CN115184609B - 检测非小细胞肺癌的分子标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域，具体提供了一种检测非小细胞肺癌的分子标志物及其应用。该分子标志物选自ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA、CEA中的一种或几种的组合标志物。本发明首次采用血浆来源的ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA的联合标志物作为非小细胞肺癌检测的生物标记物，同时构建了应用于非小细胞肺癌检测的血浆多维特征早期筛查模型，为肺癌的临床检测提供了新的方向。本发明具有特异性好、敏感度高的特点，对非小细胞肺癌的辅助诊断有良好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及血浆蛋白质组学技术、靶向代谢组学技术、免疫比浊技术、质谱技术和机器学习算法，提供了用于检测非小细胞肺癌的分子标志物、筛查非小细胞肺癌的多维特征数学评价模型，以及非小细胞肺癌的检测试剂盒。
背景技术
肺癌(Lung cancer)是目前最常见的恶性肿瘤之一，也是全球发病率和死亡率不断上升的肿瘤。据世界卫生组织(WHO)统计，2020年全球约有221万新发肺癌病例，180万死亡病例。肺癌依据其组织病理学可分为两大类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌约占肺癌总敉的80-85％，又包含鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等，目前采用化疗的方式进行治疗。在早期及时而准确地发现非小细胞肺癌，能够提升非小细胞肺癌对治疗的响应水平，进而提高患者的生存概率，以及降低治疗费用。早期诊断主要分为三步，即及时发现症状并及时寻求医疗建议，及时获得临床评估和诊断，以及及时转诊。迄今为止，全球的肺癌筛查方案由于肺癌起病阶段的隐匿性，存在较大困难。在我国，确诊时已经为Ⅲ～Ⅳ期的肺癌患者占比达到64.6％。这与目前较为低效的诊断手段存在一定联系，例如临床常用的支气管镜检查，虽然能准确辨别黏膜异形增生，但范围仅限于受检位置，对周围型肺癌检出率较低，耗时长，检查过程中患者较为痛苦；痰细胞学检查对肺癌的灵敏度不足50％；而组织学活检方法由于会对患者造成创伤，且可能造成气胸和肺内出血等并发症，不能作为肺癌的常规筛查方法。因此，早期筛查和诊断己经成为肺癌防治急需解决的重大科学问题，为肺癌筛查提供快速，高效，准确，低成本和稳定的预测模型也是肿瘤早期发现及个体化治疗的前提。
非小细胞肺癌发生状态下，患者体内一些与免疫过程相关的蛋白出现异常的上调或下调。机体在肺癌发生状态下，部分代谢模式亦发生变化，导致血浆代谢物浓度发生异常变化。然而，免疫与代谢物分子发生的异常变化中存在一定的规律，使得通过分子的异常变化情况综合进行非小细胞肺癌的早期筛查成为可能。近年来，关于通过分子的异常表达预测疾病风险，以及对疾病治疗预后的研究已有大量报道，涉及乳腺癌、白血病、结核病、肝癌、前列腺癌等多种疾病。然而迄今为止，应用于肺癌的血浆标志物及其组合在早期筛查中的价值仍然有局限。本专利应用近年来现代生物多组学和机器学习算法等多学科交叉研究成果，在血浆中筛选非小细胞肺癌患者中发生变化的蛋白质、胆汁酸和氨基酸等代谢物作为非小细胞肺癌的筛查标志物，进一步建立血浆多维特征数学模型，较大的提升了非小细胞肺癌筛查的敏感性和特异性，是非小细胞肺癌早期筛查的新方向。
发明内容
本发明的目的在于解决现有肺癌筛查技术存在的特异性不好，灵敏度不高的问题，提供了一种用于检测非小细胞肺癌的分子标志物，利用该分子标志物构建非小细胞肺癌的评价模型，以及用于检测非小细胞肺癌的试剂盒等应用。
本发明的第一方面，提供了一种用于检测非小细胞肺癌的分子标志物，所述分子标志物选自ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA、CEA中的一种或几种的组合标志物。
本发明的第二方面，提供了上述分子标志物在制备非小细胞肺癌病人早期筛查试剂盒、试剂或芯片中的应用。
本发明的第三方面，提供了上述分子标志物在制备非小细胞肺癌病人早期筛查评价模型中的应用。
本发明的第四方面，提供了一种用于检测非小细胞肺癌的试剂盒，含有上述分子标志物的检测试剂和/或检测仪器。该试剂盒包括用于从全血中分离血浆样本的试剂，血浆样本的蛋白质组学、氨基酸代谢组学和胆汁酸代谢组学定量分析相关试剂，用于检测ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA表达水平的试剂等。
