CN109061164B

CN109061164B - 用于非小细胞肺癌诊断的组合标志物及其应用

Info

Publication number: CN109061164B
Application number: CN201810956610.7A
Authority: CN
Inventors: 刘万里; 赖燕珍; 邢珊; 曾木圣
Original assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2038-08-21
Also published as: CN109061164A

Abstract

本发明公开了用于非小细胞肺癌诊断的组合标志物及其应用，该组合标志物由CST1、SPP1和Cyfra21‑1组成。本发明基于CST1、SPP1和Cyfra21‑1这3个指标建立了诊断非小细胞肺癌的数学模型，该数学模型诊断非小细胞肺癌预测概率的AUC为0.946。当灵敏度定为90.0％时，cut‑off为0.290，特异性达82.7％，阳性预测值90.0％，阴性预测值82.7％。用于非小细胞肺癌的早期诊断时，灵敏度90.6％，特异性50.7％，AUC 0.882，阳性预测值90.6％，阴性预测值58.5％，远高于CST1、SPP1或Cyfra21‑1单独预测概率，具有很好的灵敏度和特异性。

Description

用于非小细胞肺癌诊断的组合标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于非小细胞肺癌诊断的组合标志物及其应用。

背景技术

肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC约占85％。NSCLC分为腺癌(占55％)，鳞癌(占34％)，腺鳞癌，大细胞肺癌等。初诊时，晚期(III期和IV期)患者占67％，只有24％的患者在早期(局部疾病，I期或II期)得到诊治。早期NSCLC患者5年生存率为71-88％，而IV期的患者5年生存率不到2％^[][]。NSCLC的早期诊治可以明显提高患者5年生存率。

目前临床的早期肺癌筛查方法中，应用较广泛的是低剂量CT。美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)临床指南推荐肺癌高危患者定期行低剂量CT检查，以达到早发现早治疗的目的。这种筛查方式有助于提高肺癌早期发现的概率，但也存在极高假阳性率(94.5％)和高成本的问题。过高的假阳性率，给患者带来不必要的精神压力，易导致过度治疗和医疗资源的浪费。为解决这个问题，结合其他早期筛查方法可能有助于降低假阳性率。血清学的筛查具有创伤小，简便易行，操作性强等特点。目前应用于NSCLC的血清学标志物如癌胚抗原(CEA)，癌抗原(CA)-125和细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)已得到美国临床生化学会(National Academy of Clinical Biochemistry，NACB)的推荐应用。这些血清标志物虽然具有很高的特异度(90％)，但灵敏度较低(50-60％)，不能满足临床实际需求。

外周血具有采样无侵袭性，重复性较好，价格相对便宜等优点，所以血清学检查常规应用于临床。血清学肿瘤诊断标志物有miRNA，甲基化DNA、蛋白等。其中，血清蛋白标志物的检测相对于其他类型标志物需要血量少，且操作简便。迄今为止，许多血清学肿瘤标志物已被用于诊断癌症，例如前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)和肝癌的甲胎蛋白(AFP)。目前应用于临床的肺癌相关血清标志物Cyfra 21-1，CEA，CA125和SCC诊断效能欠佳。因此，更有诊断价值的肺癌相关血清标志物仍有待发现。

发明内容

本发明的目的在于提供用于非小细胞肺癌诊断的组合标志物及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

CST1、SPP1和Cyfra21-1作为非小细胞肺癌诊断或辅助诊断标志物的应用。

定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1的试剂在制备诊断或辅助诊断非小细胞肺癌试剂盒中的应用。

进一步的，所述定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1的试剂为定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1蛋白表达量的试剂。

进一步的，所述定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1蛋白表达量的试剂包括定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1的抗体。

一种用于诊断或辅助诊断非小细胞肺癌的试剂盒，该试剂盒中含有定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1的试剂。

本发明的有益效果是：

本发明提供的用于非小细胞肺癌诊断的组合标志物CST1、SPP1和Cyfra21-1，该组合标志物具有灵敏度高，特异性好的优点。

本发明基于CST1、SPP1和Cyfra21-1这3个指标建立了诊断非小细胞肺癌的数学模型：Logit(p＝NSCLC)＝-9.049+0.002×CST1+0.088×SPP1+0.265×Cyfra21-1，此数学模型预测概率诊断非小细胞肺癌的AUC为0.946。当灵敏度定为90.0％时，cut-off为0.290，特异性可达82.7％，阳性预测值90.0％，阴性预测值82.7％。用于非小细胞肺癌的早期诊断时，灵敏度90.6％，特异性50.7％，AUC 0.882，阳性预测值90.6％，阴性预测值58.5％，显著高于CST1(灵敏度：90.6％；特异性：49.3％；AUC：0.829),SPP1(灵敏度：90.6％；特异性：14.7％；AUC：0.726)；Cyfra21-1(灵敏度：90.6％；特异性40.0％：AUC：0.775)，任何一个指标单独的诊断效能。

