CN108297396B - 一种挤出沉积式3d打印制备三维骨组织工程支架的方法 - Google Patents

一种挤出沉积式3d打印制备三维骨组织工程支架的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，属于生物材料技术领域。所述方法包括：将明胶、海藻酸钠与水按一定比例混合均匀，然后加入纳米级羟基磷灰石，混合均匀后形成羟基磷灰石‑明胶‑海藻酸钠复合浆料；其中，水:明胶:海藻酸钠:羟基磷灰石的质量比为100:4～6:2～4:30～55；将所述复合浆料加入3D打印机中，打印出组织工程支架；对打印出的所述组织工程支架进行第一冷冻干燥处理、固化处理、清洗及第二冷冻干燥，获得最终的骨组织工程支架。本发明的方法采用无机和有机的生物材料混合，在3D打印技术的基础上制备出的骨组织工程支架具有微观孔洞，以及良好的生物活性、良好的降解性能及强度，在骨损伤修复领域存在极高的应用价值。

Description

一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别涉及一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法。
背景技术
挤出沉积制造技术是一种基于连续式直写技术的成形方法，其工作原理是采用压缩空气或者电机产生的压力来实现流态材料从料腔中挤出，以连续丝的方式沉积在基板上，逐层堆积形成三维实体结构。根据压力产生方式的不同，可以将挤出沉积制造技术分为气体压力助推微注射器式挤出沉积制造(Pressure Aassisted Microsyringe，简称PAM)和电机助推微注射器式挤出沉积制造(Motor Assisted Microsyringe，简称MAM)。
与传统的支架制备工艺和增材制造技术相比，挤出沉积制造技术具有以下特点：(1)能够制备出内外结构都高度复杂三维结构；(2)适用材料范围广，溶液、胶体、悬浮液、熔融体等状态的材料均可成形；(3)采用多喷头沉积成形，可实现成分上的梯度变化；(4)打印环境不引入对生物活性材料(如细胞、生长因子)有害的因素。利用挤出沉积制造技术制备多孔支架，不仅能够解决支架内外形状的可控制备问题，还能够克服传统增材制造技术在成形材料方面的限制。
传统的骨组织工程支架使用羟基磷灰石为材料制备的组织工程支架，由于其在干燥过程中易开裂，且需通过煅烧来去除分散剂等具有生物毒性的材料，所以传统支架在烧结后的表面微观孔洞较少，成骨性能和生物亲和性较差，虽然强度较高，但实际应用中支架强度要求并不苛刻，而成骨性能和生物亲和性的要求则较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，该方法制备的骨组织工程支架具有良好的生物活性、良好的降解性能及强度。
为实现上述目的，本发明提供了一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，所述方法包括：
将明胶、海藻酸钠与水按一定比例混合均匀，然后加入纳米级羟基磷灰石，混合均匀后形成羟基磷灰石-明胶-海藻酸钠复合浆料；其中，水:明胶:海藻酸钠:羟基磷灰石的质量比为100:4～6:2～4:30～55；
将所述复合浆料加入3D打印机中，打印出组织工程支架；
对打印出的所述组织工程支架进行第一冷冻干燥处理、固化处理、清洗及第二冷冻干燥，获得最终的骨组织工程支架。
进一步地，所述将明胶、海藻酸钠与水按一定比例混合均匀，然后加入纳米级羟基磷灰石，混合均匀后形成羟基磷灰石-明胶-海藻酸钠复合浆料，具体为：
取适量蒸馏水，按比例加入明胶和海藻酸钠，搅拌混合均匀，密封放置到30-35℃的水浴中保温12-14h充分混合均匀，取出进一步搅拌，再密封放置到50-55℃的水浴中保温25-35min，最后加入纳米级羟基磷灰石搅拌均匀。
