CN106957888A - 一种基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法 - Google Patents

一种基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法 Download PDF

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赵冰
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Abstract

本发明公开了一种基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法。包括仔鱼肌肉细胞悬浊液的抽吸、过滤。染色和用倍性分析仪上机检测等步骤。本发明最大的改进在于将鱼类倍性批量鉴定阶段从幼鱼期的全肌肉研磨改为初孵仔鱼微量肌肉细胞的分离，从而获得快速高效的倍性鉴定效果。应用此法可快速鉴定不同种类仔鱼倍性，大大缩短倍性操控实验的周期，并且还可更准确地评估倍性操控实验。本发明制样简单、检测快速、具有稳定的高检出率和灵敏度。

Description

一种基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法
技术领域
本发明涉及一种基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法，属于生物技术应用领域，用于快速鉴定仔鱼倍性。
背景技术
鱼类倍性操控技术(雌核发育和多倍体诱导)在水产动物育种中发挥着重要作用。目前，已经陆续开展了鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)、水晶彩鲫(C.auratus transparent colored)、白鲫(C.auratus cuvieri)、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、虹鳟(Salmo gairdneri)、大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)等近百种鱼类的雌核发育和多倍体诱导实验。不同倍性鱼类存在生长差异，一般认为三倍体鱼类因其生殖细胞减数分裂异常，性腺不发育或发育不完全，从而生长速度较二倍体快。雌核发育生殖方式常常用来对优良亲本性状进行纯化，比如鲢新品种“长丰鲢”以雌核发育方式对其亲本生长快等优良性状进行纯化，能稳定遗传给后代。
目前，有关鱼类倍性鉴定方法有多种，包括：染色体计数法、红细胞及细胞核体积测量法、核仁组织区银染计数法、体细胞DNA相对含量法等。染色体计数法需要获得鱼类体细胞有丝分裂中期分裂相，是通过染色体计数与参考染色体组进行比较鉴定鱼类倍性的一种方法，是最为准确的一种鱼类倍性鉴定方法。同时，染色体计数法也是最常用的一种倍性鉴定方法。但因体细胞有丝分裂中期分裂相制备成功率低、步骤繁琐等特点，在大规模的鱼类倍性筛选中实用性不强。红细胞及细胞核体积测量法和核仁组织区银染计数法鉴定倍性准确性较低，且不易用于批量后代的倍性鉴定。基于流式细胞术的体细胞DNA相对含量法是目前最为快速、便捷的一种鱼类倍性检测方法。只需抽取少量外周血细胞或剪取少量鳍条组织即可快速进行倍性鉴定，对鱼体伤害小，特别是一些名贵鱼类的倍性鉴定，基于流式细胞术的DNA相对含量法鉴定鱼类倍性具有其他方法无可比拟的优势。但利用流式细胞术鉴定鱼类倍性时要求待测样本个体较大，能从体外抽出红细胞或剪取足量的鳍条组织，同时不导致鱼体死亡。目前，有关初孵仔鱼的倍性鉴定多用染色体计数法，该方法步骤繁琐、成功率较低，且不可进行批量倍性鉴定。
