CN106381285A - 一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基，包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为8CF，其中8为A‑83‑01、C为CHIR99021、F为毛喉素。本发明诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为神经细胞，所得神经细胞具有正常神经细胞特异性分子标签，并且具有正常神经细胞的功能，为再生医学的细胞来源问题提供一种新的途径。

Description

一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基及其应用。
背景技术
多细胞生物体绝大部分是由全能性的受精卵发育而来的。精卵结合形成的受精卵经历逐级谱系分化最终发育为成熟个体。其中，细胞的命运决定是成千上万的外源信号与内源因子协同作用的结果，这一过程复杂而难以操控。近些年生命科学飞速发展，其中最引人注目的成就之一便是人们通过外源途径来改变细胞的命运。通过过量表达谱系特异性调控因子，人们不仅能使成体细胞去分化为胚胎干细胞，还能实现不同世系成体细胞之间的转分化过程。
随着重编程技术的发展以及干细胞本身所具有的特性，使得人类有可能在体外培养某些干细胞，诱导其分化或定向转分化为具有重要功能的体细胞，以供临床所需；同时，再生医学则正是利用组织工程、干细胞移植和药物等临床手段，将功能无法自行恢复的病变组织、器官得到结构和功能的重建。干细胞在治疗神经和神经损伤举得一些疗效，但依然面临着细胞来源不足的问题，且异体移植又可能会导致免疫排斥的发生。目前，通过在体细胞中强制表达特定重编程因子，介导体细胞直接转分化为某些珍贵的或者不可再生的细胞，为解决上述细胞来源不足的问题提供了新的途径。
然而，外源基因过量表达的方法技术壁垒较高，表达载体可能插入基因组，导入系统安全性存在隐患，效率也有待提高。除了特异性基因的诱导手段，一些小分子化合物也被证实能够促进细胞重编程过程，且重编程过程中的所有转录因子都可以被小分子所替代。小分子化合物不仅具有渗透入细胞膜、易操控和成本低等优势，并且小分子能实现没有任何外源基因介入的体细胞重编程过程，这无疑为人们获得多能性干细胞提供了新的方法和思路。
发明内容
本发明提供了一种利用添加有小分子组合的诱导培养基诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的方法。
在系统分析了10多种小分子的不同组合对小鼠成纤维细胞基因表达和克隆形态影响的基础上，发现小鼠成纤维细胞可以同时转变为包括神经细胞、心肌细胞和脂肪细胞等各种体细胞类型。这种随机多向转分化的现象，称之为小分子组合诱导的多向转分化(induced multi-lineage trans-differentiation，iMT)。具有这种功能的小分子组合称为诱导小分子组合。
一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基，包含基础培养基和诱导小分子组合，诱导小分子组合为8CF，其中8为A-83-01、C为CHIR99021、F为毛喉素(Forskolin，FSK)。其中，A-83-01是TGF-β信号通路中ALK5位点的抑制剂；CHIR99021是GSK3抑制剂；毛喉素是腺苷酸环化酶的激活剂。
所述基础培养基可以为常用的细胞培养基，比如DMEM培养基添加5％～15％的胎牛血清。因为本发明使用的成纤维细胞直接取自小鼠，属于细胞的原代培养，细胞相对比较脆弱，所以还可以适当添加些谷氨酰胺、bFGF和β-巯基乙醇等促进细胞生长的营养物质，一般添加的浓度为谷氨酰胺1～3mM、bFGF 30～50ng/mL、β-巯基乙醇0.005～0.02mM。当然，为了防止细菌污染，在基础培养基中还可以添加一些抗生素，比如链霉素、青霉素等，一般添加浓度为链霉素50～200μg/mL和青霉素50～200U/mL。
优选的，所述诱导小分子组合中各组分的浓度为：
8 0.1～1μM
C 8～12μM
F 8～12μM。
最优选的，所述诱导小分子组合中各组分的浓度为：
8 0.5μM
C 10μM
F 10μM。
诱导小分子组合中各组分的浓度是在参考了各种文献报道的基础上，再经实验验证得到的，浓度过低或过高都会造成诱导转分化的效果变差。
本发明又提供了一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的方法，使用所述的诱导培养基对成纤维细胞进行培养。
优选的，所述的成纤维细胞来源于小鼠。所述的成纤维细胞来源于10.5～14.5天的小鼠胚胎。或者，所述的成纤维细胞来源于小鼠尾尖。
优选的，所述成纤维细胞培养的第2天起开始使用所述的诱导培养基进行培养，每4天更换一次培养基。然后统计克隆数，观察细胞形态，并提取总RNA进行RT-qPCR，检测相关基因的表达情况，从而初步确定诱导转分化成功，然后将转分化所得的神经细胞进行电生理和流式细胞术等检测。
本发明还提供了利用所述方法获得的神经细胞。
本发明还提供了所述的神经细胞在药物筛选中的应用。如用于治疗神经方面疾病的药物筛选。