本发明还提供了上述试剂盒的检测方法，试剂盒中的检测试剂用于测定血浆样品中的血浆生物标志物的水平，包括以下步骤：
S1、测定受试者血浆样品中血浆蛋白标志物ApoA2、ApoB、C3、FN和CEA，氨基酸标志物His、Cit和Orn，以及胆汁酸标志物CA、UDCA、LCA和GCDCA的表达水平；
S2、将测定的受试者血浆样品中的血浆生物和代谢分子标志物水平与正常受试者的血浆中标志物的水平进行对比；
S3、测定的受试者血浆样品中APOA2、FN、His、LCA、UDCA的表达水平相对于正常受试者的下降，及APOB、C3、CEA、Cit、Orn、CA和GCDCA的表达水平相对于正常受试者的上升，指示受试者存在非小细胞肺癌。
进一步地，所述步骤S1中，检测受试者的血浆样品中蛋白质的表达水平，其中所述受试者的血浆样品中APOA2、FN的表达水平相对于正常人受试者的水平的下降及APOB、C3、CEA的表达水平相对于正常人受试者的水平的上升指示所述受试者存在非小细胞肺癌。
进一步地，所述步骤S1中，采用免疫比浊方法检测APOA2、APOB、C3、FN的表达水平。
进一步地，所述步骤S1中，采用LC-MS/MS方法检测His、Orn、CA、GCDCA、UDCA和LCA的表达水平。
进一步地，所述步骤S1中，采用电化学发光技术，检测CEA的表达水平。
本发明的第五方面，提供了一种用于非小细胞肺癌早期筛查的评价模型，包括：
(1)测定受试者血浆样品中(受试者包括正常人以及非小细胞肺癌患者)血浆蛋白标志物ApoA2、ApoB、C3、FN和CEA，氨基酸标志物His、Cit和Orn，以及胆汁酸标志物CA、UDCA、LCA和GCDCA的表达水平；
(2)以80％的样本量作为训练集，20％的样本量作为测试集，对血浆标志物的表达进行整合分析，绘制评价模型的ROC曲线，并根据ROC曲线构建得到非小细胞肺癌早期筛查评价模型；
所述评价模型为：将测得的蛋白标志物水平和氨基酸标志物水平，以及胆汁酸标志物水平的数值代入ROC曲线所得Y1在区间[0，1]上取值，以0.37作为分类阈值，高于0.37的诊断为非小细胞肺癌患者，低于0.37的为正常人；
其中，
logitP＝-0.282ApoA2+4.317ApoB+3.948C3-0.006FN-0.088His+0.084Cit+0.026Orn+0.001CA-0.071LCA-0.004UDCA+0.001GCDCA+0.510CEA+2.475)；
APOA2数值对应单位为mg/dL；
APOB、C3数值对应单位为g/L；
FN数值对应单位为mg/L；
His、Orn、Cit数值对应单位为μmol/L；
CA、LCA、UDCA、GCDCA数值对应单位为nmol/L；
CEA数值对应单位为ng/ml；
当测定的受试者血浆样品中APOA2、FN、His、LCA、UDCA的表达水平相对于正常受试者的下降，及APOB、C3、CEA、Cit、Orn、CA和GCDCA的表达水平相对于正常受试者的上升，指示受试者存在非小细胞肺癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明首次采用血浆来源的ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA的联合标志物作为非小细胞肺癌检测的生物标记物，构建了非小细胞肺癌检测的早期筛查模型，为肺癌的临床诊断提供了新的方向。因此，本发明克服了现有非小细胞肺癌早期阶段缺乏明显典型症状，诊断检出率低、不准确或不敏感等缺点，具有特异性好、灵敏度高的特点，对非小细胞肺癌的辅助诊断有良好的临床应用价值。
2.本发明提供了利用血中血浆蛋白来源的ApoA2、ApoB、C3、FN、CEA、以及代谢产物His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA和GCDCA作为非小细胞肺癌检测的生物标记物检测非小细胞肺癌的检测试剂以及试剂盒，能够准确快速的对非小细胞肺癌进行检测以及对非小细胞肺癌与其他肺部疾病进行区别检测，便于临床应用。
附图说明
图1是非小细胞肺癌核心调控蛋白网络；
图2是实施例2中免疫比浊法对4个主要血浆蛋白标志物验证结果；其中，(A)APOA2；(B)APOB；(C)C3；(D)FN；
图3是实施例2中LC-MS/MS方法对7个血浆代谢物质验证结果；(A)His；(B)Cit；(C)Orn；(D)CA；(E)UDCA；(F)LCA；(G)GCDCA；
图4是实施例2中CEA独立诊断效果ROC曲线；