进一步地，所述纳米级羟基磷灰石的粒径为60nm以下。
进一步地，使用所述3D打印机打印所述组织工程支架时控制室内温度在20℃以下。
进一步地，使用所述3D打印机打印时挤压速度设置为0.006-0.01mm/s。
进一步地，所述第一冷冻干燥处理的时间为12h以上。
进一步地，所述固化处理包括海藻酸钠固化处理和明胶固化处理；其中，所述海藻酸钠固化处理采用SrCl2的酒精溶液，所述明胶固化处理采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐+N-羟基琥珀酰亚胺的酒精溶液。
进一步地，所述固化处理时间为2-3h。
进一步地，所述清洗采用酒精溶液进行浸泡清洗。
进一步地，所述骨组织工程支架的孔洞尺寸为360-400μm。
本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本申请实施例提供的挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，包括：先将明胶、海藻酸钠与水按一定比例混合均匀，然后加入纳米级羟基磷灰石，混合均匀后形成羟基磷灰石-明胶-海藻酸钠复合浆料；将所述复合浆料加入3D打印机中，打印出组织工程支架；再对打印出的所述组织工程支架进行第一冷冻干燥处理、固化处理、清洗及第二冷冻干燥，获得最终的骨组织工程支架。该方法采用无机和有机的生物材料混合，三种材料对骨组织工程支架具有促进作用，由于采用3D打印、冷冻干燥以及固化处理相结合的手段，使制备的骨组织工程支架具有微观孔洞，以及良好的生物活性、良好的降解性能及强度，在骨损伤修复领域存在极高的应用价值。
附图说明
图1是本申请实施例挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法流程图；
图2是本申请实施例1制备的骨组织工程支架的扫描电镜照片；
图3是本申请实施例2制备的骨组织工程支架的扫描电镜照片；
图4是使用本申请实施例1制备的骨组织工程支架的细胞培养结果图；
图5是使用本申请实施例2制备的骨组织工程支架的细胞培养结果图。
具体实施方式
本申请实施例提供一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，该方法制备的骨组织工程支架具有良好的生物活性、良好的降解性能及强度，在骨损伤修复领域存在极高的应用价值。
为实现上述目的，本申请实施例总体思路如下：
本申请提供了一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，所述方法包括：
将明胶、海藻酸钠与水按一定比例混合均匀，然后加入纳米级羟基磷灰石，混合均匀后形成羟基磷灰石-明胶-海藻酸钠复合浆料；其中，水:明胶:海藻酸钠:羟基磷灰石的质量比为100:4～6:2～4:30～55；
将所述复合浆料加入3D打印机中，打印出组织工程支架；
对打印出的所述组织工程支架进行第一冷冻干燥处理、固化处理、清洗及第二冷冻干燥，获得最终的骨组织工程支架。
上述技术方案，通过挤出沉积的三维打印方式，结合冷冻干燥技术，使骨组织工程支架具有形状可控的微观孔洞，以及固化处理手段相结合，制备的骨组织工程支架具有良好的生物亲和性，对细胞的粘附及生长提供了极佳的生长环境；采用骨的主要成分羟基磷灰石为基质材料，混合具有良好的生物亲和性的海藻酸钠和明胶，对骨组织工程支架具有极佳的促进作用；三种材料采用合理的配比使复合浆料具有良好的打印性能，结合3D打印技术，能够获得在支架强度，降解性能，尤其是成骨性上更为优越的骨组织工程支架，在骨损伤修复等医学领域具有良好的应用前景。
为了更好的理解上述技术方案，下面通过附图和具体实施例对本申请技术方案做详细的说明，应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互结合。
