CN108956429A - 一种基于流式细胞术的河砚滤水率快速测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于流式细胞术的河砚滤水率快速测定方法，其特征是它包括：河蚬训养、藻类培养、河蚬滤水试验、取样及藻细胞密度测定和数据分析等过程。本发明采用流式细胞术测定藻细胞密度，取代常规的显微镜计数法，具有快捷、方便和准确等诸多优势，能够在短时间内获得河蚬滤水率参数，可以为河蚬增养殖提供重要基础数据。
Description
技术领域
本发明涉及一种水产养殖技术，尤其是一种河蚬养殖技术，具体地说是一种河砚滤水率快速测定方法，通过河蚬滤水率的测定数据为科学养殖提供依据。
背景技术
河蚬( Corbicula fluminea) 属软体动物门，瓣鳃纲(Lamellibranchia)，蚬科(Corbiculidae)，蚬属(Corbicula)，原产于我国及东亚、东南亚等国家，现已广泛分布于世界各地水域，成为底栖动物的优势种群，在水生态系统物质循环和能量流动过程中具有重要作用，对水环境有较强的净化能力。河蚬味道鲜美，富含许多特殊的活性营养成分，一直都是中国、日本、韩国及东南亚等国家居民喜爱的美食，是我国出口创汇的重要水产品之一。同时河蚬有较高的药用价值，具有开胃、通乳、明目、利小便、治脚气、去湿毒及醒酒之功效，还可治疗肝病、麻疹退热等，已经开发了许多相关保健品和食品。河蚬生长迅速，3个月可达性成熟，一年四季皆可繁殖。性腺最丰满期是5-8月，生殖旺期是5-6月，寿命约为5年。
近年来，随着捕捞强度加大、环境污染、栖息环境破坏等多种不利因素的影响，河蚬天然资源资源量急剧衰退，已经不能满足市场需求，导致河蚬增养殖业迅速发展，且已成为淡水经济贝类养殖的热点。
滤水率是指单位时间贝类所过滤水的总体积。滤水率是指示贝类生理状态的常用参数，也是反映贝类获取食物能力的重要指标，被广泛用于估算池塘养容量，在贝类摄食行为和能量学研究中占有重要地位。
测定贝类滤水率的方法有多种，其关键环节是测定一段时间内藻细胞密度的变化。目前，藻细胞密度一般是通过显微镜观察计数获得。该方法操作过程繁琐，时间长，受人为因素影响较大。本方法将流式细胞术引入，能够快速、准确测定藻细胞密度，在较短时间内计算得到河蚬滤水率，可以为河蚬的生态健康养殖提供重要依据。
发明内容
本发明的目的是针对现有的河蚬滤水率测量存在的操作过程繁琐，时间长，受人为因素影响较大的问题，发明一种基于流式细胞术的河砚滤水率快速测定方法。。
本发明的技术方案是：
一种基于流式细胞术的河砚滤水率快速测定方法，其特征是它包括以下步骤：
（1）河蚬驯养；从自然水体采集河蚬，迅速带回实验室，暂养在水簇箱中，充气培养；每天投喂蛋白核小球藻一次；每天换水一次，换水量为总水量的一半，暂养时间为7d；
（2）藻细胞培养；从中国科学院武汉水生生物研究所中国淡水藻种库购买蛋白核小球藻，利用BG-11培养基扩大培养，培养条件：温度 25℃，光强3000Lex，光照周期12h：12h，每天早晚各摇动一次，并检测藻细胞的生长情况；当细胞进入静止期，离心收集藻细胞，置于4℃冰箱，尽快用于实验；
（3）河蚬滤水率实验；
实验开始前1d河蚬停止喂食，挑选健康河蚬用于实验，体重为1-2g；用1L玻璃烧杯用于实验，添加500mL曝气自来水，放入5只河蚬，15min后加入藻细胞；藻细胞密度设置6个浓度组：103、5×103、104、5×104、105、5×105和106 cells/mL，每组设置3个平行；采用静水实验法，实验过程中不充气；为防止藻细胞下沉，每隔半小时用玻璃棒轻轻搅动烧杯中水体；2h后实验结束，从每个烧杯中取1mL水样，装入1.5mL离心管中用于测定藻细胞密度；
（4）用流式细胞仪测定藻细胞密度；
选择具有计数功能的流式细胞仪用于测定藻细胞密度，打开流式细胞仪，待状态稳定后开始检测，设定好流速、时间及计数数量等参数，将待测水样在振荡器充分混匀，直接上样检测，选择侧向角和叶绿素荧光2个参数圈选藻细胞，将细菌排除，获得藻细胞密度；
（5）计算河蚬滤水率； 根据下面公式计算河蚬的滤水率；
FR=V×ln(C 0 /C t )/(N×t)
其中， FR：滤水率（L/h）； V：实验水体积（L）； C o：实验开始时藻细胞密度（cells/mL）；Ct：实验结束后藻细胞密度（cells/mL）； N：河蚬个体数（个）； t：实验时间（h）；
根据计算所得的河蚬的滤水率，制定科学放养密度和投饵量，以利于河蚬的生态健康绿色养殖。
所述的河蚬驯养时暂养用水为曝气48h的自来水，水温控制在23℃，pH在8.0上下，溶氧6.5mg/L以上。
所述的河蚬驯养时投喂蛋白核小球藻的藻细胞密度为105cells/L。
重复进行滤水率测定并进行统计分析；河蚬在不同藻细胞密度条件下的滤水率采用SPSS软件中的ANOVA方法进行差异性分析；根据分析结果，确定河蚬适宜的投饵量。
本发明的有益效果：
本发明的方法简单易行，时间短，结果准确可靠。
本发明采用流式细胞术测定藻细胞密度，取代常规的显微镜计数法，具有快捷、方便和准确等诸多优势，能够在短时间内获得河蚬滤水率参数，可以为河蚬增养殖提供重要基础数据。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种基于流式细胞术的河砚滤水率快速测定方法，它主要包括河蚬训养、藻类培养、河蚬滤水试验、取样及藻细胞密度测定和数据分析等过程。具体步骤如下：
