KR20080009263A

KR20080009263A - 불멸화된 지지 세포

Info

Publication number: KR20080009263A
Application number: KR1020077022057A
Authority: KR
Inventors: 안드레 분 화 추; 스티브 카 웽 오
Original assignee: 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2006-02-23
Publication date: 2008-01-28
Also published as: EP1859027A4; EP1859027A1; WO2006089353A1; US20090029461A1; JP2008531001A; RU2007135164A; CN101189329A

Abstract

본 발명은 불멸화된 지지 세포주에 관한 것이다. 불멸화된 지지 세포주는 배아 섬유아세포 특히 마우스의 배아 섬유아세포에서 유래된다. 또한 본 발명의 불멸화된 지지세포주의 배양은 적합한 배양 배지를 제공하고, 적합한 담체 또는 희석액을 포함하는 불멸화된 지 지세포주를 포함하는 조성물, 본 발명의 불멸화된 지지 세포주의 성장을 위해 제조된 조건 배지를 제공한다. 아울러 본 발명은 본 발명의 세포주 또는 조건 배지의 이용을 포함하는 줄기 세포의 배양 방법 및 이를 통해 제조된 세포를 제공한다.

Description

불멸화된 지지 세포{IMMORTALISED FEEDER CELLS}

본 발명은 불멸화된 지지세포주(feeder cell lines), 그의 배양 배지 및 줄기세포 특히 인간 배아 줄기세포 배양에서 이들 세포의 사용 및 그의 배지에 관한 것이다.

착상전 배아의 배자모체(inner cell mass)에서 인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cell: hESC)의 성공적인 분리로 시험관 내에서 미분화된 hESC를 무한적으로 배양하여 재생 치료에 사용되는 배아 삼배엽(embryonic germ layers)에서 세포로 분화될 수 있는 재료의 출발 공급원을 제공할 수 있다[1]. 종래에 hESC는 공동배양으로서 지지층(feeder layers)에서 유지되었고 이들 지지층은 마우스 또는 사람에서 유래하였다[2-7]. 최근에는 hESC가 지지세포가 없는 조건에서 성공적으로 배양되었다. 여기에서 세포는 지지층에 의해 조건 배지(conditioned medium, CM)가 첨가된 마트리젤(Matrigel)과 같은 세포외 기질에서 배양하였다[8,9]. 공급원과 상관없이 지지세포는 일차 조직에서 유래하였기 때문에 배양시 한정된 수명을 가지게 된다. 예를 들어, 일차 지지세포는 세포가 노화되기 전 약 7-9 계대에서만 배양될 수 있다. 따라서 새로운 지지세포(feeders)의 신선한 배양을 위해 배양시 변이가 있을지도 모르는 일반적인 기초를 준비해야 한다. 또한 지지세포의 병원균이 hESC 에 전염될 우려가 있음을 염두해야 한다.

hESC의 배양, 특히 대량으로 배양하기 위한 지지세포의 지속적이고 유효하며 일관성있는 지지세포 공급원을 얻기 위한 하나의 가능성 있는 해결책은 일차 지지세포의 불멸화이다. 이전에 불명화하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었고 이들 방법에는 시미안 바이러스 40(SV 40), EBV(Epstein-Barr virus) 및 유두종바이러스(HPV)와 같은 DNA 발암 바이러스의 유전자를 가진 정상세포의 형질도입(transduction)이 있다[10-14]. 더욱 최근에는 인간 텔로머라제 역전사 효소, hTERT(human telomerase transcriptase)의 과발현이 체세포 또는 분화세포의 생명을 연장할 수 있음이 보고되었다[15,16].

첫 번째로 본 발명은 불멸화된 지지세포주를 제공하는 것으로 특히 배아 섬유아세포에서 유래한 불멸화된 지지세포를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로 불멸화된 지지세포주는 마우스 배아 섬유아세포(embryonic fibroblast)에서 유래된 것이다. 더욱 상세하게는 불멸화된 지지세포주는 하나 이상의 p53 암 억제 단백질의 분해, c-myc 발현 증가, 텔로머라제의 활성 및 pRb의 분해에 의한 마우스 배아 섬유아세포에서 유래된다. 더욱 상세하게는 불멸화된 지지세포주는 HPV16의 E6 및 E7 유전자의 도입(introdution)에 의한 마우스 배아 섬유아세포에서 유래된다. 바람직하게는 E6 및 E7 유전자는 형질도입(transduction)에 의해 도입된다. 바람직하게는 배아 섬유아세포는 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 암호화하는 레트로 바이러스 벡터를 감염시킨다. 바람직하게는 대부분의 세포가 그들의 정상적인 수명을 초월하여 계속 증식하고 레트로 바이러스를 감염된 후 G418에 의한 항생제 선별에 내성을 갖는다. 바람직하게는 세포주는 불멸화된 후 발암성이 되지 않는다. 바람직하게는 생체 내에서, SCID에 세포를 근육내 주입하고 16주가 되어도 어떠한 촉진 가능암을 유발하지 않는다.

본 발명의 세포주는 7, 8 또는 9계대 이상 증식한다. 바람직한 본 발명의 세포주는 시험관 내에서 70 계대 이상 증식하고 어떠한 발암성의 표현형이 나타나지 않는다. 본 발명의 세포주는 공동 배양과 CM이 첨가된 지지세포가 없는 배양에서 40 계대 초과 동안 특징적인 미분화 형태를 계속 유지하고; 다분화능성(pluripotent) 마커인 Oct-4, SSEA-4, Tra-1-60, Tra1-81 및 알카린 포스파타제(alkaline phosphatase)를 발현하고 정상 핵형을 유지하고; SCID 마우스에 주입되었을 때 배아 삼배엽의 대표적인 조직인 기형종을 형성하는 hESC를 지지한다.

