CN111650327B - 一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞或组织间差异表达蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞或组织间差异表达蛋白的方法，包括以下步骤：（1）鸡不同细胞或组织的组织或细胞蛋白提取；（2）对步骤（1）中得到的不同组的细胞或组织蛋白进行胰酶酶解；（3）酶解后的细胞或组织蛋白进行液相色谱‑质谱联用分析；（4）对分析结果进行数据库搜库和注释分析。通过本发明，本发明的优越性在于：1、本发明能够较快的获得不同组织和细胞之间的差异表达蛋白。2、方法简单可行，可重复性强，结果准确。3、该方法适用于其他物种。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞或组织间差异表达蛋白的方法，属于生物技术领域。
背景技术
蛋白质组学是一个行之有效的在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面认识的技术，也是系统地研究生物学规律和机制的成熟并且有效的工具。其基本原理则是对提取到的组织或细胞蛋白使用胰酶分解，再进行质谱分析，对得到的肽链进行比较和分析。进一步的，蛋白质组学主要可以分成两类，第一种是稳定同位素标记的定量蛋白质组学，比如iTRAQ；第二种是非标记的定量蛋白质组学技术，比如Label-free。iTRAQ定性定量结果更为准确，通量较高可同时标记2-8个样本，但是对样本数有一定限制且不适用于低丰度蛋白的定量，适合小样本量的项目；Label-free检测肽段范围广，单次可鉴定和定量较多的蛋白质，但由于样品单独进行质谱检测所以重现性较低，在大量算法的基础上更适合大量样本的蛋白组研究。目前，非标定量蛋白质组学已广泛应用于疾病的功能和机制研究之中。丛小骥等基于蛋白质组学技术对AMPK介导的磷酸化在DNA损伤反应中的分子机制,以及其与组蛋白乙酰化修饰之间的交互调控在其中的功能进行了深入的研究和阐述。周曼丽等基于差异蛋白组学研究了复方钩藤降压片与替米沙坦对左心室肥厚干预的作用。辛凯悦等则通过蛋白质组学分析了心肌肥厚预适应小鼠线粒体与正常小鼠之间的差异。但是关于蛋白组学在鸡生殖干细胞发育和分化过程中的方法并没有相关研究报道，且缺少统一明确描述，需要进一步的优化和改进。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的问题，提供一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞或组织间差异表达蛋白的方法。
本发明的目的是这样实现的，一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞或组织间差异表达蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)鸡不同细胞或组织的组织或细胞蛋白提取；
(2)对步骤(1)中得到的不同组的细胞或组织蛋白进行胰酶酶解；
(3)酶解后的细胞或组织蛋白进行液相色谱-质谱联用分析；
(4)对分析结果进行数据库搜库和注释分析。
步骤(1)中，包括以下步骤：
选择分离如皋黄鸡ESCs和PGCs细胞，分离后迅速置入液氮进行速冻，速冻后的样本置于－80℃冰箱进行保存，待全部样本采集完成后将样本从从－80℃取出，分别加入4倍体积裂解缓冲液(8M尿素、1％蛋白酶抑制剂、50uM PR-619)，超声裂解；4℃、12000g离心10min去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
步骤(2)中，包括以下步骤：
对蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min；之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min；最后将样本的尿素浓度稀释至低于2M；以1:50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜；再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h。
步骤(3)中，包括以下步骤：
将步骤(2)中消化得到的肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用NanoElute超高效液相系统进行分离；流动相A为含0.1％甲酸的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液；液相梯度设置：0-70min，6％～22％B；70-84min，22％～32％B；84-87min，32％～80％B；87-90min，80％B，流速维持在400nL/min；肽段经由超高效液相系统分离后被注入Capillary离子源中进行电离然后进tims-TOF Pro质谱进行分析；离子源电压设置为1.55kV，肽段母离子及其二级碎片都使用TOF进行检测和分析；二级质谱扫描范围设置为100-1700m/z；数据采集模式使用平行累积串行碎裂(PASEF)模式；一张一级质谱采集后进行10次PASEF模式采集母离子电荷数在0-5范围内的二级谱图，串联质谱扫描的动态排除时间设置为24秒避免母离子的重复扫描。
步骤(4)中，包括以下步骤：
二级质谱数据使用Maxquant(v1.6.6.0)进行检索；检索参数设置：数据库为UniProtGallus_gallus(29475条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为40ppm和40ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.04Da；将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化；蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％；
对得到的蛋白库进行生物信息学分析，分析包括蛋白注释(包括Gene Ontology分析、蛋白结构域注释、KEGG通路注释和亚细胞定位)、蛋白质功能富集(包括GO富集分析、通路富集分析和蛋白结构域富集分析)、蛋白功能富集的聚类分析和蛋白互作网络分析。
本发明方法先进科学，通过本发明，提供的一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞或组织间差异表达蛋白的方法，克服现有技术缺点，采用本方法能够通过组学方法快速寻找鸡不同细胞或组织间差异表达蛋白，该方法目前在鸡上尚无应用。本方法适用于鸡不同细胞或组织间大规模水平上差异蛋白表达的鉴定。本发明的优越性在于：
1、本发明能够较快的获得不同组织和细胞之间的差异表达蛋白。
2、方法简单可行，可重复性强，结果准确。
3、该方法适用于其他物种。
附图说明
图1为如皋黄鸡ESCs和PGCs细胞间差异表达蛋白分析和富集结果中，不同比较组中差异表达蛋白数量分布柱形图。
图2为如皋黄鸡ESCs和PGCs细胞间差异表达蛋白分析和富集结果中，重复样本间蛋白定量RSD分布箱线图。
