CN115032395A - 鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物，所述血浆蛋白标志物包括PRDX2、PON1或APOC3中的一种或几种；将所述的新型血浆蛋白DPRX2、PON1、APOC3与CT指标结节毛刺征、结节血管切迹征、结节分叶征和临床传统肿瘤标志物CEA、CA125和CYFRA21‑1九种变量联合构建LUAD和BPN的鉴别诊断模型，该模型对肺腺癌和良性肺部结节患者具有良好的鉴别诊断效能，对肺部结节患者的管理及鉴别具有重要意义。

Description

鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物及其应用。
背景技术
肺癌可分为非小细胞肺癌(Non- small cell lung carcinoma，NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung carcinoma，SCLC)两大类。NSCLC主要包括三种类型：肺腺癌(Lungadenocarcinoma，LUAD)、肺鳞癌(Lung squamous cell carcinoma，LUSC)和大细胞肺癌，其中LUAD作为NSCLC中最常见的组织学亚型，约占肺癌的40％。大量研究表明，肺腺癌经常发生于女性和非吸烟者中，患有原位腺癌和微浸润腺癌的肺癌患者在接受完全切除的根治手术后，其五年无瘤生存率接近 100％。因此，肺腺癌早期诊断策略的完善是降低肺癌死亡率的关键。近年来，低剂量计算机断层扫描技术(Low-dose computed tomography，LDCT)广泛应用于高危人群的肺癌筛查，显著地降低了肺癌的死亡率。但与此同时，大量受试者被检出肺部结节，此类患者的临床管理成为一大挑战。绝大多数肺部结节患者无法从常规检查中获得重要信息，即无法有效区分良恶性，经LDCT诊断为LC的患者中，其假阳性率高达21.8％-26.6％，因此，过度诊断对患者的身体和经济均造成不必要的伤害。血液肿瘤相关标志物检测是最容易被患者所接受的诊断方法，但目前临床用于肺癌检测的肿瘤标志物(CEA、CA125和CYFRA21-1等) 虽可有效的区分肺癌患者和健康人群，但其在肺部结节患者中的良恶性鉴别方面效果不佳。因此，仍需进一步研究开发和验证可有效用于良恶性肺部结节鉴别诊断的无创性生物学标志物或其组合。
血浆蛋白质组是人体最复杂的蛋白质组之一，含有来自多个器官和组织的分泌蛋白，在一定程度上反映个体的生理机能。此外，与骨髓穿刺等其他组织采样的方法相比，血液很容易在标准操作下获得，而这种创伤小易被患者所接受的采样方法也极大地促进了生物标志物在临床上的广泛应用。因此，本研究旨在基于质谱的非标记定量技术，对肺腺癌患者和良性肺部结节(Benign pulmonary nodules，BPN)患者的血浆样本进行定量蛋白质组研究，进而筛选肺腺癌和良性肺部结节患者之间的差异蛋白。通过进一步验证，将具有较好鉴别诊断价值的血浆蛋白标志物或其组合作为临床上对肺部结节患者的管理及鉴别诊断的潜在工具。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种用于鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物及其应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物，所述血浆蛋白标志物包括PRDX2、PON1或APOC3中的一种或几种。
一种用于鉴别肺腺癌和良性肺部结节的检测试剂盒，所述的试剂盒包含所述的血浆蛋白标志物。
所述的鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物的应用。
本发明还提供了所述的鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物的筛选方法，具体包括以下步骤：
(1)采集肺腺癌患者和肺部结节患者的血液样品，经分离处理后获得血浆样本；
(2)非标记定量蛋白质组学检测；
(3)筛选鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物；
所述的非标记蛋白组学检测包括：蛋白提取、胰酶酶解、液相色谱质谱联用分析、数据库搜库、蛋白的FC值和P值计算；
