CN112075391B

CN112075391B - 一种奥丽春细颈线虫体外培养方法及其应用

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Publication number: CN112075391B
Application number: CN202010998019.5A
Authority: CN
Inventors: 李军燕; 罗晓平; 王鹏龙; 耿万恒; 刘威; 高娃; 王凤武; 刘秀丽; 郭天龙; 杨晓野; 赵治国; 达来宝力格; 侯勇跃
Original assignee: Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Current assignee: Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2040-09-21
Also published as: CN112075391A

Abstract

本发明涉及一种奥丽春细颈线虫体外培养方法及其应用，所述方法是以pH值弱酸性，渗透压低的蒸馏水培养奥丽春细颈线虫虫卵，并辅以适当的温度和光照条件，能够有效地提高了奥丽春细颈线虫三期幼虫的发育率，发育率达90％以上。本发明为奥丽春细颈线虫的体外培养研究，奥丽春细颈线虫感染预防与治疗的新兽药的研发、筛选与耐药性检测提供了技术支持，为对奥丽春细颈线虫耐药基因或功能基因以及致病机制研究奠定了坚实的基础。

Description

一种奥丽春细颈线虫体外培养方法及其应用

技术领域

本发明涉及寄生虫体外培养方法，具体涉及奥丽春细颈线虫体外培养方法及其应用。

背景技术

奥丽春细颈线虫(Nematodirus oiratianus)属于圆形目(Stronglata)、毛圆科(Trichostrongylidae)、细颈属(Nematodirus)，是严重危害家畜的一种常见胃肠道线虫。由该线虫引起的细颈线虫病呈世界性分布。近些年来，随着某些常用驱虫药物的滥用，细颈线虫耐药性也常见报道。

耐药性的出现严重影响寄生虫病的治疗效果，给寄生虫病的防控带来巨大的挑战。因此，及时发现并控制寄生虫耐药性是保证药物有效性的基础。现已建立的胃肠道线虫耐药性的检测方法主要有体内试验和体外试验。体外试验主要有虫卵孵化试验(EHA)、幼虫发育抑制试验(LDA)、幼虫移行抑制试验(LMIA)等。

对于细颈线虫耐药性研究中，如何高效培养以获得纯净的三期幼虫，同时对线虫发育过程进行观察是建立耐药性体外检测的关键。常规的奥丽春细颈线虫的培养方法是粪便培养法，该方法虽然较为简便，但是由于奥丽春细颈线虫卵内发育的特性，使其在粪便中发育受限，其幼虫发育率及回收率较低，且采用粪便培养法容易同其他寄生虫的幼虫混合培养，难以获得纯净的奥丽春细颈线虫三期幼虫。而基于虫卵孵化试验(EHA)、幼虫发育抑制试验(LDA)的线虫耐药性检测技术中，需将虫卵单独分离后才能开展试验。

现有技术关于线虫虫卵的培养方法通常是将虫卵单独分离后，采用含有血清、酵母或其他营养物质、或抗生素的培养液进行线虫虫卵的体外培养，但这种方法需要添加营养物质，成本高；并且奥丽春细颈线虫有其独特的生理特点，其体外培养方法不能或很难从其他线虫的体外培养方法中获得借鉴。并且现有技术很少有动物寄生虫可以体外培养出成虫，如奥丽春细颈线虫只能在羊体内发育为成虫，且成虫在羊体外无法培养存活。基于该特点，要在体外研究奥丽春细颈线虫需要收集其虫卵将其培养至感染性幼虫，以获得感染性三期幼虫，供科研工作者进行后期的研究工作。而感染性三期幼虫的体外培养工作一直进展缓慢，现有技术也鲜有纯净奥丽春细颈线虫感染性三期幼虫的体外培养的报道

发明内容

本发明的目的是提供一种孵化效率显著提高的奥丽春细颈线虫体外培养方法。

本发明经过长期对奥丽春细颈线虫卵的发育研究，发现奥丽春细颈线虫在卵内发育至三期幼虫后才破鞘而出，奥丽春细颈线虫卵鞘具有坚硬坚固的特点，外界培养液中的物质很难透过卵鞘进入卵内，但虫卵的孵化需要在液体环境下培养，发明人经过大量试验和探索，发现了一种经济、有效、孵化率高的奥丽春细颈线虫由虫卵至感染性三期幼虫的体外培养方法。