본 발명의 세포주는 미분화된 hESC 성장을 지지한다. hESC주는 상기 지지세포주에 쉽게 적응하고 지지세포 배양과 지지세포가 없는 배양에서 미분화된 hESC 배양의 전형적인 형태를 유지한다. 또한 hESC는 다분화능성 마커인 Oct-4, SSEA-4, Tra-1-60, Tra1-81 및 알카린 포스파타제를 계속 발현한다. 바람직하게는 25 계대 이후에 세포는 안정적인 핵형을 유지하고 분화하여 SCID 마우스에서 기형종을 형성할 수 있다. 바람직하게는 지지세포가 없는 hESC 배양에서 RT-PCR 분석을 통해 세포가 Oct-4 양성이지만 E6 및 E7 항원 음성임을 확인한다.

본 발명은 E6 및 E7 항원의 과발현으로 불멸화된 일차 MEF를 제공한다. 바람직한 실시예에서 세포주는 하기 기재된 △E-MEF이다. 세포주 △E-MEF는 미생물의 국제기탁에 관한 부다페스트조약(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent procedure)에 준하여 ATCC (American Type Culture Collection)에 2005년 5월 9일자로 수탁번호 PTA-6705로 기탁하였다.

또한, 본 발명은 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁된 불멸화된 지지 세포주(수탁번호 PTA-6705)를 제공한다.

또한, 본 발명은 적합한 배지에 있는 첫 번째 실시예(first aspect)의 불멸화된 지지 세포주의 배양액과 적합한 담체(carrier) 또는 희석액(diluent)에 있는 첫 번째 실시예의 불멸화된 세포주를 포함하는 조성물을 제공한다.

두 번째로 본 발명은 첫 번째의 불멸화된 세포주의 배양으로 생산된 조건 배지(conditioned medium, CM)를 제공한다.

조건 배지는 마트리젤(matrigel)과 같은 세포외기질과 결합하여 사용된다.

세 번째로, 본 발명은 지지세포로서 첫 번째의 세포주를 사용하는 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.

네 번째로, 본 발명은 두 번째의 조건이 갖추어진 배지를 사용하는 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 줄기세포는 인간 줄기세포이다. 더욱 바람직하게는 줄기세포는 인간 배아 줄기세포이다.

세 번째와 네 번째의 방법은 공장(factory)과 같은 배양 용기의 대량의 미분화된 hESC로 이루어진다. 대량은 10⁸세포 초과가 될 것이다.

다섯 번째로, 본 발명은 세 번째 또는 네 번째의 방법에 의한 줄기세포 배양을 제공한다. 바람직하게는 줄기세포는 인간 줄기세포이다. 더욱 바람직하게는 줄기세포는 인간 배아 줄기세포이다.

인간 배아 줄기세포(hESC)는 배양시 무한하게 증식하는 능력을 가지고 있으며 또한 다양한 세포로 분화하는 능력이 유지되는 다분화능성 세포이다. 그러나 hESC 배양은 직접적인 접근의 지지세포 또는 지지세포에 의해 조건 배지를 필요로 한다. 가장 흔한 지지세포 공급원은 일차 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)이다.

본 발명에서, 본 발명자는 시험관 내에서 일차 MEF가 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 암호화하는 레트로 바이러스 벡터로 감염된 후 그의 정상적인 수명을 초월하여 증식하는 능력을 연장할 수 있는지 조사하였다. E6 단백질의 과발현은 c-myc 발현의 증가 및 텔로머라제의 활성 뿐 아니라 p53 암 억제 단백질의 분해를 초래한다[17]. 이에 반해서 발현된 E7 단백질은 망막아세포종 단백질(pRb)에 결합하여 이를 분해한다[18]. 이전에 E6 및 E7의 발현이 사람의 정상적인 섬유아세포, 포유류의 상피세포 및 포피 케라티노사이트(keratinocyte)를 효과적으로 불멸화하는 것이 증명된 바 있다[11, 19, 20]. 이에 본 발명자는 E6 및 E7 항원의 과발현으로 일차 MEF를 성공적으로 불멸화하였다. 불멸화된 MEF, △E-MEF는 70 계대이상 시험관 내에서 증식하고 어떠한 발암성의 표현형이 나타나지 않았다. 더욱이 종래에 지지세포 또는 지지세포가 없는 조건에서 일차 MEF에서 배양한 3개의 hESC주는 △E-MEF에 쉽게 적응하였다.

형태학적으로, hESC는 미분화된 채 유지되고 다분화능성의 특징인 세포내 또는 세포외 마커를 계속적으로 발현하였다. 또한 hESC 배양은 정상적인 핵형을 유지하고 SCID 마우스 모델에서 기형종을 형성하였다.

본 발명에서 본 발명자는 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 암호화하는 레트로 바이러스 벡터로 감염시켜 일차 MEF를 불멸화하였다. 일차 세포가 노화되는 반면 불멸의 세포주 △E-MEF는 7-9 계대 이상 증식할 수 있고 70 계대 이상 수명이 연장된다. hESC 성장을 지지하는 능력을 시험한 결과 hESC는 △E-MEF과 공동배양과 △E-MEF에 의한 CM을 첨가한 지지세포가 없는 배양에서 모두 40 계대 초과 특징적인 미분화된 형태를 유지하였다. 또한 배양은 다분화능성 마커인 Oct-4, SSEA-4, Tra-1-60, Tra1-81 및 알카린 포스파타제를 계속 발현하고 정상적인 핵형을 유지하였다. 더욱이 SCID 마우스에 주입하였을 때 이들 hESC가 배아 삼배엽의 대표적인 조직을 가진 기형종을 형성하였다. 마지막으로 세포 공장(factory)와 같은 배양 용기에서 △E-MEF를 이용하여 상당한 양의 미분화된 hESC(10⁸ 세포 초과)를 늘릴 수 있음을 증명하였다. 본 발명의 결과는 불멸화된 지지세포가 hESC 증식 및 연구를 위한 지지세포의 일정하고 재생가능한 공급원을 제공하여 일차 지지세포 이상의 장점을 갖고 있음을 시사한다.

