CN110596403B - 用于卵巢癌诊断的特异性蛋白标记物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于卵巢癌诊断的特异性蛋白标记物及制法，特异性蛋白标记物其组成成份为血清外泌体中的C反应蛋白、溶质转运蛋白家族11成员2、泛素样含PHD和环指域蛋白1；其制法包括蛋白提取、胰酶酶解、TMT标记、HPLC分级、液相色谱‑质谱联用分析、数据库搜索、蛋白鉴定、蛋白差异表达分析、蛋白注释及生物蛋白标记物筛选之步骤。本发明具有以下优点：(1)具有较高的敏感性和特异性；(2)可以显著区分卵巢恶性肿瘤与良性肿瘤/健康人群；(3)制备流程清晰，可操作性强，可重复性强。

Description

用于卵巢癌诊断的特异性蛋白标记物及制备方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于卵巢癌诊断的特异性蛋白标记物及制备技术。

背景技术

上皮性卵巢癌(以下简称卵巢癌)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，因其早期诊断困难，治疗效果不佳，故其病死率居妇科恶性肿瘤首位，甚至超过宫颈癌和子宫内膜癌的综合，严重威胁妇女的健康。

早期卵巢癌可能会发发生腹腔内转移，多数患者直至晚期才出现临床症状，因而卵巢癌确诊时75％的患者已属晚期，仅有25％的患者在I其被发现，而晚期卵巢癌(III～IV期)患者5年生存率仅在20％-40％，但早期卵巢癌(I～II期)患者5年生存率却在70％以上。有研究发现，卵巢癌发病率近年来有逐渐升高的趋势，因此寻找敏感度和特异度均较高的肿瘤标记物有助于卵巢癌的早期诊断，从而进一步提供生存率，为临床诊治提供参考。糖类抗原125(CA125)是一种糖蛋白，主要存在于胎儿体腔上皮分化而来的心包积液、腹膜等组织中，也存在与上皮性卵巢癌组织和卵巢癌患者的血清中，是卵巢癌的主要相关抗原，能够用来诊断卵巢癌。CA125作为卵巢癌肿瘤标记物已有30余年，是卵巢癌生物标记物中发现最早、研究最明确的肿瘤标记物。目前采用CA125 35U/mL作为诊断良、恶性肿瘤的临界值，80％的上皮性卵巢癌患者CA125升高，50～60％的I期患者和75％～90％的晚期患者CA125升高。利用放射学手段可以在出现临床症状前2～3个月发现卵巢癌，联合CA125检测时，可临床症状5个月。对于减瘤术后患者，CA125在1～2个月内科降至正常水平，如果CA125值持续异常，则预示有复发和死亡的可能，以35U/mL为标准判断肿瘤有无复发，敏感度为89％，特异度为92％；而卵巢癌患者完全缓解后CA125下降至正常值，如再上升5U/mL或10U/mL均有复发可能。因此，CA125是诊断上皮性卵巢癌、判断治疗效果、观察肿瘤复发的重要指标。但CA125除了高表达于卵巢癌外，子宫内膜异位症、早期妊娠、炎症、子宫肌瘤、肾功能障碍、消化道恶性肿瘤(如胰腺癌、肝癌、胃癌、肠癌)以及慢性胰腺炎、慢性肝炎、肝硬化、肺腺癌等都伴有CA125表达升高，并易受月经周期和妊娠的影响，且CA125在20％的卵巢癌患者血清中很少或几乎没有，这限制了其作用。因此，寻找优于CA125的新卵巢癌标记物和最佳联合诊断方法对于卵巢癌筛查和诊断具有重要意义。

外泌体是细胞分泌的小囊泡，广泛存在于人体体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液、精液、腹水、羊水、支气管肺泡液及乳汁等。外泌体中含有大量的蛋白质、脂质、mRNA、非编码RNA等内容物，广泛参与细胞间的物质运输和信号转到并且具有免疫调节、细胞迁移、介导细胞分化等功能。虽然外泌体的发现已有30多年的历史，但在疾病的诊断、预测预后等方面的研究还处于不断的探索之中，随着快速大量制备纯化外泌体技术和内容物的提取、筛选技术不断提高，有关外泌体应用的研究将会不断深入，其作为疾病早期诊断、疾病监测、预后评价以及治疗载体等方面都有较好的应用前景。

