CN109880914A - 一种基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法，将作标样的二倍体大鳞副泥鳅和待测的泥鳅放入麻醉溶液中进行麻醉；用注射器先吸取PBS缓冲液，再从泥鳅臀鳍基部抽静脉血，然后迅速注入肝素钠管中；取血样至事先加过PBS缓冲液的离心管中，加入DAPI染液，混匀后室温下避光染色，染色后每管再加PBS缓冲液，充分混匀；将上述血细胞悬浊液用流式细胞仪进行检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与标样的峰值图均值进行比较，确定检测样品的倍性大小。本发明提供的方法除了能鉴定整数倍性后代，还可检测非整数倍性和嵌合体后代，在鱼类非正常配子形成机制研究中具有重要的实用价值。

Description

一种基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法。

背景技术

水产养殖动物的倍性控制技术在水产动物育种中发挥着重要作用。我国鱼类、贝类等水产养殖动物多倍体育种研究始于20世纪70年代中期，已成功进行诱导草、鳙、鲤、鲫、鲢、罗非鱼、胡子鲶、虹鳟、大黄鱼、真鲷、牙鲆、鲍鱼、牡蛎、扇贝等30多种多倍体试验，其中三倍体的异育银鲫、湘云鲫、湘云鲤、牡蛎等已达到了实用化生产阶段。不同倍性水产动物存在生长差异，一般认为三倍体水产动物因其生殖细胞减数分裂异常，性腺不发育或发育不完全，从而生长速度较二倍体快。

目前，有关水产动物倍性鉴定方法有多种，包括：染色体计数法、红细胞及细胞核体积测量法、核仁组织区银染计数法、体细胞DNA相对含量法等。染色体制片直接计数法需要获得鱼类体细胞有丝分裂中期分裂相，是通过染色体计数与参考染色体组进行比较鉴定鱼类倍性的一种方法，是最为经典的一种鱼类倍性鉴定方法。同时，染色体计数法也是最常用的一种倍性鉴定方法。但因体细胞有丝分裂中期分裂相制备成功率低、步骤繁琐、需要耗费昂贵的试剂等特点，无法对大量样品进行快速检测。红细胞及细胞核体积测量法和核仁组织区银染计数法鉴定倍性准确性较低，且不易用于批量后代的倍性鉴定。基于流式细胞术的体细胞DNA相对含量法是目前最为快速、便捷、准确的一种鱼类倍性检测方法。只需抽取少量血细胞或剪取少量鳍条组织即可快速进行倍性鉴定，不需要杀死待测样本，对鱼体伤害小，特别是需要批量鉴定鱼类亲本的倍性、用于规模化育种时，基于流式细胞术的DNA相对含量法鉴定鱼类倍性具有其他方法无可比拟的优势。

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)是我国常见的一种小型经济鱼类。既是美味佳肴，又是益寿药品，被人们誉为“水中人参”。由于泥鳅的营养价值高，国内外市场销路好，泥鳅的市场价格逐年上涨。近十年，泥鳅的增养殖已成淡水养殖的特色农业，目前养殖规模仍在继续扩大。三倍体鱼类具有生长快、肉质好、可食率高、抗病率强、不育等优良性状的特点，在养殖上具有重要意义。因此，培育三倍体品种，对促进泥鳅养殖生产的发展，具有重要的经济价值和广泛的应用前景。目前对三倍体诱导的大量工作表明：很难有一种方法能100％的产生三倍体，且操作烦琐，每年进行诱导培育，使用昂贵的仪器，所用药品毒性大、价格昂贵，生产成本较高。四倍体与正常二倍体杂交，从理论上讲可以产生100％不育的三倍体，从而实现大量、安全、方便、可靠的生产三倍体。根据泥鳅染色体核型研究表明，我国的泥鳅除二倍体外还存在天然四倍体种类，我国天然四倍体泥鳅含有全四套染色体组的遗传四倍体(4n＝100，雌雄均能产生正常的2n配子。因此，利用天然四倍体与二倍体杂交生产100％不育的三倍体，实现大量、连续育种，为大规模生产全三倍体泥鳅提供有效途径。然而多倍体泥鳅与二倍体泥鳅在外形上没有明显差异、天然泥鳅四倍体的鉴定以及四倍体与二倍体杂交后产生的后代是否三倍体，寻找一种准确、简便、快速方法来确定染色体的倍性显得十分重要。