형태학적으로 hESC는 미분화된 채 유지되고 다분화능성의 특징인 세포내 및 세포외 마커를 모두 발현한다. 또한 hESC 배양은 정상적인 핵형을 유지하고 SCID 마우스 모델에서 기형성을 형성하였다.

도 1은 일차 MEF의 불멸화를 나타낸 도면이다. (a): 7 계대(□)와 45 계대(△)에서 E6/E7을 발현하는 레트로 바이러스로 감염된 MEF(△E-MEF) 또는 7 계대(■)에서 대조 레트로 바이러스로 감염된 MEF(△E-MEF)의 성장곡선. (b) E6/E7 infection된 세포(△E-MEF, 래인 2와 4)와 대조 바이러스 감염된 세포(△E-MEF, 래인 1과 3)에서 HPV-E6와 HPV-E7 유전자의 발현에 대한 RT-PCR 분석. 증식된 생산물은 1 % 아가로오즈 겔에서 분석한다. MW, 100-bp DNA ladder(Promega).

도 2는 △E-MEF(왼쪽 패널) 또는 △E-MEF에 의해 조건 배지를 첨가한 Matrigel(오른쪽 패널)에서 직접 배양된 hESC주, HES-3 세포의 형태를 나타낸 도면이다. 입체현미경(40 배 확대):(a와 b, scale bar=400 μm)과 위상차 현미경(40 배 확대, c와 d, scale bar=300 μm 와 100 배 확대, e, scale bar=100 μm)을 이용한 콜로니의 대표적인 이미지.

도 3은 지지세포(a-d) 또는 지지세포가 없는(e-g) 배양액에서 hESC주의 세포 내 Oct-4의 유세포분석을 나타낸 도면이다. hESC의 단일 세포 현탁액을 고정하고 permeabilize한 후 Oct-4에 대한 단일 클론 항체를 처리하였다. 표지된 세포는 FITC-결합된 항 마우스 항체로 검출된다. 음영(shaded) 히스토그램은 음성 대조군으로 처리한 것을 나타내고 개방(open) 히스토그램은 Oct-4 mAb로 처리한 것을 나타낸다.

도 4는 △E-MEF(상위 패널) 또는 △E-MEF에 의한 CM(하위 패널)과 공동 배양된 HES3의 세포 표면 마커의 발현을 보여주는 도면이다. SSEA-4(a, e), Tra-1-60(b,f), Tra1-81(c,g) 및 알카린 포스파타제(d,h)로 세포 처리. SSEA-4와 Tra-1-60/81의 경우 콜로니를 PE-결합된 이차 항체로 처리하였다. AP의 경우 양성 활성이 로다민 필터를 사용하여 형광을 내는 적색의 침전물로 특징지어진다. Scale bar=100 μm.

도 5는 △E-MEF에 의한 CM이 첨가된 지지세포가 없는 조건에서 14 계대 동안 배양된 HES-3 세포에서 유래한 기형종의 섹션(70PD)를 나타낸 도면이다. 소화관-유사 상피(a), 신경 상피(b), 근육(c), 연골(d) 및 뼈(e). Scale bar=20 μm.

도 6은 지지세포(a) 또는 지지세포가 없는(b) 조건에서 배양된 미분화된 HES-3 세포의 세포유전학 분석을 나타낸 도면이다. 양쪽 배양에서 hESC의 경우 정상적인 여성 핵형(46 X,X)이 관찰되었다.

도 7은 △E-MEF(a) 및 HES-3 지지세포가 없는 배양(b)에서 HPV-E6, HPV-E7, Oct-4 및 β-액틴의 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다. RT-PCR 후 증식된 생산물은 1 % 아가로오즈 겔에서 분석하였다.

도 8은 삼각 플라스크(a) 및 세포 공장(factory)(b)을 이용하여 △E-MEF에서 증식된 HES-3 세포의 세포내 Oct-4의 유세포분석을 나타낸 도면이다. 음영(shaded) 히스토그램은 음성 대조군으로 처리한 것을 나타내고 개방(open) 히스토그램은 Oct-4 mAb로 처리한 것을 나타낸다.

재료 및 방법

세포 배양

인간 배아 줄기세포, HES-2(46 X,X), HES-3((46 X,X)) 및 I-IES-4(46 X,X)를 ES Cell International에서 수득하였다. 세포를 젤라틴이 코팅된 기관 배양 접시에 마이토마이신-C 불활성화된 지지세포(~4×10⁴ 세포/cm²)(공동배양) 또는 지지세포에 의한 CM이 첨가된 마트리젤(matrigel)-코팅된 기관 배양 접시(지지세포가 없는 배양)에서 37℃/5% CO₂ 조건으로 배양하였다. hESC 배양에 사용하는 배지는 KNOCKOUT(KO) 배지이며, 15% KO 혈청 대체제(replacer), 1 mM L-글루타민, 1% 비필수아미노산 및 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 4-8 ng/ml의 기초 섬유아세포 성장 인자(Invitrogen)가 첨가된 85% KO-DMEM을 포함한다. 배지는 일일 교환하며 전술한 바와 같이 효소 처리 후에 주마다 계대 배양하였다[4]. 지지세포가 없는 배양을 위한 배양 접시는 냉 KO-DMEM으로 희석된(1:30 희석) matrigel(Becton Dickinson)에 서 40 ℃로 24 시간 배양하였다.