所述步骤(3)筛选鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物后，还包括：肺腺癌和良性肺部结节的差异血浆蛋白ELISA验证；所述的差异血浆蛋白ELISA验证包括：差异蛋白的最佳血浆稀释倍数确定；对血浆样本按照试剂盒说明进行ELISA检测；对所得数据进行统计分析。
本发明还提供了一种用于鉴别肺腺癌和良性肺部结节的诊断模型的构建方法，其是应用 Logistic回归分析输入法将所述的3种鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白(PRDX2、 PON1和APOC3)、3种CT指标(毛刺征、血管切迹和分叶征)和3种临床标志物 (CEA、CA125和CYFRA21-1)联合进而构建肺腺癌诊断模型PRE(P＝LUAD，model) ＝1/(1+EXP(﹣(0.010×PRDX2+0.052×APOC3+0.002×PON1+1.112×毛刺征+1.161 ×血管切迹征+0.535×分叶征﹣0.084×CEA﹣0.004×CA125﹣0.404×CYFRA21-1﹣ 7.697)))。
进一步地，所述的诊断模型的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)分组：挑选CT信息及临床传统肿瘤标志物CEA、CA125和CYFRA21-1信息齐全的患者作为样本分为肺腺癌患者组和良性肺部结节患者组；
(2)将所述的3种鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白PRDX2、PON1和APOC3； 12种CT指标结节数目、直径、边缘、空洞征、毛刺征、血管切迹、分叶征、棘突征、胸膜凹陷征、纵膈淋巴结肿大、肺气肿和钙化情况和3种临床肿瘤标志物CEA、CA125和 CYFRA21-1用于鉴别诊断步骤(1)所述的样本的单因素分析；获得在肺腺癌患者和良性肺部结节患者中的差异具有统计学意义(P<0.01)的13种指标：3种所述的鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白PRDX2、PON1和APOC3、7种CT指标(毛刺征、血管切迹、分叶征、棘突征、胸膜凹陷征、纵膈淋巴结肿大和钙化情况)和3种临床标志物(CEA、CA125 和CYFRA21-1)；
(3)通过ROC分析评估上述13种指标的鉴别诊断效能，以AUC>0.5且P<0.05的标准筛选出9种有意义指标，包括所述的3种鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白 PRDX2、PON1和APOC3、3种CT指标毛刺征、血管切迹和分叶征和3种临床标志物 CEA、CA125和CYFRA21-1。
(4)根据筛选出的9种有意义指标，使用Logistic回归分析输入法分别构建诊断模型。
有益效果
本发明通过非标记定量蛋白质组学技术及酶联免疫吸附实验筛选并鉴定可用于LUAD (肺腺癌)和BPN(良性肺部结节)鉴别诊断的新型血浆蛋白标志物(PRDX2、PON1和APOC3)。将有鉴别诊断潜力的新型血浆蛋白(PRDX2、PON1和APOC3)与CT指标结节毛刺征、结节血管切迹征、结节分叶征和临床传统肿瘤标志物(CEA、CA125和CYFRA21- 1)九种变量联合构建LUAD和BPN的鉴别诊断模型，该模型对肺腺癌和良性肺部结节患者具有良好的鉴别诊断效能，为临床较好地管理肺部结节患者提供帮助。
附图说明
图1是实施例1差异蛋白标志物的筛选及初步分析图；
其中，(A)火山图：Up代表上调蛋白，Down代表下调蛋白；(B)热图：12种差异蛋白在LUAD组和BPN组内的相对丰度；(C)12种差异蛋白在LUAD组和BPN组内的PCA 分析；(D)PCA分析所得12个主成分的各自贡献比值；注：LUAD：肺腺癌；BPN：良性肺部结节；PCA：主成分分析；FC：差异倍数。
图2是实施例1验证组一中9种差异蛋白的ELISA检测结果；
其中，(A-I)9种差异蛋白在肺腺癌患者(n＝39)及良性肺部结节患者(n＝39)中的表达情况；(J-L)3种候选蛋白在肺腺癌及良性肺部结节患者中的诊断效能评估；注： LUAD：肺腺癌；BPN：良性肺部结节。
图3是实施例1验证组二中3种候选蛋白的ELISA检测结果；
其中，(A-C)3种候选蛋白在良性肺部结节患者(n＝107)、肺腺癌患者(n＝107)、肺鳞癌患者(n＝58)、小细胞肺癌患者(n＝48)及正常对照(n＝44)中的表达情况；(D-F)3种候选蛋白在肺腺癌及良性肺部结节患者中的诊断效能评估；注：LUAD：肺腺癌；BPN：良性肺部结节；LUSC：肺鳞癌；SCLC：小细胞肺癌。
