WO2018189436A1 - Adjuvants dépourvus de cytokines pour milieux de culture cellulaire notamment pour fécondation in vitro, ou pour la culture de follicules, cellules germinales males ou embryons - Google Patents

Adjuvants dépourvus de cytokines pour milieux de culture cellulaire notamment pour fécondation in vitro, ou pour la culture de follicules, cellules germinales males ou embryons Download PDF

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carnitine
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Patrick Choay
Mohamed BIDRI
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Patrick Choay Sas
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    • C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer

Definitions

  • compositions which can be used as adjuvants or "boosters" for cell culture media, in particular for developing follicles or for the maturation of cells of the male germ line, as well as for in vitro fertilization.
  • in vitro FMV
  • the development of embryos and more generally in mammals, including humans, possibly after thawing of follicles or male cells.
  • compositions for the in vitro culture of follicles or cells of the male germ line, as well as for oocyte fertilization and embryo development are described.
  • the compositions contain one or more growth factors.
  • compositions for the in vitro culture of follicles or embryos characterized in that they comprise at least two growth factors in combination with at least one compound of the family of corticosteroids involved in mammalian energy production, and, where appropriate, with at least one key coenzyme of energy metabolism, such as NAD / NADH and NADP NADP.
  • the present invention results from the demonstration by the inventors of compositions that can be used as adjuvants both for the culture of follicles or of cells of the male germ line, for the fertilization of the oocyte and the development of the embryo until at the blastocyst stage and allowing when mixed with an aqueous solution containing the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos to improve the yield relative to that obtained with the compositions currently on the market, these new compositions being characterized in particular that they do not include cytokines.
  • a zinc salt preferably a water-soluble salt such as zinc chloride or zinc sulphate, especially at a concentration of 0.1 to 3 ⁇ g / ml, preferably at a concentration of 0.5 to 1.5 ⁇ g / ml, expressed as zinc element,
  • inositol in any of its stereoisomeric forms, preferably myo-inositol, or in the form of phosphate, preferably inositol triphosphate, especially in salt form, in particular at a concentration of 1.8 to 18. mg / ml, preferably at a concentration of 5 to 10 mg / ml, expressed as inositol,
  • carnitine in one of its stereoisomeric forms preferably L-carnitine, a carnitine salt, preferably the hydrochloride, a carnitine derivative, preferably acetylcarnitine or a salt of a carnitine derivative, preferably under the form of hydrochloride, especially at a concentration of 0.1 to 2 mg / ml, preferably from 0.5 to 1 mg / ml, expressed as carnitine base, melatonin or an analogue, an acceptable salt or a melatonin solvate particularly at a concentration of 10 "11-10" preferably 5 M 10 "10 to 10" 6 M
  • cystine in one of its stereoisomeric forms preferably L-cystine, a cystine salt, preferably the hydrochloride, a cystine derivative, preferably acetylcystine or a salt of a cystine derivative, preferably in the form of hydrochloride, in particular at a concentration of 20 to 100 ⁇ g / ml of cystine and preferably of 35 to 60 ⁇ g / ml expressed as cystine base,
  • cysteamine a cysteamine salt, preferably the hydrochloride, a cysteamine derivative, preferably acetylcysteamine or a salt of a cysteamine derivative, preferably in the hydrochloride form, in particular at a concentration of 1.5 to 15%; ⁇ g / ml of cysteamine and preferably of 4 to 12 ⁇ g / ml expressed as cysteamine base,
  • one or more key coenzymes of energy metabolism such as NAD / NADH and NADP / NADPH and in that it is cytokine-free.
  • a zinc salt preferably a water-soluble salt such as zinc chloride or zinc sulphate,
  • inositol in any of its stereoisomeric forms, preferably myo-inositol, or in the form of phosphate, preferably inositol triphosphate, in particular in salt form,
  • carnitine in one of its stereoisomeric forms, preferably L-carnitine, a carnitine salt, preferably the hydrochloride, a carnitine derivative preferably acetylcarnitine or a salt of a carnitine derivative, preferably in the form of hydrochloride,
  • cystine in one of its stereoisomeric forms, preferably L-cystine, a cystine salt, preferably the hydrochloride, a cystine derivative, preferably acetylcystine or a salt of a cystine derivative, preferably in the form of hydrochloride,
  • cysteamine a cysteamine salt, preferably the hydrochloride, a cysteamine derivative, preferably acetylcysteamine, or a salt of a cysteamine derivative, preferably in the hydrochloride form,
  • compositions of the invention can be assimilated to adjuvants, supplements or "boosters". These are compositions which, when combined with other elements, make it possible to obtain culture media.
  • the zinc salt concentrations correspond to the amount of element per volume.
  • the concentrations of zinc salt in the abovementioned compositions of the invention are from 0.1 ⁇ g / ml to 3 ⁇ g / ml, preferably from 0.5 ⁇ g / ml to 1.5 ⁇ g / ml, expressed in zinc element.
  • the elemental zinc concentrations in the aforementioned compositions of the invention are in particular 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1.0; 1.1; 1.2; 1.3; 1.4; 1.5; 2; 2.5 or 3 ⁇ g / ml.
  • the inositol may in particular be present in the form of phosphate derivatives of inositol, such as inositol mono-, di- or triphosphate, or in the form of salts.
  • concentrations indicated inositol correspond to the amount of inositol per volume.
  • the inositol concentrations in the aforementioned compositions of the invention range from 1.8 mg / ml to 18 mg / ml, preferably from 5 to 10 mg / ml.
  • concentrations of inositol in the aforementioned compositions of the invention are in particular 1.8; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17 or 18 mg / ml.
  • carnitine is in the form of an L-enantiomer and the carnitine concentrations correspond to the amount of base per volume.
  • the carnitine concentrations in the aforementioned compositions of the invention are from 0.1 mg / ml to 2 mg / ml, preferably from 0.5 mg / ml to 1 mg / ml.
  • the carnitine concentrations in the aforementioned compositions of the invention are in particular 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1.0; 1.1; 1,2; 1.3; 1.4; 1.5; 1.6; 1.7; 1.8; 1.9 or 2.0 mg / ml.
  • melatonin is in the form of a melatonin salt or solvate.
  • melatonin salt any salt with a mineral or organic acid such as salts with hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, citric acid, fumaric acid, hemisuccinic acid or maleic acid.
  • solvates include hydrates and alcoholates.
  • Melatonin analogues include biologically active products whose chemical formula derives from that of melatonin.
  • Analogs of melatonin are also, for example, described in WO 1989/001472, WO 2002/024181, EP 820768, EP 1476152.
  • the concentrations of melatonin are between 10 "11 and 10" 5 M more preferably between 10 "and 10
  • the concentrations expressed in melatonin in the aforementioned compositions of the invention include from about 10 "11 5.10” 11 10 "10 5.10” 10, 10 “9 5.10” 9, 10 “8 5.10” 8, 10 "7 , 5.10 “ 7 , 10 “6 , 5.10 “ 6 or 10 "5 M.
  • Each of the two cysteine molecules that are linked by a disulfide bridge to form the cystine molecule can be in the D or L form.
  • the possible stereoisomers can be used for the practice of the present invention.
  • the L-cystine form is the preferred form.
  • Cystine salts can be formed with mineral acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid.
  • cystine derivatives acetylcystine may be mentioned.
  • the cystine concentrations are between 20 and 100 ⁇ g / ml of cystine and preferably from 35 to 60 ⁇ g / ml expressed as cystine base.
  • cystine concentrations in the abovementioned compositions of the invention are in particular 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90,
  • Cysteamine salts can be formed with mineral acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid.
  • cysteamine derivatives mention may be made of acetylcysteamine.
  • the cysteamine concentrations are between 1.5 and 15 ⁇ 3 ⁇ 4 / ⁇ 1 and preferably between 4 and 12 ⁇ g / ml expressed as cysteamine base.