MEF 및 MEF 에 의해 조건배지(CM)의 제조

Robertson 등에 의해 기술된 방법을 이용하여 129X1/SvJ 마우스의 배아에서 일차 MEF를 분리하였다[21]. 일차 MEF의 단일층(4 계대)은 confluency가 이루어질 때까지 배양하고 10 μg/ml 마이토마이신-C를 2.5-3시간 처리하였다. 처리후 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 분리하고 상기 기재된 바와 같이 F-DMEM 배지가 있는 기관 배양 접시에 분주하였다. 상기 배지는 90 % DMEM 고(high) 글루코오즈, 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 25 U/ml 페니실린 및 25 μg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)으로 구성된다. 배지는 분주 후 24기간이 되면 KO 배지로 교환하고 hESC를 첨가 또는 MEF-CM 수득 전에 24시간 동안 평형을 유지하도록 한다. MEF-CM의 경우 배양 접시는 1.4×10⁵ 세포/cm²,마이토마이신-C 처리된 MEF로 분주되고 CM은 배지가 배양접시에 첨가 된 후 24시간 마다 회수되었다. CM을 여과(0.22 μm)하고 재조합 인간 기초 섬유아세포 성장 인자를 8 ng/ml 추가하였다.

불멸화된 지지세포주 , △E- MEF 의 확립

3 계대에서 일차 MEF(3×10⁵세포)는 75 cm² T-플라스크에 분주하고 F-DEME 배지에서 밤새 부착하도록 방치하였다. 그런 다음 세포를 8 μg/ml 폴리브렌(Sigma-Aldrich) 존재하에 PA317 LXSN HPV16E6E7 또는 PA317 PXSV 패키징 세포 주(CRL-2203과 CRL-2202, ATCC)에서 레트로 바이러스를 포함하는 멸균 여과된 상층액으로 37 ℃, 8 시간 형질도입하였다[22]. 그런 다음 바이러스를 포함하는 배지를 제거하고 새로운 F-DMEM으로 대체하고 3 일 추가 배양하였다. 그런 다음 형질도입된 세포는 14일 동안 100 μg/ml G418(Sigma-Aldrich)에서 선별하였다. 확립된 지지세포주, △E-MEF를 항생제가 없는 F-DMEM 배지에서 배양하고 스탁(stocks)은 90% FBS 및 10% DMSO에서 냉동보관하였다.

성장률 및 배가시간

MEF 및 hESC의 단세포 현탁액은 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen)로 처리한 후 날마다 수득되었다(배양 후 1-6일). 트리판 블루 익스클루젼(trypan blue exclusion)은 각 샘플의 생존 가능한 세포수 및 세포생존능력을 결정하는데 사용되었다. 시간에 따른 생존 가능한 세포수의 그래프는 급격한 성장 단계 동안 세포의 특정 성장률을 측정하는 것으로 나타내었다. 배가시간(td)은 하기의 식을 이용하여 산출되었다.

td= ln(2)/μ, μ: 특정 성장률(hr^-1).

Oct -4 발현의 유세포 분석

hESC 군에서 Oct-4인 세포 내 전사인자의 발현 수준은 유세포를 이용하여 면역형광검사에 의해 측정되었다. 세포는 트립신을 이용한 단세포 현탁액으로 취득 되었고 고정 및 투과(Caltag Laboratories)한 후 1:20 희석액에서 Oct-4(Santa Cruz)에 대한 마우스 단클론 항체로 배양되었다. 세포는 1% BSA/PBS로 세척된 후, 염소 α-마우스 항체 FITC-접합체(DAKO)의 1:500 희석액으로 암실에서 배양되었다. 배양 후, 세포는 세척되었고 FACScan(Becton Dickinson FACS Calibur) 분석을 위해 1% BSA/PBS에서 재현탁되었다. 모든 배양은 15분 동안 실내온도에서 수행되었다. 음성 대조군 세포는 적절한 전환(isotype) 대조군으로 염색되었다.

면역세포화학

세포는 45분 동안 실내온도에서 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 고정되었고, 1시간 동안 실내온도에서 SSEA-4(neat, Developmental Studies Hybridomas Bank), Tra-1-60 및 Tra-1-81(30 ㎍/ml, Chemicon)에 대한 항체로 배양되었다. 항체의 국부화는 염소 α-마우스 항체 FITC-접합체(DAKO)를 이용하여 시각화하였다.

알카린 포스파타아제 염색( Alkaline Phosphatase Staining )

알카린 포스파타아제 염색은 제조자의 프로토콜에 따라서 벡터 레드 알카린 포스파타아제 기질 키트 I(Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I)(Vector Laboratories)을 이용하여 수행되어졌다. 간략하게, hESC는 실내 온도에서 45분 동안 벡터 레드 기질 작용액으로 암실에서 배양된 PBS에서 세척되었다. 로다민(Rhodamine) 여기 및 방출 필터는 반응물을 시각화하기 위해 사용되었다.

RNA 분리 및 역전사 PCR( RT - PCR )

전체 RNA는 NucleoSpin RNA Ⅱ 키트(Macherey Nagel)를 이용하여 hESC 및 MEF로부터 분리되었고, UV 스펙트로미터에 의해 정량되었다. 표준 역전사 반응은 올리고 dT 프라이머 및 ImProm Ⅱ 역전사효소(Promega)를 이용한 1 ug 전체 RNA로 수행되었다. 상기 PCR은 Oct-4, β-액틴(actin), HPV 16 E6 및 HPV 16 E7에 대한 특정한 프라이머로 수행되었다(표 1). 증폭을 위한 순환 매개변수(cycling parameter)는 1분 동안 95℃, 1분 동안 55℃ 및 1분 동안 72℃였다. 마지막 연장은 10분 동안 72℃였다. 증폭된 산물은 1% 아가로스 겔에서 시각화되었고, 에디티움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색되었다.

SCID 마우스 모델

△MEF 및 hESC 효소처리된 후 ~4-5 x 1O⁶ 세포들을 4주차 늙은 수컷 SCID 마우스들의 뒷다리 근육 내로 살균 22G 바늘로 주사되었다. 종양이 진행된(주사 후 9-10주) 동물들은 희생되었고, 상기 종양은 해부된 후 10% 포르말린에서 고정되었다. 종양들은 파라핀에 넣어졌고, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색 후 조직학적으로 구분 및 검사되었다.