第一方面，本发明提供了一种奥丽春细颈线虫体外培养方法，该方法仅用蒸馏水培养奥丽春细颈线虫虫卵。

本发明的上述方法中，蒸馏水中接入的奥丽春细颈线虫虫卵密度为50±10枚/mL。

本发明的上述方法中，所述蒸馏水的pH值为4-7。

优选所述蒸馏水的pH值为5.5-6.5，更优选所述蒸馏水的pH值为5.5。

本发明提供的奥丽春细颈线虫体外培养方法中，所述蒸馏水的渗透压为0-700mOsm/kg。

优选所述蒸馏水的渗透压为0-400mOsm/kg，更优选所述蒸馏水的渗透压为0-100mOsm/kg，最优选所述蒸馏水的渗透压为0mOsm/kg。

本发明提供的奥丽春细颈线虫体外培养方法的培养条件为：27±0.5℃恒温培养；12-24h/d长光照；或18-24h/d光照，或24h/d长光照。

本发明进一步提供了上述奥丽春细颈线虫体外培养方法的以下任一所述的应用：

(1)在提高奥丽春细颈线虫孵化率中的应用；

(2)在筛选防治奥丽春细颈线虫的药物中的应用；

(3)在筛选奥丽春细颈线虫耐药基因或功能基因中的应用。

第二方面，本发明提供一种奥丽春细颈线虫体外培养的培养液，该培养液为pH值为4-7，渗透压为0-700mOsm/kg的蒸馏水。

优选地，所述培养液为pH值为5.5-6.5，渗透压为0-700mOsm/kg的蒸馏水。

更优选地，所述培养液为pH值为5.5-6.5，渗透压为0-400mOsm/kg、或渗透压为0-100mOsm/kg的蒸馏水。

最优选地，所述培养液为pH值为5.5，渗透压为0mOsm/kg的蒸馏水。

第三方面，本发明提供了蒸馏水在体外培养奥丽春细颈线虫中的新应用。所述蒸馏水pH值为5.5-6.5，更优选所述蒸馏水的pH值为6.0，所述蒸馏水的渗透压为0-400mOsm/kg，更优选所述蒸馏水的渗透压为0-100mOsm/kg，最优选所述蒸馏水的渗透压为0mOsm/kg。

本发明的有益效果在于，本发明经过长期研究反复验证发现，pH值弱酸性，渗透压低的蒸馏水用于培养奥丽春细颈线虫虫卵，并辅以适当的温度和光照条件，能够有效地提高了奥丽春细颈线虫三期幼虫的发育率，发育率达90％以上。所选用的蒸馏水杜绝了常见微生物的大量繁殖，确保了培养基无杂菌污染。并且，在虫卵分离过程中，采用本发明的培养方法能够仅培养奥丽春细颈线虫虫卵，其他寄生虫的虫卵通常在缺少营养成分的情况下，并不能发育为感染性幼虫，因此本发明培养方法还起到了筛选虫卵的作用，使得前期虫卵采集工作简化，不用单独分离虫卵，只需确定粪便中有奥丽春细颈线虫虫卵，无需考虑是否还存在其他寄生虫卵，即可收集并进行奥丽春细颈线虫虫卵的体外培养至感染性三期幼虫。本发明为奥丽春细颈线虫的体外培养研究，奥丽春细颈线虫感染预防与治疗的新兽药的研发、筛选与耐药性检测提供了技术支持，为对奥丽春细颈线虫耐药基因或功能基因以及致病机制研究奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为采用本发明的培养液，不同温度对奥丽春细颈线虫幼虫发育的影响。

图2为采用渗透压为0mOsm/kg的蒸馏水，不同pH对奥丽春细颈线虫幼虫发育的影响。

图3为采用pH值为7.0的蒸馏水，不同渗透压的蒸馏水对奥丽春细颈线虫幼虫发育的影响。

图4为光照时间对幼虫发育的影响。

图5为本发明体外培养方法下，不同培养时间的奥丽春细颈线虫形态和发育过程。

图6为奥丽春细颈线虫三期幼虫尾部结构，A为奥丽春细颈线虫三期幼虫(100×)，B为三期幼虫尾鞘部(100×)，C为三期幼虫脱壳后的尾部(250×)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明实施例中奥丽春细颈线虫虫卵的分离是采用以下方法进行：收集经镜检含有奥丽春细颈线虫虫卵的新鲜羊粪便样本，常温且厌氧保存带回实验室，备用。