图5是实施例4血浆多组学标志物鉴别诊断结核病的ROC曲线分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但下列实施例不应看作对本发明的限制。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
1.概述
本发明提供了非小细胞肺癌早期筛查模型的联合血浆多组学生物标志物为ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA，其指示非小细胞肺癌，且可以用于准确地鉴别诊断受试者中的非小细胞肺癌患者。
2.定义
在详细阐述本发明之前，提供要在本文中使用的某些术语的定义。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。
术语“受试者”意图包括，能够直接地或间接地涉及非小细胞肺癌的任意障碍。受试者的例子包括哺乳动物，例如，人类、非人灵长类动物、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人动物。在某些实施方案中，所述受试者是人，例如，遭受非小细胞肺癌的人，处于遭受非小细胞肺癌及其相关的风险中的人，或者潜在地能够遭受非小细胞肺癌相关的痴呆的人。
术语“治疗”在本文中用于表示解除、减轻或缓解受试者中的疾病的至少一种征状。例如，关于非小细胞肺癌，术语“治疗”包括：解除、减轻或缓解认知损害(诸如记忆和/或定向的病损)或总体功能(所有功能，包括日常生活活动)的病损，和/或减慢或逆转总体或认知损害的进行性衰退。因此，术语“治疗”也包括：在疾病的临床表现或疾病的征状之前延迟或阻止发作，和/或减少疾病征状的发展或恶化的风险。
术语“约”或“大约”通常是指在给定的值或范围的5％内，或更优选1％内。
3.非小细胞肺癌的血浆多组学生物标志物
本发明涉及血浆多组学生物标志物：与“正常”受试者相比，其被发现在患有非小细胞肺癌的受试者的血浆生物样品中差别地存在。如果在样品中的一种血浆生物标志物的表达水平之间的差异被确定为统计上显著的，那么该血浆蛋白生物标志物在样品之间差别地存在。统计显著性的常见试验包括、但不限于：t-检验、ANOVA、Kniskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和比值比。单独的或组合的血浆蛋白生物标志物可以用于提供受试者罹患非小细胞肺癌的相对风险的量度。
4.测定样品中的血浆生物标志物的表达水平
通过任意合适的方法，可以测定生物样品中的血浆生物标志物的水平。可以使用任意可靠的用于测量样品中的血浆多组学标志物的水平或量的方法。通常，可以从生物样品检测和定量血浆蛋白，所述样品是采集受试者全血而分离得到的血浆样品，所述方法包括：蛋白定量方法(例如，串联质谱-液相色谱/质谱(TMT-LC/MS)、液相色谱-平行反应监测/质谱(LC-PRM/MS)等)、蛋白浓度测定方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹法(WB)、蛋白芯片等)和模型构建算法(例如，逻辑回归算法、决策树、神经网络算法等)。其它示例性的技术包括聚合酶链式反应(PCR)、实时聚合酶链式反应(RT-PCR)等。
5.使用血浆多组学生物标志物筛查诊断非小细胞肺癌
本发明描述的血浆生物标志物可以用于筛查试验中以评估受试者的非小细胞肺癌状态。疾病状态指非小细胞肺癌的存在或不存在的状态。基于受试者的非小细胞肺癌状态，可以指示其它操作，包括、例如，其它诊断试验或治疗操作。
通常以测定的准确度、测定的灵敏度、测定的特异性或“曲线下面积”(AUC)(例如，在受试者操作特征(ROC)曲线下的面积)的方式，测量诊断试验的正确预测疾病状态的能力。本文中使用的准确度是错误分类的样品的比例的量度。可以将准确度计算为，正确分类的样品的总数除以样品的总数(例如在试验群体中)。灵敏度是通过试验预测为阳性的“真阳性”的量度，且可以计算为正确鉴别的非小细胞肺癌样品的数目除以非小细胞肺癌样品的总数。特异性是通过试验预测为阴性的“真阴性”的量度，且可以计算为正确鉴别的正常样品的数目除以正常样品的总数。AUC是受试者操作特征曲线下的面积的量度，所述曲线是灵敏度相对于假阳性率的图(1-特异性)。AUC越大，试验的预测值越有效。试验的实用性的其它有用的量度包括“阳性预测值”(它是试验为阳性的实际阳性的百分比)和“阴性预测值”(它是试验为阴性的实际阴性的百分比)。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：本发明分子标志物的筛选