염색체 분석( Karyotyping )

염섹체 분석은 NUS 또는 KK 여성 및 아동 병원(Women's and Children's Hospital)의 산과학(Obstetrics) 및 부인과(Gynaecology) 부서 세포유전학 실험실에 의해 수행되어졌다.

hESC 공동-배양 배양의 스캐일 -업( scale - up )

hESC의 정량적 증가를 위해, 공동-배양은 조직 배양 플라스크(T75, 75cm²), 트리플 플라스크(TF, 500 cm²) 및 세포공장(CF, 632 cm²)(Nunc)에서 확장되었다. 배양 조건들은 상기 설명한 것과 유사하다. 미토신(Mitomycin)-C 비활성된 지지세포(feeder)는 모든 표면에 대략 4 x IO⁴ 세포/㎠에서 젤라틴화된 배양 표면에 뿌려졌다. 세포는 인산-완충 염수(phosphate-buffered saline+, PBS+)로 세척된 후 실내온도에서 2-3분 동안 0.05% 트립신(Invitrogen)으로 배양되었다. 세포는 두드려서 플라스크로부터 이동되었고, 완만한 반복된 피펫에 의해 더 작은 집단으로 분리되었다. 그 후, 트립신은 중화되었고, 세포 집단은 1:3의 비율에서 비활성된 지지세포로 뿌려진 새로운 젤라틴화된 플라스크로 접종되었다.

결과

분열된 MEF 의 확립 및 특성

계대 3에서 1차 MEF는 HPV16-E6, HPV16-E7 및 네오마이신 내성(neomycin resistance)를 동시에 암호화하는 레트로 바이러스(retroviruses)로 감염되었다(△E-MEF). 음성 대조군으로서, 세포들은 단지 네오마이신 내성을 포함하는 대조군 레트로 바이러스로 감염되었다(△C-MEF). 감염 후(감염 후 ~12일, P7) 4 계대, △E-MEF는 대략 19.7 시간의 배가시간을 가지는 증폭을 계속하였다(도 1a). 또한, △E-MEF의 성장률 및 배가시간은 계대 4에서 1차 MEF에 대등하였다(표 2). 대조적으로, 계대 7에서 대조군 바이러스로 감염된 세포들(△C-MEF)은 6일 동안 생존가능한 세포수의 의미있는 증가가 없었기 때문에 노쇠의 징후를 보였다(도 1a). 45 계대 후(165 군 배가), △E-MEF는 계대 7과 대등한 성장 활동을 유지하였고(도 1a), 증식 용량이 감소하지 않고 70 계대 이상으로 배양되었다. 계대 7에서 △E-MEF 및 △C-MEF에서 파생된 RNA는 레트로 바이러스로 감염된 결과로서 도입된 E6 및 E7 유전자의 발현을 위해 RT-PCR에 의해 분리되고 검사되었다. 도 1b에서, E6 및 E7 유전자(상대적으로 2 및 4 주) 둘에 대한 mRNA만을 발현하는 △E-MEF는 대조군 바이러스로 감염된 세포들의 △C-MEF에서 관찰되었다.

△E-MEF가 E6 및 E7로 분열된 후, 종양 형성 능력이 있는지 결정하기 위해, 5 X 10⁶의 세포들은SCID 마우스들로 주입되었다. 동물들은 정기적으로 검사되었고, 세포의 주입 16주 후 명백한 종양이 관찰되지 않았다.

분열된 MEF 를 이용하는 지지세포 및 지지세포 없는( feeder - free ) 조건에서 hESC의 성장 및 형태

인간 ES 세포주, HES-3은 1차 MEF(공동-배양)에서 직접 또는 1차 MEF 배양으로부터 조건 배지로 보충된 매트리겔(matrigel)에서 일반적으로 배양되었다(지지세포 없음). 분열된 MEF 주인 △E-MEF는 hESC의 미분화 성장을 지지하는 것이 가능한지를 평가하기 위해, HES-3 세포들은 △E-MEF를 사용하여 각각의 조건에서 뿌려졌다.

공동배양을 위해, HES-3 세포들의 집단은 지지세포를 제외하고, △E-MEF 확장 및 형성된 콜로니(colony)로 뿌려졌다. 이는 콜로니를 둘러싸는 섬유아세포의 매우 독특한 가장자리 콜로니를 제공한다(도 2a 및 도 2c). 형태적으로, 상기 콜로니 내의 hESC는 단단히 밀집되었고, 세포질에 대한 핵의 비율이 높게 유지되었다(도 2e). 지지세포 없는 배양 동안, 지지세포의 부재에도 불구하고, △E-MEF 조건 배지로 보충된 매트리겔에서 hESC는 지지세포에서 배양된 hESC와 유사한 명백하고 밀집한 콜로니를 계속 형성하였다(도 2b 및 도 2d). 분화된 섬유아세포 유형 세포들은 미분화된 콜로니의 가장자리를 둘러싸는 것으로 관찰되었으나, 상기 세포들의 조밀도는 hESC에 비해 상당히 낮은 것으로 관찰되었다(도 2d). 지지세포 및 지지세포 없는 두 가지 조건에서 모두, HES-3 세포들은 계속된 40 계대 이상을 위해 더 미분화된 hESC 형태를 유지하였다(210 군 배가, PD). 또한, 유사한 형태들은 10 계대 이상을 위해 지지세포 및 지지세포 없는 배양에서, 2개의 추가적인 hESC 주, HES-2 및 HES-4에서 관찰되었다. 또한, 상기 두 배양 조건에서 HES-3 세포들의 특정 성장률 및 배가시간은 표 2에서 비교되었고, 간행된 문헌에 대응되었다[4, 23]