图4是实施例2中3种候选蛋白组合、CT指标组合、临床标志物组合及鉴别诊断模型在肺腺癌(n＝97)和良性肺部结节(n＝71)患者中的诊断效能评估；
其中，(A)不同组合在肺腺癌和良性肺部结节患者中的ROC分析；(B)与金标准病理评估相比，各种组合的良恶性预测效能；注：3proteins：PRDX2/PON1/APOC3，候选蛋白组合；3CT features：毛刺征/血管切迹/分叶征，CT指标组合；3markers：CEA/CA125/CYFRA21-1，临床标志物组合。
图5是实施例2中鉴别诊断模型在不同临床特征肺腺癌患者中的诊断效能；
其中，(A)鉴别诊断模型用于区分不同临床特征肺腺癌患者及良性肺部结节患者的灵敏度；(B)鉴别诊断模型用于区分不同临床特征肺腺癌患者及良性肺部结节患者的AUC；注：将最大约登指数所对应的模型预测值定义为截断值，不同亚组肺腺癌患者与良性肺部结节患者间的比较通用同一截断值，特异度均为90.14％；图中虚线代表鉴别诊断模型在区分所有肺腺癌患者与良性肺部结节患者时所对应的灵敏度和AUC；DMP：远端转移阳性；DMN：远端转移阴性；LMP：淋巴结转移阳性；LMN：淋巴结转移阴性；Advanced：晚期；Early：早期。
具体实施方式
下面结合具体实施例以及附图对本发明的技术方案进行详细阐述，本发明所使用原料如无特殊说明，均可从市售获得，所采用的方法如无特殊说明均为常规方法。
实施例1
血浆蛋白标志物的筛选与验证
1、研究对象临床数据收集
通过比对受试者ID、姓名、性别及年龄，在医院患者管理系统中查阅并收集所有良恶性肺部结节患者的临床信息，包括吸烟史、肺部结节性质、病理类型、TNM分期(仅恶性)和淋巴结转移及远端转移情况(仅恶性)。由经验丰富的影像科专家对肺部结节患者的 CT特征进行判断并记录，包括结节数目、直径(最长直径)、边缘(规则、不规则)、空洞征(有、无)、毛刺征(有、无)、血管切迹(有、无)、分叶征(有、无)、棘突征(有、无)、胸膜凹陷征(有、无)、纵膈淋巴结肿大(有、无)、肺气肿(有、无)和钙化(有、无)共12种CT特征。采集肺部结节患者的临床传统肿瘤标志物结果，主要包括3种肺癌相关指标(CEA、CA125、CYFRA21-1)。
本研究中纳入研究对象462例，分为筛选组、验证组一和验证组二，筛选组：10例肺腺癌患者和10例良性肺部结节患者；验证组一：39例肺腺癌患者和39例良性肺部结节患者；验证组二：107例肺腺癌、107良性肺部结节、44例正常对照、58例肺鳞癌和48例小细胞肺癌患者；所有受试者的基本信息、病理分期及临床传统肿瘤标志物水平等信息都在病人同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准情况下，通过该医院内部系统进行汇总整理。具体研究对象基本信息如表1所示。
表1研究对象基本特征
Figure BDA0003688926290000051
Figure BDA0003688926290000061
注：LUAD：肺腺癌；BPN：良性肺部结节；NC：正常对照；LUSC：肺鳞癌；SCLC：小细胞肺癌；
Figure BDA0003688926290000062
Figure BDA0003688926290000063
均值±标准差
2、血浆标本的收集与处理
在所有受试者空腹状态下，使用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管采集其5ml外周静脉血。采血后2小时内将样本送至实验室，室温下以3000rpm/min的转速离心5分钟，以此分离血浆及血细胞。用一次性吸管吸取上层血浆，按照500μl/管的规格等分于1.5ml的Eppendorf管中，标记疾病类型、编号及日期并储存于负80℃的超低温冰箱内。在标本登记本上记录样本存放位置及其对应的患者基本信息等。使用时，将所需样本放置于4℃冰箱内缓慢解冻，并根据实验需要用量和布局将其分装于96孔板内，避免原管的反复冻融。
3、基于非标记定量血浆蛋白质组学技术筛选血浆差异蛋白
非标记定量血浆蛋白质组学分析委托于杭州景杰生物科技有限公司，通过非标定量技术和基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术的有机结合，对10例肺腺癌和10例良性肺部结节患者的血浆样本进行定量蛋白组的研究。