图3为如皋黄鸡ESCs和PGCs细胞间差异表达蛋白分析和富集结果中，差异表达蛋白在GO二级分类中统计分布图。
图4为如皋黄鸡ESCs和PGCs细胞间差异表达蛋白分析和富集结果中，差异表达蛋白的亚细胞结构定位分布图。
图5为如皋黄鸡ESCs和PGCs细胞间差异表达蛋白分析和富集结果中，差异表达蛋白在KEGG通路中富集分布气泡图。
图6为如皋黄鸡ESCs和PGCs细胞间差异表达蛋白分析和富集结果中，蛋白结构域富集的聚类分析热图。
具体实施方式
(1)本实施例中选择分离如皋黄鸡ESCs和PGCs细胞，分离后迅速置入液氮进行速冻，速冻后的样本置于－80℃冰箱进行保存，待全部样本采集完成后将样本从从－80℃取出，分别加入4倍体积裂解缓冲液(8M尿素，1％蛋白酶抑制剂，50uM PR-619)，超声裂解。4℃，12000g离心10min，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
(2)对蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜。再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h。
(3)将(2)中消化得到的肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用NanoElute超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液。液相梯度设置：0-70min，6％～22％B；70-84min，22％～32％B；84-87min，32％～80％B；87-90min，80％B，流速维持在400nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入Capillary离子源中进行电离然后进tims-TOF Pro质谱进行分析。离子源电压设置为1.55kV，肽段母离子及其二级碎片都使用TOF进行检测和分析。二级质谱扫描范围设置为100-1700m/z。数据采集模式使用平行累积串行碎裂(PASEF)模式。一张一级质谱采集后进行10次PASEF模式采集母离子电荷数在0-5范围内的二级谱图，串联质谱扫描的动态排除时间设置为24秒避免母离子的重复扫描。
(4)二级质谱数据使用Maxquant(v1.6.6.0)进行检索。检索参数设置：数据库为UniProt Gallus_gallus(29475条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为40ppm和40ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.04Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化。蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
(5)对得到的蛋白库进行生物信息学分析，分析包括蛋白注释(包括GeneOntology分析，蛋白结构域注释，KEGG通路注释和亚细胞定位)，蛋白质功能富集(包括GO富集分析，通路富集分析和蛋白结构域富集分析)，蛋白功能富集的聚类分析和蛋白互作网络分析。本例中相关的分析结果如图1所示。表一：样品制备所需材料和试剂
表二：分析使用软件
Claims (2)
1.一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞间差异表达蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)鸡不同细胞蛋白提取，包括以下步骤：
选择分离如皋黄鸡ESCs和PGCs细胞，分离后迅速置入液氮进行速冻，速冻后的样本置于－80℃冰箱进行保存，待全部样本采集完成后将样本从－80℃取出，分别加入4倍体积裂解缓冲液,所述裂解缓冲液为8M尿素、1％蛋白酶抑制剂、50μM PR-619，超声裂解；4℃、12000g离心10min去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定；
(2)对步骤(1)中得到的不同组的细胞蛋白进行胰酶酶解，包括以下步骤：
对蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min；之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min；最后将样本的尿素浓度稀释至低于2M；以1:50的胰酶：蛋白质量比例加入胰酶，37℃酶解过夜；再以1:100的胰酶：蛋白质量比例加入胰酶，继续酶解4h；
(3)酶解后的细胞蛋白进行液相色谱-质谱联用分析，包括以下步骤：
将步骤(2)中消化得到的肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用NanoElute超高效液相系统进行分离；流动相A为含0.1％甲酸的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液；液相梯度设置：0-70min，6％～22％B；70-84min，22％～32％B；84-87min，32％～80％B；87-90min，80％B，流速维持在400nL/min；肽段经由超高效液相系统分离后被注入Capillary离子源中进行电离然后进tims-TOF Pro质谱进行分析；离子源电压设置为1.55kV，肽段母离子及其二级碎片都使用TOF进行检测和分析；二级质谱扫描范围设置为100-1700m/z；数据采集模式使用平行累积串行碎裂PASEF模式；一张一级质谱采集后进行10次PASEF模式采集母离子电荷数在0-5范围内的二级谱图，串联质谱扫描的动态排除时间设置为24秒避免母离子的重复扫描；
(4)对分析结果进行数据库搜库和注释分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞间差异表达蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)中，包括以下步骤：
二级质谱数据使用Maxquantv1.6.6.0进行检索；检索参数设置：数据库为UniProtGallus_gallus29475条序列，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为40ppm和40ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.04Da；将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化、蛋白N端的乙酰化；蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％；
对得到的蛋白库进行生物信息学分析，分析包括蛋白注释、蛋白质功能富集、蛋白功能富集的聚类分析和蛋白互作网络分析，所述蛋白注释包括Gene Ontology分析、蛋白结构域注释、KEGG通路注释和亚细胞定位，所述蛋白质功能富集包括GO富集分析、通路富集分析和蛋白结构域富集分析。
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