本发明诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为神经细胞，所得神经细胞具有正常神经细胞特异性分子标签，并且具有正常神经细胞的功能，为再生医学的细胞来源问题提供一种新的途径。
附图说明
图1为诱导小分子组合功能性筛选流程图；
图2为不同小分子组合产生克隆个数与上调基因的散点图；
图3为实施例2中不同iMT类型细胞的验证结果图；其中神经细胞(a-Actinin)、肝细胞(AFP)、脂肪细胞(Cebpa)、表皮细胞(E-cadherin)、神经细胞(Tuj 1、GFAP)、平滑肌细胞(SMA)的免疫荧光染色，内脏层器官细胞的PAS染色和脂肪细胞的油红染色，
图4为实例3中6TCF小分子组合处理TTF的免疫荧光图；其中图A为6TCF组合处理后抗a-Actinin的免疫荧光图和对应的细胞核图片；图B为6TCF组合处理后抗Tuj1的免疫荧光图和对应的细胞核图片；
图5为实施例4中诱导所得神经细胞的检测结果图；其中，图A为诱导所得细胞的明场图；B为诱导所得细胞的荧光图；C为诱导前成纤维细胞的流式检测图；D为诱导后细胞的流式检测图；
图6为实施例5中所得神经细胞的验证结果图；其中，A为电生理实验示意图；图B为利用电压钳检测神经细胞的Na+与K+电流结果图；
图7为实施例5所得神经细胞相关特异性基因转录水平检测结果图，其中图A和图B分别为不同基因的mRNA水平检测结果；
图8为实施例5所得神经细胞免疫荧光结果图。
具体实施方式
基础培养基：DMEM、15％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、40ng/mL bFGF、0.01mMβ-巯基乙醇、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。
诱导培养基为在基础培养基的基础上添加0.5μM A-83-01、10μM CHIR99021和10μM毛喉素。
实施例1
(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的制备步骤如下：
1)培养器皿的预处理：以0.2％明胶覆盖培养皿的底壁，室温下放置30min后，将0.2％明胶吸出，室温下备用。
2)给孕13.5天的小鼠(野生型小鼠或携带GFAP-GFP报告系统的转基因小鼠)注射约0.5mL阿佛丁麻醉后，实施断颈法处死小鼠，将其浸入75％酒精中消毒5分钟。
3)用75％乙醇擦拭腹部，剪开皮肤并把皮肤向后拉，暴露出腹壁。剪开腹壁以暴露出子宫。将子宫移到100mm的皿里，用10mL PBS洗三遍。
4)用剪刀剪开胚囊，并将胚胎移到培养皿中。
5)小心去除胚胎的头和内脏，将胚胎躯干部分转移到青霉素小瓶中，用2mL PBS洗三遍。
6)用眼科剪将组织剪碎，加入2mL的0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA，将悬液移入50mL离心管中，并在37℃孵育大约20min，每隔5min振荡几下。
7)充分吹打后加入10mL培养基终止消化，静置5min后，将上层约8mL的细胞悬液移入培养皿中，置37℃，5％CO2培养6h后，换液。
8)细胞约90％汇合时传代。
(2)小鼠尾尖成纤维细胞(tail-tip fibroblasts，TTFs)的制备步骤如下：
1)将6周龄的B6/C57小鼠实施断颈法处死小鼠后，浸入75％酒精中消毒5分钟。无菌剪取小鼠尾尖约4cm的组织；
2)去除皮肤后，先用PBS洗3遍，除去血液和脂肪组织；再用眼科剪把鼠尾剪成适当大小分装至盛有2滴血清的1.5mL离心管中，再充分剪碎组织块，加入500μL的血清进行涂板；用组织块贴壁培养法倒置培养6-8h，期间注意添加血清，防止血清干涸；6-8小时后，添加5mL培养基，待到24h后，将培养基添加至8mL；
3)在小鼠胚胎成纤维培养基中培养7天，期间每3天换一次液，并将培养基加至10mL；待细胞爬出至适当密度时，进行传代或冻存处理。
实施例2
为了探索小分子在改变细胞命运上的潜在作用，对已被证明对重编程有影响的10余种小分子化合物和其组合进行了系统的分析和筛选，他们包括
HDAC抑制剂：NaB(N)、VPA(V)、TSA(A)；
DNMT抑制剂：RG108(R)、5-AZA(5)；
G9a抑制剂：BIX-01294(B)；
Ezh2抑制剂：DZNep(D)、GSK126(G)；
LSD1抑制剂：苯环丙胺(T)；
AC抑制剂：Forskolin(F)；
GSK3抑制剂：CHIR99021(C)；
MEK抑制剂：PD032590(P)；
ALK5抑制剂：A-83-01(8)、E616452(6)、SB431542(S)。
各小分子化合物使用浓度如表1所示。
表1
实验流程如图1所示，将1000个实施例1制备的MEFs细胞(来自野生型小鼠)接种于96孔板上，从第二天开始培养基中添加不同的小分子组合，然后每四天换液，第16天检测，通过统计克隆的形成个数和qPCR分析，确定不同小分子组合的筛选效果。如表2所示，不同小分子组合获得的特定类型的克隆个数有所不同，其中，对照为未添加小分子，此时没有克隆形成。如图2所示，小分子组合6TCF和SGCF对MEFs相关基因上调数量较多，且转分化后的克隆数量最多，但所得的转分化后的克隆并不是单一的一种细胞类型，而是包括神经细胞、心肌细胞和脂肪细胞等各种体细胞类型(图3)。