应当理解的是，虽然本文中可能使用了术语“第一”、“第二”等等来描述各操作步骤，但是这些操作步骤不应当受这些术语限制。使用这些术语仅仅是为了将一个操作与另一个操作进行区分。举例来说，在不背离示例性实施例的范围的情况下，第一固化处理可以被称为第二固化处理，并且类似地第二固化处理可以被称为第一固化处理。
本申请实施例提供了一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤S110：将明胶、海藻酸钠与水按一定比例混合均匀，然后加入纳米级羟基磷灰石，混合均匀后形成羟基磷灰石-明胶-海藻酸钠复合浆料；其中，水:明胶:海藻酸钠:羟基磷灰石的质量比为100:4～6:2～4:30～55；
该步骤中，所述将明胶、海藻酸钠与水按一定比例混合均匀，然后加入纳米级羟基磷灰石，混合均匀后形成羟基磷灰石-明胶-海藻酸钠复合浆料，具体为：
取适量蒸馏水，按比例加入明胶和海藻酸钠，搅拌混合均匀，密封放置到30-35℃的水浴中保温12-14h充分混合均匀，取出进一步搅拌，再密封放置到50-55℃的水浴中保温25-35min，最后加入纳米级羟基磷灰石搅拌均匀。
具体而言，在水浴中保温时，为防止水分蒸发，可用保鲜膜将容器口封住。
其中，在50-55℃的水浴中保温25-35min是为了降低明胶-海藻酸钠浆料的粘度，以防止加入羟基磷灰石后形成的复合浆料中产生大型颗粒。
所述搅拌采用玻璃棒或机械搅拌装置。
其中，所述纳米级羟基磷灰石的粒径为60nm以下。粒径越小，则在制备打印复合浆料的过程中，羟基磷灰石这一固相成分的添加量的可控性就越好，可选用的针头直径便越小，则打印精度就更高。若粒径过大则会导致复合浆料制备难度增大，同样羟基磷灰石加入量相同的情况下，所获得的浆料均一性更差。
步骤S120：将所述复合浆料加入3D打印机中，打印出组织工程支架；
该步骤中，将所述复合浆料加入3D打印机中，具体而言，要趁复合浆料粘度较低时加入到3D打印机的MAM喷头的料腔中，并降下挤出活塞，防止复合浆料与空气接触而散失水分。
其中，使用所述3D打印机打印所述组织工程支架时控制室内温度在20℃以下，以保证复合浆料具有较大的粘度，能够维持自身形状，然后进行打印工作，使打印出的支架能够保持形状。
使用所述3D打印机打印时挤压速度设置为0.006-0.01mm/s。例如：选用22#针头(不锈钢材质，内径0.4mm)活塞的挤压速度选择0.008mm/s，XY平台的运动速度2.5mm/s，层高0.38mm，丝间距1.0mm，打印层高和活塞的挤压速度可根据实际打印情况进行微调。另外，根据不同孔径的针头可对工艺参数进行调整，以获得最好的打印工艺。
该步骤中，在进行3D打印时，可根据实际的骨缺损的三维形状获得的组织切片，采用该复合浆料直接打印出所需形状的骨组织工程支架。需要说明的是，本申请实施例所使用的3D打印机为现有设备。
步骤S130：对打印出的所述组织工程支架进行第一冷冻干燥处理、固化处理、清洗及第二冷冻干燥，获得最终的骨组织工程支架。
其中，所述第一冷冻干燥处理的时间为12h以上，具体在冷冻干燥机中进行干燥。
所述固化处理包括海藻酸钠固化处理和明胶固化处理。在第一冷冻干燥处理后先进行海藻酸钠固化处理，具体采用SrCl2的酒精溶液固化2-3h，取出后用酒精溶液浸泡清洗；然后再进行明胶固化处理，具体采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)+N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的酒精溶液固化2-3h，取出后同样再用酒精溶液浸泡清洗。
本申请实施例最终得到的骨组织工程支架的孔洞尺寸为370-400μm。用22#针头打印所获骨组织工程支架的孔洞尺寸约为380μm。