1、从全血中分离血浆样本
使用含有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝剂的紫盖抗凝管(BD，America)收集受试者的空腹全血样本。在6h内于4℃条件下3000×g离心15min，取上层血浆，分装至1.5ml无菌离心管，编号标记，置-80℃超低温冰箱中保存备用。用前在4℃条件下12000×g离心10min，取上层清液。
2、血浆样本蛋白酶解和肽段除盐
样本收集：18例非小细胞肺癌初治患者(NSCLC组，男、女各9例，年龄36～78岁)，18例健康人群(HC组，男、女各9例，年龄30～75岁)
按标准操作使用高丰度蛋白消耗自旋柱试剂盒(America、Thermo)去除血浆中的高丰度蛋白，加入8mol/L的尿素(配置在PH 8.0的碳酸氢钠溶液中)，调整浓度至1g/L，12000×g离心15min。取上清后，加入适量1mol/L二硫苏糖醇，控制其终浓度为5mmol/L，56℃孵育蛋白溶液30min，还原蛋白中的二硫键。加入适量1mol/L碘代乙酰胺，控制其终浓度为11mmol/L，室温避光放置15min。将蛋白样品转置于10k Da超滤管(America、Millipore)，12000×g离心60min，加入0.1mol/L碳酸氢钠溶液，12000×g离心30min，将样品中的尿素浓度稀释至2mmol/L。加入适量0.1mol/L的碳酸氢铵溶液溶解蛋白样品后，将胰蛋白酶与处理完的蛋白样品以1:50的质量比例混合，震荡混匀后37℃水浴过夜，进行酶解。翌日，将样本12000×g离心10min，向胰酶酶解的样品中加入0.1％甲酸至其终浓度为1％，观察是否浑浊，若浑浊则继续12000×g离心10min。取上清，按标准操作使用Strata X C18蛋白除盐柱(America、Phenomenex)进行肽段除盐，并真空干燥，置于-80℃超低温冰箱保存备用。
3、液相色谱-串联质谱法分析获得差异表达蛋白数据
按标准操作使用TMT标记试剂盒(America、Thermo)对处理后的血浆样本进行操作获得TMT标记的肽段样品，除盐后真空干燥。在EASY-nLC1000超高效液相色谱仪上用离子交换液相色谱柱对TMT标记的肽段采进行反向高PH高效液相色谱(high performance liquidchromatography，HPLC)分离，肽段分级梯度为8％～32％、PH 9.0的乙腈，在60min内分馏为60个组分，并最终合并为10个组分。对完成分馏的肽段进行真空干燥，-80℃保存备用。
溶解分馏得到的肽段，将不同组分的肽段分别加载到Zorbax 300Extend C18色谱柱(America、Agilent)中对样品进行反相色谱分级分离。
色谱条件：流动相A为0.1％甲酸与2％乙腈水溶液的混合物；流动相B为0.1％甲酸与90％乙腈水溶液的混合物。梯度洗脱，四个液相梯度设置：0～45min，10％-27％流动相B；45～53min，27％-37％流动相B；53～57min，37％-100％流动相B；57～60min，100％流动相B。流速为0.45ml/min。
通过Q-Exactive HF-X混合四极杆轨道阱质谱仪(America、Thermo)对分离后的肽段进行分析。
质谱条件：电喷雾离子源，负离子扫描，离子源电压为2000V，离子源温度为600℃。MRM扫描分析设置：一级质谱扫描范围为50-1600m/z，扫描分辨率120000；二级质谱扫描范围固定为100m/z，二级扫描分辨率30000。
使用Maxquant软件对二级质谱图数据进行肽段、蛋白的鉴定及差异表达蛋白的定量。通过在线生物信息分析网站METASCAPE，使用京都基因和基因组百科全书(Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)数据库和基因本论(gene ontology，GO)数据库中的生物学进程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)对所得到的差异表达蛋白进行富集分析和通路分析；使用在线绘图类网站Bioimformatics对通路和富集分析结果可视化展示；使用在线检索基因/蛋白质相互作用检索网站STRING进行蛋白质相互作用分析；使用Cytoscape软件对相互作用分析结果可视化展示。