  • concentrations of cysteamine in the aforementioned compositions of the invention are in particular 1.5; 2; 2.5; 3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5; 6; 6.5; 7; 7.5; 8; 8.5; 9; 9.5; 10; 10.5; 11; 11.5; 12; 12.5; 13; 13.5; 14; 14.5 or 15 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the invention more particularly relates to the abovementioned compositions for the in vitro culture of developing follicles for the maturation of the oocytes contained in said follicles, or for the maturation of cells of the male germline, or for fertilization in vitro oocytes by spermatozoa, or for embryo culture, possibly after thawing of follicles or male cells.
  • compositions of the invention provide the growing and differentiating cells with regulatory molecules.
  • these compositions are capable of allowing the maturation of mammalian oocytes and in particular human immature oocytes as well as the maturation of the cells of the male germ line. They can also ensure the development of the mammalian embryo and in particular the human embryos up to the blastocyst stage, this stage having a higher percentage implantation in the uterus than when the embryo is at a lesser stage. advanced.
  • compositions of the invention contain the following concentrations of active principles:
  • the concentration of zinc, particularly in the form of chloride or of zinc sulphate, is approximately 1 ⁇ g / ml expressed in element
  • the concentration of inositol, particularly in the form of myo-inositol, is approximately 5 mg / ml expressed as inositol
  • the concentration of L-carnitine, particularly in base form or hydrochloride is about 0.6 mg / ml, expressed as carnitine base.
  • the concentration of melatonin base is about 10-7 M.
  • the concentration of cystine, particularly in the form of L-cystine and more particularly in the form of L-cystine hydrochloride is approximately 50 ⁇ g / ml, expressed as cystine base,
  • the concentration of cysteamine, particularly in the hydrochloride form is approximately 8 ⁇ g / ml, expressed as cysteamine base.
  • compositions according to the invention are characterized in that they comprise at least three compounds chosen from the group consisting of:
  • a zinc salt preferably a water-soluble salt such as zinc chloride or zinc sulfate, especially at a concentration of 0.1 to 3 ⁇ g / ml, preferably at a concentration of 0.5 to 1.5 ⁇ g / ml, expressed in zinc element,
  • inositol in any of its stereoisomeric forms, preferably myo-inositol, or in the form of phosphate, preferably inositol triphosphate, especially in salt form, in particular at a concentration of 1.8 to 18. mg / ml, preferably at a concentration of 5 to 10 mg / ml, expressed as inositol,
  • carnitine in one of its stereoisomeric forms, preferably L-carnitine, a carnitine salt, preferably the hydrochloride, a carnitine derivative, preferably acetylcarnitine or a salt of a carnitine derivative, preferably under the form of hydrochloride in particular at a concentration of 0.1 to 2 mg / ml, preferably from 0.5 to 1 mg / ml, expressed as carnitine base, melatonin or an analogue, a salt or a solvate of melatonin, in particular at a concentration of 10 -11 to 10 -5 M, preferably 10 -10 to 10 -6 M, and especially of
  • cystine in one of its stereoisomeric forms preferably L-cystine, a cystine salt, preferably the hydrochloride, a cystine derivative, preferably acetylcystine or a salt of a cystine derivative, preferably under the hydrochloride form, especially at a concentration of 20 to 100 ⁇ g / ml of cystine and preferably from 35 to 60 ⁇ g / ml, expressed as cystine base,
  • cysteamine a cysteamine salt, preferably the hydrochloride, a cysteamine derivative, preferably acetylcysteamine or a salt of a cysteamine derivative, preferably in the form of hydrochloride, in particular at a concentration of 1.5 to 15 ⁇ g; ml of cysteamine and preferably 4 to 12 g / ml expressed as cysteamine base.
  • compositions according to the invention are characterized in that they comprise a quantity preferentially indicated in the present application for each of the compounds mentioned in the group indicated above, namely a zinc salt, myo-ionositol optionally in the form of phosphate, L-carnitine or acetylcarnitine optionally in the form of hydrochloride, melatonin, L-cystine or acetylcystine optionally in the form of hydrochloride and cysteamine or acetylcysteamine optionally in form hydrochloride.
  • a zinc salt myo-ionositol optionally in the form of phosphate
  • L-carnitine or acetylcarnitine optionally in the form of hydrochloride
  • melatonin L-cystine or acetylcystine
  • cysteamine or acetylcysteamine optionally in form hydrochloride.
  • composition according to the invention comprises about 1 mcg / ml zinc, 5 mg / ml inositol, 0.6 mg / ml L-carnitine base, 10 "base melatonin 7 M, 50 mcg / ml of L-cystine base and possibly 8 ⁇ g / ml of cysteamine base.
  • compositions for in vitro culture comprising at least one compound of the family of corticoids, preferably hydrocortisone in the form of a water-soluble salt such as hydrocortisone hemisuccinate or sodium succinate. hydrocortisone and hydrocortisone sodium phosphate.
  • compositions is between 5 x 10 " M and 10 " M, and is especially 7 x 10 "7 M, or about 350 ng / ml hydrocortisone hemisuccinate expressed as hydrocortisone.
  • compositions for in vitro culture comprising at least one zinc salt in hydrated or anhydrous form chosen from the following salts: zinc chloride, zinc sulphate, zinc gluconate, zinc picolinate, citrate zinc, zinc acetate, zinc lactate, zinc stearate, preferably a water-soluble salt such as zinc sulfate or zinc chloride.
  • compositions defined above contain key coenzymes of the aforementioned energy metabolism, in particular at concentrations such that:
  • the concentration of NADP / NADPH is approximately 1 ⁇ g / ml.
  • compositions for in vitro culture comprising at least two compounds chosen from the group consisting of:
  • a water-soluble salt of zinc chosen from zinc sulphate or zinc chloride and / or myo-inositol and / or melatonin and / or L-carnitine or L-carnitine hydrochloride and / or L-cystine or L-cystine hydrochloride and / or L-cysteamine or L-cysteamine hydrochloride and
  • hydrocortisone hemisuccinate hydrocortisone hemisuccinate, and optionally
  • the invention relates in particular to the above-defined compositions in the form of a lyophilizate, namely in the form of compositions whose different constituents are brought into the dry state, and are capable of being put back into solution while keeping their properties. physico-chemical and biological.
  • the invention more particularly relates to the aforementioned lyophilisais, containing:
  • a zinc salt especially at a concentration of 0.1 to 3 ⁇ g / ml, preferably at a concentration of 0.5 to 1.5 ⁇ g / ml, expressed as zinc element, inositol in any of its stereoisomeric forms, preferably myo-inositol, in particular at a concentration of 1.8 to 18 mg / ml, preferably at a concentration of 5 to 10 mg / ml, expressed in inositol
  • the. carnitine in one of its stereoisomeric forms, preferably L-carnitine, a carnitine salt, preferably the hydrochloride, a carnitine derivative, preferably acetylcarnitine or a salt of a carnitine derivative, especially at a concentration of 0.1 to 2 mg / ml, preferably 0.5 to 1 mg / ml, expressed as carnitine base,
  • melatonin or an analogue an acceptable salt or a melatonin solvate, in particular at a concentration of 10 -11 to 10 -5 M, preferably 10 -10 to 10 -6 M, and
  • cystine in one of its stereoisomeric forms, preferably L-cystine, a cystine salt, preferably the hydrochloride, a cystine derivative, preferably acetylcystine or a salt of a cystine derivative, preferably in the form of of hydrochloride in particular at a concentration of 20 to 100 ⁇ g / ml of cystine and preferably of 35 to 60 ⁇ g / ml expressed as cystine base
  • cysteamine a cysteamine salt, preferably the hydrochloride, a cysteamine derivative, preferably acetylcysteamine or a salt of a cysteamine derivative, preferably in the hydrochloride form, in particular at a concentration of 1.5 to 15 ⁇ g. / ml of cysteamine and preferably at 4 to 12 ⁇ g / ml expressed as cysteamine base
  • At least one compound of the family of corticosteroids defined above such as hydrocortisone hemisuccinate,
  • compositions in freeze-dried form characterized in that they are free of cytokines.
  • the invention also relates to the application of the abovementioned compositions or lyophilisates, as effector adjuvants for the preparation of media for the in vitro culture of follicles under development for the purpose of maturation of oocytes contained in said follicles, or for the maturation of cells of the male germ line, or for in vitro fertilization of oocytes by sperm, or for the culture of embryos, possibly after thawing of follicles or male gametes, said media in vitro culture comprising a composition as defined above, in admixture or in combination with an aqueous solution containing the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos.