为了使本领域所属技术人员能够进一步的了解本发明实施例的方案，下面将基于本申请实施例所介绍的方案对其进行详细介绍。
实施例1
S1：采用量筒量取20ml的蒸馏水放入烧杯中，称取1g的明胶(GA)，然后称取0.4g的海藻酸钠(SA)，加入烧杯中，用玻璃棒持续搅拌，待其较为均匀之后，使用保鲜膜将瓶口封住，防止水分蒸发，之后将SA-GA混合物放入到30℃的水溶液中进行恒温水浴12小时；
通过12小时的恒温水浴，SA-GA混合物浆料得以混合均匀，取出用玻璃棒进一步搅拌，再将SA-GA浆料用保鲜膜密封，放入到55℃的温水中进一步水浴30分钟，使浆料的粘度进一步降低，为之后的浆料制备做准备。待水浴加热后，称取11g羟基磷灰石(HA)，分次加入SA-GA浆料中，并用玻璃棒搅拌均匀，这一过程需要在25℃以上的室温中进行，并且需要持续搅拌，尽快完成这一搅拌过程，避免温度降低导致浆料的粘度增大而使得最终获得的HA-GA-SA复合浆料存在大型颗粒；
S2：趁复合浆料的粘度较低，将制备好的复合浆料及时放入到MAM喷头的料腔中，并控制电机用活塞封住料腔口，避免浆料水分的蒸发。打印构成需控制室温在20℃以下，以保证浆料维持在一个较大的粘度，从而打印出的支架能够保持形状；其中，打印参数设置：选用22#针头，活塞的挤压速度0.008mm/s，XY平台的运动速度2.5mm/s，层高0.38mm，丝间距1.0mm；
S3：将打印出来的支架及时进行第一冷冻干燥处理12h以上，保持支架的形貌不产生收缩，同时去除支架中的水分，然后将支架首先放置到SrCl2酒精溶液中对海藻酸钠进行固化处理2小时，之后将支架取出并用酒精溶液浸泡清洗30分钟，再将支架放入EDC+NHS的酒精溶液中对明胶进行固化处理2小时，同样再用酒精溶液进行清洗30分钟，最后对获得的支架再进行第二冷冻干燥处理，获得最终的骨组织工程支架。如图2所示，得到的骨组织工程支架孔洞尺寸380nm左右，孔洞十分丰富，对细胞的粘附及生长提供了极佳的生长环境。
实施例2
S1：采用量筒量取20ml的蒸馏水放入烧杯中，称取1g的明胶(GA)，然后称取0.8g的海藻酸钠(SA)，加入烧杯中，用玻璃棒持续搅拌，待其较为均匀之后，使用保鲜膜将瓶口封住，防止水分蒸发，之后将SA-GA混合物放入到30℃的水溶液中进行恒温水浴12小时；
通过12小时的恒温水浴，SA-GA混合物浆料得以混合均匀，取出用玻璃棒进一步搅拌，再将SA-GA浆料用保鲜膜密封，放入到55℃的温水中进一步水浴30分钟，使浆料的粘度进一步降低，为之后的浆料制备做准备。待水浴加热后，称取6g羟基磷灰石(HA)，分次加入SA-GA浆料中，并用玻璃棒搅拌均匀，这一过程需要在25℃以上的室温中进行，并且需要持续搅拌，尽快完成这一搅拌过程，避免温度降低导致浆料的粘度增大而使得最终获得的HA-GA-SA复合浆料存在大型颗粒；
S2：趁复合浆料的粘度较低，将制备好的复合浆料及时放入到MAM喷头的料腔中，并控制电机用活塞封住料腔口，避免浆料水分的蒸发。打印构成需控制室温在20℃以下，以保证浆料维持在一个较大的粘度，从而打印出的支架能够保持形状；其中，打印参数设置：选用22#针头，活塞的挤压速度0.009mm/s，XY平台的运动速度2.5mm/s，层高0.38mm，丝间距1.0mm；
S3：将打印出来的支架及时进行第一冷冻干燥处理12h以上，保持支架的形貌不产生收缩，同时去除支架中的水分，然后将支架首先放置到SrCl2酒精溶液中对海藻酸钠进行固化处理2小时，之后将支架取出并用酒精溶液浸泡清洗30分钟，再将支架放入EDC+NHS的酒精溶液中对明胶进行固化处理2小时，同样再用酒精溶液进行清洗30分钟，最后对获得的支架再进行第二冷冻干燥处理，获得最终的骨组织工程支架。如图3所示，得到的骨组织工程支架孔洞尺寸380nm左右，孔洞十分丰富，对细胞的粘附及生长提供了极佳的生长环境。
实施例3