通过根据这些蛋白的GO富集分析、KEGG通路分析、蛋白相互作用等生物信息学分析结果和蛋白的差异倍数，进一步筛选出候选蛋白标志物，根据蛋白标志物通路初步选择了氨基酸代谢相关的代谢物和胆汁酸代谢相关的代谢物。兼顾试剂商品化程度，进一步选择出了ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA共12种标志物。图1所示为非小细胞肺癌核心调控蛋白网络，兼顾试剂标准化选择了标志物ApoA2、ApoB、C3、FN。CEA为临床常用的蛋白标志物。对差异蛋白的富集分析显示差异表达蛋白富集在胆汁酸代谢和氨基酸代谢相关通路，根据试剂商品化程度选择标志物His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA。
实施例2：本发明中标志物对非小细胞肺癌的筛查价值验证
1、从全血中分离血浆样本
用含有促凝剂的红盖促凝管(BD，America)采集受试者空腹外周血全血，30min内16000×g离心15min、6小时内分离血浆至新的1.5mL离心管中。血浆样品保存于-80℃低温冰箱中。
2、免疫比浊方法测定血浆样本中蛋白表达水平
样本收集：100例HC组、110例非小细胞肺癌患者(NSCLC组)、作为参照的108例良性肺部疾病患者(BPD组)
按标准操作使用人APOA2免疫比浊试剂盒(Leadman Biochemistry、Beijing，CN)、APOB免疫比浊试剂盒(Mike、SiChuan、CN)、人C3免疫比浊试剂盒(Siemens、German)和人FN免疫比浊试剂(Strong Biotechnologies，Beijing，CN)盒检测血浆蛋白标志物的表达水平。使用SPSS 22.0和MedCalc 15.0进行统计分析。正态性分布检验方法为K-S检验。呈正态分布的数据以x±s表示，使用独立样本t检验进行组间比较；呈非正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。将差异表达的蛋白进行受试者工作曲线(Receiver Operating Curve，ROC)分析(P<0.05时，具有显著性差异，P<0.01时，具有极显著差异)。绘制包含误差线的散点图。如图2所示，根据210例样本(100例HC组、110例非小细胞肺癌患者)的定量检测结果APOA2、APOB、C3、FN在NSCLC组和HC组中均存在显著差异。其中APOA2和FN在非小细胞肺癌患者中相对于正常人呈现下降趋势，APOB和C3在非小细胞肺癌患者中相对于正常人呈现上升趋势。
3、LC-MS/MS方法测定血浆样本中的氨基酸和胆汁酸表达水平
样本收集：100例HC组、110例非小细胞肺癌患者(NSCLC组)、作为参照的108例良性肺部疾病患者(BPD组)。
按标准操作使用氨基酸代谢谱分析试剂盒(ClinMeta,Shanghai,CN)检测血浆氨基酸的表达水平。分离血清，取10μl待测样本于EP管中，加入40μl氨基酸样本稀释液，震荡混匀(2000rp，5min)。设置氮吹仪温度50℃吹干；加入复溶液100μl至96孔板内，以600rpm震荡混匀5min，采用LC-20A液相色谱仪和API3200MD三重四级杆质谱仪进行检测，采用Analyst质谱工作站对数据和质谱图像进行收集。
色谱条件：使用ACE Excel3 C18(3.0mm×100mm)分析柱；柱温40℃；流动相A：超纯水与流动相添加剂的混合液；流动相B：甲醇与流动相添加剂的混合液；梯度洗脱、流速550μL/min。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，按试剂说明书进行参数设置：离子源参数为雾化气压力为50psi、辅助加热器压力为50psi，气帘气压力为30psi，碰撞气压力为6psi；离子源电压为5000V；离子源温度为500℃。MRM扫描分析。
按标准操作使用胆汁酸代谢谱分析试剂盒(ClinMeta,Shanghai,CN)检测血浆胆汁酸的表达水平。分离血清，取血清样本100μl，加入含内标的提取液500μl，涡旋混匀(2500rpm，5min)；离心(13000rpm，10min)；取上清液400μl于96孔板中，60℃氮气吹干；加入复溶液100μl，将96孔板放置在微孔板恒温振荡器中混匀(700rmp 10min)，转移96孔板中的复溶液到专用过滤板中，过滤板下放置新的96孔板，将过滤板及96孔板一起放置于多管架自动平衡离心机中进行过滤，离心(4000rpm，1min)，收集滤液，采用LC-20A液相色谱仪和API3200MD三重四级杆质谱仪进行检测，采用Analyst质谱工作站对数据和质谱图像进行收集。