发明内容

针对现有卵巢癌特异性蛋白标记物的缺点，本发明的目的在于提供一种用于卵巢癌诊断的特异性蛋白标记物及制备方法，对于临床指导卵巢癌的筛查和诊断有巨大帮助。

为实现上述目的，本发明用于卵巢癌诊断的特异性蛋白标记物，其组成成份为血清外泌体中的C反应蛋白(C Reactive Protein,CRP)、溶质转运蛋白家族11成员2(SoluteCarrier Family 11 Member 2,SLC11A2)、泛素样含PHD和环指域蛋白1(Ubiquitin-LikePHD and RING Finger Domain-containing Protein 1，UHRF1)。

用于卵巢癌诊断的特异性蛋白标记物的制备方法包括以下步骤：

(1)收集卵巢癌患者全血5mL，3000rpm离心10分钟后收集血清，冻存于－80℃；

(2)样品4℃，12000g离心15分钟，上清液用0.22μM微孔滤膜过滤后，用iZON公司生产的试剂盒参照qEV original Size Exclusion Column说明书分离外泌体；

(3)1％Triton超声裂解外泌体中的蛋白后利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，以1:50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜，再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h将胰酶酶解为肽段；

(4)胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥；以0.5MTEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段，标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥；

(5)肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH 9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为9个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥；

(6)肽段用液相色谱流动相A相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC1200超高效液相系统进行分离；流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液；液相梯度设置：0～38min，6％-22％B；38～52min，22％-32％B；52～56min，32％-80％B；56～60min，80％B，流速维持在450nL/min；肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进Q ExactiveTM HF-X质谱进行分析；

(7)二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行数据库检索；

(8)质谱分析共得到858855张二级谱图，质谱二级谱图经蛋白理论数据搜库后，得到可利用有效谱图数为52992；通过谱图解析共鉴定到15089条肽段，其中特异性肽段为14180；一共鉴定到1119个蛋白，其中998个可定量；

(9)通过多次全蛋白定量重复实验，分别得到每个样本在多次重复中的定量值；第一步计算比较组中两个样本间蛋白的差异表达量，首先计算出每个样本在多次重复中定量值的平均值，然后再计算两个样本之间平均值的比值，该比值作为比较组最终的差异表达量；第二步计算该蛋白在两个样本中的差异表达显著性P-value，首先将各个样本的相对定量值取log2(以使得数据符合正态分布)，然后用双样本双尾T检验方法计算p-value；当p-value<0.05时，以差异表达量变化超过1.2作为显著上调的变化阈值；

(10)对鉴定到的蛋白质到的功能、特征等从基因本论、蛋白结构域、KEGG通路、COG功能分类以及亚细胞结构定位等方面进行详细的注释；

(11)将在卵巢恶性肿瘤对比于健康人群及良性肿瘤人群均有显著升高的定义为候选蛋白，以经典的卵巢癌生物标记物MUC16(CA125)作为参照标准，以差异倍数大于MUC16的蛋白定义为目标蛋白，因此筛选出CRP、SLC11A2、UHRF1蛋白这一组卵巢癌特异性生物标志物。

与现有卵巢癌血清标记物相比，本发明提供的卵巢癌特异性生物蛋白标记物具有以下优点：(1)具有较高的敏感性和特异性；(2)可以显著区分卵巢恶性肿瘤与良性肿瘤/健康人群；(3)制备流程清晰，可操作性强，可重复性强。