在开展鱼类倍性操控实验时，需要对所设定的实验条件或方法进行有效评估。目前，对鱼类雌核发育和多倍体诱导结果的评估都是待后代生长至幼鱼甚至成鱼阶段，再对其进行倍性鉴定，继而评估倍性操控实验时所选用的实验条件或方法的优劣。这样就存在一些缺陷：①由于利用雌核发育和多倍体诱导技术获得的后代进行倍性鉴定需待其生长至幼鱼甚至成鱼时，这就需要等待一段较长甚至相当长的时间才能最终评估倍性操控实验的结果；②由于评估倍性操控实验结果前，有一段较长的养殖过程。在这过程中因养殖环境或养殖技术等原因鱼类一般会出现不同程度的死亡，因而幼鱼或成鱼阶段倍性鉴定的结果并不能非常准确地反映真实的利用雌核发育和多倍体诱导技术获得的后代的倍性结果。所以，目前急切需要一种对初孵仔鱼倍性进行快速、批量鉴定的方法。
发明内容
本发明提供了一种基于倍性分析仪快速、批量鉴定仔鱼倍性的方法。针对上述现有技术中鱼类倍性鉴定存在的问题，将倍性分析仪应用到仔鱼倍性鉴定中，建立仔鱼倍性快速鉴定方法体系，从而提高仔鱼的倍性鉴定效率，加速鱼类育种材料的选育。
一种基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法，包括以下步骤：
1)将1-2尾脱膜初孵仔鱼置于样品管内，用PBS缓冲液冲洗两次，最后一次预留400-500μL PBS缓冲液，利用1mL一次性注射器对样品管内仔鱼进行抽吸，反复抽吸2-3次即可获得仔鱼肌肉细胞悬浊液；
2)利用30μm孔径滤网对仔鱼肌肉细胞悬浊液进行过滤；
3)将上述过滤液转移至新的样品管中，加800μL细胞核染色液进行避光染色1-2分钟；
4)将上述染色后的仔鱼肌肉细胞悬浊液进行上机检测，记录荧光信号值，通过峰值图均值比较确定检测样品倍性大小。
所述PBS缓冲液为含有以下成分：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
所述滤网的孔径为30μm。
所述细胞核染色液是浓度为1mg/mL的DAPI。
1尾仔鱼出现单峰，根据其峰值图即可判断仔鱼倍性；2尾仔鱼出现单峰，说明该2尾仔鱼倍性相同，若出现双峰则判定2尾仔鱼倍性不同，根据峰值图分别判定2尾仔鱼倍性。
注意在进行样品检测之前，以已知二倍性成鱼血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。
本发明具有如下优点：
1.本发明方法简便可行。利用注射器针孔抽吸形成的负压对仔鱼微量肌肉细胞进行分离，获取仔鱼肌肉单细胞成功率较高，细胞大小均一，倍性分析仪检出率高，克服了一般组织样品切割制备单细胞悬液样品需求量大的缺点。
2.该方法倍性检测灵敏度高。本方法除了能鉴定整数倍性后代，还可检测非整数倍性后代，在鱼类非正常配子形成机制研究中具有重要的实用价值。
3.应用范围广。本发明适用于各种鱼类初孵仔鱼的倍性鉴定，大大缩短了鱼类雌核发育和多倍体诱导条件优化所需的实验周期。
4.采用本发明所述方法可满足批量样本的倍性检测。倍性检测速度快，大大提高了仔鱼倍性检测的效率。
附图说明
图1是实施例1中二倍体泥鳅雌核发育后代单倍体仔鱼DNA含量峰值图。
图2是实施例1中二倍体泥鳅雌核发育后代二倍体仔鱼DNA含量峰值图。
图3是实施例2中泥鳅多倍体诱导后代三倍体仔鱼DNA含量峰值图。
图4是实施例3中团头鲂多倍体诱导后代三倍体仔鱼DNA含量峰值图。
图5是实施例4中人工诱导获得的杂种五倍体泥鳅雌鱼与四倍体泥鳅雄鱼杂交获得的四倍体仔鱼DNA含量峰值图。
图6是实施例4中人工诱导获得的杂种五倍体泥鳅雌鱼与四倍体泥鳅雄鱼杂交获得的五倍体仔鱼DNA含量峰值图。
图7是实施例4中人工诱导获得的杂种五倍体泥鳅雌鱼与四倍体泥鳅雄鱼杂交获得的2.5倍体和四倍体仔鱼DNA含量峰值图。
图8是实施例4中人工诱导获得的杂种五倍体泥鳅雌鱼与四倍体泥鳅雄鱼杂交获得的3.5倍体仔鱼DNA含量峰值图。
具体实施方式
下面给出几个典型实施例，但本发明并不局限于以下实施例中。
实施例1
利用本发明方法对泥鳅雌核发育后代仔鱼倍性进行鉴定，具体操作如下：
1)对成熟的二倍体泥鳅雌性个体和团头鲂雄性个体进行催熟。按照常规雌核发育方法，将团头鲂灭活精子与二倍体泥鳅成熟卵子混合进行“人工授精”，启动雌核发育过程，并对其进行染色体加倍处理。待二倍体泥鳅雌核发育后代孵化脱膜后，对初孵仔鱼进行倍性鉴定；
2)将1-2尾脱膜初孵仔鱼置于样品管内，利用5mL塑料胶头滴管抽吸PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L)冲洗两次，最后一次预留400-500μL PBS溶液。将盛有仔鱼的样品管置于冰上对其进行麻醉处理。利用干净的1mL注射器对样品管内仔鱼进行抽吸，反复抽吸2-3次获得仔鱼肌肉细胞悬浊液；
3)利用30μm孔径滤网对上述仔鱼肌肉细胞悬浊液进行过滤；
4)将上述过滤液转移至新的样品管中，加800μL细胞核染色液(1mg/mL DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行避光染色1-2分钟；
5)将上述样品管内液体体系进行上机检测，电脑记录其荧光信号峰值图，通过峰值图均值比较确定检测样品倍性大小。
注意在进行样品检测之前，以已知二倍性泥鳅血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本研究中二倍体荧光信号峰值位于100。对100尾二倍体泥鳅雌核发育初孵仔鱼进行倍性鉴定，倍性检出率为100％。其中，单倍体出现23尾(图1)，二倍体出现77尾(图2)，雌核发育诱导成功率为77％。
实施例2
利用本发明方法对泥鳅多倍体诱导后代仔鱼倍性进行鉴定，具体操作如下：
1)对成熟的二倍体泥鳅雌雄个体进行催熟，人工授精获得二倍体泥鳅自交受精卵，并进行冷休克处理诱导多倍体后代。待泥鳅多倍体诱导后代孵化脱膜后，对初孵仔鱼进行倍性鉴定；
2)将1-2尾脱膜初孵仔鱼置于样品管内，利用5mL塑料胶头滴管抽吸PBS缓冲液冲洗两次，最后一次预留400-500μL PBS溶液。将盛有仔鱼的样品管置于冰上对其进行麻醉处理。利用干净的1mL注射器对样品管内仔鱼进行抽吸，反复抽吸2-3次获得仔鱼肌肉细胞悬浊液；
3)利用30μm孔径滤网对上述仔鱼肌肉细胞悬浊液进行过滤；
4)将上述过滤液转移至新的样品管中，加800μL细胞核染色液(1mg/mL DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行避光染色1-2分钟；
5)将上述样品管内液体体系进行上机检测，电脑记录其荧光信号峰值图，通过峰值图均值比较确定检测样品倍性大小。
注意在进行样品检测之前，以已知二倍性泥鳅血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本研究中二倍体荧光信号峰值位于100。对100尾泥鳅多倍体诱导后代初孵仔鱼进行倍性鉴定，倍性检出率为100％。其中，二倍体出现12尾，三倍体出现88尾(图3)，泥鳅三倍体诱导成功率为88％。
实施例3
利用本发明方法对团头鲂多倍体诱导后代仔鱼倍性进行鉴定，具体操作如下：
1)对成熟的二倍体团头鲂雌雄个体进行催熟，人工授精获得团头鲂自交受精卵，并进行冷休克处理诱导多倍体后代。待团头鲂多倍体诱导后代孵化脱膜后，对初孵仔鱼进行倍性鉴定。
2)将1-2尾脱膜初孵仔鱼置于样品管内，利用5mL塑料胶头滴管抽吸PBS缓冲液冲洗两次，最后一次预留400-500μL PBS溶液。将盛有仔鱼的样品管置于冰上对其进行麻醉处理。利用干净的1mL注射器对样品管内仔鱼进行抽吸，反复抽吸2-3次获得仔鱼肌肉细胞悬浊液；
3)利用30μm孔径滤网对上述仔鱼肌肉细胞悬浊液进行过滤；
4)将上述过滤液转移至新的样品管中，加800μL细胞核染色液(1mg/mL DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行避光染色1-2分钟；
5)将上述样品管内液体体系进行上机检测，电脑记录其荧光信号峰值图，通过峰值图均值比较确定检测样品倍性大小。
注意在进行样品检测之前，以已知二倍性团头鲂血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本研究中二倍体荧光信号峰值位于200。对100尾团头鲂多倍体诱导后代初孵仔鱼进行倍性鉴定，倍性检出率为100％。其中，二倍体出现21尾，三倍体出现79尾(图4)，团头鲂三倍体诱导成功率为79％。
实施例4
利用本发明方法对人工诱导获得的杂种五倍体泥鳅与四倍体泥鳅杂交产生的仔鱼倍性进行鉴定，具体操作如下：
1)对人工诱导获得的杂种五倍体泥鳅雌性个体与野生四倍体泥鳅雄性个体进行催熟，人工授精获得受精卵。待其孵化脱膜后，对初孵仔鱼进行倍性鉴定。
2)将1-2尾脱膜初孵仔鱼置于样品管内，利用5mL塑料胶头滴管抽吸PBS缓冲液冲洗两次，最后一次预留400-500μL PBS溶液。将盛有仔鱼的样品管置于冰上对其进行麻醉处理。利用干净的1mL注射器对样品管内仔鱼进行抽吸，反复抽吸2-3次获得仔鱼肌肉细胞悬浊液；
3)利用30μm孔径滤网对上述仔鱼肌肉细胞悬浊液进行过滤；
4)将上述过滤液转移至新的样品管中，加800μL细胞核染色液(1mg/mL DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行避光染色1-2分钟；
5)将上述样品管内液体体系进行上机检测，电脑记录其荧光信号峰值图，通过峰值图均值比较确定检测样品倍性大小。
注意在进行样品检测之前，以已知二倍性泥鳅血液作为参考，调节仪器电压值使其荧光信号峰值图位于合适位置。本研究中二倍体荧光信号峰值位于100。对100尾初孵仔鱼进行倍性鉴定，倍性检出率为100％。初孵仔鱼检测到多种倍性，多为四倍体(图5)，同时检测到少量五倍体(图6)和非整数倍性(图7，图8)。由此推测，人工诱导获得的五倍体泥鳅可产生多种不同倍性成熟配子。对人工诱导获得杂种五倍体泥鳅雌鱼与四倍体泥鳅雄鱼进行杂交获得的子代在其幼鱼或成鱼阶段进行倍性鉴定，均只能检测到四倍体，根据这样的鉴定结果就不能准确地得出人工诱导获得的五倍体泥鳅可产生多种不同倍性成熟配子的结论了。
从实施例1、2、3、4可以证明，本发明提供的一种基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性方法具有快速方便、应用范围广、倍性检出率高、检测灵敏度高等优点。应用此法可大大缩短倍性操控实验的周期，并且还可更准确地评估倍性操控实验。

Claims (4)

1.一种基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将1-2尾脱膜初孵仔鱼置于样品管内，用PBS缓冲液冲洗两次，最后一次预留400-500μL PBS缓冲液，利用1mL一次性注射器对样品管内仔鱼进行抽吸，反复抽吸2-3次即可获得仔鱼肌肉细胞悬浊液；
2)利用30μm孔径滤网对仔鱼肌肉细胞悬浊液进行过滤；
3)将上述过滤液转移至新的样品管中，加800μL细胞核染色液进行避光染色1-2分钟；
4)将上述染色后的仔鱼肌肉细胞悬浊液进行上机检测，记录荧光信号值，通过峰值图均值比较确定检测样品倍性大小。
2.根据权利要求1所述的基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法，其特征在于，所述PBS缓冲液为含有以下成分：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L。
3.根据权利要求1所述的基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法，其特征在于：所述滤网的孔径为30μm。
4.根据权利要求1所述的基于倍性分析仪快速鉴定仔鱼倍性的方法，其特征在于：所述细胞核染色液是浓度为1mg/mL的DAPI。
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