色谱条件：使用ACE Excel3 C18(3.0mm×100mm)分析柱；柱温40℃；流动相A：超纯水与流动相添加剂的混合液；流动相B：甲醇；梯度洗脱、流速500μL/min。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，按试剂说明书进行参数设置：离子源参数为雾化气压力为60psi、辅助加热器压力为65psi，气帘气压力为20psi，碰撞气压力为8psi；离子源电压为-4500V；离子源温度为600℃。MRM扫描分析。
采用SPSS 22.0软件及MedCalc 15.0软件进行统计分析。正态性分布检验采用K-S检验。呈正态分布的数据以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；呈非正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。采用ROC曲线评估各指标的诊断性能。以P<0.05为差异有统计学意义。如图3所示，根据210例样本(100例HC组、110例非小细胞肺癌患者)的定量检测结果His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA在NSCLC组和HC组中均存在显著差异。其中His、LCA、UDCA在非小细胞肺癌患者中相对于正常人呈现下降趋势，Cit、Orn、CA和GCDCA在非小细胞肺癌患者中相对于正常人呈现上升趋势。
4、电化学发光技术检测血浆样本中的经典肿瘤标志物表达水平
样本收集：100例HC组、110例非小细胞肺癌患者(NSCLC组)、作为参照的108例良性肺部疾病患者(BPD组)。
按标准操作使用CEA试剂盒(Roche，Swiss)检测经典肿瘤标志物的表达水平，使用Cobas e801电化学发光分析仪对肺癌经典给肿瘤标志物进行检测。。采用双抗体夹心法原理，仪器首先吸取血清样本，与生物素化的待测肿瘤标志物单克隆抗体混匀，继续加入三联吡啶钌标记的待测肿瘤标志物单克隆抗体，混匀，形成双抗体夹心复合物。继而加入链霉亲和素包被的微粒，使双抗体夹心复合物通过生物素——链霉亲和素间的反应，结合到微粒上。最后混合有微粒的反应混合液被吸取到测量池中，微粒被磁铁吸附到电极上，通电后产生化学发光现象，通过光电倍增管进行测定，仪器通过校准曲线得到待测肿瘤标志物的浓度。
采用SPSS 22.0软件及GraphPad 6.0软件进行统计分析。采用K-S检验进行正态性分布检验。呈正态分布的数据以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；呈非正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。采用ROC曲线评估指标的诊断性能。P<0.05为差异有统计学意义。如图4所示，根据210例样本(100例HC组、110例非小细胞肺癌患者)的定量检测结果，CEA在非小细胞肺癌患者体内高于在正常人体内，图4为反映其筛查效果的ROC曲线。
5、评估各标志物对非小细胞肺癌早期筛查的价值
采用SPSS 22.0软件及GraphPad 6.0软件进行统计分析。采用ROC曲线评估指标的筛查性能。整理各标志物独立进行筛查效果为表1所示数据，AUC>0.5时表明标志物具有独立筛查效果。ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA的诊断效果如表1所示。
表1筛查模型标志物独立诊断效果
CI:置信区间
实施例3：本发明分子标志物应用于非小细胞肺癌早期筛查模型建立
非小细胞肺癌早期筛查模型的构建
样本收集：100例HC组、110例非小细胞肺癌患者(NSCLC组)、作为参照的108例良性肺部疾病患者(BPD组)。
数据收集：使用免疫比浊方法测定血浆样本中蛋白表达水平；LC-MS/MS方法测定血浆样本中的氨基酸和胆汁酸表达水平；电化学发光技术检测血浆样本中的经典肿瘤标志物表达水平。
模型构建：采用SPSS 22.0对血浆蛋白标志物的表达进行整合分析，以80％的样本量作为训练集，20％的样本量作为测试集进行二元Logistics回归分析。利用GraphPadPrism 8软件进行筛查模型的ROC曲线的绘制。
评价模型：将测得的蛋白标志物水平和氨基酸标志物水平，以及胆汁酸标志物水平的数值代入ROC曲线所得Y1在区间[0，1]上取值，以0.37作为分类阈值，高于0.37的诊断为非小细胞肺癌患者，低于0.37的为正常人；
logitP＝-0.282ApoA2+4.317ApoB+3.948C3-0.006FN-0.088His+0.084Cit+0.026Orn+0.001CA-0.071LCA-0.004UDCA+0.001GCDCA+0.510CEA+2.475)；
APOA2数值对应单位为mg/dL；