发明内容

本发明提供一种基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法，针对上述现有技术中鱼类倍性鉴定存在的问题，将流式细胞仪应用到泥鳅倍性鉴定中，建立泥鳅倍性快速鉴定方法体系，从而提高泥鳅倍性鉴定效率，为三倍体泥鳅产业化提供基础。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法，包括以下步骤：

1)将作标样的二倍体大鳞副泥鳅和待测的泥鳅放入加有MS₂₂₂的麻醉溶液中进行麻醉，分别编号，抽血，每尾独立存放；

2)用1ml的注射器先吸取0.1mlPBS缓冲液，再从泥鳅臀鳍基部抽静脉血，抽取0.1-0.2ml血即可，然后迅速注入肝素钠管中，轻摇均匀；

3)取10ul肝素钠管中的血样至1.5ml的事先加过100ulPBS缓冲液的离心管中，加入100ul的DAPI染液，混匀后室温下避光染色10-15min，染色后每管再加300ul的PBS缓冲液，使血细胞悬液浓度达到10⁵-10⁶个/ml，充分混匀；

4)将上述血细胞悬浊液用流式细胞仪进行检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与标样的峰值图均值进行比较，确定检测样品的倍性大小。

所述步骤2)中，将盛有静脉血样的肝素钠管放入冰箱冷藏室保存，以保证血液的新鲜度。

所述PBS缓冲液含有以下成分：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L，其余为水。

所述DAPI染液的浓度为1mg/mL。

注意：每次在测定待测泥鳅样本之前，用已知二倍大鳞副泥鳅血液作为标样，调节仪器电压值使其荧光信号峰位于合适位置；且待测泥鳅所有检测参数设置与标样一致。

一个物种细胞中染色体形态结构和数目是恒定的。细胞核内的DNA含量与它们所含染色体数成比例，当细胞内染色体倍数增加时，其DNA含量也相应增加，因此可通过DNA含量来确定染色体数的多少，染色体数多少决定该物种的倍性。20世纪90年代以前国内外对于鱼类多倍体的鉴定，绝大多数采用染色体计数方法，染色体计数方法报道的基本均是把鱼体肾细胞作为制样材料，比较费时，要获得好的染色体标本不容易，而且必须把鱼杀死，无法进行活体筛选，尽管染色体计数是传统的准确的鉴定鱼类倍性方法，但作为规模化选择育种的方法具有很大的局限性。20世纪90年代后随着流式细胞仪的问世及准确度的不断提高，到目前，用流式细胞仪测定鱼类的DNA相对含量的方法已比较完善和普遍，有多位研究者对染色体计数与流式细胞仪测定鱼类相对DAN含量确定倍性两种方法进行比较，结果表明，二者所得到的结果完全一致，该方法已得到国内外水产学者及专家的普遍认可。该方法根据物种细胞中染色体数与其DNA含量成比例的原理，利用流式细胞仪通过待测泥鳅血细胞中DNA的荧光峰值与大鳞副泥鳅血细胞中DNA的荧光峰值图，即直方图与已知标样对比，得出待测样本的倍性，已知大鳞副泥鳅为二倍体，因此，如荧光比峰值比在1.0左右(与1.0差异不显著)，则待测泥鳅为二倍体；如峰值比在1.5左右(与1.5差异不显著)，则为三倍体；如峰值比在2左右(与2差异不显著)，则为四倍体。

相对于现有技术，本发明提供的方法简便可行，利用1ml注射器针抽取微量血即可检测，倍性分析仪检出率高，克服了需要大量血液制备血细胞悬液样缺点，减少了待测泥鳅的应激反应，对待测样本伤害小。特别是四倍体亲本，水域中天然四倍体泥鳅本身少，鉴定出倍性后，要留做亲本试验和繁育三倍体后代，如在鉴定的过程中受到伤害大，难以恢复。

检测倍性灵敏度高。本发明提供的方法除了能鉴定整数倍性后代，还可检测非整数倍性和嵌合体后代，在鱼类非正常配子形成机制研究中具有重要的实用价值。

速度快、可进行批量样本的倍性检测。样本量大，选用自动进样模式，每个样本检测不超过1min，倍性检测速度快，大大提高了亲鳅倍性检测的效率，在三倍体泥鳅规模化育种上意义重大。