本发明的生物蛋白标记物通过对疑似患者的血清外泌体中的生物蛋白标记物的分析，实现卵巢癌的早期诊断，为卵巢癌的诊疗，治疗效果判断，治疗后监测提供可靠依据。

附图说明

图1为本发明生物蛋白标记物质谱平台筛选的分组信息。

图2为血清中提取的外泌体的电镜图片。

图3为质谱平台进行的蛋白鉴定统计表。

图4为差异蛋白统计信息。

图5为表达水平明显升高的蛋白。

图6为CRP蛋白在健康人群、良性肿瘤患者、恶性肿瘤患者血清外泌体中水平。

图7为SLC11A1蛋白在健康人群、良性肿瘤患者、恶性肿瘤患者血清外泌体中水平。

图8为UHRF1蛋白在健康人群、良性肿瘤患者、恶性肿瘤患者血清外泌体中水平。

图9为MUC16蛋白在健康人群、良性肿瘤患者、恶性肿瘤患者血清外泌体中水平。

图10为MUC16蛋白在恶性肿瘤患者与健康人群/良性肿瘤患者的血清外泌体中水平的ROC曲线。

图11为CRP蛋白在恶性肿瘤患者与健康人群/良性肿瘤患者的血清外泌体中水平的ROC曲线。

具体实施方式

一：本发明基于质谱平台检测卵巢癌血清外泌体中特异性生物蛋白标记物鉴定及筛选：

1、实验材料收集：

收集正常健康人群、卵巢良性囊腺瘤、卵巢恶性肿瘤患者血清各9例。使用BD公司的真空采血管收集5mL全血，立即3000rpm离心后转移上清至新离心管，冻存于负80℃。

2、主要实验方法：

TMT技术是近年来研发的一种多肽体外标记技术，为同时比较多组不同样品中蛋白质的相对含量提供了便利。本发明通过将TMT标记、高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术的有机结合对样本进行定量蛋白组的研究。分别选取健康组/良性组/恶性组血清样本各9例进行TMT标记-HPLC分级-液相色谱-质谱串联分析(分组信息参阅图1)。

3、具体实验步骤：

(1)蛋白提取

样品从－80℃取出，4℃，12000g离心15分钟，上清液转移至新的离心管，0.22μM微孔滤膜过滤后，用iZON公司生产的试剂盒参照qEV original Size Exclusion Column说明书分离外泌体(外泌体电镜图参阅图1)。加入终浓度为1％Triton以及蛋白酶抑制剂超声裂解，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。

(2)胰酶酶解

蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min。加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。将样品的尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜。再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h。

(3)TMT标记

胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。以0.5MTEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。

(4)HPLC分级

肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH 9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为9个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。

(5)液相色谱-质谱联用分析

肽段用液相色谱流动相A相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0～38min，6％-22％B；38～52min，22％-32％B；52～56min，32％-80％B；56～60min，80％B，流速维持在450nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进Q ExactiveTM HF-X质谱进行分析。离子源电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1600m/z，扫描分辨率设置为120,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为30,000。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为1E5，信号阈值设置为830000ions/s，最大注入时间设置为60ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒避免母离子的重复扫描。

(6)数据库搜索

二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置：数据库为SwissProt Human(20387条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化和天冬酰胺的脱酰胺化。定量方法设置为TMT-10plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。

(7)蛋白鉴定

通过质谱分析共得到858855张二级谱图。质谱二级谱图经蛋白理论数据搜库后，得到可利用有效谱图数为52992，谱图利用率为6.2％。通过谱图解析共鉴定到15089条肽段，其中特异性肽段为14180。我们一共鉴定到1119个蛋白，其中998个可定量(定量蛋白表示至少一个比较组有定量信息)，结果参阅图3。

(8)蛋白差异表达分析

通过多次全蛋白定量重复实验，分别得到了每个样本在多次重复中的定量值。第一步计算比较组中两个样本间蛋白的差异表达量，首先计算出每个样本在多次重复中定量值的平均值，然后再计算两个样本之间平均值的比值，该比值作为比较组最终的差异表达量。第二步计算该蛋白在两个样本中的差异表达显著性P-value，首先将各个样本的相对定量值取log2(以使得数据符合正态分布)，然后用双样本双尾T检验方法计算p-value。当p-value<0.05时，以差异表达量变化超过1.2作为显著上调的变化阈值，小于1/1.2作为显著下调的变化阈值，结果参阅图4。

(9)蛋白注释

对鉴定到的蛋白质到的功能、特征等从基因本论、蛋白结构域、KEGG通路、COG功能分类以及亚细胞结构定位等方面进行详细的注释。

(10)生物蛋白标记物筛选

本发明旨在筛选特异性的卵巢癌血清生物标记蛋白，可以将卵巢恶性肿瘤显著区分良性卵巢肿瘤和健康人群。因而在卵巢恶性肿瘤对比于健康人群及良性肿瘤人群均有显著升高的定义为候选蛋白，请参阅图5。其中，CRP、SLC11A2、UHRF1蛋白显著升高，且差异倍数大于经典的卵巢癌生物标记物MUC16(CA125)，因此筛选为一组卵巢癌特异性生物标志物。