  • Said elements are known to those skilled in the art. They may in particular be chosen from human or bovine serum albumin, where appropriate recombinant, and / or mineral salts such as KCl, NaCl, MgSO 4 , NaHCO 3 , Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 .
  • vitamins such as vitamins of group B, including vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B9, vitamin B12 and / or vitamin C and / or vitamin E, and optionally insulin and / or possibly at least one other substance contributing to the process for preparing the culture medium, in particular one or more growth chosen in particular from GM-CSF, IGF-1, IGF-2, EGF, TGF or LIF and preferably GM-CSF and / or at least one antibiotic.
  • group B including vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B9, vitamin B12 and / or vitamin C and / or vitamin E, and optionally insulin and / or possibly at least one other substance contributing to the process for preparing the culture medium, in particular one or more growth chosen in particular from GM-CSF, IGF-1, IGF-2, EGF, TGF or LIF and preferably GM-CSF and / or at least one antibiotic.
  • the expression “in a mixture” means that the compositions of the invention and the aqueous solution containing the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos form only one solution which is the final culture medium after one has been poured into the other whereas the expression “in combination” means that both formulations, namely the invention and the aqueous solution are present together, for example in a kit, but will not be mixed until they are used.
  • the invention also relates to a method for preparing media for in vitro culture defined above, characterized in that it comprises a step of mixing a composition according to the invention acting as adjuvant, complement or "booster" (if appropriate after dissolving in a suitable liquid of said composition according to the invention if it is in the form of powder or lyophilisate) with a solution containing the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos, said elements being as defined above.
  • a composition according to the invention acting as adjuvant, complement or "booster" if appropriate after dissolving in a suitable liquid of said composition according to the invention if it is in the form of powder or lyophilisate
  • a solution containing the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization or the culture of follicles, male cells, or embryos, said elements being as defined above.
  • the appropriate liquid may be for example distilled water, physiological saline, a solution of bovine or recombinant human serum albumin or not, a mixture of these different ingredients or a culture medium conventionally used.
  • the invention also relates to media for the in vitro culture of developing follicles for the maturation of oocytes contained in said follicles, or for maturation of cells of the male germ line, or for in vitro fertilization of oocytes. by the spermatozoa, or for the culture of embryos, optionally after thawing the follicles or male cells, said media for the in vitro culture being as obtained by the process of associating a composition of the invention in the form of a liquid , powder or lyophilisate with an aqueous solution containing the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos, a non-limiting list of said elements being indicated above.
  • compositions according to the invention are mainly adjuvants or "complements" or
  • Booster which are not, in principle, intended to be used alone as culture media. They are mainly intended to be mixed with aqueous solutions containing the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization. A non-exhaustive list of these elements has been indicated previously.
  • aqueous solutions may be constituted by media for in vitro culture which could be used as such but for which the addition of adjuvants, supplements or "booster" according to the invention makes it possible to improve the performances.
  • These aqueous solutions may therefore be commercial culture media such as those marketed under the names such as Gl, G2, EmbryoGen, BlastoGen, Ferticult and HTF.
  • aqueous solutions containing the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos may also be potential culture media prepared by biologists skilled in the art and for whom adjuvants, supplements or "boosters" according to the invention allow, as indicated above and shown hereinafter in the experimental part, to improve performance and efficiency.
  • the invention more particularly relates to media for the in vitro culture of developing follicles for the maturation of the oocytes contained in said follicles, or for the maturation of cells of the male germ line, or for the fertilization in vitro.
  • in vitro from the oocytes by the spermatozoa, or for the culture of embryos, possibly after thawing of the follicles or male cells said media being characterized in that they comprise the constitutive elements of a composition according to the invention as defined herein. above, in combination or in combination with the abovementioned elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos as defined above.
  • the subject of the invention is also a method of maturation of developing mammalian follicles with a view to the maturation of the oocytes contained in said follicles, and more particularly of human follicles, where appropriate after thawing the previously frozen follicles, characterized in that it comprises a step of culturing in vitro follicles taken from the female, and more particularly from women, in a culture medium as defined above according to the invention, advantageously for about 24 to 48 hours .
  • the invention also relates to a method for maturation of cells of the male germ line of mammals, and more particularly human, where appropriate after thawing of previously frozen cells, characterized in that it comprises a step of culturing said cells in vitro. cells, in a culture medium as defined above according to the invention, in particular for several days, advantageously from 1 to 5 days.
  • the subject of the invention is also a process for the in vitro fertilization of oocytes by spermatozoa, and more particularly of oocytes and spermatozoa of human origin, where appropriate after thawing of previously frozen spermatozoa, characterized in that it comprises a step of culturing in vitro the oocytes and spermatozoa mentioned above, in a culture medium as defined above according to the invention, advantageously for about 1 day to about 2 days.
  • the invention also relates to a method for developing mammalian embryos, and more particularly human embryos, characterized in that it comprises a step of culturing in vitro said embryos in a culture medium as defined herein. above according to the invention, preferably during the 5 to 6 days following in vitro fertilization, advantageously so as to obtain embryos in the blastocyst stage.
  • the invention relates in particular to the methods as defined above in which the mammals can be chosen from primates, including humans, sheep, cattle, pigs and in animal species on the way. of disappearance.
  • compositions of the invention can be used both for the maturation of follicles or that of the cells of the male germ line, the in vitro fertilization of the oocytes, and the maturation of the embryos resulting from said fertilization, in particular until blastocyst stage, possibly after thawing of follicles or male cells.
  • kit for the extemporaneous preparation of a culture medium as defined above according to the invention, especially in the context of the implementation of a method mentioned above, kit comprising:
  • composition according to the invention optionally in the form of a lyophilizate and
  • a culture medium prepared from the compositions according to the invention may comprise mainly compounds selected from inorganic salts such as KCl, NaCl, MgSO 4 , NaHCO 3 , Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 ; essential amino acids as well as other amino acids such as glutamic acid, glycine, taurine, cysteine and glutamine; oses and metabolic derivatives, such as glucose, pyruvate, lactate, acetate; vitamins, especially vitamins of group B and vitamin C; purine bases and pyrimidics; albumin; phospholipids; cholesterol; insulin and / or at least one other substance contributing to the process, in particular a growth factor; antibiotics, such as penicillin G, streptomycin, gentamycin or other aminoglycoside.
  • inorganic salts such as KCl, NaCl, MgSO 4 , NaHCO 3 , Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4
  • essential amino acids as well as other amino acids
  • other amino acids such
  • This invention which can be in various forms (liquid, powder, or lyophilisate), can be mixed before conditioning with a liquid solution comprising the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the follicle culture, of male cells, or embryos, this solution can thus be itself a ready-to-use culture medium.
  • the improved medium resulting from the mixture will be intended for the culture of follicles under development for the maturation of oocytes, or for the maturation of cells of the male germline, or for the in vitro fertilization of oocytes by spermatozoa or else for embryo culture, possibly after thawing of follicles, or male cells.
  • compositions according to the invention may also be mixed extemporaneously with a liquid solution comprising the elements conventionally used in the context of in vitro fertilization, or the culture of follicles, male cells, or embryos.
  • the solution thus obtained is a culture medium.
  • compositions of the effector adjuvant object of the present invention that can be used for the preparation of media for the in vitro culture of follicles under development for the maturation oocytes contained in said follicles , or for the maturation of cells of the male germ line, or for the in vitro fertilization of oocytes by sperm, or for the culture of embryos, possibly after thawing of follicles or male cells.
