CN110665059B

CN110665059B - 一种组织工程化神经移植体及其制备方法

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Publication number: CN110665059B
Application number: CN201910988238.2A
Authority: CN
Inventors: 张锋; 胡雅楠; 张焕相; 范志海; 秦建忠; 金志高; 沈影超; 杨敏; 何其圣
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2039-10-17
Also published as: CN110665059A

Abstract

本发明提供了组织工程化神经移植体的制备方法，包括以下步骤：构建三维丝蛋白纤维多孔支架；在支架上接种成纤维细胞、并进行培养扩增细胞；加入小分子化合物组合CFLSSVY诱导成纤维细胞分化为神经元，并形成神经元网络。本发明所述制备方法简单高效，且所用丝蛋白材料来源广、成体细胞来源方便，易于标准化制备。本发明提供的是一种真正意义上的仿生组织工程化神经移植体，其不仅含有有利于细胞与组织生长的通透丝蛋白纤维支架，还含有种子细胞神经元形成的神经元网络，是外周与中枢神经损伤修复的理想移植体，具有广泛的应用前景与价值。

Description

一种组织工程化神经移植体及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程的神经损伤移植领域，具体涉及一种组织工程化神经移植体，用于修复长距离外周神经缺损及中枢神经损伤。

背景技术

由于疾病和事故导致的器官或组织损伤和功能缺失的病人每年都有数百万之多，仅美国每年需要800多万次手术对这类病人进行救治，其经济花费在4000亿美元以上。随着现代医学和外科手术技术的发展，通过组织或器官移植来修复功能损失已经被广泛接受，然而却面临着巨大的供体缺口。通过再生医学手段体在体内或体外形成组织或器官为受损功能的修复提供了新的治疗方案。其中，组织工程化移植体的构建成为该治疗方法的关键之一。

神经组织是由神经元（即神经细胞）和神经胶质所组成。神经元是神经组织中的主要成份，具有接受刺激和传导兴奋的功能，也是神经活动的基本功能单位。人体神经组织主要由神经细胞构成。神经细胞也叫神经元，包括细胞体和突起两部分。一般每个神经元都有一条长而分支少的轴突，几条短而呈树状分支的树突。神经元的突起也叫神经纤维。神经纤维末端的细小分支叫神经末梢，分布到所支配的组织。神经元受刺激后能产生兴奋，并能沿神经纤维传导兴奋。

神经元胞体或近胞体处严重损伤时，可导致神经细胞解体死亡。外周神经系统损伤部位的近侧断端，残留的施万细胞分裂增生，向远瑞形成细胞索。受伤的近端轴突以出芽的方式生长。伸入新生的施万细胞索内，在施万细胞的诱导下，轴突沿细胞索生长直至伸到原来轴突终末所在部位，新生轴突终末可分支与相应细胞组织建立联系，恢复了功能，此过程称为神经再生。一般神经轴突都有再生能力，可恢复原来的功能，所需时间一般约3～6个月。若外周神经损伤严重，两断端相距甚远，与远端未能良好互相对接，将严重影响神经再生。中枢神经系统损伤后神经细胞受损、缺失或死亡，常使神经功能严重受损而导致偏瘫、失语、智力障碍或昏迷，甚至死亡。

神经损伤不可避免造成神经元死亡及其轴突断裂，进而导致神经支配功能的丧失，支持和引导损伤轴突的再生是SCI修复的关键。通过组织工程技术，将神经元与支架材料结合，并预构神经元网络，由此得到真正意义上的组织工程神经移植体，并有望用于长距离外周神经缺损及中枢神经损伤的治疗。然而，该技术亟待解决的技术难题是神经元细胞获取困难，缺少生物相容性好切三维通的理想透支架。

发明内容

要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种组织工程化神经移植体，用于修复长距离外周神经缺损及中枢神经损伤。

技术方案：一种组织工程化神经移植体的制备方法包括如下步骤：

1）丝蛋白微纳米纤维多孔支架的构建：蚕丝脱胶后，均匀分散于有机溶剂中，再经反复冻融，水洗后得到三维丝蛋白微纳米纤维多孔支架；

2）成纤维细胞的接种培养：提取成体成纤维细胞，并将其接种于含有步骤1)制备的丝蛋白微纳米纤维多孔支架的培养基上，进行培养扩增成纤维细胞；

3）成纤维细胞的诱导分化：在步骤2）培养基中添加小分子化合物组合CFLSSVY，经诱导后得到组织工程化神经移植物。

优选的，所述步骤1）的蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝、天蚕丝或木薯蚕丝中的任一一种或几种的混合物。