3.1实验具体操作步骤
1)蛋白提取：首先，将血浆样本从﹣80℃冰箱内取出，置于4℃冰箱内解冻，离心(4℃， 12000g，10min)以去除细胞碎片。接着，将上清液转移至新的离心管内，用Thermo公司生产的试剂盒参照PierceTM Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns Kit说明书去除高丰度蛋白。最后，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定并通过SDS-PAGE电泳的方式分析所提取蛋白的质量。
2)胰酶酶解：根据上述步骤中的浓度测定结果，取等量蛋白，以体积最大的样品为标准，用8M尿素调整其他样品体积，使其保持一致，加入终浓度5mM二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)于56℃孵育30分钟，冷却至室温后加入终浓度11mM碘代乙酰胺(Iodoacetamide，IAM)避光孵育15分钟。将烷基化好的样本转移至超滤管内进行离心 (室温，12000g，10min)，并用碳酸氢铵对样本进行3次置换处理，进而彻底置换样本中的尿素。加入胰蛋白酶液(蛋白酶：蛋白＝1：50，m/m)，37℃酶解过夜。离心(室温， 12000g，10min)回收肽段，加入酶解缓冲液再次离心(室温，12000g，10min)回收肽段，最终合并两次所得肽段溶液。
3)液相色谱质谱联用分析：用液相色谱流动相A相将肽段溶液溶解后使用EASY-nLC 1000 超高效液相系统对其进行分离。液相浓度设置为：0-90min，6％-25％B；90-112min，25％- 35％B；112-116min，35％-80％B；116-120min，80％B，流速维持在500nL/min。流动相A 为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离，然后进入Q ExactivePlus质谱进行分析。离子源电压设置为2.2kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，分辨率设置为17500。数据采集模式使用数据依赖型扫描程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前10名肽段母离子依次进入HCD碰撞池，使用 28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制设置为5E4，信号阈值设置为40000ions/s，最大注入时间设置为100ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒以此避免母离子的重复扫描。
4)数据库搜库：将二级质谱数据导入Maxquant软件(V1.5.2.8)进行检索。检索参数设置如下：数据库为Homo_sapiens_9606_SP_20191115(20380条序列)，添加反库以计算随机匹配造成的假阳性错误发现率(False discovery rate，FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为 2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰定义为甲硫氨酸的氧化、蛋白N端的乙酰化、脱酰胺化。蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR均设置为1％。
5)计算两组间蛋白的FC值和P值：本发明通过质谱分析技术检测蛋白在每个血浆样本中的对应信号丰度，通过非标定量的计算方法获得蛋白在每个样本中非标定量强度(Lable- Free Quantitative intensity，LFQ intensity)，根据蛋白在不同样本之间的LFQ intensity计算其在每个样本之间的相对定量值。第一步计算两组间蛋白的差异表达量，即FC值(首先计算出每组中各样本相对定量值的平均值，然后再计算两组间平均值的比值---肺腺癌组/良性肺部结节组，该比值作为两组最终的差异表达量)。第二步计算该蛋白在两组间的差异表达显著性，即P值(首先将蛋白在各样本中的相对定量值取log2，以使得数据符合正态分布，接着用双样本双尾T检验的方法计算P值)。