(1)首先称取50g粪便于研钵中，加入饱和盐水研碎混匀。

(2)再加入适量饱和盐水，并用60目网筛过滤至平皿中，使粪液凸出于皿壁而不流出。

(3)将塑料薄片与凸液面紧密贴合(无气泡)，静置20min。

(4)用饱和盐水冲洗薄片上的虫卵，置于烧杯中。

(5)所得虫卵盐水先后通过100目网筛及200目筛过滤，弃滤液，此时，虫卵保留在200目网筛上。

(6)用蒸馏水冲洗网筛上的虫卵至烧杯中。

在缺少营养成分的情况下，很多寄生虫的虫卵并不能发育为感染性幼虫。

实施例1奥丽春细颈线虫最适发育条件的筛选

将上述步骤(6)收集的细颈线虫虫卵悬液置于细胞培养瓶中，在恒温培养箱中进行27℃恒温培养，时间为2周，并每天进行观察记录。

1、奥丽春细颈线虫幼虫培养条件优化单因素试验

(1)温度对奥丽春细颈线虫虫卵孵化的影响：收集虫卵悬浮液(蒸馏水冲洗网筛上的虫卵制得)，调节pH为7.0，渗透压为0，取24孔培养板，每孔加入1mL虫卵悬浮液，使每孔约50个虫卵，培养温度分别设为10℃、17℃、22℃、27℃、32℃、37℃，每个温度设三个重复，光照时间为培养期间昼夜交替，记为12h/d。培养15d后，在显微镜观察虫卵孵化情况，统计发育率。结果见图1。

温度对奥丽春细颈线虫幼虫发育率的影响：不同温度对奥丽春细颈线虫幼虫发育率的影响如图1所示，当温度为27℃时，幼虫发育率最高为87.8％。随着温度的升高或降低，幼虫发育率均降低。同时发现当温度为37℃时，已发现有部分幼虫活力显著下降。温度为10℃时，虫卵仍处于桑椹胚状态。表明奥丽春细颈线虫虫卵在低温时不发育。

(2)pH对奥丽春细颈线虫幼虫发育的影响：收集虫卵悬浮液，调节虫卵悬浮液pH分别为4、5.5、6、6.5、7、8，渗透压均为0，取24孔培养板，每孔加入1mL虫卵悬浮液，每孔约50个虫卵，每个pH均做三个重复，培养温度为27℃，光照时间为12h/d。培养15d后，在显微镜下观察虫卵孵化情况，统计发育率。

pH对奥丽春细颈线虫幼虫发育率的影响：不同pH对奥丽春细颈线虫幼虫发育率的影响如图2所示，幼虫发育率受到pH的影响，当pH逐渐增大时，幼虫发育率也增加。通过折线图可知，当pH为6.0时，幼虫发育率达到最大，为86.1％；但是pH值继续增大时，幼虫发育率逐渐减小。表明奥丽春细颈线虫幼虫适宜在微酸性条件下发育。

(3)渗透压对奥丽春细颈线虫幼虫发育的影响：收集虫卵悬浮液，调节悬浮液pH为7.0采用FM-8P全自动冰点渗透压计检测悬浮液渗透压分别为0mOsm/kg、79mOsm/kg、193mOsm/kg、317mOsm/kg、617mOsm/kg、1217mOsm/kg。取24孔培养板，每孔加入1ml虫卵悬浮液，每孔约50个虫卵，每个渗透压做三个重复，温度27℃，光照时间为12h/d。培养15d后，在显微镜下观察虫卵孵化情况，统计发育率。结果见图3。

渗透压对奥丽春细颈线虫幼虫发育率的影响：不同渗透压对奥丽春细颈线虫幼虫发育率的影响如图3所示，当渗透压为0mOsm/kg时，幼虫发育率最高为81.4％；随着渗透压的增大，幼虫发育率逐渐降低；当渗透压为1217mOsm/kg时，幼虫发育率仅为17.2％。表明高渗液体环境严重抑制奥丽春细颈线虫幼虫发育。

(4)光照对奥利春细颈线虫幼虫发育的影响：收集虫卵悬浮液，调节悬浮液pH为7.0，渗透压为0，取24孔培养板，每孔加入1ml虫卵悬浮液，每孔约50个虫卵，培养温度为27℃，光照时间分别设为培养期间全程黑暗(记为0h/d)、培养期间昼夜交替光照(记为12h/d)、培养期间每天光照18h(记为18h/d)、培养期间全程光照(记为24h/d)，每个光照条件设三个重复。培养15d后，在显微镜下观察虫卵孵化情况，统计发育率。

光照时间对奥丽春细颈线虫幼虫发育率的影响：不同光照时间对奥丽春细颈线虫幼虫发育率的影响如图4所示，随着光照时间的延长，幼虫发育率逐渐增加；无光照条件时，奥丽春细颈线虫幼虫发育率为61.4％；培养期间全程光照时，幼虫发育率提高到82.7％；可见，培养奥丽春三期幼虫时，将其置于光照环境，更有利于幼虫的发育。

2、培养条件正交试验

在单因素试验的基础上，以虫卵孵化率为考察指标，以pH(A)、培养温度(B)、悬浮液渗透压(C)、光照时间(D)为试验因素，每个因素设置4个水平，采用4因素4水平正交试验设计(表1)，试验共16个处理组，每个处理组重复3次。培养15d后，统计各个处理组的幼虫发育率。并采用直观分析法和方差分析法，分析各因素对幼虫发育的影响。