1. 河蚬驯养。从自然水体采集河蚬，迅速带回实验室，暂养在水簇箱中，充气培养。暂养用水为曝气48h的自来水，水温控制在23℃，pH在8.0上下，溶氧6.5mg/L以上。每天投喂蛋白核小球藻一次，藻细胞密度大约为105cells/L。每天换水一次，换水量为总水量的一半。暂养时间为7d（天）。
2. 藻细胞培养。从中国科学院武汉水生生物研究所中国淡水藻种库购买蛋白核小球藻，利用BG-11培养基扩大培养。培养条件：温度 25℃，光强3000Lex，光照周期12h：12h，每天早晚各摇动一次，并检测藻细胞的生长情况。当细胞进入静止期，离心收集藻细胞，置于4℃冰箱，尽快用于实验。
3. 河蚬滤水率实验
实验开始前1d河蚬停止喂食，挑选健康河蚬用于实验，体重约为1-2克，以约1.5g为最佳。用1L（升）玻璃烧杯用于实验，添加500mL曝气自来水，放入5只河蚬，15min后加入藻细胞。藻细胞密度设置6个浓度组：103、5×103、104、5×104、105、5×105和106 cells/mL，每组设置3个平行。采用静水实验法，实验过程中不充气。为防止藻细胞下沉，每隔半小时用玻璃棒轻轻搅动烧杯中水体。2h后实验结束，从每个烧杯中取1mL水样，装入1.5mL离心管中用于测定藻细胞密度。
4. 流式细胞仪测定藻细胞密度。
选择具有计数功能的流式细胞仪用于测定藻细胞密度。打开流式细胞仪，待状态稳定后开始检测。设定好流速、时间及计数数量等参数。将待测水样在振荡器充分混匀，直接上样检测。选择侧向角和叶绿素荧光2个参数圈选藻细胞，将细菌排除，获得藻细胞密度。
5. 计算河蚬滤水率。 根据下面公式计算河蚬的滤水率。
FR=V×ln(C 0 /C t )/(N×t)
其中， FR：滤水率（L/h）； V：实验水体积（L）； C o：实验开始时藻细胞密度（cells/mL）；Ct：实验结束后藻细胞密度（cells/mL）； N：，河蚬个体数（个）； t：实验时间（h）。
6. 统计分析
重复进行1-5实验获取河蚬在不同藻细胞密度条件下的滤水率，然后采用SPSS软件中的ANOVA方法进行差异性分析。根据分析结果，确定河蚬适宜的投饵量。具体的滤水率与投饵量之间的关系可参见相关的河蚬养殖手册或教科书、手册等资料，本发明不再一一列举。
本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。
Claims (4)
1.一种基于流式细胞术的河砚滤水率快速测定方法，其特征是它包括以下步骤：
（1）河蚬驯养；从自然水体采集河蚬，迅速带回实验室，暂养在水簇箱中，充气培养；每天投喂蛋白核小球藻一次；每天换水一次，换水量为总水量的一半，暂养时间为7d；
（2）藻细胞培养；从中国科学院武汉水生生物研究所中国淡水藻种库购买蛋白核小球藻，利用BG-11培养基扩大培养，培养条件：温度 25℃，光强3000Lex，光照周期12h：12h，每天早晚各摇动一次，并检测藻细胞的生长情况；当细胞进入静止期，离心收集藻细胞，置于4℃冰箱，尽快用于实验；
（3）河蚬滤水率实验；
实验开始前1d河蚬停止喂食，挑选健康河蚬用于实验，体重为1-2g；用1L玻璃烧杯用于实验，添加500mL曝气自来水，放入5只河蚬，15min后加入藻细胞；藻细胞密度设置6个浓度组：103、5×103、104、5×104、105、5×105和106 cells/mL，每组设置3个平行；采用静水实验法，实验过程中不充气；为防止藻细胞下沉，每隔半小时用玻璃棒轻轻搅动烧杯中水体；2h后实验结束，从每个烧杯中取1mL水样，装入1.5mL离心管中用于测定藻细胞密度；
（4）用流式细胞仪测定藻细胞密度；
选择具有计数功能的流式细胞仪用于测定藻细胞密度，打开流式细胞仪，待状态稳定后开始检测，设定好流速、时间及计数数量等参数，将待测水样在振荡器充分混匀，直接上样检测，选择侧向角和叶绿素荧光2个参数圈选藻细胞，将细菌排除，获得藻细胞密度；
（5）计算河蚬滤水率； 根据下面公式计算河蚬的滤水率；
FR=V×ln(C 0 /C t )/(N×t)
其中， FR：滤水率（L/h）； V：实验水体积（L）； C o：实验开始时藻细胞密度（cells/mL）；Ct：实验结束后藻细胞密度（cells/mL）； N：河蚬个体数（个）； t：实验时间（h）；
根据计算所得的河蚬的滤水率，制定科学放养密度和投饵量，以利于河蚬的生态健康绿色养殖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的河蚬驯养时暂养用水为曝气48h的自来水，水温控制在23℃，pH在8.0上下，溶氧6.5mg/L以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的河蚬驯养时投喂蛋白核小球藻的藻细胞密度为105cells/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是重复进行滤水率测定并进行统计分析；河蚬在不同藻细胞密度条件下的滤水率采用SPSS软件中的ANOVA方法进行差异性分析；根据分析结果，确定河蚬适宜的投饵量。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20181207 |