  • Zinc expressed as element 1 ⁇ g / ml
  • compositions 10 times more concentrated than the concentrations mentioned above are diluted extemporaneously at l / 10 th in a conventional culture medium during the production methods of their application.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a zinc salt and melatonin is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 10 ⁇ g of zinc element and 10 " 6 M melatonin.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a zinc salt, inositol and melatonin is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 10 ⁇ g of elemental zinc, 50 mg of inositol and 10 "6 M of melatonin.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a zinc salt, inositol, melatonin and cystine is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 10 ⁇ of zinc element, 50 mg of inositol, 10 -6 M of melatonin and 0.5 mg of cystine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a zinc salt, inositol, melatonin, cystine and carnitine is distributed in 1 ml flasks, such Each vial contains 10 ⁇ g of zinc element, 50 mg of inositol, 10 -6 M of melatonin, 0.5 mg of cystine base and 6 mg of L-carnitine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a zinc salt, inositol, melatonin, cystine, cysteamine and carnitine is distributed in bottles of 1 ml, in such a way that each vial contains 10 ⁇ g of elemental zinc, 50 mg of inositol, 10 -6 M of melatonin, 0.5 mg of cystine base, 80 ⁇ g of cysteamine base and 6 mg of L-carnitine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a zinc salt, inositol and carnitine is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 10 ⁇ g of zinc element, 50 mg of inositol and 6 mg of L-carnitine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • Composition 7 A solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing inositol, melatonin and cystine is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 50 mg of inositol, 10 "6 M and 0.5 mg of melatonin cystine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a zinc salt, inositol, melatonin and carnitine is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 10 ⁇ g of zinc element, 50 mg of inositol, 10 -6 M of melatonin and 6 mg of L-carnitine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing inositol, melatonin, cystine and carnitine is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 50 mg of inositol, 10 -6 M of melatonin, 0.5 mg of cystine base and 6 mg of L-carnitine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a hydrocortisone salt, a zinc salt and melatonin is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 7 x 10 -6 M hydrocortisone, 10 ⁇ g zinc element and 10 -6 M melatonin.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • Composition 11 A solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a hydrocortisone salt, a zinc salt, inositol and carnitine is distributed in 1 ml flasks, so that each vial contains 7 ⁇ 10 -6 M hydrocortisone, 10 ⁇ g zinc element, 50 mg inositol and 6 mg L-carnitine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a hydrocortisone salt, a zinc salt and inositol is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 7 x 10 "6 M hydrocortisone, 10 ug of zinc element and 50 mg of inositol.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a zinc salt and inositol is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 10 ⁇ g of zinc element and 50 mg of inositol.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a hydrocortisone salt, a zinc salt and carnitine is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 7 x 10 "6 M hydrocortisone, 10 ⁇ g zinc element and 6 mg L-carnitine base.
  • This solution is to be diluted at 1/10 in culture medium during the production processes.
  • Composition 15 A solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a zinc salt and carnitine is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 10 g of zinc element and 6 mg of L-carnitine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing a hydrocortisone salt, inositol and cystine is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • a solution prepared extemporaneously by mixing a culture medium with a composition according to the invention containing inositol and cystine is distributed in 1 ml flasks, such that each flask contains 50 mg of inositol and 0, 5 mg of cystine base.
  • This solution was diluted to l / 10th in a culture medium during the production processes.
  • the flasks of the various compositions from 1 to 17 are stored at + 4 ° C. or when their contents are freeze-dried it is stored at a temperature below -20 ° C.
  • oocytes at the stage of the germinal vesicle or “oocytes at the stage of metaphase I” are cultured in a conventional medium of in vitro maturation supplemented with two or more substances.
  • Test 1a Oocytes at the stage of the germinal vesicle (VG) The number of VG oocytes that evolve at the metaphase I (MI) or metaphase II (Mil) stages is determined.
  • VG oocytes are placed in wells containing only the culture medium.
  • the VG oocytes are placed in wells containing the culture medium and a composition according to the invention containing melatonin and zinc.
  • VG oocytes are placed in wells containing the culture medium and a composition according to the invention containing melatonin, zinc and inositol.
  • VG oocytes are placed in wells containing the culture medium and a composition according to the invention containing melatonin, zinc, inositol and cystine.
  • VG oocytes are placed in wells containing the culture medium and a composition according to the invention containing melatonin, zinc, inositol, cystine, cysteamine and carnitine.
  • the VG oocytes are placed in wells containing the culture medium and a composition according to the invention containing melatonin, zinc and hydrocortisone.
  • the VG oocytes are placed in wells containing the culture medium and a composition according to the invention containing zinc and inositol.
  • VG oocytes are placed in wells containing the culture medium and a composition according to the invention containing zinc, inositol and hydrocortisone.
  • the VG oocytes are placed in wells containing the culture medium and a composition according to the invention containing zinc and carnitine.
  • the VG oocytes are placed in wells containing the culture medium and a composition according to the invention containing zinc, carnitine and hydrocortisone.
  • the different groups of oocytes are cultured in the same oven at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% CO 2 .
  • compositions according to the invention which contain substances such as hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, melatonin, cystine and / or cysteamine results in an improvement of the maturation of VG oocytes at the MI and M1 stage after 24H and 48H of culture compared to VG oocytes cultured in the culture medium alone.
  • compositions according to the invention provides improvements in the maturation of MI-oocytes evolving in the Mil stage in the presence of the compositions according to the invention which contain substances such as hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, melatonin, cystine and / or cysteamine
  • the most mature eggs and the best spermatozoa are selected to facilitate fertilization and the number of embryos formed after 48 hours of culture is evaluated.
  • the mature oocytes are placed in the presence of about 10 6 competent spermatozoa in a culture medium to which compositions are added.
  • compositions which contain substances such as hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, melatonin, cystine and / or cysteamine according to the same protocol as that used previously.
  • compositions according to the invention which contain substances such as hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, melatonin, cystine and / or cysteamine in the culture medium improves the percentage of fertilized eggs relative to the group of eggs. present in the culture medium alone.
  • hydrocortisone leads to an improvement in the results of fertilization compared to the absence of hydrocortisone.
  • the mouse CF-1 strain may be used, since the number embryos evolving at the blastocyst stage in a usual culture medium is weak. This model allows to appreciate the beneficial effects of these substances on the early embryonic development.
  • compositions according to the invention which contain substances such as hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, melatonin, cystine and / or cysteamine leads to an improvement in the development of embryos at different stages compared to the group containing only the culture centre.
  • hydrocortisone leads to an improvement in the results of early embryonic development compared with the absence of hydrocortisone.

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Abstract

La présente invention a pour objet des compositions utilisables comme adjuvants pour la culture in vitro de cellules, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins deux composés choisis parmi le groupe constitué par un sel de zinc, l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, la carnitine ou un dérivé de la carnitine, la mélatonine ou un analogue, la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques ou sous forme de dérivé, la cystéamine ou un sel de cystéamine, un corticoïde de préférence P hydrocortisone, lesdites compositions étant dépourvues de cytokines. L'invention a également pour objet des procédés de fécondation in vitro et des procédés de maturation de follicules, de cellules germinales mâles, ou d'embryons utilisant de tels adjuvants de milieux de culture, ainsi que des kits pour la mise en œuvre de ces procédés et comprenant un lyophilisât susmentionné et une solution aqueuse, contenant les autres constituants desdits milieux de culture.

Description

ADJUVANTS DEPOURVUS DE CYTOKINES POUR MILIEUX DE CULTURE CELLULAIRE, NOTAMMENT POUR FECONDATION IN VITRO, OU POUR LA CULTURE DE FOLLICULES, CELLULES GERMINALES MALES OU
EMBRYONS
La présente invention a pour objet des compositions utilisables en tant qu'adjuvants ou «boosters» pour milieux de culture cellulaire, notamment pour des follicules en cours de développement ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ainsi que pour la Fécondation in vitro (FIV) et le développement d'embryons, et plus généralement chez les mammifères, notamment les humains, éventuellement après décongélation de follicules ou de cellules mâles.
Dans l'art antérieur sont décrits des exemples de compositions pour la culture in vitro de follicules ou de cellules de la lignée germinale mâle, ainsi que pour la fécondation de l'ovocyte et le développement de l'embryon. Dans certains de ces exemples, les compositions contiennent un ou plusieurs facteurs de croissance.
C'est ainsi que dans le brevet européen EP 1.088.057 est décrite l'utilisation du GM-CSF pour la préparation d'un milieu destiné au développement d'embryons humains à un stade précoce jusqu'au stade blastocyste dans un programme de FIV.