优选的，所述步骤1）的丝蛋白微纳米纤维多孔支架的纤维直径在十纳米到十微米之间。

优选的，所述步骤1）的丝蛋白微纳米纤维多孔支架中含有活性物质视黄酸。

优选的，所述步骤2）的成纤维细胞为皮肤成纤维细胞。

优选的，所述步骤3）的小分子化合物组合CFLSSVY为：CHIR99021，Forskolin，LDN193189，SB431542，SP600125，VPA和Y27632的组合物。

优选的，所述各小分子化合物的浓度分别为：CHIR99021为3 μM，Forskolin为50 μM，LDN193189为0.1 μM，SB431542为2 μM，SP600125为10 μM，VPA为0.5 mM和Y27632为5 μM。

上述任意一种制备方法制备的组织工程神经移植体。

优选的，所述神经移植体由成纤维细胞转分化神经元与三维丝蛋白纤维支架组成，且神经元的神经突起相互连接形成神经网络。

上述的组织工程神经移植体在神经损伤领域的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明中的神经移植体具有以下优点：

1、神经移植体为丝蛋白支架及在支架上形成的神经元网络，神经移植体中的丝蛋白支架具有三维微纳米纤维结构特征，该结构赋予材料立体通透性，有利于细胞在支架内的有效迁移与突触连接的建立，神经移植体具有生物活性与信号传递能力，从而可以与神经缺损两段进行整合促进神经再生与功能恢复；

2、通过丝蛋白支架为支架材料，成纤维细胞诱导时间短，成纤维细胞转分化为神经元的转化效率高，高达92%；

2、种子细胞为成纤维细胞，成纤维细胞广泛存在于各组织器官中，具有来源方便、创伤小、易培养扩增；

3、神经元由成纤维细胞转分化而来，应用的是小分子化合物作为诱导剂，避免了应用载体携带外源基因进行细胞转染存在基因整合突变的安全隐患，该方法具有操作简单、易于标准化的优点。

附图说明：

图1为本发明制备组织工程化神经移植体的流程示意图；

图2三维丝蛋白纤维支架的扫描电镜图片，其中，（a）为丝蛋白支架的低倍SEM图片和（b）为丝蛋白支架的高倍SEM图片；

图3生长在丝蛋白纤维支架上的成纤维细胞的鬼笔环肽与核染色共聚焦图片，其中，（a）为鬼笔环肽染色图片，（b）为核染色图片，（c）为鬼笔环肽与核染色图片；

图4生长在丝蛋白纤维支架上的成纤维细胞的扫描电镜图片，其中，（a）单个成纤维细胞长在材料上，（b）大量成纤维细胞长在材料上；

图5生长在丝蛋白纤维支架上的成纤维细胞经小分子化合物转分为神经元的Tubb3与核免疫组化染色共聚焦图片，其中，（a）为Tubb3免疫染色图，（b）为核免疫组化染色图，（c）Tubb3与核免疫组化染色图；

图6生长在丝蛋白纤维支架上的成纤维细胞经小分子化合物转分为神经元的扫描电镜图片；

图7组织工程化神经移植体大鼠脊髓缺损植入实验示意图；

图8 组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后不同时间点的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评分结果，表面移植体植入后后肢运动功能恢复明显增加，其中，Sham为正常神经，SCI为神经损伤不处理组，3D-SF为单纯丝蛋白组,3D-SF-CiNs为组织工程化神经移植体；

图9组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后大鼠腿部运动的连续照片；

图10组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后皮层运动诱发电位的电生理检测；

图11组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后的潜伏期更短而电压幅值更大，其中，Sham为正常神经，SCI为神经损伤不处理组，3D-SF为单纯丝蛋白组,3D-SF-CiNs为组织工程化神经移植体；

图12组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后的HE染色切片，其中，SCI为神经损伤不处理组，3D-SF为单纯丝蛋白组,3D-SF-CiNs为组织工程化神经移植体；

图13组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后的空洞面积定量分析，其中，SCI为神经损伤不处理组，3D-SF为单纯丝蛋白组,3D-SF-CiNs为组织工程化神经移植体；