미분화된 hESC 에 대한 특정 마커의 특성화

미분화된 hESC는 세포 내 전사 인자, Oct-4와 같은 마커들 및 SSEA-4, Tra-1 -60 및 Tra-1 -81과 같은 표면 마커들의 발현에 의해 특성화될 수 있다. 유세포 분석을 이용하여, 본 발명자들은 지지세포 및 지지세포 없는 조건에서 3개의 hESC 주들에서 Oct-4의 발현을 비교하였다(도 3). 1차 MEF에서 배양된 HES-3 세포들과 같이(도 3a), △E-MEF에서 배양된 HES-2, HES-3 및 HES-4 세포들의 88% 초과(도 3c, 3b 및 3d)는 Oct-4에 대해 양성으로 염색되었다. 유사하게, △E-MEF로부터 파생된 CM으로 지지세포 없는 조건에서 유지될 때, 세포들(모든 3hESC 주들)의 97% 이상은 Oct-4에 대해 양성이었다(도 3e 내지 3g). 또한, △E-MEF(도 4, 윗쪽 그림) 또는 △E-MEF CM(도 4, 아래쪽 그림)에서 배양된 HES-3 세포들은 SSEA-4(도 4a 및 4e), Tra-1-60(도 4b 및 4f) 및 Tra-1-81(도 4c 및 4g)에 대해 양성으로 염색되었고, 높은 알카린 포그파타아제 활성을 가졌다(도 4d 및 도 4h).

생체 내 분화된 조직 형성 가능성을 평가하기 위해서, △E-MEF를 사용하여 지지세포 또는 지지세포 없는 배양에서 유지된 HES-3 세포들은 SCID 마우스들 내로 주입되었다. 주입 10주 후, 기형종(teratomas)은 모든 조건에서 관찰되었다. 종양들은 조직학적으로 분리되고 검사되었다. 분리한, 배아 삼배엽(embryonic germ layer)에 대한 대표적인 조직은 확인되었고, 이는 내장류 상피(gut-like epithelium)(내배엽, 도 5a), 신경 상피(neural epithelium)(외배엽 도 5b), 근육, 연골 및 뼈(중배엽, 도 5c 내지 5e)를 포함한다. 또한, 세포유전학 검사는 적어도 25 연속적인 계대(130 PD) 후에 지지세포 및 지지세포 없는 세포군에서 파생된 HES-3 세포들에서 수행되었다(도 6a 및 도 6b). 분석 결과, HES-3 세포들은 두 배양 조건하에서 정상적인 핵형(46 X, X)을 유지한다.

마지막으로, 레트로 바이러스들은 1차 MEF를 유지하기 위해 사용되기 때문에, 바이러스들이 E6 및 E7 항원들로 hESC를 감염할 수 있는 △E-MEF에 의해 생산될 수 없다는 것을 확립하는 것이 중요하다. RT-PCR은 40 계대 후 HES-3 지지세포 없는 배양에서 E6 및 E7 항원 모두의 발현을 검출되지 않았다(도 7b). 대신, Oct-4의 발현은 hESC가 분화되지 않는 것을 유지하는 것이 검출되었다. 또한, 대조군으로서, RT-PCR은 △E-MEF에서 수행되었다(도 7a). 지지세포에 의한 E6 및 E7의 발현은 Oct-4를 제외하고 검출되었다.

△E- MEF 를 이용한 HES -3 공동 배양의 스캐일 -업

△E-MEF가 미분화된 hESC의 스캐일-업에 이용될 수 있다는 것을 설명하기 위해, 공동 배양은 기관 배양 디쉬에서 조직 배양 플라스크에 이르기까지 확대되었다. 조직 배양 플라스크로부터 파생된 세포들은 트리플 플라스크 및 세포공장으로 hESC 발현을 위해 접종물로 사용되었다. 표 3에서 보는 바와 같이, 상기 큰 배양 용기에서 7일 후 취득한 전체 세포 수율은 대략 2-3 X 10⁸개의세포들이었다. 또 한, 기관 배양 디쉬에 비해 트리플 플라스크 및 세포공장에 대한 208x 및 263x에 의해 표면 부위에서 증가함에 불구하고, 세포 조밀도는 ~0.37 X 10⁶세포들/㎠이 유지되었다. 또한, 트리플 플라스크 및 세포공장에서 확장된 hESC 군의 89%-96%는 Oct-4에 대해 양성으로 염색을 유지하였다(도 8a 및 8b). 상기 결과는 △E-MEF에서 미분화된 hESC가 상당한 양으로 확대되는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.

RT - PCR 을 위한 프라이머 서열

프라이머	서열(5'-3')	크기(bp)	참고
HPV16-E6-F	GCAACAGTTACTGCGACGTG	234	[11]
HPV16-E6-R	GGACACAGTGGCTTTTGACA	234	[11]
HPV16-E7-F	GATGGTCCAGCTGGACAAGC	143	[11]
HPV16-E7-R	GTGCCCATTAACAGGTGTTC	143	[11]
Oct-4-F	CGRGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG	241	[2]
Oct-4-R	AAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC	241	[2]
β-Actin-F	TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC	396	[2]
β-Actin-R	GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC	396	[2]

지지세포, hESC 공동 배양 및 지지세포 없는 배양의 특정 성장률 및 배가시간

hESC 주 시간/Td(h)	지지세포	특정 성장률 비율/u(h^-1)	배가
-	MEF(P4)	0.049	20.4
-	△E-MEF(P7)	0.051	19.7
HES-3	△E-MEF	0.022	31.8
HES-3	- (지지세포 없는 △E-MEF CM)	0.021	32.7

다양한 배양 플랫폼에서 hESC 공동 배양의 총 세포 수율 및 세포 조밀도

배양 플랫폼	표면 부위 (㎠)	총 세포 수율 (X 10⁶ 세포)	세포 조밀도 (X 10⁶ 세포/㎠)
기관 배양 디쉬	2.4	1.0	0.42
조직 배양 플라스크	75.0	29.4	0.39
트리플 플라스크	500.0	187.5	0.37
세포 공장	632.0	295.3	0.47