Dans le brevet européen EP 1.176.190 sont décrites des compositions pour la culture in vitro de follicules ou d'embryons, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins deux facteurs de croissance en association avec au moins un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, et, le cas échéant, avec au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP NADPH.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs de compositions utilisables comme adjuvants aussi bien pour la culture de follicules ou de cellules de la lignée germinale mâle, que pour la fécondation de l'ovocyte et le développement de l'embryon jusqu'au stade blastocyste et permettant lorsqu'elles sont mélangées avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons d'améliorer le rendement par rapport à celui obtenu avec les compositions actuellement sur le marché, ces nouvelles compositions étant notamment caractérisées en ce qu'elles ne comprennent pas de cytokines.
La présente invention a donc pour objet des compositions sous toutes les formes possibles et notamment sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisât pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour le développement d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des spermatozoïdes caractérisées en ce qu'elles comprennent : au moins deux composés choisis parmi le groupe constitué par :
- un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 μg/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1,5 μg/ml, exprimée en zinc élément,
- l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, ou sous forme de phosphate, de préférence l'inositol triphosphate, notamment sous forme de sel, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en inositol,
- la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L- carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en carnitine base, la mélatonine ou un analogue, un sel acceptable ou un solvate de mélatonine notamment à une concentration de 10"11 à 10"5 M de préférence de 10"10 à 10"6 M
0 7
et notamment de 10" à 10" M exprimée en mélatonine base, la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence Pacétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 20 à 100 μg/ml de cystine et de préférence de 35 à 60 μg/ml exprimée en cystine base,
- la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 1,5 à 15 μg/ml de cystéamine et de préférence de 4 à 12 μg/ml exprimée en cystéamine base,
et, le cas échéant,
un ou plusieurs composés choisis parmi les composés de la famille des corticoïdes et/ou
un ou plusieurs coenzymes clés du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH et en ce qu'elle est dépourvue de cytokine.
La présente invention a pour autre objet des compositions sous toutes les formes possibles et notamment sous forme de liquide, de poudre où de lyophilisât pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour le développement d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des spermatozoïdes caractérisées en ce qu'elles comprennent :
* au moins deux composés ou au moins trois composés choisis parmi le groupe constitué par :
- un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc,
- l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, ou sous forme de phosphate, de préférence l'inositol triphosphate, notamment sous forme de sel,
- la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L- carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, de préférence sous la forme de chlorhydrate,
- la mélatonine ou un analogue, un sel acceptable ou un solvate de mélatonine, la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence l'acétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate,
- la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence Pacétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate,
*un ou plusieurs composés choisis parmi les composés de la famille des corticoïdes et, le cas échéant,
*un ou plusieurs coenzymes clés du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH, et en ce qu'elle est dépourvue de cytokine.
Les compositions de l'invention peuvent être assimilées à des adjuvants, des compléments ou des "boosters". Il s'agit de compositions qui, une fois associées à d'autres éléments, permettent d'obtenir des milieux de culture.
Dans les compositions de l'invention, les concentrations en sel de zinc correspondent à la quantité d'élément par volume.
De préférence, les concentrations en sel de zinc dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises de 0,1 μg/ml à 3 μg/ml, de préférence de 0,5 μg/ml à 1,5 μg/ml exprimées en zinc élément.
Les concentrations en zinc élément dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1 ; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5 ; 2; 2,5 ou 3 μg/ml.
Dans les compositions de l'invention, l'inositol peut notamment être présent sous forme de dérivés phosphatés d'inositol, tels que l'inositol mono-, di- ou triphosphate, ou sous forme de sels. Les concentrations indiquées en inositol correspondent à la quantité d'inositol par volume.
De préférence, les concentrations en inositol dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises de 1,8 mg/ml à 18 mg/ml, de préférence de 5 à 10 mg/ml.
Les concentrations en inositol dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 1,8 ; 2 ; 3 ; 4 ; 5 ; 6 ; 7 ; 8 ; 9 ; 10 ; 11 ; 12 ; 13 ; 14 ; 15 ; 16 ; 17 ou 18 mg/ml.
Dans les compositions de l'invention, la carnitine est sous la forme d'un énantiomère L et les concentrations en carnitine correspondent à la quantité de base par volume.
De préférence, les concentrations en carnitine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises de 0,1 mg/ml à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 mg/ml à 1 mg/ml.
Les concentrations en carnitine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 ; 1,0 ; 1,1 ; 1,2 ; 1,3 ; 1,4 ; 1,5 ; 1,6 ; 1,7 ; 1,8 ; 1,9 ou 2,0 mg/ml.
Dans les compositions de l'invention, la mélatonine est sous la forme d'un sel ou d'un solvate de mélatonine.
Par sel de mélatonine, on entend tout sel avec un acide minéral ou organique tels que les sels avec l'acide chlorhydrique, sulfurique, acétique, citrique, fumarique, hémisuccinique ou maléique.
Des exemples de solvates incluent les hydrates et les alcoolates.
Les analogues de mélatonine incluent les produits biologiquement actifs dont la formule chimique dérive de celle de la mélatonine.
Des analogues de la mélatonine sont aussi, par exemple, décrits dans les brevets WO 1989/001472, WO 2002/024181, EP 820768, EP 1476152.
De préférence, dans les compositions de l'invention, les concentrations en mélatonine sont comprises entre 10"11 et 10"5 M plus préférentiellement entre 10"10 et
0 7
10" M et notamment de 10" et 10" M concentrations exprimées en mélatonine base.
Les concentrations exprimées en mélatonine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment d'environ 10"11, 5.10"11, 10"10, 5.10"10, 10"9, 5.10"9, 10"8, 5.10"8, 10"7, 5.10"7, 10"6, 5.10"6 ou 10"5 M. Chacune des deux molécules de cystéine qui sont reliées par un pont disulfure pour former la molécule de cystine peuvent se trouver sous la forme D ou L.
Les stéréoisomères possibles peuvent être utilisés pour la mise en œuvre de la présente invention. La forme L-cystine est la forme préférée.
Les sels de cystine peuvent être formés avec les acides minéraux comme l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique.
Parmi les dérivés de cystine on peut citer Pacétylcystine.
De préférence, dans les compositions de l'invention, les concentrations en cystine sont comprises entre 20 et 100 μg/ml de cystine et de préférence de 35 à 60 μg/ml exprimées en cystine base.
Les concentrations en cystine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90,
Figure imgf000007_0001
Les sels de cystéamine peuvent être formés avec les acides minéraux comme l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique.
Parmi les dérivés de cystéamine on peut citer l'acétylcystéamine.
De préférence, dans les compositions de l'invention, les concentrations en cystéamine sont comprises entre 1,5 et 15 μί¾/ηι1 et de préférence entre 4 et 12 μg/ml exprimées en cystéamine base.
Les concentrations en cystéamine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ; 8 ; 8,5 ; 9 ; 9,5 ; 10 ; 10,5 ; 11 ; 11,5 ; 12 ; 12,5 ; 13 ; 13,5 ; 14 ; 14,5 ou 15 μ^πιΐ.
L'invention a plus particulièrement pour objet des compositions susmentionnées pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles.
Les compositions de l'invention apportent aux cellules en croissance et en différenciation des molécules régulatrices. Ainsi, ces compositions sont susceptibles de permettre la maturation des ovocytes de mammifères et en particulier les ovocytes immatures humains ainsi que la maturation des cellules de la lignée germinale mâle. Elles peuvent aussi assurer le développement de l'embryon de mammifères et en particulier les embryons d'humain jusqu'au stade blastocyste, ce stade ayant un plus fort pourcentage d'implantation dans l'utérus que lorsque l'embryon est à un stade moins avancé.
Avantageusement, les compositions de l'invention contiennent les concentrations suivantes en principes actifs :
- la concentration en zinc, particulièrement sous forme de chlorure ou de sulfate de zinc est d'environ 1 μg/ml exprimée en élément,
- la concentration en inositol, particulièrement sous forme de myo-inositol est d'environ 5 mg/ml exprimée en inositol,
- la concentration en L-carnitine, particulièrement sous forme de base ou de chlorhydrate est d'environ 0,6 mg/ml, exprimée en carnitine base.