附图说明

图1是实施例1中大鳞副泥鳅DNA含量峰值图。

图2是实施例1中天然四倍体泥鳅后备亲本DNA含量峰值图。

图3是实施例2中大鳞副泥鳅(♀)与大鳞副泥鳅(♂)自交产生的二倍体后代DNA含量峰值图。

图4是实施例3中大鳞副泥鳅(♀)与四倍体泥鳅(♂)杂交产生的三倍体后代DNA含量峰值图。

图5是实施例4中四倍体泥鳅(♀)与大鳞副泥鳅(♂)杂交产生的三倍体后代DNA含量峰值图。

图6是实施例5中二倍体泥鳅(♀)与四倍体泥鳅(♂)杂交产生的三倍体后代DNA含量峰值图。

图7是实施例6中四倍体泥鳅(♀)与四倍体泥鳅(♂)自交产生的四倍体后代DNA含量峰值图。

具体实施方式

下面给出几个典型实施例，但本方法并不局限于以下实施例中。

如果检测时温度高、一次采样量大(超过30尾)，抽10-15尾时，把血样放入冰箱4℃保存，以保证血液新鲜度。

实施例1：

利用本方法对天然水域中泥鳅倍性进行鉴定，具体操作如下：

1)待测泥鳅采自湖北荆州市自然水域。暂养水泥池中，检测时用地笼捕出。先用MS₂₂₂麻醉，逐尾称量体重，测量全长等生物学指标，分别编号，抽血，每尾独立存放于带盖子的塑料盒中。

2)用1ml的注射器事先吸取0.1mlPBS缓冲液，从泥鳅臀鳍基部抽静脉血，抽取0.1ml血，迅速注入肝素钠管中，轻摇均匀，放入冰箱冷藏室保存。

3)血细胞悬液制作：取上述血样10ul至1.5ml的事先加过100ulPBS缓冲液的离心管中，加入100ul的1mg/mL的DAPI染液，混匀后室温下避光染色10min，染色后再加入300ul的PBS缓冲液，使血细胞悬液浓度达到10⁵-10⁶个/ml，充分混匀。

4)将上述样本吸20ul注入检测管内用流式细胞仪进行检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与标样的峰值图均值进行比较，确定检测样品的倍性大小。

注意：在进行样品检测之前，以已知二倍性大鳞副泥鳅血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本发明中二倍性大鳞副泥鳅荧光信号峰值位于50(图1)。

对1800尾待测泥鳅进行倍性鉴定，其中四倍体出现767尾(图2)。

四倍体泥鳅亲本倍性的部分检测数据如表1-3所示。

表1泥鳅后备亲鱼倍性分析(2017.7.11上午湖北荆州样本、102#池、地笼捕获)

表2泥鳅后备亲鱼倍性分析(2017.7.13湖北荆州样本、102#池、地笼捕获)

表3泥鳅后备亲鱼倍性分析(2018.6.29上午湖北荆州样本、102^#池、地笼捕获)

由表1-3可知，荧光比值在2附近的可视为四倍体泥鳅，按照上述方法进行检测，共鉴定出四倍体泥鳅767尾，其中，筛选出雄性四倍体549尾、雌性271尾。

实施例2：

利用本方法对大鳞副泥鳅(♀)与大鳞副泥鳅(♂)自交产生子代的倍性进行鉴定。具体操作如下：

1)用地笼捕出养殖在水泥池中子代，先用MS₂₂₂麻醉，逐尾称量体重，测量全长等生物学指标，分别编号，抽血，每尾独立存放于带盖子的塑料盒中。

2)用1ml的注射器事先吸取0.1mlPBS缓冲液，从待测子代泥鳅臀鳍基部抽静脉血，抽取0.12ml血，迅速注入肝素钠管中，轻摇均匀，放入冰箱冷藏室保存。

3)血细胞悬液制作：取上述血样10ul至1.5ml的事先加过100ulPBS缓冲液的离心管中，加入100ul的1mg/mL的DAPI染液，混匀后室温下避光染色11min，染色后再加300ul的PBS缓冲液，使血细胞悬液浓度达到10⁵-10⁶个/ml，充分混匀。

4)将上述样品吸20ul注入检测管内用流式细胞仪进行检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与标样的峰值图均值进行比较，确定检测样品的倍性大小。