의견

지지세포들은 hESC의 배양에서 필수적인 성분이다. 마우스 배아 줄기 세포와 달리, hESC는 지지세포에 직접 접한 조건 또는 지지세포-CM으로 보충된 지지세포 없는 배양 조건에서 성장된다. 상기 조건들하에서, hESC는 미분화된 표현형을 유지한다. 그러나, 주요한 한계는 hESC 활동에서 사용되는 지지세포는 마우스 또는 인간의 1차 조직으로부터 파생된다는 것이다. 정상의 체세포들은 배양액에서 한정된 수명을 가지고, 마지막 복제 후에 퇴화될 것이다. HPV16 E6 및 E7 항원을 가지는 1차 세포들의 형질전환은 인간 섬유아세포의 수명을 200 군 배가 이상으로 연장하는 것을 보여준다[19].

이번 연구에서, 본 발명자들은 1차 MEF의 수명이 7-9 계대로부터 70 계대(250 군 배가) 이상까지 연장될 수 있음을 증명하였다. E6 및 E7 항원들의 발현은 RT-PCR에 의해 확인되었다. 세포들이 SV40, E6 및 E7과 같은 유전자들이 세포 퇴화의 주요 단계로 들어가는 것을 이용하여 수명을 유지하는 것은 이전에 보고된 바 있다. 상기 군으로부터, 분해를 계속하는 세포들은 수명을 유지하는 세포주를 형성하기 위해 진행한다[24]. 상기 세포는 △E-MEF로 관찰되지 않는다. 대량의 세포들은 그들의 정상적인 수명 이상으로 증식하고, 레트로 바이러스로 감염되는 G418로 항생적 선별에 저항된다. 또한, 생체 내에서, SCID 내로 △E-MEF의 근육 내 주입은 주입 16주 후 촉진가능한 종양이 나타나지 않았다. 이는 △E-MEF이 수명이 연장된 후 종양으로 되지 않는 것을 확인하는 것이다. 대조적으로, 주입된 동등한 양의 hESC는 주입 9-10주 후 대략 1-2㎠의 기형종이 형성되었다.

수명이 연장된 세포들에 대한 E6 및 E7 항원들의 사용의 주요 관심사는 수명이 연장이 p53 및 망막아종 단백질(retinoblastoma protein)들의 분해에 의해 취득될 수 있음에도 불구하고, E6 및 E7이 수명이 연장된 세포에서 다른 경로 및 세포의 기능을 영향을 줄 수 있다는 것이다. Murvai 등[25]은 HPV16 E7이 NIH/3T3에서 전환 성장 인자-β2(transforming growth factor-β2, TGF-β2)의 활성을 억제하는 것을 관찰하였다. 인간 케라티노사이트(keratinocyte)에서, E6 및 E7의 과발현은 TGF-β2 mRNA의 발현 및 TGF-β2의 생물학적 활성의 분비를 억제하였다[26]. 한편, HPV16 E6은 6배(fold)에 의해 TGF-β1의 활성을 상당히 유도하였으나, 상기 효과는 상피세포에서는 관찰되지 않고 섬유아세포에서만 단지 관찰되었다[27].

본 연구의 문맥상에서, E6 및 E7 불멸화(immortalization)는 미분화 hESC 성장을 지속시키는 ΔE-MEF 능력을 변경하지 않는다. 우리는 3개의 hESC 세포주가 이들 지지 세포와 쉽게 적응하고, 지지세포 또는 지지세포 없는 배양 모두에서 미분화 hESC 배양의 전형적인 형태를 유지함을 관찰하였다. hESC는 또한 Oct-4, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81 및 알카린 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 포함하는 다분화능 표지자(pluripotent marker)를 계속 발현하였다. 25 계대 후, 세포는 안정화된 핵형(karyotype)을 계속 유지하고, SCID 마우스에 기형종(teratomas) 형태로 분화가 가능하다. 또한 HES-3 지지세포 없는 배양의 mRNA의 RT-PCR 분석은 세포가 Oct-4에는 양성이나 E6 및 E7 항원에는 음성으로 남음이 확인되었다. 후반 결과는 ΔE-MEF는 hESC에 이용하는데 안전하며, 지지세포에서 hESC 세포로 이들의 항원의 전이 위험이 없음을 증명함으로써 의미있다. 미분화된 hESC의 유의적인 양을 생산하는 본 연구 결과, 우리는 세포 공장(~2-3×10⁸ 세포)과 같은 대량 배양 용기에서 ΔE-MEF를 이용한 HES-3 세포의 대량 공동 배양이 가능함을 증명하였다. 기관 배양 용기와 비교하여 208-263x 로 표면적을 증가시켰음에도 불구하고 세포 질의 타협없이 배양 7일 후 hESC의 동등한 농도를 수득할 수 있었다.

보다 최근에 본 연구진은 또한 3개의 성공적으로 불멸화된 인간 포피 섬유아세포주(human foreskin fibroblast: hF)이 참고문헌[4]에 기재된 방법을 이용하여 hESC 발현을 지원함을 이전에 보여주었다. ΔE-MEF와 같이 불멸화된 hF 세포주인 ΔE-Hs68는 이들의 지지세포 공동 배양(>26 계대) 또는 지지세포 없는 배양(>16 계대)에서 미분화 HES-3 세포의 증식를 지원하는 능력을 계속 유지하였다. HES-3 세포의 배가 시간(doubling time)은 초기 Hs68 공동 배양시 HES-3 세포의 33.3 시간과 비교했을 때 각각 34.5 시간 및 36.4 시간이었다. 또한 hESC는 Oct-4, GCTM-2, SOX-2, SSEA-4, Tra-1-60 및 Tra-1-81에 계속적으로 염색 양성이었다(결과 보이지 않음).