6)差异蛋白筛选：当P<0.05时，以FC>1.2作为显著上调的变化阈值，FC<1/1.2作为显著下调的变化阈值，进而筛选差异蛋白标志物。
7)结果分析：经上述蛋白提取、胰酶酶解、质谱分析、数据库搜库等步骤，对血浆蛋白质组进行检测，获得可定量蛋白在每个样本中的相对定量值。通过比较两个比较组间蛋白的平均相对定量值，获得该蛋白在两组间的差异倍数(Fold change，FC)；并利用t检验方法计算P值。当P<0.05时，以FC>1.2作为显著上调的变化阈值，FC<1/1.2作为显著下调的变化阈值，最终筛选出12种差异蛋白，包括8种上调蛋白(SERPINA7，LYZ，FCGR3B， HGFAC，CLEC3B，ICAM1，ENPP2，LUM)和4种下调蛋白(PRDX2，CA2，PON1， APOC3)(图1A)。12种差异蛋白的组学表达结果在肺腺癌组和良性肺部结节组间有显著差异(图1B)，且主成分分析(Principle component analysis，PCA)结果显示这12种差异蛋白可将两个比较组间的患者较好地区分开(图1C-D)。
4、运用ELISA法对血浆差异蛋白指标进行验证
4.1实验所需试剂
本发明中用于检测血浆中差异蛋白表达情况的ELISA试剂盒均来自于武汉云克隆科技股份有限公司。
4.2预实验探索12种差异蛋白的最佳血浆稀释倍数
随机选取4例肺腺癌患者和4例良性肺部结节患者的血浆样本，按照试剂盒说明书所推荐的稀释倍数，在其倍数上下设置2个浓度梯度，实验结束后，结合样本OD值和标准品OD值选取最优血浆稀释倍数，保证样本和标准品的显色时间一致且样本OD值均在标准品OD值的最高值和最低值之间。
4.3实验具体操作步骤(以APOC3蛋白指标为例)
1)使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25℃)，如果该试剂盒在一段时间内不能完全使用，则仅取出本次试验所需的酶标条和试剂，并将剩余的酶标条及试剂按指定条件保存。
2)准备标准品溶液(以APOC3蛋白指标为例，其余指标参照说明书)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10min，同时轻轻摇动(避免起泡)，该溶液为贮液，浓度为6000pg/mL。准备7个稀释标准品的Ep管，每个Ep管中加入500μL的标准品稀释液，依次倍比稀释成6000pg/mL，3000pg/mL，1500pg/mL，750pg/mL，375pg/mL， 187.5pg/mL，93.75pg/mL，标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验必须使用新的标准品溶液。
3)加样：分别设标准孔、标准品空白孔、待测样品孔(不同类型样本随机布板)、样品空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL上述不同浓度的标准品。标准品空白孔加100μL标准品稀释液，余孔加待测样品100μL(提前按照预实验所探索的最佳稀释倍数将血浆样本稀释)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。
4)检测溶液A工作液及检测溶液B工作液的配制：检测溶液A(生物素化抗体)及检测溶液B(酶标亲和素)在使用前用手甩几下或短暂离心处理，以使黏附在管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以1:100的比例用检测稀释液A或B将其稀释(如：10μL检测溶液A/990μL检测稀释液A)，充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μL/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2mL。
5)温育时间结束后，弃去孔内液体，甩干，不用洗涤。
6)加检测溶液A工作液(现用现配)，100μL/孔，酶标板覆膜，37℃温育1小时。
7)弃去孔内液体，用试剂盒中所提供的洗涤液(使用前用纯水将其稀释为1X)重复洗板3 次，350μL/孔，1.5分钟/次。最后一次洗涤后，弃去孔内残留液体，并在吸水纸上将其拍干。
8)加检测溶液B工作液(现用现配)，100μL/孔，酶标板覆膜，37℃温育30分钟。
9)弃去孔内液体，重复洗板5次，方法同步骤7)。
10)加TMB底物溶液，90μL/孔，酶标板覆膜，37℃温育。(反应时间控制在30分钟内，当标准孔的前四孔有明显的颜色梯度且后四孔梯度不明显时，即可终止。)
