CN105031728A - 一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料,所述胶原丝素蛋白材料由如下质量份数的组份制备而成:胶原蛋白40-80;丝素蛋白6-45;甘油0.5-6;相容剂0.1-5。本发明采用的材料均匀,良好的生物相容性和力学性能,同时为生物降解可控性材料,在生物体内不同组织可降解为人体可吸收的无毒无害物质,通过控制其成分质量比,控制其体内的降解时间,促进组织再生。
Description
技术领域
本发明涉及一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料及其制备方法和应用。
背景技术
生物材料是组织工程技术的重要组成部分,而体内具有可控性生物可降解材料是未来组织工程材料的发展趋势。低温快速成型技术近年来逐渐成熟的技术,该技术可以在保持材料生物活性的基础上,根据所设计或物体的空间三维参数,在计算机控制程序、特殊软件、精密电机等控制下,迅速打印出具有立体空间结构的物体或活性生物材料。结合低温快速成型技术优势和生物材料特性,开拓其在生物医学领域的应用,将有助于组织工程技术的突破和发展。
胶原是细胞外基质(ECM)中含量最高的组成蛋白,参与很多细胞功能的表达。已有研究证实,胶原能被分布在细胞表面的整合素识别并结合,孔隙联通的多孔胶原海绵支架可以诱导血管的新生。以胶原为支架材料植入脊髓损伤部位,神经细胞能够存活生长,并能促进轴突生长。近来研究表明,将肝素或血管内皮细胞生长因子(VEGF)结合于胶原海绵上,比单纯应用胶原海绵能更有效的促进血管的新生。GerburgKeilhoff等对I/III型胶原复合导管的生物相容性进行了研究,结果表明术后5-7天导管与宿主得到很好的结合。胶原凝胶、功能化胶原凝胶均具有良好的细胞相容性,神经生长因子活化的胶原能促进大鼠脊髓神经功能的恢复。但是,单一的胶原构建三维多孔网状结构的能力较差,结构不稳定,生物机械性能差及体内降解速度较快等缺点。要克服胶原蛋白在组织修复过程中的缺点,除了对胶原蛋白本身进行改性及加工,同时需寻找性质互补的天然高分子材料。
丝素蛋白是一种含有人体必需氨基酸的天然蛋白质,具有良好的生物相容性和力学性能,降解缓慢。在胶原内加入少量丝素蛋白,可改善其在干态下的机械物理性能,在提高膜的力学性能同时改善膜的抗水性能,降低其热水溶失率,且对成纤维细胞、皮肤表皮细胞的黏附性好。从生物降解方面来看,丝素蛋白缓慢的降解速度可以为细胞提供长久的支持,以匹配组织细胞的生长速度。而且经过不同处理可以得到不同的形态和孔隙要求。Shen等研究了丝素蛋白纳米纤维对嗅鞘细胞生长及迁移引导作用,结果表明丝素蛋白纳米纤维与嗅鞘细胞具有良好的生物相容性,对嗅鞘细胞生长迁移起重要的支持引导作用,同时对细胞神经营养因子基因和蛋白的表达没有任何不良影响。丝素蛋白材料用于各种组织的研究已比较深入。因此,胶原/丝素蛋白复合材料既解决了单纯胶原或丝素蛋白材料本身的不足,同时有助于材料互相之间功能的互补,同时,结合低温快速成型技术,达到材料功能与结构的完美统一,有望成为理想组织工程支架材料。
发明内容
本发明克服现有技术的不足,提供了一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料,该材料可在低温快速成型三维打印技术中应用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料,所述胶原丝素蛋白材料由如下质量份数的组份制备而成:
优选的,所述胶原丝素蛋白材料如下质量份数的组份制备而成:
进一步,所述相容剂为马来酸酐。
本发明还提供了一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料的制备方法,其特征在于:分别配置1-3%胶原蛋白溶液和0.5-20%丝素蛋白溶液,静置24-48h后,按照丝素蛋白和胶原蛋白质量比为6-45:40-80均匀混合,加入甘油和相容剂,低温及冷冻干燥后,制备获得胶原/丝素蛋白材料。
进一步,所述低温干燥的温度不高于-5℃。
其中,所述胶原蛋白溶液的制备方法包括如下步骤:
(a)将富含胶原蛋白的动物组织去除血管、肌肉和表皮等杂质,清洗干净后用弱碱溶液脱脂;优选的,弱碱溶液为pH8.0-12的NaOH;