APOB、C3数值对应单位为g/L；
FN数值对应单位为mg/L；
His、Orn、Cit数值对应单位为μmol/L；
CA、LCA、UDCA、GCDCA数值对应单位为nmol/L；
CEA数值对应单位为ng/ml；
当测定的受试者血浆样品中APOA2、FN、His、LCA、UDCA的表达水平相对于正常受试者的下降，及APOB、C3、CEA、Cit、Orn、CA和GCDCA的表达水平相对于正常受试者的上升，指示受试者存在非小细胞肺癌。
由ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA组成的非小细胞肺癌早期筛查模型在鉴别非小细胞肺癌和健康人群的AUC达0.959，敏感性为88.75％，特异性为92.00％，见图5所示。
通过对包括100例HC组、110例非小细胞肺癌患者(NSCLC组)的血浆来源的多组学标志物的分析，发现由ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA组成早期筛查模型，在使用从全部样本中随机抽选的42例测试样本(22例NSCLC，20例正常人)进行的模型验证过程中，判断为真阳性的有20例，真阴性的有18例，判断敏感性为90.9％，特异度为90.0％，有很好的诊断敏感性和不错的特异性。可为非小细胞肺癌的早期筛查提供依据。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (6)
1.一种用于检测非小细胞肺癌的分子标志物，所述分子标志物为ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA的组合标志物。
2.根据权利要求1所述的分子标志物在制备非小细胞肺癌病人筛查试剂盒、试剂或芯片中的应用。
3.根据权利要求1所述的分子标志物在制备非小细胞肺癌病人筛查评价模型中的应用。
4.一种用于检测非小细胞肺癌的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1所述的分子标志物的检测试剂和/或检测仪器。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于从全血中分离血浆样本的试剂，用于检测ApoA2、ApoB、C3、FN、His、Cit、Orn、CA、UDCA、LCA、GCDCA和CEA表达水平的试剂。
6.一种用于非小细胞肺癌筛查的评价模型，包括：
（1）测定受试者血浆样品中血浆蛋白标志物ApoA2、ApoB、C3、FN和CEA，氨基酸标志物His、Cit和 Orn，以及胆汁酸标志物CA、UDCA、LCA和 GCDCA的表达水平；
（2）以80%的样本量作为训练集，20%的样本量作为测试集，对血浆标志物的表达进行整合分析，绘制评价模型的ROC曲线，并根据ROC曲线构建得到非小细胞肺癌筛查评价模型；
所述评价模型为：将测得的蛋白标志物水平和氨基酸标志物水平，以及胆汁酸标志物水平的数值代入ROC曲线，所得Y1在区间[0，1]上取值，以0.37作为分类阈值，高于0.37的诊断为非小细胞肺癌患者，低于0.37的为正常人；
其中，
logitP＝- 0.282ApoA2 + 4.317ApoB + 3.948C3 - 0.006FN - 0.088His +0.084Cit + 0.026Orn + 0.001CA - 0.071LCA - 0.004UDCA + 0.001GCDCA + 0.510CEA+ 2.475；
APOA2数值对应单位为mg/dL；
APOB、C3数值对应单位为g/L；
FN数值对应单位为mg/L；
His、Orn、Cit数值对应单位为μmol/L；
CA、LCA、UDCA、GCDCA数值对应单位为nmol/L；
CEA数值对应单位为ng/ml；
当测定的受试者血浆样品中APOA2、FN、His、LCA、UDCA的表达水平相对于正常受试者的下降，及APOB、C3、CEA、Cit、Orn、CA和GCDCA的表达水平相对于正常受试者的上升，指示受试者存在非小细胞肺癌。
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| CN109061164A (zh) * | 2018-08-21 | 2018-12-21 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 用于非小细胞肺癌诊断的组合标志物及其应用 |
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