11)加终止液，50μL/孔，此时孔内液体颜色由蓝色转变为黄色。
12)在确保孔内无气泡且孔底无水滴后，立即用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD 值)，保存数据。
13)制作标准曲线：以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘制标准曲线，最佳方程式应以回归方程计算的R2值来定，R2越趋于1越好。
14)将样本OD值代入方程式，计算出样本浓度，再乘以稀释倍数，即为该指标在样本中的实际浓度。
4.4结果分析
1)ELISA预实验探索12种差异蛋白的最佳血浆稀释倍数。
使用双抗体夹心法ELISA实验对少量样本(4例肺腺癌和4例良性肺部结节患者血浆) 进行预实验分析，进而探索每个蛋白指标在该实验中的最佳血浆稀释倍数。12种差异蛋白的最优血浆稀释倍数如表2所示，其中，FCGR3B、HGFAC和LUM三个上调蛋白因未能通过ELISA的方法学验证，故而放弃这三个指标的后续验证，后续对其他9种差异蛋白进行验证。
表2 ELISA预实验探索12种差异蛋白的最优血浆稀释倍数
Figure BDA0003688926290000101
注：-：无最佳血浆稀释倍数
2)ELISA实验对9种血浆差异蛋白的鉴别诊断效能进行初步验证。
依据预实验中所获得的最优血浆稀释倍数，在含有39例肺腺癌和39例良性肺部结节患者血浆的验证组一中检测9种血浆差异蛋白的表达情况。如图2所示，5种上调蛋白在ELISA检测中，仅SERPINA7与ICAM1这两个指标在肺腺癌和良性肺部结节患者血浆中的差异具有显著性(P<0.001)，但其均在良性肺部结节患者中表达较高，与血浆蛋白质组结果相反。4种下调蛋白的验证结果显示，除CA2外，PRDX2、PON1和APOC3在肺腺癌患者血浆中的表达量均显著低于良性肺部结节患者(P<0.01)。经受试者工作特征(Receiver operatingcharacteristic，ROC)曲线分析，PRDX2、PON1和APOC3三个指标在肺腺癌和良性肺部结节患者中均具有良好的鉴别诊断效能，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.707、 0.725和0.713(P<0.01)。
3)通过ELISA实验对3种候选蛋白的鉴别诊断效能进行进一步验证。
根据验证组一中的初步验证结果，选择在肺腺癌与良性肺部结节中有显著差异且与蛋白质组学结果相一致的蛋白指标(PRDX2、PON1和APOC3)为候选蛋白。接着，在含有107例肺腺癌、107例良性肺部结节、44例正常对照、58例肺鳞癌和48例小细胞肺癌患者血浆的验证组二中检测3种候选蛋白的表达情况。结果如图3所示，3种候选蛋白在肺腺癌血浆中表达量均显著低于良性肺结节，诊断效能评估显示其AUC(95％CI)分别为0.603 (0.527-0.678)、0.772(0.710-0.835)和0.706(0.638-0.775)。同时，我们还检测了其他肺癌类型和正常对照中三种候选蛋白的表达量。PRDX2在LUAD患者中表达量虽显著低于 BPN患者(P<0.01)，而在LUSC及SCLC患者中是显著高于BPN患者的(P<0.01)。PON1 和APOC3两个指标在肺癌的三个亚型中的血浆表达量均显著低于BPN患者(P<0.001)。此外，三种候选蛋白中仅APOC3在LUAD患者和正常对照血浆中表达量有显著差异 (P<0.05)。
实施例2
鉴别肺腺癌和良性肺部结节的诊断模型的构建
(1)筛选用于构建鉴别诊断模型的有意义指标(候选蛋白、CT指标、临床标志物)。
合并验证组一及验证组二中肺腺癌及良性肺部结节患者，挑选CT信息及临床传统肿瘤标志物(CEA、CA125和CYFRA21-1)信息齐全的97例肺腺癌患者和71例良性肺部结节患者，相关信息概述如表3所示。
表3构建鉴别诊断模型的肺腺癌及良性肺部结节患者的CT信息和临床标志物信息
Figure BDA0003688926290000111
Figure BDA0003688926290000121
注：CEA：癌胚抗原；CA125：癌抗原125；CYFRA21-1：细胞角蛋白19片段；
Figure BDA0003688926290000123
均值±标准差