表1正交实验设计与结果

直观分析法：表1中K1、K2、K3、K4分别表示在各因素及各水平下奥丽春细颈线虫幼虫发育率的总和，C1、C2、C3、C4分别表示在各因素和各水平下幼虫发育率的平均值。

采用直观分析法时，一般采用幼虫发育率的平均值大小来反映同一因素各个不同水平对试验结果(幼虫发育率)影响的大小，并以此确定该因素应取得最佳水平。同时，用同一因素各个水平下的平均幼虫发育率的极差R来反映各因素水平的变动对试验结果的影响。极差越大，表示该因素的水平变动对试验结果又较大的影响；极差越小，表示该因素的变动对实验结果的影响不大。

由表1可知，影响奥丽春细颈线虫虫卵孵化和幼虫发育培养液的因素主次顺序依次是pH(因素A)、温度(因素B)、渗透压(因素C)、光照时间(因素D)(极差R：32.4＞13.8＞12.4＞10.9)。其主要因素应取最好水平，次要因素应根据成本、时间、试验需求等合理选取适当水平。

实施例2奥丽春细颈线虫的体外培养方法的建立

基于实施例1中的研究，确定影响奥丽春细颈线虫虫卵孵化和幼虫发育的培养液的主要影响因素是pH，因此观察实施例1中正交试验中发育率最高那一组组合中，pH的条件，该条件即为最佳条件，因此选择5.5。关于培养温度，理论上依据第二高发育率高的组别确定，但是第二高的发育率，温度为32℃，在单因素试验中与27℃相差不大，且根据一般线虫培养温度原则，因此选择27℃。渗透压理论上依据第三高发育率组别确定，但是，第三高的有两组，且有一定差异，参照单因素试验以及实际情况，选择渗透压为0。光照的选择同上，但是上述选择的四个条件并未在正交试验中出现(本试验得到的培养奥丽春细颈线虫幼虫的最佳条件是pH＝5.5，培养温度为27℃，渗透压0mOsm/kg，全程光照)，因此重新在这些条件下培养细颈线虫卵，发现其发育率大于正交试验中最高发育率，表明该条件可作为优化条件)但是，正交试验中，并无该组合，本实施例通过补充试验发现，该条件下，幼虫发育率高达91.5％，大于正交试验设计中的最高值89.2％，说明利用正交试验优化幼虫发育条件是成功的。

方差分析法：尽管直观法分析简单、直观、易计算，但是却不能反映试验误差，即不能确定实验结果的差异是由各因素的变化所引起，还是由于试验中模型误差和试验误差所引起。因此，本研究在直观分析的基础上，做方差分析。方差分析结果见表2，F(A)、F(B)、F(C)、F(D)均大于临界F值(F0.05(3,32)＝2.92，F0.01(3，32)＝4.51)，所以各因素P值均＜0.01，即各因素对幼虫发育影响均有显著差异。且F(A)＞F(B)＞F(C)＞F(D)，因此，影响奥丽春细颈线虫幼虫发育的主次因素依次是pH、温度、渗透压、光照时间。按照方差分析，只需对有显著影响的因素，选择最佳水平，对其他试验结果影响较小的因素，选择合适的水平即可。所以，本实施例中奥丽春细颈线虫幼虫培养的最佳条件是pH＝5.5，培养温度为27℃，渗透压0Osm/kg，光照时间24h/d，与直观分析法结果相一致。

在本实施例选择的最佳培养条件的体外培养方法下，不同培养时间的奥丽春细颈线虫形态和发育过程见图5，并对培养获得的感染性幼虫进行鉴定(见图6)，证实即为奥丽春细颈线虫感染性三期幼虫。

表2方差分析表

Note：F_0.05(3,32)＝2.92,F_0.01(3，32)＝4.51

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种奥丽春细颈线虫体外培养方法，其特征在于，仅用蒸馏水培养奥丽春细颈线虫虫卵，蒸馏水中接入的奥丽春细颈线虫虫卵密度为50±10枚/mL，所述蒸馏水的pH值为5.5-6.5，蒸馏水的渗透压为0-100mOsm/kg，培养条件为：27±0.5℃恒温培养。

2.根据权利要求1所述的奥丽春细颈线虫体外培养方法，其特征在于，所述蒸馏水的pH值为5.5。

3.根据权利要求1所述的奥丽春细颈线虫体外培养方法，其特征在于，所述蒸馏水的渗透压为0mOsm/kg。

4.权利要求1-3任一所述的奥丽春细颈线虫体外培养方法的以下任一所述的应用：

(1)在提高奥丽春细颈线虫孵化率中的应用；

(2)在筛选防治奥丽春细颈线虫的药物中的应用；

(3)在筛选奥丽春细颈线虫耐药基因或功能基因中的应用。