附图说明

图1是30例非小细胞肺癌患者(NSCLC)和25例正常人(HC)血清CST1(A图)、SPP1(B图)、Cyfra21-1(C图)和CEA(D图)浓度比较情况；

图2是测试组70例非小细胞肺癌患者(NSCLC)与75例正常人(HC)中血清CST1(A图)、SPP1(B图)、Cyfra21-1(C图)和CEA(D图)浓度比较情况；

图3是血清CST1、SPP1、Cyfra21-1和CEA及数学诊断模型诊断测试组中非小细胞肺癌的ROC；

图4是测试组中32例早期非小细胞肺癌患者(早期NSCLC)与75例正常人(HC)血清CST1(A图)、SPP1(B图)和Cyfra21-1(C图)浓度比较；

图5是血清CST1、SPP1、Cyfra21-1及数学诊断模型诊断测试组中早期非小细胞肺癌的ROC；

图6是验证组132例非小细胞肺癌患者(NSCLC)与121例正常人(HC)中血清CST1(A图)、Cyfra21-1(B图)、SPP1(C图)浓度比较；

图7是血清CST1、SPP1、Cyfra21-1及数学诊断模型诊断验证组中非小细胞肺癌的ROC；

图8是验证组中64例早期非小细胞肺癌患者(早期NSCLC)与121例正常人(HC)血清CST1(A图)、SPP1(B图)和Cyfra21-1(C图)浓度比较；

图9是血清CST1、SPP1和Cyfra21-1及数学诊断模型诊断验证组中早期非小细胞肺癌的ROC。

具体实施方式

本发明通过分析TCGA、NCBI数据库肺腺癌相关数据、筛选、ONCOMINE验证等一系的研究，发现了CST1和SPP1不仅在肺腺癌，而且在其他类型NSCLC中显著高表达，最终获得了诊断非小细胞肺癌的组合标志物及其数学诊断模型：Logit(p＝NSCLC)＝-9.049+0.002×CST1+0.088×SPP1+0.265×Cyfra21-1，式中，CST1表达量的单位为pg/ml，SPP1和Cyfra21-1表达量的单位为ng/ml，P值大于0.29时定义为高风险，反之则为低风险。在清楚CST1、SPP1和Cyfra21-1组合使用可以获得更高灵敏度和特异性时，可以通过检测分析已有病例，结合本领域的公知技术，确定合理的诊断公式及风险判断标准。

定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1的试剂在制备诊断或辅助诊断非小细胞肺癌药剂中的应用。

优选的，所述定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1的试剂为定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1蛋白表达量的试剂。

优选的，所述定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1蛋白表达量的试剂包括定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1的抗体。

一种非小细胞肺癌的早期诊断方法，包括如下步骤：

1)定量待测组织中CST1、SPP1和Cyfra21-1的表达量；

2)根据CST1、SPP1和Cyfra21-1的表达量，确定非小细胞肺癌的情况。

上述确定非小细胞肺癌情况的具体方式为，根据诊断公式：Logit(p＝NSCLC)＝-9.049+0.002×CST1+0.088×SPP1+0.265×Cyfra21-1进行确定，式中，CST1表达量的单位为pg/ml，SPP1和Cyfra21-1表达量的单位为ng/ml，当P值大于0.29时定义为非小细胞肺癌高风险，反之则为非小细胞肺癌低风险。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

(1)本发明诊断标志物的筛选

分析TCGA和NCBI数据库数据，筛选条件如下：

TCGA转录组数据筛选早期肺腺癌肿瘤标志物：NSCLC I/II期，FC>2或FC<-2，FDR<0.01。I/II期取交集。从58例正常肺组织，276例I期肺腺癌组织，122例II期肺腺癌组织中筛选出肺腺癌I期差异表达基因1410个，II期肺腺癌1459个基因，两者共同差异表达基因1220个。

NCBI转录组数据筛选早期肺腺癌肿瘤标志物：筛选条件为肺腺癌I/II期，FC>1.5或FC<-1.5，FDR<0.05。I/II期取交集。从224例正常肺组织，188例I期肺腺癌组织，94例II期肺腺癌组织中筛选出肺腺癌I期差异表达基因610个，II期肺腺癌482个基因，两者共同差异表达基因284个。