注意：在进行样品检测之前，以已知二倍性大鳞副泥鳅血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本发明中标样二倍性大鳞副泥鳅荧光信号峰值位于50(图1)，对随机抽取的30尾大鳞副泥鳅自交子代进行检测，倍性检出率为100％，均为二倍体，具体检测结果见表4和图3。

表4大鳞副泥鳅自交后代检测结果

从表4可看出：大鳞副泥鳅自交后代均为二倍体。

实施例3：

利用本方法对大鳞副泥鳅(♀)与四倍体泥鳅(♂)杂交产生子代的倍性进行鉴定。具体操作如下：

1)用地笼捕出养殖在水泥池中子代。先用MS₂₂₂麻醉，逐尾称量体重，测量全长等生物学指标，分别编号，抽血，每尾独立存放于带盖子的塑料盒中。

2)用1ml的注射器事先吸取0.1mlPBS缓冲液，从待测子代泥鳅臀鳍基部抽静脉血，抽取0.14ml血，迅速注入肝素钠管中，轻摇均匀。检测时温度高，每抽10-15尾时，把血样放入冰箱4℃保存，以保证血液新鲜度。

3)DNA检测血细胞悬液制作：取上述血样10ul至1.5ml的事先加过100ulPBS缓冲液的离心管中，加入100ul的1mg/mL的DAPI染液，混匀后室温下避光染色12min，染色后再加300ul的PBS缓冲液，使血细胞悬液浓度达到10⁵-10⁶个/ml，充分混匀。

4)将上述样品吸20ul注入检测管内用流式细胞仪进行检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与标样的峰值图均值进行比较，确定检测样品的倍性大小。

注意在进行样品检测之前，以已知二倍性大鳞副泥鳅血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本发明中标样二倍性大鳞副泥鳅荧光信号峰值位于44，对随机抽取的111尾杂交子代进行倍性检测，倍性检出率为100％，均为三倍体，但出现超三倍体，与标样DNA荧光比值达到1.699，具体检测结果见表5和图4。

表5大鳞副泥鳅与四倍体泥鳅杂交产生三倍体后代的倍性检测数据

实施例4：

利用本方法对四倍体泥鳅(♀)与大鳞副泥鳅(♂)杂交产生子代的倍性进行鉴定。具体操作如下：

1)用地笼捕出养殖在水泥池中子代。先用MS₂₂₂麻醉，逐尾称量体重，测量全长等生物学指标，分别编号，抽血，每尾独立存放于带盖子的塑料盒中。

2)用1ml的注射器事先吸取0.1mlPBS缓冲液，从待测子代泥鳅臀鳍基部抽静脉血，抽取0.16ml血，迅速注入肝素钠管中，轻摇均匀。检测时温度高，每抽10-15尾时，把血样放入冰箱4℃保存，以保证血液新鲜度。

3)DNA检测血细胞悬液制作：取10ul血样至1.5ml的事先加过100ulPBS缓冲液的离心管中，加入100ul的1mg/mL的DAPI染液，混匀后室温下避光染色13min，染色后再加300ul的PBS缓冲液，使血细胞悬液浓度达到10⁵-10⁶个/ml，充分混匀。

4)将上述样品吸20ul注入检测管内用流式细胞仪进行检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与标样的峰值图均值进行比较，确定检测样品的倍性大小。

注意在进行样品检测之前，以已知二倍性大鳞副泥鳅血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本发明中标样二倍性大鳞副泥鳅荧光信号峰值位于44，对随机抽取的53尾杂交子代进行倍性检测，倍性检出率为100％，均为三倍体，但出现超三倍体和亚三倍体，与标样DNA荧光比值高的达到1.74、低的为1.43，具体检测结果见表6和图5。

表6四倍体泥鳅与大鳞副泥鳅杂交产生的三倍体后代检测数据

实施例5：

利用本方法对二倍体泥鳅与四倍体泥鳅杂交产生子代的倍性进行鉴定。具体操作如下：

1)用地笼捕出养殖在水泥池中子代。先用MS₂₂₂麻醉，逐尾称量体重，测量全长等生物学指标，分别编号，抽血，每尾独立存放于带盖子的塑料盒中。

2)用1ml的注射器事先吸取0.1mlPBS缓冲液，从待测子代泥鳅臀鳍基部抽静脉血，抽取0.18ml血，迅速注入肝素钠管中，轻摇均匀。检测时温度高，每抽10-15尾时，把血样放入冰箱4℃保存，以保证血液新鲜度。