S1：采用量筒量取20ml的蒸馏水放入烧杯中，称取0.8g的明胶(GA)，然后称取0.4g的海藻酸钠(SA)，加入烧杯中，用玻璃棒持续搅拌，待其较为均匀之后，使用保鲜膜将瓶口封住，防止水分蒸发，之后将SA-GA混合物放入到35℃的水溶液中进行恒温水浴13小时；
通过13小时的恒温水浴，SA-GA混合物浆料得以混合均匀，取出用玻璃棒进一步搅拌，再将SA-GA浆料用保鲜膜密封，放入到50℃的温水中进一步水浴35分钟，使浆料的粘度进一步降低，为之后的浆料制备做准备。待水浴加热后，称取8g羟基磷灰石(HA)，分次加入SA-GA浆料中，并用玻璃棒搅拌均匀，这一过程需要在25℃以上的室温中进行，并且需要持续搅拌，尽快完成这一搅拌过程，避免温度降低导致浆料的粘度增大而使得最终获得的HA-GA-SA复合浆料存在大型颗粒；
S2：趁复合浆料的粘度较低，将制备好的复合浆料及时放入到MAM喷头的料腔中，并控制电机用活塞封住料腔口，避免浆料水分的蒸发。打印构成需控制室温在18℃以下，以保证浆料维持在一个较大的粘度，从而打印出的支架能够保持形状；其中，打印参数设置：选用22#针头，活塞的挤压速度0.006mm/s，XY平台的运动速度2.5mm/s，层高0.36mm，丝间距1.0mm；
S3：将打印出来的支架及时进行第一冷冻干燥处理12h以上，保持支架的形貌不产生收缩，同时去除支架中的水分，然后将支架首先放置到SrCl2酒精溶液中对海藻酸钠进行固化处理3小时，之后将支架取出并用酒精溶液浸泡清洗40分钟，再将支架放入EDC+NHS的酒精溶液中对明胶进行固化处理3小时，同样再用酒精溶液进行清洗40分钟，最后对获得的支架再进行第二冷冻干燥处理，获得最终的骨组织工程支架。
实施例4
S1：采用量筒量取20ml的蒸馏水放入烧杯中，称取1.2g的明胶(GA)，然后称取0.6g的海藻酸钠(SA)，加入烧杯中，用玻璃棒持续搅拌，待其较为均匀之后，使用保鲜膜将瓶口封住，防止水分蒸发，之后将SA-GA混合物放入到32℃的水溶液中进行恒温水浴14小时；
通过14小时的恒温水浴，SA-GA混合物浆料得以混合均匀，取出用玻璃棒进一步搅拌，再将SA-GA浆料用保鲜膜密封，放入到55℃的温水中进一步水浴25分钟，使浆料的粘度进一步降低，为之后的浆料制备做准备。待水浴加热后，称取10g羟基磷灰石(HA)，分次加入SA-GA浆料中，并用玻璃棒搅拌均匀，这一过程需要在25℃以上的室温中进行，并且需要持续搅拌，尽快完成这一搅拌过程，避免温度降低导致浆料的粘度增大而使得最终获得的HA-GA-SA复合浆料存在大型颗粒；
S2：趁复合浆料的粘度较低，将制备好的复合浆料及时放入到MAM喷头的料腔中，并控制电机用活塞封住料腔口，避免浆料水分的蒸发。打印构成需控制室温在19℃以下，以保证浆料维持在一个较大的粘度，从而打印出的支架能够保持形状；其中，打印参数设置：选用22#针头，活塞的挤压速度0.01mm/s，XY平台的运动速度2.5mm/s，层高0.37mm，丝间距1.0mm；
S3：将打印出来的支架及时进行第一冷冻干燥处理12h以上，保持支架的形貌不产生收缩，同时去除支架中的水分，然后将支架首先放置到SrCl2酒精溶液中对海藻酸钠进行固化处理2.5小时，之后将支架取出并用酒精溶液浸泡清洗35分钟，再将支架放入EDC+NHS的酒精溶液中对明胶进行固化处理2.5小时，同样再用酒精溶液进行清洗35分钟，最后对获得的支架再进行第二冷冻干燥处理，获得最终的骨组织工程支架。
实施例5：细胞培养试验
试验方法：
S1：将实施例1和2制备得到的HA-SA-GA骨组织工程支架用酒精清洗消毒；
S2：将HA-SA-GA支架放入到预先准备好的细胞培养皿中，使HA-SA-GA支架浸没于细胞培养的营养物质中，然后接种前成骨细胞MC3T3-E1；
S3：定期为培养皿更换培养液，并观察细胞的生长情况。