TCGA和NCBI数据库筛选结果取交集得到共同差异表达基因64个，其中肿瘤较正常升高的10个，下降的54个。我们在筛选得到的64个基因中进一步筛选得到3个上调的表达分泌蛋白的基因—CST1、SPP1和ADAMTS1。

(2)ONCOMINE验证

登陆http://www.ONCOMINE.org/，找出所有NSCLC相关研究，分别输入待验证的基因名。

在ONCOMINE验证CST1、SPP1和ADAMTS1的差异表达，发现CST1和SPP1表达水平在ONCOMINE中的非小细胞肺癌患者中明显升高(CST1P<0.0001，SPP1P＝0.005)，而ADAMTS1表达水平无显著性差异(P＝0.905)。CST1和SPP1不仅在肺腺癌中高表达，在其他类型NSCLC中也有较高表达，基于此推测CST1和SPP1是NSCLC的潜在诊断标志物。

(3)总结候选基因的研究现状

登陆https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/，汇总候选基因的研究现状，包括癌种，标本类型，实验方法，研究成果等。

搜索得到CST1、SPP1相关文献：CST1的肿瘤相关文献14篇，主要涉及组织或细胞中的CST1与肺癌的不良预后相关，CST1在肺癌中的血清学研究尚未报道；SPP1的肺癌相关文献约140篇，关于肺癌外周血SPP1检测的文献13篇，主要与肿瘤转移、复发相关。

(4)非小细胞肺癌的数学诊断模型的建立与验证

1)将2个在非小细胞肺癌患者血清中显著表达的候选标志物CST1、SPP1与目前临床上应用的Cyfra21-1和CEA联合。本研究中CST1为组装的ELISA试剂盒，利用的SPP1、Cyfra21-1和CEA为商品化ELISA试剂盒。对30例非小细胞肺癌患者和25例配对的正常人血清中候选蛋白(CST1、SPP1、Cyfra21-1和CEA)浓度采用两独立样本比较的秩和检验法，比较正常对照组与非小细胞肺癌组血清浓度的差别。

检测结果如图1所示，从中可以看出，非小细胞肺癌患者血清CST1、SPP1、Cyfra21-1、CEA的血清浓度显著升高，其与正常组之间的血清浓度差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2)由于初步实验提示CST1和SPP1能显著区分非小细胞肺癌患者及正常人，所以发明人进一步用测试组(70例非小细胞肺癌患者与75例正常人血清，两组人群性别、年龄差异无统计学意义)来验证初步实验的结果。

检测结果如图2所示，从中可以看出，非小细胞肺癌患者血清CST1(4499pg/mlvs2213pg/ml，P<0.001)、SPP1(53.25ng/ml vs 23.91ng/ml，P<0.001)的浓度明显高于正常人血清浓度，能显著区分非小细胞肺癌患者及正常人(见图2)。上述结果说明，CST1和SPP1标志物血清浓度测试组进一步验证了非小细胞肺癌患者血清CST1和SPP1浓度显著升高。

3)血清CST1、SPP1、Cyfra21-1和CEA标志物联合诊断非小细胞肺癌的性能和非小细胞肺癌数学诊断模型的建立

检测上述测试组中血清CST1、SPP1、Cyfra21-1和CEA标志物的血清浓度(检测结果如图2所示)，利用ROC曲线分析其单个指标检测和四个指标联合检测诊断非小细胞肺癌的性能。

ROC曲线分析结果如图3所示，显示在测试组中CST1、SPP1、Cyfra21-1和CEA单独诊断非小细胞肺癌的AUC分别为0.829，0.726，0.775及0.762；当灵敏度定于90％时，CST1、SPP1、Cyfra21-1和CEA单独诊断非小细胞肺癌的特异度分别仅49.3％，14.7％，40.0％及22.7％。

4)最后进一步回归分析四个指标中最佳组合诊断非小细胞肺癌，筛选出了三个指标：CST1、SPP1和Cyfra21-1，剔除了CEA指标，并建立非小细胞肺癌的数学诊断模型：Logit(p＝NSCLC)＝-9.049+0.002×CST1+0.088×SPP1+0.265×Cyfra21-1，用于非小细胞肺癌预测概率计算，并进行ROC曲线非小细胞肺癌诊断性能分析(图3)。CST1表达量的单位为pg/ml，SPP1和Cyfra21-1表达量的单位为ng/ml；当P值大于0.29定义为高风险，反之则为低风险。