3)DNA检测血细胞悬液制作：取10ul血样至1.5ml的事先加过100ulPBS缓冲液的离心管中，加入100ul的1mg/mL的DAPI染液，混匀后室温下避光染色14min，染色后再加300ul的PBS缓冲液，使血细胞悬液浓度达到10⁵-10⁶个/ml，充分混匀。

4)将上述样品吸20ul注入检测管内用流式细胞仪进行检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与标样的峰值图均值进行比较，确定检测样品的倍性大小。

注意在进行样品检测之前，以已知二倍性大鳞副泥鳅血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本发明中标样二倍性大鳞副泥鳅荧光信号峰值位于52，对随机抽取的51尾杂交子代进行倍性检测，倍性检出率为100％，均为三倍体，但出现超三倍体和亚三倍体，与标样DNA荧光比值高的达到1.78、低的为1.28，具体检测结果见表7和图6。

表7二倍体泥鳅与四倍体泥鳅杂交产生的三倍体后代检测数据

实施例6：

利用本方法对四倍体泥鳅与四倍体泥鳅自交产生子代的倍性进行鉴定。具体操作如下：

1)用地笼捕出养殖在水泥池中子代。先用MS₂₂麻醉，逐尾称量体重，测量全长等生物学指标，分别编号，抽血，每尾独立存放于带盖子的塑料盒中。

2)用1ml的注射器事先吸取0.1mlPBS缓冲液，从待测子代泥鳅臀鳍基部抽静脉血，抽取0.2ml血，迅速注入肝素钠管中，轻摇均匀。检测时温度高，每抽10-15尾时，把血样放入冰箱4℃保存，以保证血液新鲜度。

3)DNA检测血细胞悬液制作：取10ul血样至1.5ml的事先加过100ulPBS缓冲液的离心管中，加入100ul的1mg/mL的DAPI染液，混匀后室温下避光染色15min，染色后加300ul的PBS缓冲液，使血细胞悬液浓度达到10⁵-10⁶个/ml，充分混匀。

4)将上述样品吸20ul注入检测管内用流式细胞仪进行检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与标样的峰值图均值进行比较，确定检测样品的倍性大小。

注意在进行样品检测之前，以已知二倍性大鳞副泥鳅血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本研究中标样二倍性大鳞副泥鳅荧光信号峰值位于50(图1)，对随机抽取的24尾自交子代进行倍性检测，倍性检出率为100％，均为四倍体，具体检测结果见表8和图7。

表8四倍体泥鳅与四倍体泥鳅自交后代检测数据

从实施例1-6可以证明，本方法提供的一种基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性方法，具有快速方便、倍性检出率高、检测灵敏度高等优点。应用此法可批量检测泥鳅及其他鱼类倍性。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将作标样的二倍体大鳞副泥鳅和待测的泥鳅放入加有MS₂₂₂的麻醉溶液中进行麻醉，分别编号，抽血，每尾独立存放；

2）用1ml的注射器先吸取0.1mlPBS缓冲液，再从泥鳅臀鳍基部抽静脉血，抽取0.1-0.2ml血即可，然后迅速注入肝素钠管中，轻摇均匀；

3）取10ul肝素钠管中的血样至1.5ml的事先加过100ulPBS缓冲液的离心管中，加入100ul的DAPI染液，混匀后室温下避光染色10-15min，染色后每管再加300ul的PBS缓冲液，使血细胞悬液浓度达到10⁵-10⁶个/ml，充分混匀；

4）将上述血细胞悬浊液用流式细胞仪进行检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与标样的峰值图均值进行比较，确定检测样品的倍性大小。

2.根据权利要求1所述的基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法，其特征在于：所述步骤2）中，将盛有静脉血样的肝素钠管放入冰箱冷藏室保存，以保证血液的新鲜度。

3.根据权利要求1所述的基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法，其特征在于：所述PBS缓冲液含有以下成分：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L，其余为水。

4.根据权利要求1所述的基于流式细胞仪快速鉴定泥鳅倍性的方法，其特征在于：所述DAPI染液的浓度为1mg/mL。