- la concentration en mélatonine base est d'environ 10"7 M.
- la concentration en cystine, particulièrement sous forme de L-cystine et plus particulièrement sous forme de chlorhydrate de L-cystine est d'environ 50 μg/ml exprimée en cystine base,
- la concentration en cystéamine, particulièrement sous forme de chlorhydrate est d'environ 8 μg/ml, exprimée en cystéamine base.
Avantageusement, les compositions selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins trois composés choisis parmi le groupe constitué par :
un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 μg/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1,5 μg/ml, exprimée en zinc élément,
- l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, ou sous forme de phosphate, de préférence l'inositol triphosphate, notamment sous forme de sel, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en inositol,
- la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L- carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en carnitine base, - la mélatonine ou un analogue, un sel ou un solvate de mélatonine notamment à une concentration de 10"11 à 10"5 M de préférence de 10"10 à 10"6 M et notamment de
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KF à lO" M exprimée en mélatonine base.
- la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence l'acétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 20 à 100 μg/ml de cystine et de préférence de 35 à 60 μg/ml exprimée en cystine base,
- la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 1,5 à 15 μg/ml de cystéamine et de préférence de 4 à 12 g/ml exprimée en cystéamine base.
Avantageusement, les compositions selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité préférentiellement indiquée dans la présente demande de chacun des composés mentionnés dans le groupe indiqué ci-dessus à savoir un sel de zinc, du myo-ionositol éventuellement sous forme de phosphate, de la L-carnitine ou de l'acétylcarnitine éventuellement sous forme de chlorhydrate, de la mélatonine, de la L-cystine ou de l'acétylcystine éventuellement sous forme de chlorhydrate et de la cystéamine ou de l'acétylcystéamine éventuellement sous forme de chlorhydrate.
Une forme préférée de composition selon l'invention comprend environ 1 μg/ml de zinc, 5 mg/ml d'inositol, 0,6 mg/ml de L-carnitine base, 10"7 M de mélatonine base, 50 μg/ml de L-cystine base et éventuellement 8 μg/ml de cystéamine base.
L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant au moins un composé de la famille des corticoïdes, de préférence de l'hydrocortisone sous forme de sel hydrosoluble tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone, le succinate de sodium d'hydrocortisone et le phosphate de sodium d'hydrocortisone. De préférence, la concentration du sel d'hydrocortisone dans les
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compositions susmentionnées est comprise entre 5 x 10" M et 10" M, et est notamment de 7 x 10"7 M, soit environ 350 ng/ml pour l'hémisuccinate d'hydrocortisone exprimé en hydrocortisone base.
L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant au moins un sel de zinc sous forme hydratée ou anhydre choisi parmi les sels suivants : chlorure de zinc, sulfate de zinc, gluconate de zinc, picolinate de zinc, citrate de zinc, acétate de zinc, lactate de zinc, stéarate de zinc, de préférence un sel hydrosoluble comme le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc.
Avantageusement, les compositions définies ci-dessus contiennent des coenzymes clés du métabolisme énergétique susmentionnés, notamment à des concentrations telles que :
- la concentration de NAD/NADH soit d'environ 1
Figure imgf000010_0001
- la concentration de NADP/NADPH soit d'environ 1 μg/ml.
L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant au moins deux composés choisi parmi le groupe constitué par :
- un sel hydrosoluble de zinc choisi parmi le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc et/ou du myo-inositol et/ou de la mélatonine et/ou de la L-carnitine ou du chlorhydrate de L-carnitine et/ou de la L-cystine ou du chlorhydrate de L-cystine et/ou de la L- cystéamine ou du chlorhydrate de L-cystéamine et
- de l'hémisuccinate d'hydrocortisone, et éventuellement
- du NAD/NADH et/ou du NADP/NADPH.
L'invention concerne en particulier les compositions définies ci-dessus se présentant sous forme de lyophilisât, à savoir sous forme de compositions dont les différents constituants sont amenés à l'état sec, et sont susceptibles d'être remis en solution en gardant leurs propriétés physico-chimiques et biologiques.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les lyophilisais susmentionnés, contenant :
au moins deux composés choisis parmi le groupe constitué par :
- un sel de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 μg/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1,5 μg/ml, exprimée en zinc élément, - l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en inositol,
- la. carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomérique, de préférence la L- carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en carnitine base,
- la mélatonine ou un analogue, un sel acceptable ou un solvate de mélatonine notamment à une concentration de 10"11 à 10"5 M de préférence de 10"10 à 10"6 M et
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notamment de 10" à 10" M exprimée en mélatonine base,
- la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence Pacétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 20 à 100 μg/ml de cystine et de préférence de 35 à 60 μg/ml exprimée en cystine base
et/ou
- la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 1 ,5 à 15 μg/ml de cystéamine et de préférence à 4 à 12 μg/ml exprimée en cystéamine base
et
- au moins un composé de la famille des corticoïdes défini ci-dessus, tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone,
- et éventuellement, le cas échéant ou au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique défini ci-dessus, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH
et compositions sous forme de lyophilisât caractérisées en ce qu'elle sont dépourvues de cytokines.
L'invention a également pour objet l'application des compositions ou lyophilisais susmentionnés, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des gamètes mâles, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition telle que définie ci-dessus, en mélange ou en association avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons. Lesdits éléments sont connus de l'homme de métier. Ils peuvent notamment être choisis parmi les sérums albumines humaine ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux tels que KC1, NaCl, MgS04, NaHC03, Na2HP04, KH2P04. et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, le citrate et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B, notamment la vitamine Bl, la vitamine B2, la vitamine B3, la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B9, la vitamine B12 et/ou de la vitamine C et/ou de la vitamine E, et éventuellement de l'insuline et/ou éventuellement au moins une autre substance contribuant au procédé de préparation du milieu de culture, en particulier un ou plusieurs facteurs de croissance choisis notamment parmi le GM-CSF, l'IGF-l, l'IGF-2, l'EGF, le TGF ou le LIF et de préférence le GM-CSF et/ou au moins un antibiotique.
Dans ce qui suit, l'expression « en mélange » signifie que les compositions de l'invention et la solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons ne forment qu'une seule solution qui est le milieu de culture final après que l'une ait été versée dans l'autre alors que l'expression « en association » signifie que les deux formulations, à savoir l'invention et la solution aqueuse, sont présentes ensemble, par exemple dans un kit, mais ne seront mélangées qu'au moment de leur utilisation.
L'invention concerne également un procédé de préparation de milieux pour la culture in vitro définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mélange d'une composition selon l'invention agissant comme adjuvant, complément ou «booster » (le cas échéant après dissolution dans un liquide approprié de ladite composition selon l'invention si elle se présente sous forme de poudre ou de lyophilisât) avec une solution contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis ci-dessus.
Le liquide approprié peut être par exemple de l'eau distillée, du sérum physiologique, une solution de sérum albumine bovine ou humaine recombinante ou non, un mélange de ces différents ingrédients ou un milieu de culture classiquement utilisé.
L'invention concerne également des milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux pour la culture in vitro étant tels qu'obtenus par le procédé consistant à associer une composition de l'invention sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisât avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, une liste non-limitative desdits éléments étant indiquée ci-dessus.
Comme il apparaît dans les développements indiqués ci-dessus, les compositions selon l'invention constituent principalement des adjuvants ou "compléments" ou
«booster » qui ne sont pas, en principe, destinés à être utilisés seuls comme milieux de culture. Ils sont principalement destinés à être mélangés avec des solutions aqueuses contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro. Une liste non limitative de ces éléments a été indiquée précédemment.
Ces solutions aqueuses peuvent être constituées par des milieux pour la culture in vitro qui pourraient être utilisées comme tels mais pour lesquels l'addition des adjuvants, compléments ou «booster » selon l'invention permet d'améliorer les performances. Ces solutions aqueuses peuvent donc être des milieux de culture commerciaux comme ceux commercialisés sous les dénominations tels que Gl, G2, EmbryoGen, BlastoGen, Ferticult et HTF.