上述数学模型预测概率诊断非小细胞肺癌的AUC为0.946。当灵敏度定为90.0％时，cut-off为0.290，特异性可达82.7％，阳性预测值90.0％，阴性预测值82.7％。用于非小细胞肺癌的早期诊断时，灵敏度90.6％，特异性50.7％，AUC 0.882，阳性预测值90.6％，阴性预测值58.5％。P值大于0.29时定义为高风险，反之则为低风险。

5)上述数学诊断模型在测试组早期非小细胞肺癌中的诊断性能分析

上述数学诊断模型在测试组早期非小细胞肺癌中的诊断性能分析图如图4和图5所示。其中图4显示了，在测试组32例早期非小细胞肺癌患者与75例正常人血清中，早期非小细胞肺癌患者CST1浓度(2906pg/ml)显著高于正常人(2198pg/ml)，P＝0.0005；SPP1浓度(23.42pg/ml)显著高于正常人(22.87pg/ml)，P＝0.0025；Cyfra21-1浓度(7.435pg/ml)也显著高于正常人(2.650pg/ml)(2，P<0.001。能显著区分早期非小细胞肺癌人群及正常人群。图5显示了，在早期非小细胞肺癌中数学诊断模型的早期非小细胞肺癌诊断效能为灵敏度90.6％，特异性50.7％，AUC 0.882，阳性预测值87.5％，阴性预测值50.7％，显著高于CST1(灵敏度：90.6％；特异性：40.3％；AUC：0.829),SPP1(灵敏度：90.6％；特异性14.7％；AUC：0.726),Cyfra21-1(灵敏度：90.6％；特异性：40.0％；AUC：0.775)任何一个指标单独的诊断效能。

6)在验证组中验证数学诊断模型诊断非小细胞肺癌的性能

由132例非小细胞肺癌患者与121例正常人组成验证组血清标本，用于验证该数学诊断模型的诊断非小细胞肺癌的效能。纳入验证组的患者年龄、性别比例、分期比例与测试组相似。

性能分析结果如图6和图7所示，其中图6显示，非小细胞肺癌患者血清中的CST1、SPP1、Cyfra21-1均高于正常人群(中位浓度对比：CST1：3506vs 2182pg/ml；SPP1：27.38vs20.76ng/ml；Cyfra21-1：5.55vs 2.47ng/ml)，差异均有统计学意义(P<0.001)，见图6。用联合诊断数学模型计算得到验证组各个人群的预测概率。

用ROC曲线评价验证组中数学诊断模型在非小细胞肺癌和正常人中的诊断效能，包括曲线下面积(AUC)，灵敏度，特异性。结果如图7所示，其显示在验证组中，CST1、SPP1和Cyfra21-1单独诊断非小细胞肺癌的AUC分别为0.772、0.679及0.802，当灵敏度定于90.1％时，其特异度分别为68.9％，47.7％及55.3％。而数学诊断模型预测AUC为0.910，当灵敏度定为90.1％时，特异性可达81.1％，阳性预测值90.2％，阴性预测值67.2％(图7)；

7)数学诊断模型在验证组早期非小细胞肺癌诊断中的验证

图8显示在验证组中CST1、SPP1和Cyfra21-1诊断64例早期非小细胞肺癌的结果，CST1、SPP1和Cyfra21-1指标均能显著区分早期非小细胞肺癌人群及正常人群(P<0.001)。ROC曲线(图9)评价显示，CST1、SPP1和Cyfra21-1单独诊断早期非小细胞肺癌的AUC分别为0.682,0.576及0.843，当灵敏度定于90.1％时，其特异度分别仅54.7％，35.9％及59.4％。而数学诊断模型预测早期非小细胞肺癌AUC为0.872，当灵敏度定为90.1％时，特异性可达75.0％，阳性预测值75.0％，阴性预测值90.1％。同样验证了发明人建立的非小细胞肺癌数学模型早期诊断非小细胞肺癌的效能。

综上所述，发明人从TCGA和NCBI数据库中非小细胞肺癌和正常人组织转录组数据分析找到提高诊断非小细胞肺癌灵敏度与特异性的血清标准物：CST1、SPP1和Cyfra21-1。建立的数学诊断模型可用于正常人群非小细胞肺癌的筛查和早期非小细胞肺癌的检测，减少漏诊，为早期筛查和诊断非小细胞肺癌提供了一个新途径。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.定量检测血清中CST1、SPP1和Cyfra21-1的试剂在制备诊断或辅助诊断非小细胞肺癌试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1的试剂为定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1蛋白表达量的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1蛋白表达量的试剂包括定量检测CST1、SPP1和Cyfra21-1的抗体。