(b)脱脂后溶解于稀酸溶液,优选的,稀酸溶液为pH5.0-6.5的乙酸或盐酸;搅拌混匀后加入复合蛋白酶,胶原蛋白与复合蛋白酶质量比为500-1000:1,继续搅拌过夜;
(c)离心,收集上清液,加入NaCl,搅拌,收集沉淀物,加入乙酸,重复步骤(c)操作3-4次后后,得到的沉淀物为胶原蛋白,将胶原蛋白溶解于0.01-0.1%乙酸溶液中,获得1-3%的胶原蛋白溶液。
进一步,所述丝素蛋白溶液的制备方法包括如下步骤:
(d)取蚕丝,加入0.5—1%的Na2CO3稀碱溶液中,高温清煮30-60min,蒸馏水反复清洗;重复清煮及清洗2-3次,真空干燥完成脱胶;
(e)将脱胶后成分以质量比1:10比例置于LiBr溶液中,50-60℃水浴箱保温直至溶解;
(f)溶解液置于透析袋中用蒸馏水匀速透析,得到丝素蛋白溶液,所述丝素蛋白溶液的浓度为0.5-20%,5℃储存,使用时60Co照射灭菌。
另外,本发明的目的还在于提供一种低温快速成型三维打印胶原/丝素蛋白材料的应用,其特征在于:胶原/丝素蛋白材料作为生物支架材料使用时,细胞或生长因子可贴服或融合与胶原/丝素蛋白材料的内外表面;优选的,所述细胞为神经干细胞、少突胶质细胞、神经元或星形胶质细胞。
同时,本发明提供一种低温快速成型三维打印胶原/丝素蛋白材料的打印方法,其特征在于:将胶原/丝素蛋白材料的溶液置于生物打印机材料储存器中,生物打印机针头直径为60—400μm,针头数量为6—16个,针头到基底打印层为100—300μm,打印速度2-10mm/秒,打印间隙为100μm—400μm,温度设置为-30℃—5℃,打印。
本发明的胶原/丝素蛋白材料可用于生物体组织修复及体外组织工程研究。尤其是应用于脊髓损伤、外周神经损伤及颅脑损伤领域。
本发明采用的生物学性能和力学性能良好的胶原/丝素蛋白材料,其分别具有如下材料性能:(1)丝素蛋白,在干态下具有良好的机械物理性能和抗水性能,对成纤维细胞、皮肤表皮细胞的黏附性好,丝素蛋白缓慢的降解速度可以为细胞提供长久的支持,以匹配组织细胞的生长速度。(2)胶原蛋白,是细胞外最重要的纤维蛋白,参与很多细胞功能的表达。胶原蛋白具有良好的细胞相容性,可促进细胞生长。但是,单一的胶原构建三维多孔网状结构的能力较差,结构不稳定,生物机械性能差及体内降解速度较快等缺点。
与现有技术比较,本发明的有益效果是:(1)本发明采用胶原/丝素蛋白材料具有材料均匀,良好的生物相容性和力学性能,可用于中枢神经损伤、外周神经损伤、血管、骨组织和其它领域的治疗和研究。(2)本发明采用的低温快速成型技术在低温情况下迅速使得胶原/丝素蛋白材料快速凝固,结构稳定,性质良好。(3)本发明所用胶原/丝素蛋白材料为生物降解可控性材料,在生物体内不同组织可降解为人体可吸收的无毒无害物质,通过控制其成分质量比,控制其体内的降解时间,促进组织再生。(4)本发明的胶原/丝素蛋白材料结合低温快速成型技术其总体具有很高的技术质量,且应用范围广,具有较高的市场前景。
具体实施方式
实施例1胶原/丝素蛋白材料的制备
(1)胶原蛋白溶液的制备
以嫩猪皮或牛腱作为胶原生物材料,清洗干净后用pH8.0-12的NaOH溶液脱脂,脱脂后溶解于pH5.0-6.5的乙酸溶液,搅拌混匀后加入复合蛋白酶,胶原蛋白与复合蛋白酶质量比为500-1000:1,继续搅拌过夜;
离心,收集上清液,加入NaCl,搅拌,收集沉淀物,加入乙酸,重复操重复离心,收集上清液,加入NaCl,搅拌,收集沉淀物,加入乙酸的步骤3次后,得到的沉淀物为胶原蛋白,将胶原蛋白溶解于0.01-0.1%乙酸溶液中,获得1-3%的胶原蛋白溶液。
(2)丝素蛋白溶液的制备
取蚕丝,将蚕丝原材料放入80-120℃的Na2CO3的溶液中,高温清煮30-60min,蒸馏水反复清洗;重复清煮及清洗2-3次,真空干燥完成脱胶;将脱胶后成分以质量比1:10比例置于LiBr溶液中,50-60℃水浴箱保温直至溶解,溶解液置于透析袋中用蒸馏水匀速透析,得到丝素蛋白溶液,浓度为0.5-20%,5℃储存,使用时60Co照射灭菌
(3)胶原/丝素蛋白材料的制备
将上述两溶液静置24-48h后,加胶原和丝素蛋白混合溶液以1:1或1:2或1:3或1:4浓度进行配比,同时加入甘油和马来酸酐,进行透析及超滤,最后浓缩成材料溶液。
实施例2胶原/丝素蛋白支架材料的打印
(1)将实施例1得到的生物材料的溶液置于打印机材料储存器中;生物打印机针头直径为60—400μm,针头数量为6—16个,针头到基底打印层为100—300μm,打印速度2-10mm/秒,打印间隙为100μm—400μm,温度设置为-30℃—5℃。