图14组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后纵向切面的NF-H和GFAP免疫组化染色；

图15组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后NF-H阳性神经纤维面积；

图16组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后GFAP阳性胶质区面积；

图17组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损8周后可见存活的诱导神经元，并表达NF-H，其中，神经损伤区域前端（a1，b1，c1，rostral），中段（a2，b2，c2， centre）和尾端（a3，b3，c3，caudal）；

图18 组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后MBP和NF-H免疫组化染色，表明移植后NF-H阳性轴突被髓鞘包裹。

具体实施方式

实施例1

制备组织工程化神经移植体

按照图1的示意图，首先构建丝蛋白支架，提取种子细胞成纤维细胞；然后将成纤维细胞接种于丝蛋白支架上，扩增培养；最后通过小分子化合物诱导支架内的成纤维细胞转分化为神经元，并建立神经元轴突间的联系，形成神经网络，由此得到组织工程化神经移植体。

1）丝蛋白微纳米纤维多孔支架的构建

蚕丝经0.05%（w/v）煮沸脱胶后，分散于含有0.1%氯化钙（w/v）的98%甲酸中（蚕丝：溶液比1：50），蚕丝分散液置于-20℃下冷冻24h，然后于75%乙醇中解冻处理1h，再用去离子水中充分洗涤，对得到的湿态丝蛋白支架进行冷冻干燥即得到三维丝蛋白微纳米纤维多孔支架，经辐照灭菌后用于生物实验。

如图2所示，经扫描电镜观察可见丝蛋白微纳米纤维多孔支架主要由微纳米级纤维组成，纤维直径在10nm-10μm之间，由于独特的微纳米纤维结构，该支架内部完全通透，避免了传统多孔支架孔壁的阻碍作用。

2）成纤维细胞制备

取新生大鼠一块皮肤，经胰酶消化，贴壁培养获取成纤维细胞，经2-3次传代后用于实验。

3）成纤维细胞接种于丝蛋白微纳米纤维多孔支架

裁取适当尺寸丝蛋白微纳米纤维多孔支架，将1×10⁵个细胞接种于支架上进行培养，待细胞长到需要数量时，进行转分化实验。

如图3和4所示，经共聚焦显微镜和扫描电镜观察可见，成纤维细胞成功在丝蛋白支架内进行黏附与增殖，细胞形态正常，显示为梭形。

4）成纤维细胞转分化为神经元

更换培养液为神经元培养基（DMEM，50 µM的维生素C，20 ng/ml的bFGF，0.5%的N₂，1%的B27），并加入小分子化合物组合CFLSSVY （CHIR99021为3 μM，Forskolin为50μM，LDN193189为0.1μM，SB431542为2μM，SP600125为10μM，VPA为0.5 mM，Y27632为5μM），诱导7天后，检测成纤维细胞转分化为神经元的情况。

如图5和6所示，经共聚焦显微镜和扫描电镜观察可见，小分子化合物诱导后，有高达92%的成纤维细胞转分化为神经元（Tubb3阳性），由其伸出的轴突相互连接，形成典型的神经网络结构。

实施例2

制备组织工程化神经移植体

按照图1的示意图，首先构建丝蛋白支架，提取种子细胞人皮肤成纤维细胞；然后将成纤维细胞接种于丝蛋白支架上，扩增培养；最后通过小分子化合物诱导支架内的成纤维细胞转分化为神经元，并建立神经元轴突间的联系，形成神经网络，由此得到组织工程化神经移植体。

1）丝蛋白微纳米纤维多孔支架的构建

蚕丝经0.05%（w/v）煮沸脱胶后，分散于含有0.1%氯化钙（w/v）的98%甲酸中（蚕丝：溶液比1：50），蚕丝分散液置于-20℃下冷冻24h，然后于75%乙醇中解冻处理1h，再用去离子水中充分洗涤，对得到的湿态丝蛋白支架进行冷冻干燥即得到三维丝蛋白微纳米纤维多孔支架，经辐照灭菌后用于生物学实验。

2）人皮肤成纤维细胞制备

取人正常皮肤组织，经胰酶消化，贴壁培养获取成纤维细胞，经2-3次传代后即可用于移植体构建。

3）人皮肤成纤维细胞接种于丝蛋白微纳米纤维多孔支架

裁取适当尺寸丝蛋白微纳米纤维多孔支架，将2×10⁵个细胞接种于支架上进行培养，待细胞长到需要数量时，进行转分化实验。

4）成纤维细胞转分化为神经元

更换培养液为神经元培养基（DMEM，50 µM的维生素C，20 ng/ml的bFGF，0.5%的N₂，1%的B27），并加入小分子化合物组合CFLSSVY （CHIR99021为3 μM，Forskolin为50μM，LDN193189为0.1μM，SB431542为2μM，SP600125为10μM，VPA为0.5 mM，Y27632为5μM），诱导7天后，在丝蛋白支架上形成神经元网络。成纤维细胞转分化为神经元的比例为56%。