表2不同小分子组合下克隆形成数量(单位：个)。
表皮样克隆 圆形克隆 神经样克隆 心肌样克隆 脂肪样克隆 黑色克隆 克隆总数
对照 0 0 0 0 0 0 0
A 0 0 0 0 0 0 0
C 0 0 0 0 0 0 0
CF 0 0 0 0 0 0 0
F 0 0 0 0 0 0 0
SGC 1 0 1 0 0 0 2
G 0 0 0 0 5 0 5
6VCF 1 0 4 0 1 0 6
6 1 0 0 0 7 0 8
8CF 1 1 8 0 0 0 10
T 5 0 0 0 8 0 13
SCF 1 5 1 8 0 0 15
8 0 0 0 0 20 0 20
S 0 0 0 0 20 0 20
SGF 0 0 0 5 15 0 20
TCF 1 0 2 0 20 0 23
SGCF 8 7 18 7 4 1 45
6TC 1 1 8 0 30 0 40
V6TC 1 1 10 0 30 0 42
SG 0 0 0 0 50 0 50
V6TCF 4 6 24 4 16 0 54
6TF 5 0 0 0 50 0 55
V6CF 8 4 15 6 22 0 55
6TCF 18 8 18 8 16 0 68
实施例3
将20000个实施例1制备的TTFs细胞接种于细胞培养的6孔板上，从第二天开始在培养基中添加不同的小分子组合，然后每四天换液，第16天检测，通过统计克隆的形成个数和qPCR分析，确定不同小分子组合的筛选效果。如图4所示，小分子组合6TCF处理TTFs，也能获取a-Actinin阳性的类心肌细胞和Tuj 1阳性的类神经细胞。
实施例4
GFAP蛋白为神经细胞形成初期的一个特异性标志物，通过检测GFAP蛋白的出现，可以判断成纤维细胞是否被诱导转分化为神经细胞。
将20000个实施列1制备的MEFs细胞(来自携带GFAP-GFP报告系统的转基因小鼠)接种于细胞培养的6孔板中，从第二天开始使用诱导培养基进行培养(对照组仍使用基础培养基进行培养)，然后每四天换液，第16天检测，确定8CF小分子组合的处理效果。
结果如图5所示，经诱导培养基诱导后的细胞在荧光显微镜下有发绿色荧光的克隆，说明有GFAP-GFP表达，利用流式细胞术分析发现，表达GFAP-GFP的细胞的比例达到26.3％。
实施例5
将20000个实施列1制备的MEFs细胞(来自野生型小鼠)接种于细胞培养的6孔板中，从第二天开始使用诱导培养基进行培养(对照组仍使用基础培养基进行培养)，然后每四天换液，第16天检测，通过统计克隆的形成个数和qPCR分析，确定8CF小分子组合的处理效果。
如图6所示，对经过含有8CF诱导小分子组合的诱导培养基培养后获得的细胞进行电生理实验检测，利用电压钳检测神经细胞的Na+与K+电流，结果可以看到，所得细胞具有与神经细胞相似的功能。
如图7所示，通过RT-qPCR方法检测诱导培养基培养所得细胞，结果可以看到，神经细胞相关特异性基因，如Ascl1、Neurog2、PAX6、SOX1、SOX2和MYT1L，这些基因的mRNA水平较成纤维细胞均有显著的提高，符合神经细胞的特征。
Map2蛋白是神经细胞特异标记蛋白，对诱导培养基培养所得细胞进行Map2蛋白免疫荧光处理，然后利用倒置荧光显微镜观察，如图8所示，其中小的圆点表示细胞核，长梭形表示Map2阳性的神经细胞。
由上面这些证据表明，成纤维细胞经过含有8CF诱导小分子组合的诱导培养基培养后可以变成神经细胞。

Claims (9)

1.一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的诱导培养基，包含基础培养基和诱导小分子组合，其特征在于，所述诱导小分子组合为8CF，其中8为A-83-01、C为CHIR99021、F为毛喉素。
2.如权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述诱导小分子组合中各组分的浓度为：
8 0.1～1μM
C 8～12μM
F 8～12μM。
3.一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的方法，其特征在于，使用如权利要求1或2任一所述的诱导培养基对成纤维细胞进行培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的成纤维细胞来源于小鼠。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的成纤维细胞来源于10.5～14.5天的小鼠胚胎。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的成纤维细胞来源于小鼠尾尖。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，成纤维细胞培养的第2天起开始使用如权利要求1所述的诱导培养基，之后每4天更换一次培养基。
8.使用如权利要求3～7任一所述的方法获得的神经细胞。
9.如权利要求8所述的神经细胞在药物筛选中的应用。
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