二、生物标记物检测效能

1、CRP、SLC11A2、UHRF1蛋白在恶性肿瘤患者与健康人群/良性肿瘤患者中的血清水平的比较:

(1)主要方法：利用graphpad软件进行三组数据比较的统计分析，比较恶性组患者血清外泌体中的CRP、SLC11A2、UHRF1蛋白相比于健康人群或者良性肿瘤患者的水平，通过非配对T检验方法检验他们之间的差异是否具备统计学差异。

(2)结果：基于质谱方法检测的卵巢恶性肿瘤患者血清外泌体中CRP、SLC11A2、UHRF1蛋白水平明显高于健康人群和良性肿瘤患者(参阅图6，图7，图8，图9)。

2、以CRP、SLC11A2、UHRF1蛋白作为基于质谱平台检测的卵巢癌血清外泌体中生物蛋白标记物的性能检测。

(1)具体方法：以ROC曲线判断CRP、SLC11A2、UHRF1蛋白作为卵巢癌血清外泌体中生物蛋白标记物的分类器性能指标。利用graphpad软件进行恶性肿瘤组与健康人群/良性肿瘤患者的ROC曲线绘制。设置对照组为健康人群/良性肿瘤患者，疾病组为恶性肿瘤患者的血清外泌体中的CRP、SLC11A2、UHRF1蛋白水平，设置95％的置信区间，以百分比(percentage)输出结果，即AUC(ROC曲线下与坐标轴围成的面积)。

(2)结果：通过ROC曲线计算，CRP蛋白的AUC为0.9028，高于MUC16的AUC(0.8210)，参阅图10、图11，有潜力成为由于CA125的卵巢恶性肿瘤基于质谱方法检测的卵巢癌特异性血清标记物。

Claims (1)

1.一种用于卵巢癌诊断的特异性蛋白标记物的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)收集卵巢癌患者全血5mL，3000rpm离心10分钟后收集血清，冻存于－80℃；

(2)样品4℃，12000g离心15分钟，上清液用0.22μM微孔滤膜过滤后，用iZON公司生产的试剂盒参照qEV original Size Exclusion Column说明书分离外泌体；

(3)1％Triton超声裂解外泌体中的蛋白后利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，以蛋白质量比例1/50加入胰酶，37℃酶解过夜，再以蛋白质量1/100加入胰酶，继续酶解4h将胰酶酶解为肽段；

(4)胰酶酶解的肽段用Strata X C18-Phenomenex除盐后真空冷冻干燥；以0.5M TEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段，标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥；

(5)肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH 9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为9个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥；

(6)肽段用液相色谱流动相A相0.1％体积分数甲酸水溶液溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离；流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液；液相梯度设置：0～38min，6％-22％B；38～52min，22％-32％B；52～56min，32％-80％B；56～60min，80％B，流速维持在450nL/min；肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进Q ExactiveTM HF-X质谱进行分析；

(7)二级质谱数据使用Maxquant v1.5.2.8 进行数据库检索；

(8)质谱分析共得到858855张二级谱图，质谱二级谱图经蛋白理论数据搜库后，得到可利用有效谱图数为52992；通过谱图解析共鉴定到15089条肽段，其中特异性肽段为14180；一共鉴定到1119个蛋白，其中998个可定量；

(9)通过多次全蛋白定量重复实验，分别得到每个样本在多次重复中的定量值；第一步计算比较组中两个样本间蛋白的差异表达量，首先计算出每个样本在多次重复中定量值的平均值，然后再计算两个样本之间平均值的比值，该比值作为比较组最终的差异表达量；第二步计算该蛋白在两个样本中的差异表达显著性P-value，首先将各个样本的相对定量值取log2，以使得数据符合正态分布，然后用双样本双尾T检验方法计算p-value；当p-value<0.05时，以差异表达量变化超过1.2作为显著上调的变化阈值；

(10)对鉴定到的蛋白质到的功能、特征等从基因本论、蛋白结构域、KEGG通路、COG功能分类以及亚细胞结构定位等方面进行详细的注释；

(11)将在卵巢恶性肿瘤对比于健康人群及良性肿瘤人群均有显著升高的定义为候选蛋白，以经典的卵巢癌生物标记物MUC16-CA125作为参照标准，以差异倍数大于MUC16的蛋白定义为目标蛋白，因此筛选出CRP、SLC11A2、UHRF1蛋白这一组卵巢癌特异性生物标志物。

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