实施例1的HA-SA-GA骨组织工程支架的细胞生长情况如图4所示，实施例2的HA-SA-GA骨组织工程支架的细胞生长情况如图5所示。由图4和图5可以看出，细胞在支架上的生长情况良好，HA-SA-GA支架的生物相容性良好，无细胞毒性，在生物组织工程的应用有良好的前景。
本申请具有以下优点：
1、通过挤出沉积的三维打印方式，制备宏观可控的形状及孔洞，采取冷冻干燥处理，使组织工程支架具有微观孔洞，以及固化处理等手段，制备出具有良好的生物亲和性的组织工程支架；
2、制备的支架宏观上具有尺寸可控的孔洞，微观孔洞也十分丰富，对细胞的粘附及生长提供了极佳的生长环境；
3、采用的三种材料的对骨组织工程具有极佳的促进作用，合理的比例使得复合浆料具有良好的打印工艺，在微观上具有不同尺度的孔洞，在骨组织工程应用上提供了更多的可能性。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，其特征在于，所述方法包括：
将明胶、海藻酸钠与水按一定比例混合均匀，然后加入纳米级羟基磷灰石，混合均匀后形成羟基磷灰石-明胶-海藻酸钠复合浆料；其中，水:明胶:海藻酸钠:羟基磷灰石的质量比为100:4～6:2～4:30～55；
将所述复合浆料加入3D打印机中，打印出组织工程支架，其中，使用所述3D打印机打印时挤压速度设置为0.006-0.01mm/s；
对打印出的所述组织工程支架进行第一冷冻干燥处理、固化处理、清洗及第二冷冻干燥，获得最终的骨组织工程支架；其中，固化处理包括按序对海藻酸钠、明胶固化处理。
2.如权利要求1所述的一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，其特征在于，所述将明胶、海藻酸钠与水按一定比例混合均匀，然后加入纳米级羟基磷灰石，混合均匀后形成羟基磷灰石-明胶-海藻酸钠复合浆料，具体为：
取适量蒸馏水，按比例加入明胶和海藻酸钠，搅拌混合均匀，密封放置到30-35℃的水浴中保温12-14h充分混合均匀，取出进一步搅拌，再密封放置到50-55℃的水浴中保温25-35min，最后加入纳米级羟基磷灰石搅拌均匀。
3.如权利要求1或2所述的一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，其特征在于，所述纳米级羟基磷灰石的粒径为60nm以下。
4.如权利要求1所述的一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，其特征在于，使用所述3D打印机打印所述组织工程支架时控制室内温度在20℃以下。
5.如权利要求1所述的一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，其特征在于，所述第一冷冻干燥处理的时间为12h以上。
6.如权利要求1所述的一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，其特征在于，所述固化处理包括海藻酸钠固化处理和明胶固化处理；其中，所述海藻酸钠固化处理采用SrCl2的酒精溶液，所述明胶固化处理采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐+N-羟基琥珀酰亚胺的酒精溶液。
7.如权利要求1或6所述的一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，其特征在于，所述固化处理时间为2-3h。
8.如权利要求1所述的一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，其特征在于，所述清洗采用酒精溶液进行浸泡清洗。
9.如权利要求1所述的一种挤出沉积式3D打印制备三维骨组织工程支架的方法，其特征在于，所述骨组织工程支架的孔洞尺寸为360-400μm。
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