在上述样本集内进行3种候选蛋白、12种CT指标和3种临床肿瘤标志物用于鉴别诊断肺腺癌和良性肺部结节的单因素分析，结果显示3种候选蛋白(PRDX2、PON1和 APOC3)、7种CT指标(毛刺征、血管切迹、分叶征、棘突征、胸膜凹陷征、纵膈淋巴结肿大和钙化情况)和3种临床标志物(CEA、CA125和CYFRA21-1)在肺腺癌患者和良性肺部结节患者中的差异具有统计学意义(P<0.01)(表4)。
通过ROC分析进一步评估这13种指标的鉴别诊断效能，以AUC>0.5且P<0.05的标准筛选出9种有意义指标，包括3种候选蛋白(PRDX2、PON1和APOC3)、3种CT指标 (毛刺征、血管切迹和分叶征)和3种临床标志物(CEA、CA125和CYFRA21-1)。9种指标的AUC范围为0.595-0.762，其中PON1的AUC(95％CI)最大，为0.762(0.689-0.836) (表4)。
表4 3种候选蛋白、12种CT指标和3种临床标志物用于鉴别诊断肺腺癌和良性肺部结节的单因素分析和ROC分析结果
Figure BDA0003688926290000122
Figure BDA0003688926290000131
注：CEA：癌胚抗原；CA125：癌抗原125；CYFRA21-1：细胞角蛋白19片段
(2)联合候选蛋白、CT指标及临床标志物构建肺腺癌和良性肺部结节的鉴别诊断模型。
根据筛选出的9种有意义指标，使用Logistic回归分析输入法分别构建候选蛋白组合 (PRDX2、PON1和APOC3)、CT指标组合(毛刺征、血管切迹和分叶征)、临床标志物组合(CEA、CA125和CYFRA21-1)以及鉴别诊断模型(包括9种有意义指标)；各种指标的 ROC分析结果如图4所示。其中，所述的鉴别诊断模型是应用Logistic回归将3种候选蛋白 (PRDX2、PON1和APOC3)、3种CT指标(毛刺征、血管切迹和分叶征)和3种临床标志物(CEA、CA125和CYFRA21-1)9种变量联合构建肺腺癌诊断模型PRE(P＝LUAD， model)＝1/(1+EXP(﹣(0.010×PRDX2+0.052×APOC3+0.002×PON1+1.112×毛刺征 +1.161×血管切迹征+0.535×分叶征﹣0.084×CEA﹣0.004×CA125﹣0.404×CYFRA21-1 ﹣7.697)))。
由图4可以看出，与单一类型指标组合相比(候选蛋白组合：AUC＝0.805，CT指标组合：AUC＝0.757，临床标志物组合：AUC＝0.748)，将不同类型指标联合构建鉴别诊断模型可显著提高其诊断效能(鉴别诊断模型：AUC＝0.904)(图4A)。此外，由图4B的条形图可直观地发现，鉴别诊断模型(灵敏度＝81.44％，特异度＝90.14％)明显提高了CT指标组合 (灵敏度＝59.79％，特异度＝83.10％)和临床标志物组合(灵敏度＝49.48％，特异度＝94.37％)的灵敏度，且显著提高了候选蛋白组合的特异度(灵敏度＝81.44％，特异度＝70.42％)。
(3)诊断模型在不同临床特征肺腺癌中诊断效能评估。
将用于构建鉴别诊断模型的97例肺腺癌患者根据临床分期、淋巴结转移情况、远端转移情况分别分为早期和晚期肺腺癌患者、无淋巴结转移和有淋巴结转移的肺腺癌患者、无远端转移和有远端转移的肺腺癌患者。把71例良性肺部结节患者分别与不同类别的肺腺癌患者进行比较，以评估鉴别诊断模型在不同临床特征肺腺癌中的诊断效能。结果如表5及图5 所示，鉴别诊断模型在晚期肺腺癌患者中，其灵敏度、特异度和AUC(95％CI)和准确度分别为96.55％、90.14％、0.956(0.917-0.996)和92.00％；在早期肺腺癌患者中其诊断效能也十分可观，灵敏度、特异度和AUC(95％CI)和准确度分别为65.63％、90.14％、0.868 (0.799-0.937)和82.52％；此外，该模型在有远端转移的肺腺癌患者中呈现出最佳的诊断效能，其灵敏度、特异度和AUC(95％CI)和准确度分别高达100％、90.14％、0.976(0.951-1)和92.47％。
表5鉴别诊断模型在不同临床特征肺腺癌患者中的诊断效能评估
Figure BDA0003688926290000141
注：Sen：灵敏度；Spe：特异度；AUC：ROC曲线下面积；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值；LR：似然比