Ces solutions aqueuses contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons peuvent également être des milieux de culture potentiels préparés par des biologistes du métier et pour lesquels les adjuvants, compléments ou «booster » selon l'invention permettent, comme indiqué ci-dessus et montré ci-après dans la partie expérimentale, d'améliorer les performances et l'efficacité.
L'invention a plus particulièrement pour objet les milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux étant caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments constitutifs d'une composition selon l'invention telle que définie ci-dessus, en association ou en mélange avec des éléments susmentionnés utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, cellules mâles, ou embryons tels que définis ci-dessus.
L'invention a également pour objet un procédé de maturation des follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation des follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle, et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 24 à 48 heures.
L'invention concerne également un procédé de maturation de cellules de la lignée germinale mâle de mammifères, et plus particulièrement humaines, le cas échéant après décongélation de cellules préalablement congelées, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdites cellules, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, notamment pendant plusieurs jours, avantageusement de 1 à 5 jours.
L'invention a également pour objet un procédé de fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, et plus particulièrement d'ovocytes et de spermatozoïdes d'origine humaine, le cas échéant après décongélation des spermatozoïdes préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro des ovocytes et spermatozoïdes susmentionnés, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 1 jour à environ 2 jours. L'invention concerne également un procédé de développement d'embryons de mammifères, et plus particulièrement d'embryons humains, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdits embryons, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, de préférence pendant les 5 à 6 jours qui suivent la fécondation in vitro, avantageusement de manière à obtenir des embryons au stade de blastocystes.
De manière non limitative, l'invention concerne notamment les procédés tels que définis ci-dessus dans lesquels les mammifères peuvent être choisis parmi les primates, y compris les êtres humains, les ovins, les bovins, les porcins et chez les espèces animales en voie de disparition.
Avantageusement, les compositions de l'invention peuvent être utilisées à la fois pour la maturation de follicules ou celle des cellules de la lignée germinale mâle, la fécondation in vitro des ovocytes, et la maturation des embryons issus de ladite fécondation, notamment jusqu'au stade de blastocyste, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles.
L'invention a également pour objet un kit (ou trousse) pour la préparation extemporanée d'un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, notamment dans le cadre de la mise en œuvre d'un procédé susmentionné, ce kit comprenant :
- une composition selon l'invention éventuellement sous forme de lyophilisât et
- une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons, tels que les éléments définis ci-dessus, notamment un milieu commercialisé.
La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée suivante d'exemples de milieux de culture préparés selon l'invention.
A titre de solution aqueuse telle que définie ci-dessus, un milieu de culture préparé à partir des compositions selon l'invention peut comprendre principalement les composés choisis parmi les sels minéraux tels que KC1, NaCl, MgS04, NaHC03, Na2HP04, KH2P04 ; les acides aminés essentiels ainsi que d'autres acides aminés tels que l'acide glutamique, la glycine, la taurine, la cystéine et la glutamine ; des oses et dérivés métaboliques, tels que glucose, pyruvate, lactate, acétate ; des vitamines, notamment des vitamines du groupe B et de la vitamine C ; des bases puriques et pyrimidiques ; de l'albumine ; des phospholipides ; du cholestérol ; de l'insuline et/ou au moins une autre substance contribuant au procédé, en particulier un facteur de croissance ; des antibiotiques, tels que la pénicilline G, la streptomycine, la gentamycine ou un autre aminoside.
Cette invention, qui peut se présenter sous différentes formes (liquide, poudre, ou lyophilisât), peut être mélangée avant le conditionnement avec une solution liquide comprenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons, cette solution pouvant être ainsi elle-même un milieu de culture prêt à l'emploi. Le milieu amélioré résultant du mélange sera destiné à la culture de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes ou encore pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, ou des cellules mâles. Les compositions selon l'invention peuvent aussi être mélangées extemporanément avec une solution liquide comprenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons. La solution ainsi obtenue est un milieu de culture.
PARTIE EXPERIMENTALE :
Sont décrites ci-après des compositions de formulations de l'adjuvant effecteur objet de la présente invention qui peuvent être utilisés pour la préparation de milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles.
Dans toutes les expérimentations suivantes, les principes actifs sont finalement utilisés aux concentrations suivantes :
Zinc exprimé en élément = 1 μg/ml
Inositol exprimé en molécule = 5 mg/ml
L-carnitine exprimée en base = 0,6 mg/ml Mélatonine exprimée en base = 10"7 M
Cystine exprimée en base = 50 μg/ml
Cystéamine exprimée en base = 8 μg/ml
Hydrocortisone exprimée en base = 7 x 10"7 M
Nous avons choisi de préparer préalablement des compositions 10 fois plus concentrées que les concentrations citées ci-dessus. De ce fait, ces solutions sont à diluer extemporanément au l/10eme dans un milieu de culture usuel lors de la réalisation des procédés pour leur application.
Toutes les opérations sont effectuées avec des matières premières stériles et en milieu stérile.
Composition 1
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc et de la mélatonine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 10 μg de zinc élément et 10"6 M de mélatonine.
Cette solution est à diluer au l/10ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 2
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol et de la mélatonine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 10 μg de zinc élément, 50 mg d'inositol et 10"6 M de mélatonine.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 3
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol, de la mélatonine et de la cystine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 10 μ de zinc élément, 50 mg d'inositol, 10"6 M de mélatonine et 0,5 mg de cystine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 4
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol, de la mélatonine, de la cystine et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 10 μg de zinc élément, 50 mg d'inositol, 10"6 M de mélatonine, 0,5 mg de cystine base et 6 mg de L-carnitine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 5
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol, de la mélatonine, de la cystine, de la cystéamine et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 10 μg de zinc élément, 50 mg d'inositol, 10"6 M de mélatonine, 0,5 mg de cystine base, 80 μg de cystéamine base et 6 mg de L-carnitine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 6
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 10 μg de zinc élément, 50 mg d'inositol et 6 mg de L-carnitine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 7 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant de l'inositol, de la mélatonine et de la cystine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 50 mg d'inositol, 10"6 M de mélatonine et 0,5 mg de cystine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 8
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol, de la mélatonine et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 10 μg de zinc élément, 50 mg d'inositol, 10"6 M de mélatonine et 6 mg de L- carnitine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 9
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant de l'inositol, de la mélatonine, de la cystine et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 50 mg d'inositol, 10"6 M de mélatonine, 0,5 mg de cystine base et 6 mg de L- carnitine base.
Cette solution est à diluer au l/10ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 10
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel d' hydrocortisone, un sel de zinc et de la mélatonine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 7 x 10"6 M d' hydrocortisone, 10 μg de zinc élément et 10"6 M de mélatonine. Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 11 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel d'hydrocortisone, un sel de zinc, de l'inositol et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 7 x 10~6 M d'hydrocortisone, 10 μg de zinc élément, 50 mg d'inositol et 6 mg de L-carnitine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 12
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel d'hydrocortisone, un sel de zinc et de l'inositol est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 7 x 10"6 M d'hydrocortisone, 10 μg de zinc élément et 50 mg d'inositol. Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 13
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc et de l'inositol est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 10 μg de zinc élément et 50 mg d'inositol.
Cette solution est à diluer au l/10ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 14
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel d'hydrocortisone, un sel de zinc et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 7 x 10"6 M d'hydrocortisone, 10 μg de zinc élément et 6 mg de L-carnitine base.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 15 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 10 g de zinc élément et 6 mg de L-carnitine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 16
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel d'hydrocortisone, de l'inositol et de la cystine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne
7 x 10"6 M d'hydrocortisone, 50 mg d'inositol et 0,5 mg de cystine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 17
Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant de l'inositol et de la cystine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 50 mg d'inositol et 0,5 mg de cystine base.
Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Les flacons des différentes compositions de 1 à 17 sont conservés à + 4°C ou lorsque leur contenu est lyophilisé il est conservé à une température inférieure à - 20°C.
Essai 1) Maturation in vitro des ovocytes de mammifères
En fonction du stade de la maturation des ovocytes, les « ovocytes au stade de la vésicule germinative » ou les « ovocytes au stade de la métaphase I » sont mis en culture dans un milieu classique de maturation in vitro supplémenté avec deux ou plusieurs substances.