(2)将打印的支架材料60Co灭菌消毒,置入含有106—108/ml神经干细胞的培养液中,培养8—14天。
(3)制备大鼠颅脑损伤模型,将制备的含有细胞的支架材料置入损伤部位,形成局部细胞定向分化,分布均匀可替代生物支架材料。
实施例3胶原/丝素蛋白材料的制备
(1)胶原蛋白溶液的制备
以嫩猪皮或牛腱作为胶原生物材料,清洗干净后用pH8.0-12的NaOH溶液脱脂,脱脂后溶解于pH5.0-6.5的乙酸溶液,搅拌混匀后加入复合蛋白酶,胶原蛋白与复合蛋白酶质量比为500-1000:1,继续搅拌过夜;
离心,收集上清液,加入NaCl,搅拌,收集沉淀物,加入乙酸,离心,收集上清液,加入NaCl,搅拌,收集沉淀物,加入乙酸,重复操重复离心,收集上清液,加入NaCl,搅拌,收集沉淀物,加入乙酸的步骤4次后,得到的沉淀物为胶原蛋白,将胶原蛋白溶解于0.01-0.1%乙酸溶液中,获得1-3%的胶原蛋白溶液。
(2)丝素蛋白溶液的制备
取蚕丝,将蚕丝原材料放入80-120℃的Na2CO3的溶液中,高温清煮30-60min,蒸馏水反复清洗;重复清煮及清洗2-3次,真空干燥完成脱胶;将脱胶后成分以质量比1:10比例置于LiBr溶液中,50-60℃水浴箱保温直至溶解,溶解液置于透析袋中用蒸馏水匀速透析,得到丝素蛋白溶液,浓度为0.5-20%,5℃储存,使用时60Co照射灭菌
(3)胶原/丝素蛋白材料的制备
将上述两溶液静置24-48h后,加胶原和丝素蛋白混合溶液以1:1或1:2或1:3或1:4浓度进行配比,同时加入甘油和马来酸酐,进行透析及超滤,最后浓缩成材料溶液。
实施例4胶原/丝素蛋白支架材料的打印
(1)将实施例3得到的生物材料的溶液置于打印机材料储存器中;生物打印机针头直径为60—400μm,针头数量为6—16个,针头到基底打印层为100—300μm,打印速度2-10mm/秒,打印间隙为100μm—400μm,温度设置为-30℃—5℃。
(2)根据大鼠脊髓神经解剖结构及测量数据进行比较分析,了解脊髓皮质脊髓束、脊髓丘脑束、薄束和楔束的直径及走行,设计并优化脊髓微导管支架3D模型,进行有限元分析;将脊髓微导管3D模型导入3D生物打印机电脑中,进行格式转换、数据模拟及参数优化,直径在2.5-2.8mm,横径在2.2-2.5mm;
(3)按照常规技术制备含有神经干细胞的溶液,加B27、bFGF无血清培养基及神经元特定培养基,加NT-3和BDNF生长因子;将打印的脊髓微导管60Co灭菌消毒,置入含有108/ml细胞的培养液中,培养4—12天。
制备精确大鼠胸10水平脊髓损伤模型,将制备的含有细胞的已成熟脊髓微导管置入脊髓损伤处,形成局部对合良好,力学性能稳定,分布均匀、生物可降解的脊髓导管支架材料。
实施例5胶原/丝素蛋白支架材料的打印
(1)将实施例3得到的生物材料的溶液置于打印机材料储存器中;生物打印机针头直径为60—400μm,针头数量为6—16个,针头到基底打印层为100—300μm,打印速度2-10mm/秒,打印间隙为100μm—400μm,温度设置为-30℃—5℃。
(2)根据大鼠坐骨神经解剖结构及测量数据进行测量分析,优化神经导管支架3D模型,进行有限元分析;将神经导管3D模型导入3D生物打印机电脑中,进行格式转换、数据模拟及参数优化,直径在1.8-3.2mm。
(3)按照常规技术制备含有神经干细胞的溶液,加B27、bFGF无血清培养基及神经元特定培养基,加NT-3和BDNF生长因子;将打印的神经导管60Co灭菌消毒,置入含有108/ml细胞的培养液中,培养4—12天。
(4)制备大鼠单侧坐骨神经损伤模型,将制备的含有细胞的神经导管置入脊髓损伤处,形成局部对合良好,力学性能稳定,生物可降解的神经导管。
实施例6胶原/丝素蛋白支架材料的打印
(1)将实施例3得到的生物材料的溶液置于打印机材料储存器中;生物打印机针头直径为60—400μm,针头数量为6—16个,针头到基底打印层为100—300μm,打印速度2-10mm/秒,打印间隙为100μm—400μm,温度设置为-30℃—5℃。
(2)根据大鼠坐骨神经解剖结构及测量数据进行测量分析,优化神经导管支架3D模型,进行有限元分析;将神经导管3D模型导入3D生物打印机电脑中,进行格式转换、数据模拟及参数优化,直径在1.8-3.2mm;