결론적으로, 이와 같은 결과는 유전적 전략으로 E6 및 E7을 이용한 불멸화된 세포는 마우스 및 인간 지지세포에 모두 응용될 수 있음을 제시한다. 이들의 정상 수명을 넘어선 증식 및 hESC 발현을 지원하는 능력을 계속 유지하는 지지세포의 능력은 유익한데, 이는 초기 지지세포의 빈번한 제조를 위한 필요를 해결될 것이기 때문이다. 지지세포의 일관된 근원은 지지세포 및 지지세포 없는 조건 모두에서 hESC의 배양 증가시 특히 재현성을 용이하게 하며, 또한 지지세포 질의 생산 배지와 연관된 문제들을 감소시킬 것이다. 그에 더불어 이들 불멸의 지지 세포주는 지지세포로부터 hESC로 전달될 수 있는 잠재적 병원균의 부재를 확보하도록 선별될 수 있다.

참고문헌

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Claims

불멸화(immortalized)된 지지 세포주(feeder cell line).
배아 섬유아세포(embryonic fibroblast)에서 유래된 불멸화된 지지 세포주.
마우스(mouse)의 배아 섬유아세포에서 유래된 불멸화된 지지 세포주.
p53 종양 억제 단백질(tumor suppressor protein)의 분해, c-myc 발현의 상향 조절, 텔로머라제(telomerase)의 활성화 및 pRb의 분해 중 하나 또는 그 이상에 의한 마우스의 섬유아세포에서 유래된 불멸화된 지지 세포주.
HPV16의 E6 및 E7 유전자의 도입에 의한 배아 섬유아세포에서 유래된 불멸화된 지지 세포주.
제 5항에 있어서, E6 및 E7 유전자는 형질도입(transduction)에 의해 도입된 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지세포주.
제 6항에 있어서, 배아 섬유아세포는 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 암호화하는 레트로 바이러스 벡터로 감염된 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주.
제 7항에 있어서, 세포 덩어리가 이들의 정상적인 수명을 넘어서서 증식을 계속하고, 레트로 바이러스로 감염된 다음 G418로 항생제 선별에 저항하는 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주.
제 7항에 있어서, 세포주는 불멸화 후에도 종양화(tumorigenic)되지 않는 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주.
제 9항에 있어서, 생체 내에서 SCID로 세포의 근육주사는 주사 후 16주까지 어떠한 촉진가능 암(palpable tumor)도 유발하지 않는 것을 특징으로 하는 불멸화 된 지지 세포주.
제 1항에 있어서, 세포주는 7, 8 또는 9계대 후에도 증식하는 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주.
제 11항에 있어서, 세포주는 시험관 내에서 70 계대를 넘게 증식하고, 어떤 종양 형성 표현형을 획득하지 않는 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주.
제 1항에 있어서, 하기와 같은 특징을 갖는 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 지지하는 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주:

공동 배양(co-culture) 및 CM이 첨가된 지지세포 없는 배양(feeder-free culture) 모두에서 40 계대 초과시에도 전형적인 미분화된 형태를 계속 유지하고;

다분환능 표지자(pluripotent marker)인 Oct-4, SSEA-4, Tra-1 -60, Tra-1-81, 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 발현하고, 정상적인 핵형를 계속 유지하고;

SCID 마우스에 주사할 때 배아 삼배엽(embryonic germ layer)성 조직과 기형종(teratomas)을 형성함.
제 1항에 있어서, 미분화된 hESC 성장을 지지하는 불멸화된 지지 세포주.
제 1항에 있어서, hESC가 쉽게 세포주에 적응하고, 지지세포 또는 지지세포 없는 배양 모두에서 미분화된 hESC 배양의 전형적인 형태를 유지하는 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주.
제 15항에 있어서, hESC가 Oct-4, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81 및 알카린 포스파타아제를 포함하는 다분화능 표지자가 계속 발현되는 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주.
제 15항에 있어서, 25 계대 후에 hESC가 안정화된 핵형을 계속 유지하고, SCID 마우스에서 기형종 형태로 분화될 수 있는 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주.
제 15항에 있어서, HES 지지세포 없는 배양으로부터 mRNA의 RT-PCR 분석시 세포가 Oct-4에 양성이나, E6 및 E7 항원에 음성을 유지하는 것으로 확인되는 것을 특징으로 하는 불멸화된 지지 세포주.
E6 및 E7 항원의 과발현으로 불멸화된 초기 MEF.
여기에 기술된 세포주 ΔE-MEF.
ATCC(American Type Culture Collection)수탁번호 PTA-6705로 기탁된 불멸화된 지지 세포주.
적합한 배양 배지에서의 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 불멸화된 지지 세포주의 배양체.
적합한 담체 또는 희석액과 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 불멸화된 지지 세포주를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 불멸화된 지지 세포주의 성장을 위해 제조된 조건 배지.
제 24항에 있어서, 마트리겔(matrigel)과 같은 세포외 기질(extracellular matrices)이 결합에 이용되는 것을 특징으로 하는 조건 배지.
지지 세포로서 제 1항 내지 제 21항 중 어느 하나인 세포주의 이용이 포함된 줄기 세포 배양 방법.
제 26항에 있어서, 줄기세포는 인간 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 27항에 있어서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항 또는 제 25항의 조건 배지의 이용을 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 배양 방법.
제 29항에 있어서, 줄기 세포는 인간 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 30항에 있어서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 26항 내지 제 31항 중 어느 한 방법에 있어서, 세포 공장(cell factories)과 같은 배양 용기에 미분화된 hESC의 증가된 양으로 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, 증가량은 10⁸ 세포 초과인 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 내지 제 31항 중 어느 한 방법에 의해 배양된 줄기 세포.
제 34항의 인간 줄기 세포.
제 32항의 인간 배아 줄기 세포.