快速打印人脊髓支架。
(7)制备含有自体骨髓间充质干细胞溶液;将打印的脊髓支架常规消毒净化,置入含有108/ml细胞的培养液中,常规培养4-12天。
(8)严格脊髓损伤入组患者,按照伦理道德委员会要求优选胸腰段脊髓全横断损伤慢性期患者;
(9)将脊髓支架置入脊髓横断损伤处,观察1年时间,形成神经网络联接并促进神经功能恢复。
实施例三人用高仿真胶原脊髓支架的制备
(1)将富含胶原蛋白的牛腱或幼猪皮等动物组织去除筋膜、脂肪、肌肉和血管等组织,反复清洗后用NAOH(pH10.0)溶液浸泡脱脂;
(2)将脱脂后材料溶解于pH6.5乙酸溶液,搅拌混匀后按质量比1000:1加入复合蛋白酶,反复搅拌24h;
(3)100g离心10min后收集上清液,加入Nacl搅拌,收集沉淀物,再次加入乙酸搅拌均匀,重复上述操作3次后将胶原溶解于0.01-0.1乙酸溶液中,获得1-3%胶原溶液。
(4)根据文献和神经电生理数据,精确测量人胸腰段水平脊髓主要参数数据,进行统计学处理分析;
(5)根据人天然神经电生理解剖结构,结合所测量数据优化设计支架空间的结构,制作3D打印Solidwork模型;
(6)将制备好的混有细胞或神经生长因子的胶原材料置于三维打印机储存器中,将设置编程的Solidwork模型导入打印机;打印机针头直径为60—100μm,打印速度5-10mm/秒,打印间隙为50μm—100μm,温度设置为-20℃—5℃,打印范围在5cm×5cm之间。按照设置程序快速打印人脊髓支架。
(7)严格脊髓损伤入组患者,按照伦理道德委员会要求优选胸腰段脊髓全横断损伤慢性期患者;
(8)将脊髓支架置入脊髓横断损伤处,观察1年时间,形成神经网络联接并促进神经功能恢复。
以上对本发明创造的实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明创造的较佳实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明创造范围所作的均等变化与改进等,均应仍归属于本专利涵盖范围之内。
Claims (9)
1.一种人用高仿真胶原脊髓支架,其特征在于:包括支架本体,所述支架本体内部设有用于生长脊髓灰质、薄束、楔束、皮质脊髓侧束、红核脊髓及网状脊髓束、脊髓丘脑侧束、脊髓顶盖束、网状脊髓束、皮质脊髓前束及中央管的空心区域;所述用于生长薄束、楔束的空心区域位于支架本体上半部;用于生长脊髓灰质和中央管的空心区域位于支架本体中央部位;所述用于生长皮质脊髓侧束的空心区域、红核脊髓及网状脊髓束的空心区域、脊髓丘脑侧束的空心区域、脊髓顶盖束的空心区域均为两个,分别对称设置在支架本体的两侧部位;所述用于生长网状脊髓束的空心区域和用于生长皮质脊髓前束的空心区域均为两个,分别对称设置在支架本体下半部;用于生长网状脊髓束的空心区域在外,用于生长皮质脊髓前束的空心区域在内;所述支架本体垂直外径为1.2-1.8cm,横向外径为1.4-1.8cm,高度为2.0mm-8cm,所述支架本体的材料为胶原。
2.根据权利要求1所述的高仿真胶原脊髓支架,其特征在于:所述支架材料可配合细胞或神经生长因子进行神经修复。
3.根据权利要求2所述的高仿真胶原脊髓支架,其特征在于:所述细胞包括自体骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求2所述的高仿真胶原脊髓支架,其特征在于:所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、神经营养因子-3、脑源性生长因子、表皮细胞生长因子、类胰岛素生长因子、神经生长因子和血小板源性神经营养因子中的一种或几种。
5.根据权利要求2所述的高仿真胶原脊髓支架,其特征在于:所述细胞种植在支架材料表面的密度为1×105—1×108cell/ml。
6.根据权利要求1所述的高仿真胶原脊髓支架,其特征在于:所述胶原材料的制备方法包括以下步骤:
(1)将富含胶原蛋白的牛腱或幼猪皮动物组织去除筋膜、脂肪、肌肉和血管等组织,反复清洗后用pH8.0-12的NaOH溶液浸泡脱脂;
(2)将脱脂后材料溶解于pH5.0-6.5的乙酸溶液,搅拌混匀后按质量比混合物:复合蛋白酶=500-1000:1加入复合蛋白酶,反复搅拌24h,得到混合溶解液;
(3)取上述混合溶解液100g离心10min后收集上清液,加入Nacl搅拌,收集沉淀物,再次加入乙酸搅拌均匀,重复步骤(3)操作3-4次后将沉淀物溶解于0.01-0.1mmol/L乙酸溶液中,获得1-3%胶原溶液。
7.根据权利要求2所述的高仿真胶原脊髓支架,其特征在于:所述细胞或神经生长因子采用缓释技术与胶原材料混合,或通过直接的局部注射方式与胶原材料混合。
8.一种制备如权利要求1-7任一项所述的高仿真胶原脊髓支架的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)根据人天然神经电生理解剖结构及人胸腰段水平脊髓结构,设计三维仿真移植支架3D打印Solidwork模型;
(2)将制备好的混有细胞或神经生长因子的胶原材料置于三维打印机储存器中,将设置编程的Solidwork模型导入打印机;
(3)设置打印机参数,打印机针头直径为60—100μm,打印速度5-10mm/秒,打印间隙为50μm—100μm,温度设置为-20℃—5℃,打印范围在5cm×5cm之间。
(4)按照设置程序快速打印人脊髓支架。
9.根据权利要求8所述的制备高仿真胶原脊髓支架的方法,其特征在于:所述步骤(2)所述的胶原材料为混有细胞或神经生长因子的胶原材料。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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