本发明的统计分析方法是利用SPSS 26.0，GraphPad Prism 8.0和R 4.0软件对实验数据进行统计学分析及结果的可视化。使用非参检验(Mann-Whitney U检验)的方法分析各指标或模型在不同组间的差异。使用ROC曲线获得各指标或模型在LUAD和BPN鉴别诊断时的AUC、灵敏度、特异度(截断值为最大约登指数时所对应的指标浓度或模型预测概率)。所有统计学分析均采用双侧检验，当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。
以上实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物，其特征在于，所述血浆蛋白标志物包括PRDX2、PON1或APOC3中的一种或几种。
2.一种鉴别肺腺癌和良性肺部结节的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的血浆蛋白标志物。
3.权利要求1所述的鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物的应用。
4.一种如权利要求1所述的鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)采集肺腺癌患者和肺部结节患者的血液样品，经分离处理后获得血浆样本；
(2)非标记定量蛋白质组学检测；
(3)筛选鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物；
所述的非标记蛋白组学检测包括：蛋白提取、胰酶酶解、液相色谱质谱联用分析、数据库搜库、蛋白的FC值和P值计算；
所述步骤(3)筛选鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白标志物后，还包括：肺腺癌和良性肺部结节的差异血浆蛋白ELISA验证；所述的差异血浆蛋白ELISA验证包括：差异蛋白的最佳血浆稀释倍数确定；对血浆样本按照试剂盒说明进行ELISA检测；对所得数据进行统计分析。
5.一种用于鉴别肺腺癌和良性肺部结节的诊断模型的构建方法，其特征在于，是应用Logistic回归分析输入方法将权利要求1所述的3种鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白PRDX2、PON1和APOC3、3种CT指标毛刺征、血管切迹和分叶征和3种临床标志物CEA、CA125和CYFRA21-1联合构建肺腺癌和良性肺部结节的诊断模型PRE(P＝LUAD，model)＝1/(1+EXP(﹣(0.010×PRDX2+0.052×APOC3+0.002×PON1+1.112×毛刺征+1.161×血管切迹征+0.535×分叶征﹣0.084×CEA﹣0.004×CA125﹣0.404×CYFRA21-1﹣7.697)))。
6.如权利要求5所述的诊断模型的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)分组：挑选CT信息及临床传统肿瘤标志物CEA、CA125和CYFRA21-1信息齐全的患者作为样本分为肺腺癌患者组和良性肺部结节患者组；
(2)将所述的3种鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白PRDX2、PON1和APOC3，12种CT指标结节数目、直径、边缘、空洞征、毛刺征、血管切迹、分叶征、棘突征、胸膜凹陷征、纵膈淋巴结肿大、肺气肿和钙化情况，和3种临床肿瘤标志物CEA、CA125和CYFRA21-1用于鉴别诊断步骤(1)所述的样本的单因素分析；获得在肺腺癌患者和良性肺部结节患者中的差异具有统计学意义(P<0.01)的13种指标：3种所述的鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白PRDX2、PON1和APOC3；7种CT指标毛刺征、血管切迹、分叶征、棘突征、胸膜凹陷征、纵膈淋巴结肿大和钙化情况和3种临床标志物CEA、CA125和CYFRA21-1；
(3)通过ROC分析评估上述13种指标的鉴别诊断效能，以AUC>0.5且P<0.05的标准筛选出9种有意义指标，包括3种所述的鉴别肺腺癌和良性肺部结节的血浆蛋白PRDX2、PON1和APOC3；3种CT指标毛刺征、血管切迹和分叶征和3种临床标志物CEA、CA125和CYFRA21-1；
(4)根据筛选出的9种有意义指标，使用Logistic回归分析输入法构建诊断模型。
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