实施例3

移植组织工程化神经移植体治疗脊髓损伤

1）脊髓横断模型的建立

构建大鼠脊髓横断模型，切除T10水平长度为2mm脊髓组织。

2）移植组织工程化神经移植体

在脊髓缺损处用组织工程化神经移植体填充，如图7所示。

3）行为学观察与评分

将动物放入以开口盆，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况。

如图8和9所示，由BBB评分可见，手术后1d所有老鼠均完全瘫痪，说明造模成功。支架植入治疗后，BBB评分逐渐升高，1周内各组间屋明显差异。2周开始，组织工程化神经移植体的BBB评分明显高于单纯材料植入组与无材料植入组。说明组织工程化神经移植体可以促进缺损中枢神经再生，促进脊髓损伤功能恢复；另外，图9中对老鼠下肢运动观察可见，脊髓损伤后，组织工程化神经移植体植入后，老鼠后肢具有一定的运动行为，表现为1-2个关节发生一定轻微运动。说明老鼠运动功能得到一定恢复。。

4）电生理分析

术后8周，通过BIOPAC MP150型16通道多导生理记录仪评估后肢脊髓的生理完整性和运动功能恢复情况。

如图10和11所示，3D-SF-CiNs，与SCI组、3D-SF组相比，潜伏期与电压幅值有显著差异，说明神经损伤恢复效果更好组织工程化神经移植体植入大鼠脊髓缺损后的潜伏期更短而电压幅值更大，表明脊髓损伤部位的神经传导功能得到明显改善。

5）HE染色观察

术后8周，行HE染色观察脊髓损伤部位的空洞情况。

如图12和13所示，HE染色结果表明，组织工程化神经移植体植入后，大鼠脊髓缺损部位的空洞面积显著降低，提示移植体对组织再生具有良好的支持作用，同时与切断的脊髓残端居于良好的融合度。

6）免疫组化染色

术后8周，行NF-H 和GFAP免疫组化染色，对再生轴突与胶质组织进行表征与分析。

如图14-18所示，组织工程化神经移植体植入后，大鼠脊髓缺损部位NF-H阳性神经纤维面积显著增大、GFAP阳性胶质面积明显降低，表明良好的神经轴突再生。此外，8周后仍可见存活的诱导神经元，并表达NF-H，表面诱导神经元在体内良好的生物相容性，免疫原性低。

Claims

1.一种组织工程化神经移植体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1）：丝蛋白微纳米纤维多孔支架的构建：蚕丝脱胶后，均匀分散于有机溶剂中，再经反复冻融，水洗后得到三维丝蛋白微纳米纤维多孔支架；

步骤2）：成纤维细胞的接种培养：提取成体成纤维细胞，并将其接种于含有步骤1)制备的丝蛋白微纳米纤维多孔支架的培养基上，进行培养扩增成纤维细胞；

步骤3）：成纤维细胞的诱导分化：在步骤2）培养基中添加小分子化合物组合CFLSSVY，经诱导后得到组织工程化神经移植物；

其中，小分子化合物组合CFLSSVY为：CHIR99021，Forskolin，LDN193189，SB431542，SP600125，VPA和Y27632的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）的蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝、天蚕丝或木薯蚕丝中的任一一种或几种的混合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）的丝蛋白微纳米纤维多孔支架的纤维直径在十纳米到十微米之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）的丝蛋白微纳米纤维多孔支架中含有活性物质视黄酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）的成纤维细胞为皮肤成纤维细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各小分子化合物的浓度分别为：CHIR99021为3 μM，Forskolin为50 μM，LDN193189为0.1 μM，SB431542为2 μM，SP600125为10 μM，VPA为0.5 mM和Y27632为5 μM。

7.根据权利要求1-6所述任意一种制备方法制备的组织工程神经移植体。

8.根据权利要求7所述的组织工程神经移植体，其特征在于：所述神经移植体由成纤维细胞转分化神经元与三维丝蛋白纤维支架组成，且神经元的神经突起相互连接形成神经网络。