Essai la) Ovocytes au stade de la vésicule germinative (VG) On détermine le nombre d'ovocytes VG qui évoluent aux stades de la métaphase I (MI) ou de la métaphase II (Mil).
Dans cette expérience, 10 groupes sont utilisés
Groupe n°l (témoin), les ovocytes VG sont placés dans des puits ne contenant que le milieu de culture.
Groupe n°2, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant de la mélatonine et du zinc.
Groupe n°3, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant de la mélatonine, du zinc et de l'inositol.
Groupe n°4, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant de la mélatonine, du zinc, de l'inositol et de la cystine.
Groupe n°5, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant de la mélatonine, du zinc, de l'inositol, de la cystine, de la cystéamine et de la carnitine.
Groupe n°6, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant de la mélatonine, du zinc et de l'hydrocortisone.
Groupe n°7, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant du zinc et de l'inositol.
Groupe n°8, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant du zinc, de l'inositol et de l'hydrocortisone.
Groupe n°9, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant du zinc et de la carnitine.
Groupe n°10, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant du zinc, de la carnitine et de l'hydrocortisone.
Les différents groupes d'ovocytes sont mis en culture dans la même étuve à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de C02.
Résultats On vérifie si l'addition des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine entraîne une amélioration de la maturation des ovocytes VG au stade MI et Mil au bout de 24H et 48H de culture par rapport aux ovocytes VG mis en culture dans le milieu de culture seul.
Essai lb) Ovocytes au stade métaphase I
Dans cette expérimentation, on détermine le nombre d'ovocytes qui évoluent en M II. On utilise le même protocole que précédemment en sélectionnant des ovocytes au stade ML
Résultats
On vérifie si l'addition des compositions selon l'invention apporte des améliorations de la maturation des ovocytes MI évoluant au stade Mil en présence des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine
Dans les deux expérimentations citées, on vérifie aussi si l'ajout de Γ hydrocortisone entraine une amélioration de la maturation des ovocytes par rapport à l'absence de l'hydrocortisone.
Essai 2) Fécondation in vitro
Pour évaluer l'influence des différentes substances (hydrocortisone, zinc, inositol, L- carnitine, mélatonine, cystine et cystéamine) contenues dans les compositions selon l'invention, sur la fécondation in vitro, les expérimentations sont réalisées chez un mammifère.
Pour ce faire, on sélectionne les ovules les plus matures et les meilleurs spermatozoïdes pour faciliter la fécondation et on évalue le nombre d'embryons formés après 48 heures de culture.
Comme pour l'évaluation de la maturation in vitro, dans cette expérimentation on utilise 10 groupes.
Dans chaque groupe, les ovocytes matures sont mis en présence d'environ 106 spermatozoïdes compétents dans un milieu de culture auquel on ajoute des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine selon le même protocole que celui utilisé précédemment.
Résultats
On vérifie si l'ajout des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine au milieu de culture améliore le pourcentage des ovules fécondés par rapport au groupe d'ovules présents dans le milieu de culture seul.
Aussi on vérifie si l'ajout de hydrocortisone entraine une amélioration des résultats de la fécondation par rapport à l'absence de hydrocortisone.
Essai 3) Développement embryonnaire précoce
Pour évaluer les effets des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine sur le développement embryonnaire précoce on utilise éventuellement la souche CF-1 de souris, car le nombre d'embryons évoluant au stade de blastocyste dans un milieu de culture usuel est faible. Ce modèle permet d'apprécier les effets bénéfiques de ces substances sur le développement embryonnaire précoce.
Dans cette expérimentation, on utilise le même protocole 10 groupes d'embryons sont mis en culture dans différentes conditions.
Résultats
On vérifie si l'ajout des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que hydrocortisone, zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine entraîne une amélioration du développement des embryons à différents stades par rapport au groupe contenant uniquement le milieu de culture.
Aussi on vérifie si l'ajout de hydrocortisone entraine une amélioration des résultats du développement embryonnaire précoce par rapport à l'absence de l'hydrocortisone.

Claims

REVENDICATIONS
Composition sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisât pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour le développement d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles caractérisée en ce qu'elle comprend :
*au moins deux composés ou au moins trois composés choisis parmi le groupe constitué par :
un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc, l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, ou sous forme de phosphate, de préférence l'inositol triphosphate, notamment sous forme de sel, la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L- carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, la mélatonine ou un analogue, un sel acceptable ou un solvate de mélatonine, la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence l'acétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, - la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate,
*un ou plusieurs composés choisis parmi les composés de la famille des corticoïdes et, le cas échéant,
*un ou plusieurs coenzymes clés du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH, et en ce qu'elle est dépourvue de cytokine.
2. Composition sous forme de liquide pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour le développement d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles caractérisée en ce qu'elle comprend :
*au moins deux composés ou au moins trois composés choisis parmi le groupe constitué par :
- un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 μg/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1,5 μg/ml, exprimée en zinc élément, l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, ou sous forme de phosphate, de préférence l'inositol triphosphate, notamment sous forme de sel, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en inositol,
- la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L- carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en carnitine base, - la mélatonine ou un analogue, un sel acceptable ou un solvate de mélatonine notamment à une concentration de 10"11 à 10"5 M de préférence de 10"10 à 10"6 M et notamment de 10"9 à 10"7 M exprimée en mélatonine base,
- la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence l'acétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 20 à 100 μg/ml de cystine et de préférence de 35 à 60 μg/ml exprimée en cystine base,
- la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétyl cystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate,notamment à une concentration de 1,5 à 15 μg/ml de cystéamine et de préférence de 4 à 12 μg/ml exprimée en cystéamine base,
*un ou plusieurs composés choisis parmi les composés de la famille des corticoïdes et, le cas échéant,
*un ou plusieurs coenzymes clés du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH et en ce qu'elle est dépourvue de cytokine.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que le au moins composé de la famille des corticoïdes, est de préférence choisi parmi le groupe constitué par : l'hydrocortisone sous forme de sel hydrosoluble tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone, le succinate de sodium d'hydrocortisone et le phosphate de sodium d'hydrocortisone, dans laquelle la concentration du sel d'hydrocortisone est comprise entre 5 x 10" M et 10" M, et est notamment de 7 x 10" M, soit 350 ng/ml pour l'hémisuccinate d'hydrocortisone exprimée en hydrocortisone base.
4. Composition selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un sel de zinc sous forme hydratée ou anhydre choisi parmi les sels suivants : chlorure de zinc, sulfate de zinc, gluconate de zinc, picolinate de zinc, citrate de zinc, acétate de zinc, lactate de zinc, stéarate de zinc, de préférence un sel hydrosoluble comme le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc.
5. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de lyophilisât.
6. Application des compositions selon l'une des revendications 1 à 5, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition selon l'une des revendications 1 à 5 en mélange avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant choisis notamment parmi les sérums albumines humaine ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, le citrate et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B, notamment la vitamine Bl, la vitamine B2, la vitamine B3, la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B9, la vitamine B12, et/ou de la vitamine C et/ou de la vitamine E, et éventuellement de l'insuline et/ou éventuellement un ou plusieurs facteurs de croissance choisis notamment parmi le GM-CSF, l'IGF-l, l'IGF-2, l'EGF, le TGF ou le LIF et de préférence le GM-CSF et/ou au moins un antibiotique.
7. Milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux de culture in vitro étant tels qu'obtenus par le procédé consistant à associer une composition sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisât selon l'une des revendications 1 à 5 avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant choisis notamment parmi les éléments décrits à la revendication 6.
8. Milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux étant caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments d'une composition selon l'une des revendications 1 à 5 en mélange avec les éléments utilisés dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis dans la revendication 6.
9. Procédé in vitro de maturation de follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation des follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture selon la revendication 8, avantageusement pendant environ 24 à 48 heures.
10. Kit pour la préparation extemporanée d'un milieu selon la revendication 8, notamment dans le cadre de la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une composition sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisât selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,
- et une solution aqueuse contenant les éléments utilisés dans le cadre de la culture de follicules, cellules mâles ou embryons, tels que définis dans la revendication 6.
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