(3)按照常规技术制备含有脂肪干细胞的溶液,加B27、bFGF无血清培养基及神经元特定培养基,加NT-3和BDNF生长因子;将打印的神经导管60Co灭菌消毒,置入含有108/ml细胞的培养液中,培养4—12天。
(4)制备大鼠单侧坐骨神经损伤模型,将制备的含有施万细胞的神经导管置入脊髓损伤处,形成局部对合良好,具有神经传导性能的神经导管。
以上对本发明的较佳实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的较佳实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等,均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料,其特征在于:所述胶原/丝素蛋白材料由如下质量份数的组份制备而成:
2.根据权利要求1所述的胶原丝素蛋白材料,其特征在于:所述胶原/丝素蛋白材料如下质量份数的组份制备而成:
3.一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料的制备方法,其特征在于:分别配置1-3%胶原蛋白溶液和0.5-20%丝素蛋白溶液,静置24-48h后,按照丝素蛋白和胶原蛋白质量比为6-45:40-80均匀混合,加入甘油和相容剂,低温及冷冻干燥后,制备获得胶原/丝素蛋白材料。
4.根据权利要求3所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法,其特征在于:所述低温干燥的温度不高于-5℃。
5.根据权利要求3所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法,其特征在于:所述胶原蛋白溶液的制备方法包括如下步骤:
(a)将富含胶原蛋白的动物组织去除血管、肌肉和表皮等杂质,清洗干净后用弱碱溶液脱脂;
(b)脱脂后溶解于稀酸溶液,搅拌混匀后加入复合蛋白酶,胶原蛋白与复合蛋白酶质量比为500-1000:1,继续搅拌过夜;
(c)离心,收集上清液,加入NaCl,搅拌,收集沉淀物,加入乙酸,重复步骤(c)操作3-4次后,得到的沉淀物为胶原蛋白,将胶原蛋白溶解于0.01-0.1%乙酸溶液中,获得1-3%的胶原蛋白溶液。
6.根据权利要求5所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法,其特征在于:所述步骤(a)中的弱碱溶液为pH8.0-12的NaOH。
7.根据权利要求5所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法,其特征在于:所述步骤(b)中的稀酸溶液为pH5.0-6.5的乙酸或盐酸。
8.根据权利要求3所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法,其特征在于:所述丝素蛋白溶液的制备方法包括如下步骤:
(d)取蚕丝,加入0.5-1%的Na2CO3稀碱溶液中,高温清煮30-60min,蒸馏水反复清洗;重复清煮及清洗2-3次,真空干燥完成脱胶;
(e)将脱胶后成分以质量比1:10比例置于LiBr溶液中,50-60℃水浴箱保温直至溶解;
(f)溶解液置于透析袋中用蒸馏水匀速透析,得到丝素蛋白溶液,所述丝素蛋白溶液的浓度为0.5-20%,5℃储存,使用时60Co照射灭菌。
9.一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料的应用,其特征在于:胶原/丝素蛋白材料作为生物支架材料使用时,细胞或生长因子可贴服或融合与胶原/丝素蛋白材料的内外表面;优选的,所述细胞为神经干细胞、少突胶质细胞、神经元或星形胶质细胞。
10.一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料的打印方法,其特征在于:将胶原/丝素蛋白材料的溶液置于生物打印机材料储存器中,生物打印机针头直径为60—400μm,针头数量为6—16个,针头到基底打印层为100—300μm,打印速度2-10mm/秒,打印间隙为100μm—400μm,温度设置为-30℃—5℃,打印。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |