CN104630335B - 一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，其步骤：1）提取待测鳜鱼（翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代）样品的基因组DNA；2）以提取的待测样品基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCR）扩增出DNA目的片段，用于PCR的一对微卫星引物序列为：引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’，引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’；3）PCR产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行银染色，拍照记录电泳结果；4）与标准酶切片段的图谱进行比对，读出待测鳜鱼样品的目的条带所处的位置，分别鉴定为翘嘴鳜、斑鳜、杂交子一代。方法易行，操作简便，弥补了形态学鉴定的不足，解决了水产养殖中杂交鳜（翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代）鉴定难和种质混杂的问题。

Description

一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法

技术领域

本发明属于水产养殖中鱼种鉴定技术领域，具体涉及一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法。

背景技术

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi Basilewsky)和斑鳜(Siniperca scherzeriSteindachner)同隶属于鲈形目、鳜亚科、鳜属，鳜亚科自然仅分布于东亚(中国、朝鲜、韩国、日本、越南(红河))和俄罗斯远东地区。翘嘴鳜和斑鳜肉味鲜美、营养丰富、无肌间刺，且市场价格高，出口需求大，是我国传统的淡水养殖名贵鱼类。翘嘴鳜体型大、生长快，但抗病力较弱；斑鳜易驯食、抗逆性强，但生长慢、养殖周期长。通过杂交获得翘嘴鳜和斑鳜的杂交子代，杂交子代表现出较好的养殖性能及生长性能，在杂交子代的基础上继续进行人工选择、定向交配，培育出生长快、易驯食、抗逆性强的优良品种。翘嘴鳜、斑鳜和杂交子代形态相似，在育种过程中特别是育苗阶段和亲本选择阶段，传统的形态学鉴别方法很难准确辨别纯种和杂交种，因此容易造成种质混杂。

微卫星又称为简单重复序列，均匀分布于真核生物的基因组中，由2-6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星具有等位基因数目多、重复性好、呈共显性遗传等特点，被广泛应用于物种鉴定和基因定位等方面的研究。目前在翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的鉴别方面，学者们已经开发了能鉴别翘嘴鳜与斑鳜的微卫星引物序列，但是目前还没有采用微卫星分子鉴定法进行翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代鉴定的相关报道。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，方法易行，弥补了形态学鉴定的不足，解决了水产养殖中杂交鳜(翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代)鉴定难和种质混杂的问题。操作简便，能快速、准确鉴别翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代，在鳜类种质鉴定和保护、遗传育种和养殖生产中有极大的应用价值。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，包括以下步骤：

1)基因组DNA的提取：采集待测鳜鱼(翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代)样品(采样后立即保存在无水乙醇中，以保证DNA不降解，鳜鱼已死亡)的鳍条或者肌肉组织，提取基因组DNA并测定其纯度和浓度，该步骤中测得DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.80-1.95；

2)DNA目的片段的扩增：以步骤1)提取的待测样品基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增出DNA目的片段，用于PCR的一对微卫星引物序列为：

引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’,

引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’；

3)PCR产物的电泳及银染色鉴定：对PCR产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果，该步骤中采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶。

4)与标准图谱进行对比：与标准酶切片段比对，读出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的目的条带所处的位置。样品在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为翘嘴鳜；样品在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为斑鳜；样品在靠近标准酶切片段的105bp位置和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。

所述1)步骤中测得DNA的浓度范围为579.3-3122.9ng/μl。

所述2)步骤中PCR反应体系为：

所述2)步骤中PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后再72℃延伸10min，反应结束后于4℃中保存。

本发明还提供了一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定试剂盒，包括一对微卫星引物和标准图谱，其中用于PCR的一对微卫星引物序列为：

引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’,

引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’.

本发明提供了一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法。其特征是分子鉴定方法包括以下步骤：基因组DNA的提取、DNA目的片段的扩增、PCR产物的电泳及银染色鉴定。方法中还包括一对特异微卫星引物和标准图谱。本发明的分子鉴定法能快速、有效地鉴别出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代，具有客观、快速、准确、经济的优点，而且对于种质鉴定、种质资源保护、遗传育种和亲缘鉴定有着重要意义。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明采用微卫星标记技术对翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代进行鉴别，其反应稳定，重复性好，具有广泛的适用性，与传统的形态学鉴定相比具有检测准确性高的优点。本发明通过一个微卫星位点、进行一次PCR鉴别出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代，减少了检测时间和降低了检测成本。有较高的产业化前景，实际操作性强，简便、准确，价格适中。

附图说明

图1为一种扩增的翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的微卫星带谱。

M为DNA分子量标记，翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代扩增出三种不同的DNA带型：第一种带型为翘嘴鳜，在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带；第二种带型为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代，在靠近标准酶切片段的105bp位置和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条带；第三种带型为斑鳜，在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带。根据DNA带型的不同即可鉴别出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代。

图2为翘嘴鳜、斑鳜、杂交子一代、翘嘴鳜子代和斑鳜子代的微卫星扩增带谱。

M为DNA分子量标记，读带标准同图1。图2中左边的带型为斑鳜，中间的带型为翘嘴鳜，右边的带型为杂交子一代、翘嘴鳜子代和斑鳜子代。由读带标准对图2样本进行判断：在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带的样本是1、7，判断为斑鳜子代；在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带的样本是5、6、9、10、11，判断为翘嘴鳜子代；在靠近标准酶切片段的105bp位置和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条带的样本是2、3、4、8、12，判断为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。

具体实施方式

现结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，其步骤是：

1.基因组DNA的提取：

从每尾鱼剪取鳍条组织约0.5mg，按照天根生化科技(北京)有限公司生产的血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)所示方法和步骤提取基因组DNA，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，浓度为1.5％的琼脂糖凝胶检测DNA纯度。

2.DNA目的片段的扩增：

即进行PCR。

1)用于PCR反应的一对微卫星引物序列为：

引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’,

引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’.

2)PCR反应体系如下：

混匀后短暂离心。

3)PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后再72℃延伸10min，反应结束后于4℃中保存。

3.PCR产物的电泳及银染色鉴定：

1)制胶：8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶。

2)电泳：每个产物上样3ul(含1ul上样缓冲液、2ul PCR反应产物)，同时点上标准酶切片段作为标准图谱以便比对。用1×TBE电泳缓冲液，120V恒压电泳约1h 40min至蓝色染料到达凝胶底端时终止。

3)银染色鉴定：染色过程如下：拆板后将凝胶放于双蒸水中水洗两次，然后用浓度为0.1％的硝酸银(AgNO₃)染色10min，再用双蒸水漂洗两次，每次约15s，接着用浓度为2％的氢氧化钠(NaOH)、浓度为0.04％的无水碳酸钠(Na₂CO₃)和体积比为0.4％的无水甲醛混合配成的显影液显影约10min，实际以刚能看到黑色条带就停止显影，自来水终止显影以防显影过分造成凝胶全部变黑影响读带，最后在凝胶成像系统中进行成像拍照并保存电泳结果。

4)电泳图谱显示:与标准酶切片段比对，分别读出翘嘴鳜、斑鳜、杂交子一代的目的条带所处的位置。如样品在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为翘嘴鳜；如样品在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为斑鳜；如样品在靠近标准酶切片段的105bp和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。

相关结果请见图1。

实施例2：

一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法的验证实例，其步骤是：

1.样本来源和基因组DNA的提取：

鳜鱼33尾(翘嘴鳜亲本11尾，斑鳜亲本10尾，翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代、翘嘴鳜子代、斑鳜子代共计12尾)从广东清远宇顺农牧渔业科技服务有限公司渔场采得。从每尾鱼剪取鳍条组织约0.5mg，按照天根生化科技(北京)有限公司生产的血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)所示方法和步骤提取基因组DNA，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，浓度为1.5％的琼脂糖凝胶检测DNA纯度。

2.DNA目的片段的扩增：

即进行PCR。

1)用于PCR反应的一对微卫星引物序列为：

引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’,

引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’.

2)PCR反应体系如下：

混匀后短暂离心。

3)PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后再72℃延伸10min，反应结束后于4℃中保存。

3.PCR产物的电泳及银染色鉴定：

1)制胶：8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶。

2)电泳：每个产物上样3ul(含1ul上样缓冲液、2ul PCR反应产物)，同时点上标准酶切片段作为标准图谱以便比对。用1×TBE电泳缓冲液，120V恒压电泳约1h 40min至蓝色染料到达凝胶底端时终止。

3)银染色鉴定：染色过程如下：拆板后将凝胶放于双蒸水中水洗两次，然后用浓度为0.1％的硝酸银(AgNO₃)染色10min，再用双蒸水漂洗两次，每次约15s，接着用浓度为2％的氢氧化钠(NaOH)、浓度为0.04％的无水碳酸钠(Na₂CO₃)和体积比为0.4％的无水甲醛混合配成的显影液显影约10min，实际以刚能看到黑色条带就停止显影，自来水终止显影以防显影过分造成凝胶全部变黑影响读带，最后在凝胶成像系统中进行成像拍照并保存电泳结果。

4)电泳图谱显示:与标准酶切片段比对，分别读出翘嘴鳜、斑鳜、杂交子一代的目的条带所处的位置。如样品在靠近标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为翘嘴鳜；如样品在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为斑鳜；如样品在靠近标准酶切片段的105bp和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。由图2可知：样本1、7为斑鳜子代；样本5、6、9、10、11为翘嘴鳜子代；样本2、3、4、8、12为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代。

相关结果请见图2。

结合附图和具体实施例可知：

传统的形态学鉴定很难将翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代一一鉴别出来，现有微卫星技术只能鉴别出翘嘴鳜和斑鳜，而采用本发明的检测试剂盒和鉴别技术，只需要通过一次PCR鉴别反应就能对翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代进行鉴别，并且反应稳定、重复性好、检测准确性高，并且检测时间减少了40％以上。检测成本降低了50％以上。

Claims (1)

1.一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，其步骤是：

1)基因组DNA的提取：采集待测鳜鱼样品的鳍条或者肌肉组织，提取基因组DNA并测定其纯度和浓度，该步骤中测得DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.80-1.95；

2)DNA目的片段的扩增：以步骤1)提取的待测样品基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增出DNA目的片段，用于PCR的一对微卫星引物序列为：

引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’,

引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’；

3)PCR产物的电泳及银染色鉴定：对PCR产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果；

4)与标准图谱进行对比：与标准酶切片段比对，读出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的目的条带所处的位置，样品在标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带，鉴定为翘嘴鳜；样品在标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带，鉴定为斑鳜；样品在标准酶切片段的105bp位置和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条带，鉴定为翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代；

所述1)步骤中测得DNA的浓度范围为579.3-3122.9ng/μl；

所述2)步骤中PCR反应体系为：

所述2)步骤中PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后再72℃延伸10min，反应结束后于4℃中保存。